ứng dụng vi khuẩn nội sinh phân hủy n-acyl-l-homoserine lactones (ahls) trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI
TRƯỜNG THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam
**************
ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT
DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ
LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015).
Tên đề tài: ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH PHÂN HỦY N-ACYL-L-HOMOSERINE
LACTONES (AHLs) TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN KHOAI TÂY
Lĩnh vực: Sinh học tế bào và phân tử
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
- TS. Hoàng Hoa Long
- Đơn vị công tác: Viện Di truyền nông
nghiệp, KM2, đường Phạm Văn Đồng, Từ
Liêm, Hà Nội
TÁC GIẢ:
1. Vũ Văn Hiệp Lớp: 12 Hóa 1
Trường: THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam
2. Nguyễn Chu Hải Linh Lớp: 12 Toán 1
Trường: THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam
Hà Nội, tháng 11 năm 2014

1
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ
AND Acid Deoxyribo Nucleic
AHLs N-acyl-L-homoserine lactones
ARN Acid Ribo Nucleic
CV026 Chromobacterium violaceum
CFU (Colony Forming Unit) đơn vị hình thành khuẩn lạc
CS Cộng sự
Ecc Erwinia cartovora subsp. carotovora

Ep Endophytes (vi khuẩn nội sinh)
LB Môi trường Luria Bertani medium
PCR Polymerase chain reaction
QQ Quorum Quenching
QS Quorum Sensing
TB Tế bào
VKNS Vi khuẩn nội sinh
YPDA Yeast Peptone Dextrose Agar
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1: Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn 9
Hình 2: Thí nghiệm thử khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn 11
Hình 3: Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs 13
Hình 4: Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 trên môi trường YPDA sau
24 giờ nuôi cấy ở 28oC 17
Hình 5: Triệu chứng bệnh sau khi tái nhiễm chủng P.2.6.1 trên khoai tây sau 24h 18
Hình 6: Khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn của chủng vi khuẩn gây bệnh P.2.6.1 19
Hình 7: Các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs chuỗi ngắn 21
Hình 8: Sản phảm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng VKNS 22
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Độc tính của các chủng vi khuẩn phân lập được từ củ khoai tây bị bệnh thối nhũn 17
Bảng 2: Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh 19
Bảng 3: Các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs 20
Bảng 4: Hiệu lực phòng trừ bệnh thối nhũn của chủng VKNS 1.6 21
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG 3
MỤC LỤC 4
I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 4
II. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 5
1. Mục tiêu nghiên cứu 5
2. Đối tượng nghiên cứu 6

3. Phương pháp và cơ chế 6
4. Các giai đoạn tiến hành 7
5. Tính mới, tính thời sự của đề tài 7
6. Ý nghĩa thực tiến của đề tài 7
III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 7
3.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 7
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 7
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu 7
3.1.3. Môi trường dùng trong nghiên cứu 8
3.1.4. Dụng cụ, thiết bị 8
3.2. Phương pháp nghiên cứu 8
3.2.1. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Ecc 8
3.2.2. Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây 11
3.2.3. Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều kiện in vitro
và in vivo 12
3.2.4. Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vị khuẩn gây bệnh thối nhũn và triệu
chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS 13
3.2.5. Phân loại vi khuẩn VKNS và đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng
VKNS 15
3.2.6. Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng VKNS bên trong mô cây chủ 16
3.2.7. Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành) 17
3.3. Kết quả nghiên cứu 17
3.3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn từ củ khoai tây 17
3.3.2. Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên cũ khoai tây trong phòng thí nghiệm
17
3.3.3. Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh 18
3.3.4. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh từ củ khoai tây 19
3.3.5. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy AHLs in vitro và
in vivo 20
3.3.6. Đánh giá khả năng ức chế bệnh thối nhũn trên lát cắt củ khoai tây của chủng

VKNS 1.6 21
3.3.7. Phân loại và đánh giá mức độ an toàn sinh học của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6. .22
3.3.8. Khả năng tồn tại của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 trong mô cây chủ 23
IV. KẾT LUẬN 24
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 25
I. Tài liệu tham khảo tiếng Việt 25
II. Tài liệu tham khảo tiếng Anh 25
I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum, thuộc họ
Solanaceae. Ngày nay, khoai tây trở thành cây lương thực quan trọng, trên khắp
thế giới từ khoai tây người ta đã chế biến ra hàng trăm món ăn khác nhau, thơm
ngon, rẻ tiền, rất bổ dưỡng vì trong khoai tây có chứa các vitamin, khoáng
chất và phân loại của chất phytichemical như carotenoids và phenol tự nhiên
Một củ khoai tây còn vỏ có kích thước trung bình 150g, cung cấp 27 mg vitamin
C (45% giá trị hàng ngày), 620 mg kali (18%), 0.2 mg vitamin B6 (10%) và một
lượng rất nhỏ thiamin, riboflavin, folate, niacin, magie, photpho, sắt, kẽm…
Nghiên cứu còn cho thấy khoai tây không chỉ là lương thực, mà còn là dược
phẩm, có tính chất chữa bệnh. GS.Venket Rao khoa dinh dưỡng Trường đại học
Y Toronto, Canada cho hay, trong khoai tây có nhiều chất chống ôxy hóa. Nó có
khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát triển của ung thư, kích
thích tiêu hóa và chữa viêm tuyến dịch vị và một số bệnh khác. Những nghiên
cứu gần đây còn cho thấy khoai tây rất giàu sterol, giúp tăng cường khả năng
miễn dịch cho cơ thể.
Tuy nhiên, người nông dân đang phải đối mặt với tình trạng gây hại của
sâu, bệnh trên khoai tây, đặc biệt là bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn
Erwinia carotovora subsp. carotovora gây ra. Hiện nay, biện pháp phòng trừ
bệnh chủ yếu là dựa vào các phương pháp truyền thống và sử dụng thuốc trừ sâu
hóa học. Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả cao và đặc biệt
việc sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến
chất lượng nông sản, sức khỏe và môi trường sống của con người. Vì vậy, đề

xuất một biện pháp phòng trừ hiệu quả và thân thiện với môi trường trở thành
vấn đề cấp bách hiện nay.
Vi khuẩn gây bệnh E. carotovora subsp. carotovora sử dụng quorum
sensing (QS) như một cơ chế trao đổi thông tin giữa các tế bào và phụ thuộc mật
độ quần thể. Trong cơ chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai
trò như các chất tự cảm ứng (autoinducer) và cũng là các phân tử tín hiệu có mặt
trong hầu hết các vi khuẩn gây bệnh Gram âm. Theo các nghiên cứu gần đây,
một nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy AHLs qua cơ chế quorum quenching
(QQ) đã được sử dụng trong phòng trừ sinh học bệnh thực vật.
Do vậy, nhóm tác giả tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: "Ứng dụng
vi khuẩn nội sinh phân hủy N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) trong
phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây".
II. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ
1. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập và định danh các chủng vi khuẩn nội sinh phân hủy AHLs có
khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thối nhũn từ khoai tây với hiệu quả
cao và ổn định.
- Thử nghiệm các chủng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh thối nhũn
khoai tây do vi khuẩn Ecc gây ra trên khoai tây
- Tìm ra quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả.
2. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn.
- Mẫu củ khoai tây sạch bệnh.
- Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia cartovora subsp.
carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây
- Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026 có khả năng phản
ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím (violacein).
3. Phương pháp và cơ chế
* Phương pháp nghiên cứu
- Phân lập VKNS và vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp khử trùng bề mặt tiêu

chuẩn.
- Phân loại VKNS và vi khuẩn gây bệnh dựa trên xác định các đặc tính sinh lý
sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA.
- Tuyển chọn các chủng có khả năng phân hủy AHLs in vitro và in vivo theo
phương pháp đồng nuôi cấy với reporter strains Chromobacterium violaceum
CV026.
- Đánh giá độ an toàn sinh học của các chủng VKNS dựa trên cơ sở dữ liệu của
DSMZ.
* Cơ chế
Đề tài tập trung khai thác tiềm năng của vi khuẩn nội sinh ức chế sự phát triển
của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn, làm rõ cơ chế tương tác giữa vi khuẩn nội sinh
và vi khuẩn gây bệnh thông qua phá hủy mạng lưới QS. Vấn đề này không chỉ
có ý nghĩa khoa học đối với một loại bệnh nhất định trên cây trồng mà còn giúp
tạo cơ sở để nghiên cứu điều trị các bệnh trên người do vi khuẩn phụ thuộc tín
hiệu QS gây ra
4. Các giai đoạn tiến hành
Bước 1: Phân lập các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn Ecc
Bước 2: Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây.
Bước 3: Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều
kiện in vitro và in vivo
Bước 4: Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối
nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS
Bước 5: Phân loại, đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng VKNS
Bước 6: Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng VKNS bên trong mô cây chủ
Bước 7: Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành)
5. Tính mới, tính thời sự của đề tài
Ở Việt Nam: Hiện chưa có nghiên cứu nào vè cơ chế gây bệnh của vi khuẩn gây
bệnh thối nhũn cũng như sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng để
phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh trong phòng trừ bệnh thối nhũn do vi
khuản gây hại cây trồng

Trên thế giới: Đã có nhiều nghiên cứu theo hướng này. Hầu hết các nghiên cứu
đều sử dụng vi khuẩn đã được phân lập từ đất hoặc vi khuẩn biểu mô. Do vậy
điểm mới của đè tài này là sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh
6. Ý nghĩa thực tiến của đề tài
Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây góp phần
tạo ra sản phẩm nông sản an toàn, làm giảm sử dụng thuốc hóa học giúp bảo vệ
môi trường, sức khỏe con người và tăng thu nhập cho người nông dân. Trên cơ
sở đó có thể mở rộng ứng dụng để phòng trừ bệnh trên nhiều loài cây trồng khác
nhau.
III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ
3.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 05/2014 đến nay
- Địa điểm: Bộ môn Bệnh Học Phân Tử - Viện Di Truyền Nông Nghiệp
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn.
- Mẫu củ khoai tây sạch bệnh.
- Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia cartovora subsp.
carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây
- Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026 có khả
năng phản ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím
(violacein).
3.1.3. Môi trường dùng trong nghiên cứu
+ Môi trường YPDA dùng trong phân lập và nuôi cấy vi khuẩn: Cao nấm
men 1,5 g; Peptone 0,3 g; Glucose 1,5 g; Nước cất 1000 ml; Agar 20 g; pH 7,2;
Khử trùng 121
o
C trong 15 phút
+ Môi trường LB dùng trong nuôi cấy, thử khả năng phân hủy AHLs:
Tryptone 10g; Cao nấm men 5g; NaCl 5g; Nước cất 1000 ml; Agar 20; pH 7,2;

Kkhử trùng 121ºC trong 15 phút
+ Sữa gầy (skimmed milk) dùng trong bảo quản các chủng vi khuẩn: 10%
skim milk; 0,05 % L-Glutamic Acid; khử trùng 121ºC trong 15 phút
3.1.4. Dụng cụ, thiết bị
Các thiết bị và máy móc của Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền
Nông nghiệp, bao gồm một số thiết bị chính như: tủ cấy an toàn sinh học
NUAIRE (Mỹ), nồi khử trùng OMRON (Nhật Bản), máy ly tâm lạnh
UNIVERSAL (Mỹ), cân điện tử AND (Anh), lò vi sóng, máy chụp ảnh gel, máy
đo pH HORIBA (Nhật Bản), máy PCR, tủ lạnh giữ giống VESTROST (Đan
Mạch), tủ nuôi cấy JEIOTECH (Hàn Quốc), bể điện di MUPID (Nhật Bản), tủ
sấy LENTON (Anh), máy khuấy từ FISHER (Mỹ)…
Dụng cụ: đĩa Petri, Pipette các loại, ống Fancol, ống nghiệm, ống
eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (50, 100, 250 ml), bình Schott, que
cấy…
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Ecc
3.2.1.1. Điều tra và thu thập mẫu bệnh
- Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn được thu thập từ các chợ đầu mối trên
địa bàn Hà Nội và trên các cánh đồng trồng khoai tây khu vực Thường Tín,
Đông Anh, Sóc Sơn.
- Các mẫu bệnh được thu dựa trên triệu chứng thối nhũn điển hình: mô
bệnh bị thối, có màu kem đến màu nâu, ướt, nhũn. Quá trình thối bắt đầu trên bề
mặt củ và ăn sâu vào bên trong. Ranh giới giữa mô bệnh và khỏe rõ ràng bởi
đường viền tối màu hoặc đen (Hình 1). Thường thối nhũn không có mùi trong
giai đoạn đầu phân hủy, nhưng khi có sự xâm nhiễm thứ cấp có mùi rất khó
chịu.
Hình 1: Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn
Mẫu bệnh thu thập được để riêng biệt trong túi báo, bảo quản ở nhiệt độ
4
o

C cho đến khi phân lập vi khuẩn gây bệnh.
3.2.1.2. Phân lập vi khuẩn gây bệnh
Phân lập vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo phương pháp của Furuya
và cộng sự (2002) theo các bước sau:
- Rửa mẫu dưới vòi nước và sau đó xịt cồn 70% trên toàn mẫu.
- Cắt những miếng nhỏ (1x1cm) giữa vùng bị bệnh và vùng không bị bệnh
trên 3 điểm khác nhau của mẫu bệnh, sau đó đặt vào đĩa Petri đã khử trùng.
- Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào sau đó nghiền nát để lấy dịch gốc.
Chuẩn bị 6 ống eppendorf 1.5ml, mỗi ống chứa 900µl nước cất khử trùng.
- Hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từ
ống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6 để được các nồng độ
pha loãng.
- Lấy 100µl từ các ống eppendorf với 6 nồng độ đã được pha loãng nhỏ
lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trang đều trên bề mặt đĩa.
- Để mẫu trong tủ 28
o
C, sau 24 giờ kiểm tra khuẩn lạc. Mô tả đặc điểm
của các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi trường YPDA mới.
- Bảo quản các chủng vi khuẩn đã phân lập được trong sữa tách béo 10%
ở -20
o
C để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1.3. Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên củ khoai tây trong phòng
thí nghiệm
Độc tính của các tác nhân gây bệnh được đánh giá trong phòng thí nghiệm
bằng phương pháp lây nhiễm trực tiếp lên lát cắt củ khoai tây (Nguyễn Thanh Hà
và cs., 2013) theo các bước sau:
- Củ khoai tây được rửa sạch dưới vòi nước chảy. Xịt cồn 70% lên bề mặt
của củ. Sau đó, củ khoai tây được cắt thành những lát có chiều dầy khoảng 1cm
và đặt trong đĩa petri.

- Dùng đầu tăm nhọn đã khử trùng lấy nguồn khuẩn nhiễm đã được cấy
trên YPDA sau 24 giờ, đâm đều xung quanh lát cắt khoai tây, mỗi lần lấy nguồn
khuẩn nhiễm sử dụng cho 2-3 lỗ châm.
- Đối chứng dương được sử dụng là chủng vi khuẩn Erwinia carotovora
subsp. carotovora ATCC175713
T
(Ecc), gây bệnh thối nhũn điển hình. Đối
chứng âm được sử dụng với nước cất khử trùng.
- Mẫu khoai tây sau khi nhiễm được đặt trên giấy thấm ẩm trong đĩa Petri
và ủ ở 28
o
C. Quan sát triệu chứng và mức độ biểu hiện bệnh sau 24h, 48h. Mỗi
chủng vi khuẩn được lây nhiễm trên 3 lát cắt. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.2.1.4. Xác định khả năng sản sinh AHLs
Khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo
phương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) (Hình 2) với một số
thay đổi như sau:
- Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và Ecc được cấy trên môi trường LB và
YPDA tương ứng và ủ ở 28
o
C trong 48 giờ.
- Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở
28
o
C trong 24 giờ.
- Các chủng vi khuẩn được cấy vạch thành một đường trên môi trường
LB, kèm sát bên phải là chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng được cấy vạch
thành một đường, tạo thành 2 đường cấy song song.
- Đối chứng dương gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau. Đối chứng
âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt.

- Mẫu được để trong tủ 28
o
C. Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết
quả được thể hiện sau 24 giờ.
• Cách đọc kết quả:
- Dương tính (+): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 chuyển màu
tím.
- Sản sinh AHLs yếu (±): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 có
màu tím nhạt hơn.
- Âm tính (-): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 không chuyển
màu tím (màu của khuẩn lạc vi khuẩn).
Hình 2: Thí nghiệm thử khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn
3.2.2. Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây
3.2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu khoai tây sạch bệnh thu thập từ các chợ đầu mối trên địa bàn Hà Nội
và các vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông Anh.
3.2.2.2. Phương pháp phân lập
Phân lập VKNS được tiến hành theo phương pháp của Furuya và cộng sự
(2002) với một số thay đổi như sau:
Mẫu củ khoai tây được rửa sạch dưới vòi nước để phục vụ cho việc phân
lập. Ngâm củ khoai tây trong cồn 70% trong 3 phút và dung dịch Sodium
hypochlorite (3% Cl-) trong 5 phút. Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng.
Nghiền mẫu trong đĩa petri khử trùng. Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào dịch
nghiền và trộn đều để tạo dịch gốc. Chuẩn bị 6 ống pendorf 1.5ml, mỗi ống
chứa 900µl nước cất khử trùng. Hút 100 µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp
tục hút 100 µl dịch từ ống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6
để được các nồng độ pha loãng. Lấy 100 µl từ các ống pendorf với 6 nồng độ đã
được pha loãng nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trà đều trên bề
mặt đĩa. Để mẫu trong tủ 28
o

C, sau 24h kiểm tra khuẩn lạc. Mô tả đặc điểm của
các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi trường YPDA mới. Bảo quản
các chủng VKNS phân lập được trong sữa gầy (skimmed milk) 10% ở -20
o
C để
tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều
kiện in vitro và in vivo
Khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo
phương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) (Hình 3) với một số
thay đổi như sau:
- Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn
Ecc được cấy trên môi trường LB và YPDA tương ứng và ủ ở 28
o
C trong 48h.
- Các chủng VKNS được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở 28
o
C trong
24h.
- Các chủng VKNS được cấy vạch thành một đường trên môi trường, kèm
sát hai bên là chủng vi khuẩn Ecc và chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng được
cấy vạch thành một đường, tạo thành 3 đường cấy song song.
- Đối chứng dương chỉ gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau; Đối
chứng âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt
- Mẫu được để trong tủ 28
0
C.
Lưu ý: Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết quả được thể hiện sau
24h.
• Cách đọc kết quả:

- Dương tính (+): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 có màu tím
sẫm
- Phân hủy AHLs một phần (±): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị
CV026 có màu tím nhạt
- Âm tính (-): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị không màu (màu của
khuẩn lạc vi khuẩn) (Hình 3).
Hình 3: Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs
3.2.4. Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vị khuẩn gây bệnh thối
nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS
3.2.4.1. Chuẩn bị lát cắt củ khoai tây
- Rửa củ khoai tây dưới vòi nước chảy cho hết bùn đất và để ráo nước.
- Cắt lát khoai tây và khoan một lỗ trên mỗi lát cắt khoai tây (sử dụng
khoan đục lỗ thạch).
- Khử trùng bề mặt lát cắt khoai tây với cồn 70% trong 3 phút, tiếp theo
NaClO (3% Cl
-
) + 1 - 2 giọt Tween 20 trong 5 phút. Tráng sạch bằng nước cất
khử trùng 3 lần.
- Thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Đặt mỗi lát cắt khoai tây vào mỗi
đĩa Petri.
3.2.4.2. Chuẩn bị dịch vi khuẩn
- Chuẩn bị ống eppendorf (1.5ml) chứa 1000µl nước cất khử trùng. Dùng
que cấy lấy 1 - 2 đầu que cấy vi khuẩn (VKNS và vi khuẩn gây bệnh Ecc) đã
nuôi trên đĩa Petri cho vào ống nước cất, trộn kỹ trên máy vortex cho đến khi tạo
thành dịch khuẩn đục (khoảng 10
8
-10
9
cfu/ml)
3.2.4.3. Lây nhiễm

Phương pháp lây nhiễm được tiến hành như mô tả của Molina và cs
(2003).
• Phươn pháp 1: nhiễm trộn VKNS và Ecc
Ba lát cắt khoai tây cho mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm, đặt trong 3 đĩa
Petri riêng biệt.
Chuẩn bị hỗn hợp dịch khuẩn: 25µl dịch vi khuẩn nội sinh và 25µl vi
khuẩn gây bệnh Ecc trộn đều vào nhau.
Đối chứng âm: 50µl nước cất vô trùng; Đối chứng vi khuẩn gây bệnh
Ecc: 25µl nước cất vô trùng + 25µl dịch khuẩn Ecc.
Đĩa thí nghiệm: Dùng hỗn hợp dịch khuẩn nhỏ đều xung quanh thành lỗ
khoan. Ủ mẫu trong 28
o
C và kiểm tra sau 24h.
• Phương pháp 2: nhiễm VKNS trước 24h và nhiễm Ecc sau
Đối chứng âm: 50µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 50µl nước cất vô
trùng; Đối chứng Ecc: 50µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 50µl Ecc.
Đĩa thí nghiệm: Nhỏ trước 50µl VKNS và sau 24h sau tiến hành nhỏ tiếp
50µl Ecc vào thành lỗ khoan. Ủ mẫu 28
o
C và kiểm tra sau 48h.
• Phương pháp 3: nhiễm Ecc trước 24h và nhiễm VKNS sau
Đối chứng âm: 50µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 50µl nước cất vô
trùng; Đối chứng Ecc: 50µl Ecc, sau 24h thêm 50µl nước cất vô trùng.
Đĩa thí nghiệm: Nhỏ trước 50µl Ecc và sau 24h sau tiến hành nhỏ tiếp
50µl VKNS vào thành lỗ khoan. Ủ mẫu 28
o
C và kiểm tra sau 48h.
3.2.4.4. Đọc kết quả
- Đọc kết quả sau 48h ủ ở 28
o

C.
- Đánh số các đĩa 1, 2, 3 (mỗi chủng 3 đĩa). Cân từng miếng khoai tây đã
lây nhiễm và ghi kết quả.
- Rửa nhẹ dưới vòi nước chảy để loại bỏ hết phần thối. Cân lại trọng
lượng lát cắt khoai tây sau khi rửa và ghi kết quả.
3.2.4.5. Phân tích kết quả
Nhập kết quả trọng lượng lát cắt củ khoai tây vào Excel và tính trọng
lượng của mô thối đã rửa.
Xử lý số liệu phân tích phương sai ANOVA bằng phần mềm Statview
version 5.0.1 (SAS Institute Inc.) để tìm ra mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê
của trọng lượng mô thối của lát cắt khoai tây xử lý VKNS và không xử lý
VKNS.
3.2.5. Phân loại vi khuẩn VKNS và đánh giá mức độ an toàn sinh học của các
chủng VKNS
3.2.5.1. Phương pháp phân loại các chủng VKNS
Phản ứng nhân gen PCR và giải trình tự gen sử dụng primer F27 5’-
AGAGTTTATCMTGGCTCAG-3’ và R1492 5’-GRTACCTTGTTACGACTT-
3’. Giải trình tự gen 16S rRNA trực tiếp từ phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp Big
Dye và tiến hành trên máy ABI Sequence Detector System SDS 7700. Trình tự
gen 16S rRNA được phân tích bằng chương trình BLAST
(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) dựa vào cơ sở dữ liệu của NCBI (National
Center for Biotechnology Information).
3.2.5.2. Phương pháp đánh giá độ an toàn sinh học của các chủng VKNS
Đánh giá độ an toàn sinh học của các chủng vi khuẩn nội sinh dựa trên
Phân nhóm Prokaryotes (Vi khuẩn và vi khuẩn cổ) thành các nhóm nguy cơ (risk
group) trong Các quy định kỹ thuật đối với tác nhân sinh học (Technical Rules for
Biological Agents-TRBA466) công bố bởi Ủy ban về các tác nhân sinh học của
Cộng hòa LB Đức (TRBA 466, 2010) và theo Hướng dẫn số 2000/54/EC của Hội
đồng và Nghị viện Châu Âu về bảo vệ người lao động khỏi nguy cơ khi tiếp xúc
với các tác nhân sinh học. (Directive 2000/54/EC of the European Parliament and

Council of 18.09.2000 on the protection of workers from risks related to exposure
to biological agents at work). Theo Thông tư số 07 /TT-BYT ngày 14 tháng 5 năm
2012) Danh mục vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm theo nhóm nguy cơ và cấp độ
an toàn sinh học phù hợp kỹ thuật xét nghiệm.
Các loài vi khuẩn được phân thành 4 nhóm nguy cơ trong đó:
Nhóm 1: Không gây bệnh cho người
Nhóm 2: Có thể gây bệnh cho người nhưng không thể lan truyền trong
cộng đồng, thường có biện pháp điều trị nếu nhiễm phải.
Nhóm 3: Có thể gây bệnh cho người và tiềm ẩn nguy cơ lan truyền trong
cộng đồng, có biện pháp điều trị nếu nhiễm phải.
Nhóm 4: Gây bệnh nặng cho người và có nguy cơ cao lan truyền trong
cộng đồng, chưa có biện pháp điều trị thích hợp.
Dựa vào kết quả phân loại vi khuẩn ở trên, nếu xác định loài vi khuẩn
không thuộc nhóm nguy cơ nào hoặc thuộc nhóm 1 thì tiếp tục sử dụng cho các
nghiên cứu tiếp theo; nếu các loài vi khuẩn thuộc nhóm nguy cơ 2, 3 và 4 thì
ngừng sử dụng và tiêu hủy các chủng này bằng khử trùng ở nhiệt độ cao 2 lần
liên tiếp sau 24 giờ.
3.2.6. Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng VKNS bên trong mô cây chủ
3.2.6.1. Chuẩn bị củ khoai tây
- Rửa củ khoai tây dưới vòi nước chảy cho hết bùn đất và để ráo nước;
khử trùng bề mặt củ khoai tây với cồn 70% trong 3 phút và tráng sạch bằng
nước cất khử trùng 3 lần.
- Để củ khoai tây khô tự nhiên, sau đó đặt các củ khoai tây vào rổ nhựa
lưới và để ở nhiệt độ phòng.
3.2.6.2. Chuẩn bị dịch vi khuẩn
- Chuẩn bị 500ml dịch huyền phù vi khuẩn nội sinh (mật độ khoảng 10
6
-
10
7

cfu/ml).
3.2.6.3. Lây nhiễm
- Đối chứng âm: củ khoai tây được ngâm trong 500ml nước cất vô trùng
trong 30 phút.
- Thí nghiệm: củ khoai tây được ngâm trong 500ml dịch khuẩn nội sinh
trong 30 phút; Mỗi chủng nội sinh sử dụng 3 củ khoai tây, đặt trong rổ nhựa lưới
và giữ ở nhiệt độ phòng.
3.2.6.4. Đánh giá kết quả thí nghiệm
- Mỗi củ khoai tây được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 3 phút và
rửa 3 lần với nước cất vô trùng trong box cấy.
- Từ mỗi củ khoai tây cắt 3 miếng có kích thước 2,0x2,0 cm và cân trọng
lượng của 3 lát cắt, sau đó dùng dao mổ cắt thành từng miếng nhỏ trong 1ml
nước cất vô trùng.
- Chuẩn bị 3 ống eppendorf, mỗi ống cho 900µl nước cất vô trùng. Sau
khi nghiền mẫu, hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl
dịch từ ống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 3 để được các
nồng độ pha loăng. Lấy 100µl từ các ống eppendorf ở 3 nồng độ đã được pha
loãng nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trà đều trên bề mặt đĩa. Để
mẫu trong tủ 28
0
C, sau 48h kiểm tra và đếm số lượng khuẩn lạc.
3.2.7. Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành)
3.3. Kết quả nghiên cứu
3.3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn từ củ
khoai tây
Từ 10 mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn điển hình được thu thập từ các chợ
đầu mối trên địa bàn Hà Nội và các vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông
Anh, Sóc Sơn, phân lập được 98 chủng vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn phân lập
được có hình thái khuẩn lạc và màu sắc đa dạng (Hình 4)
Hình 4: Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 trên môi

trường YPDA sau 24 giờ nuôi cấy ở 28oC
Các chủng vi khuẩn này được đặt tên theo thứ tự mẫu bệnh thu được ở các
đợt khác nhau và được làm thuần bằng cách cấy truyền các khuẩn lạc tách rời
nhau khi phát triển trên môi trường YPDA. Sau 3 lần cấy truyền liên tiếp từ một
khuẩn lạc thu được chủng vi khuẩn thuần. Bảo quản các chủng vi khuẩn gây bệnh
phân lập được trong sữa tách béo 10% ở -20
o
C để tiến hành các thí nghiệm tiếp
theo.
3.3.2. Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên cũ khoai tây trong phòng
thí nghiệm
Sau khi lây nhiễm 98 chủng vi khuẩn trên củ khoai tây sạch bệnh để đánh
giá độc tính của chúng, thu được 10 chủng thể hiện độc tính mạnh trên lát cắt củ
khoai tây (Bảng 1). Các chủng vi khuẩn này được bảo quản bằng sữa tách béo
10% ở nhiệt độ -20
o
C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 1: Độc tính của các chủng vi khuẩn phân lập được từ củ khoai tây bị
bệnh thối nhũn
STT Chủng vi khuẩn Độc tính
Sau 24h Sau 48h
1 P.1.3 ++ +++
2 P.1.5 + ++
3 P.2.4.5 ++ +++
4 P.2.5.1 ++ +++
5 P.2.5.3 ++ +++
6 P.2.6.1 + ++
7 P.4.5.5 ± +
8 P.4.5.6 ++ +++
9 P.4.6.2 ++ +++

10 P.4.6.3 - ±
Chú thích:
1. Không có biểu hiện bị bệnh: -
2. Biểu hiện bệnh yếu: ±
3. Biểu hiện bệnh nhẹ: +
4. Biểu hiện bệnh nặng: ++
5. Biểu hiện bệnh rất nặng: +++
Hình 5: Triệu chứng bệnh sau khi tái nhiễm chủng P.2.6.1 trên khoai tây
sau 24h
3.3.3. Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh
Trong số 98 chủng vi khuẩn phân lập, thu được 6 chủng có khả năng sản
sinh AHLs (Bảng 2). Hai chủng P.2.5.1 và P.2.6.1 vừa có khả năng sản sinh
AHLs vừa thể hiện độc tính mạnh trên lát cắt củ khoai tây. Chủng P.2.6.1 được
lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình .
Bảng 2: Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh
STT
Chủng vi
khuẩn
Độc tính trên lát cắt củ
khoai tây
Khả năng sản sinh
AHLS chuỗi ngắn
1 P.2.5.1 +++ +
2 P.2.6.1 ++ +
3 P.2.6.3 - +
4 P.3.4.7 - +
5 P.3.5.1 - +
6 P.4.5.5 + +
7 P.4.5.6 +++ -
8 P.8.6.5 - -

Chú thích:
( + ): Khả năng sản sinh AHLs mạnh
( ± ): Khả năng sản sinh AHLs yếu
( - ) : Không có khả năng sản sinh AHLs
Hình 6: Khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn của chủng vi khuẩn gây bệnh
P.2.6.1
3.3.4. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh từ củ khoai tây
Từ 25 mẫu củ khoai tây sạch bệnh được thu thập từ các chợ đầu mối trên
địa bàn Hà Nội và một số vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông Anh, chúng
tôi đã phân lập, tuyển chọn được 100 chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc và
màu sắc đa dạng.
Các chủng VKNS này được thu mẫu ở các lần khác nhau và được cấy
truyền các khuẩn lạc tách rời nhau khi phát triển trên môi trường YPDA. Sau 3 lần
cấy truyền liên tiếp từ một khuẩn lạc thu được chủng vi khuẩn thuần. Bảo quản các
chủng VKNS phân lập được trong sữa tách béo 10% ở nhiệt độ -20
o
C để tiến hành
các thí nghiệm về khả năng phân hủy AHLs tiếp theo.
3.3.5. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy AHLs
in vitro và in vivo
Từ 100 chủng VKNS được phân lập từ củ khoai tây sạch bệnh, sau khi
tiến hành tuyển chọn khả năng phân hủy AHLs của chủng vi khuẩn gây bệnh
Ecc P.2.6.1 bằng phương pháp nuôi cấy vạch song song, đã xác định được 6
chủng có khả năng phân hủy AHLs và ổn định nhất là chủng Ep 1.6 (Bảng 3).
Chủng Ep 1.6 sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3: Các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs
Chú thích
+ : Khả năng phân hủy AHLs mạnh
± : Khả năng phân hủy AHLs yếu
- : không có khả năng phân hủy AHLs

STT Ký hiệu Khả năng phân hủy AHLs
1 Ep 1.6 +
2 Ep 1.9 ±
3 Ep 1.10 ±
4 Ep 1.13 ±
5 Ep 2.1 +
6 Ep 2.7 ±
Hình 7: Các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs chuỗi ngắn
3.3.6. Đánh giá khả năng ức chế bệnh thối nhũn trên lát cắt củ khoai tây của
chủng VKNS 1.6
Hiệu lực phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây của chủng 1.6 được tiến
hành sử dụng chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1. Đây là chủng gây bệnh có độc
tính mạnh đã phân lập, tuyển chọn từ mẫu khoai nhiễm bệnh thu thập được.
Thí nghiệm cũng được tiến hành bởi 3 phương pháp lây nhiễm:
- Phương pháp 1: Lây nhiễm đồng thời vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn
gây bệnh
- Phương pháp 2: Lây nhiễm vi khuẩn nội sinh trước 24h sau đó lây nhiễm
vi khuẩn gây bệnh
- Phương pháp 3: Lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh trước 24h sau đó lây nhiễm
vi khuẩn nội sinh
Bảng 4: Hiệu lực phòng trừ bệnh thối nhũn của chủng VKNS 1.6
STT Công thức
Phương pháp lây nhiễm
1 2 3
1 P2.6.1 7.04 ± 0.65 6.54 ± 2.74 6.4 ± 0.22
2 P2.6.1 + 7.9 5.7 ± 1.05 4.77 ± 0.32 6.1 ± 1.46
3 P2.6.1 + 1.6 0.1 ± 0.09
*
2.9 ± 0.84
*

0.16 ± 0.06
*
(*): Sai khác có ý nghĩa giữa công thức xử lý VKNS và đối chứng P2.6.1
Chủng 1.6 có ý nghĩa trong phòng trừ bệnh thối nhũn trên khoai tây do
chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 cụ thể: chủng vi khuẩn nội sinh này làm giảm
trọng lượng mô thối nhiễm bệnh từ 75 - 90% so với công thức đối chứng không xử
lý vi khuẩn nội sinh (ở cả 3 phương pháp lây nhiễm) (Bảng 4).
3.3.7. Phân loại và đánh giá mức độ an toàn sinh học của chủng vi khuẩn nội
sinh 1.6
3.3.7.1. Phân loại các chủng VKNS
Chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 có hiệu quả ức chế bệnh thối nhũn trên củ
khoai tây được lựa chọn để xác định vị trí phân loại dựa vào giải trình tự gen
16S rADN. Sau khi tách chiết ADN genome vi khuẩn, phản ứng nhân gen
(PCR) vùng 16S rADN sử dụng cặp mồi F27 và R1492 được tiến hành trên
ADN khuôn của vi khuẩn. Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose
0.8 %. Kết quả điện di cho thấy đã nhân bản thành công được một đoạn ADN có
kích thước khoảng 1,5 kb (Hình 8).
Hình 8: Sản phảm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng VKNS
Dựa vào kết quả giải trình tự gen 16S rRNA sử dụng trực tiếp sản phẩm
PCR được tinh sạch và so sánh với các trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn trên
Ngân hàng gen (GenBank) sử dụng BLASTN, đã xác định được vị trí phân loại
của chủng VKNS 1.6 cụ thể như sau: trình tự gen 16S rDNA của chủng 1.6
tương đồng đến 100% so với của chủng Bacillus thuringiensis KJ524494.
3.3.7.2. Mức độ an toàn sinh học của chủng VKNS 1.6
Dựa vào Quy định kỹ thuật đối với các tác nhân sinh học (Technical
Rules for Biological Agents) TRBA số 466 xuất bản năm 2010 của Ủy ban về
các tác nhân sinh học của Cộng hòa LB Đức và Hướng dẫn số 2000/54/EC của
Hội đồng và Nghị viện Châu Âu về bảo vệ người lao động khỏi nguy cơ khi tiếp
xúc với các tác nhân sinh học. Theo Thông tư số 07 /TT-BYT ngày 14 tháng 5
năm 2012) Danh mục vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm theo nhóm nguy cơ và

cấp độ an toàn sinh học phù hợp kỹ thuật xét nghiệm thì chủng vi khuẩn nội sinh
1.6 được đánh giá thuộc nhóm nguy cơ 1, có nghĩa là vi khuẩn không có khả
năng gây bệnh cho người.
3.3.8. Khả năng tồn tại của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 trong mô cây chủ
Vi khuẩn nội sinh đối kháng có mối quan hệ mật thiết với cây chủ, chúng
có khả năng tồn tại với mật độ cao trong mô của củ khoai tây. Mục tiêu của
nghiên cứu này nhằm khẳng định chính xác các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao
trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây là những chủng nội sinh thực vật. Kết
quả thí nghiệm được đánh giá sau 1 tuần bảo quản củ khoai tây nhiễm VKNS ở
nhiệt độ phòng. Chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 có hoạt lực phòng trừ bệnh cao, với
khả năng xâm nhập, tồn tại và phát triển trong mô cây chủ với mật độ khá cao,
cụ thể với mật độ tế bào vi khuẩn nội sinh đạt 4,6x10
4
cfu/g sinh khối tươi. Đây
là chủng vi khuẩn nội sinh rất có triển vọng trong phòng trừ bệnh thối nhũn
khoai tây và là nguyên vật liệu để sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ sản xuất
nông nghiệp.
IV. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:
- Từ 10 mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn điển hình, đã phân lập được 98
chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc đa dạng. Trong số 98 chủng vi khuẩn
phân lập được thì có 6 chủng có khả năng sản sinh AHLs. Trong số 6 chủng vi
khuẩn này, có 2 chủng P.2.5.1 và P.2.6.1 sản sinh AHLs và có khả năng gây
bệnh thối nhũn trên lát cắt củ khoai tây.
- Từ 25 mẫu củ khoai tây sạch bệnh đã phân lập được 100 chủng VKNS.
Trong số đó, đã tuyển chọn được duy nhất chủng VKNS 1. 6 có khả năng phân
hủy AHLs chuỗi ngắn và có khả năng phòng trừ bệnh thối nhũn trên lát cắt củ
khoai tây với hiệu quả cao. Chủng 1.6 này có khả năng tồn tại trong mô củ khoai
tây với mật độ cao từ 10
3

đến 10
4
cfu/g sinh khối tươi.
- Đã định danh được chủng VKNS 1.6 dựa trên giải trình tự gen 16S
rRNA và chủng này đều đảm bảo mức độ an toàn sinh học và thuộc nhóm nguy
cơ 1 không có khả năng gây bệnh cho người.
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tham khảo tiếng Việt
1. Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999, “Bệnh vi khuẩn và virus hại cây
trồng”. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội,tr. 7 – 118.
2. Nguyễn Thị Thanh Hà, 2006, “Phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora
subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) bằng phương pháp PCR”,
tr. 20-24.
3. Phạm Xuân Tùng (2000), “Sản xuất khoai tây ở Việt Nam”, Trung tâm
nghiên cứu cây Lương thực Đà Lạt
II. Tài liệu tham khảo tiếng Anh
1. Furuya N., Taura S., Thuy B. T., Matsumoto M., Aye S. S. and Ton P. H.
(2002). Isolation and preservation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae
from Vietnam in 2001-2002. Bull Inst Trop Agr, Kyushu Univ, 25, pp. 43-
50.
2. McClean KH, Winson MK, Fish L, Taylor A and others (1997). Quorum
sensing in Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein
production and inhibition for the detection of N-acyl-homoserine lactones.
Microbiology 143:3703–3711.
3. Molina L., Constantinuescu F., Michel L.,Reimmann C.,Duffy B. and
Défago G. (2003). Degradation of pathogen quorum-sensing molecules
by soil bacteria: a preventive and curative biological control mechanisn.
FEMS Microbiology Ecology, 45, pp. 71-81.
4. Morohoshi T., Kato M., Fukamachi K., Kato N. and Ikeda T. (2008). N-
acyl homoserine lactone regulates violacein production in

Chromobacterium violaceum type strain ATCC12472. FEMS Microbiol
Lett, 279(1), pp. 124-130.
5. Park SJ, Park SY, Ryu CM, Park SH, Lee JK. (2008). The role of AiiA, a
quorum-quenching enzyme from Bacillus thuringiensis, on the
rhizosphere competence. Journal of Microbiology and Biotechnology
18(9):1518-21.
6. Uroz, S., D’Angelo-Picard, C., Carlier, A., Elasri, M., Sicot, C., Petit, A.,
Oger, P., Faure, D. & Dessaux, Y. (2003). Novel bacteria degrading N-
acylhomoserine lactones and their use as quenchers of quorum-sensing-
regulated functions of plant-pathogenic bacteria. Microbiology 149, 1981-
1989.