báo cáo nghiên cứu chiết tách kaempferol từ lá chè việt nam

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI
TRƯỜNG THPT CHUYÊN NGUYỄN HUỆ - HÀ ĐÔNG
**************
ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT
DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC
LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015).
Đề tài:
“ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT KAEMFEROL
TỪ LÁ CHÈ VIỆT NAM “
Lĩnh vực: HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
HD1:
- Th.S.Nguyễn Đức Thanh
- Đơn vị công tác: Học viện Quân Y
HD2:
-Th.S Kim Phương Hà
- Đơn vị công tác: Trường THPT chuyên Nguyễn
Huệ
TÁC GIẢ:
1. Chu Tấn Kiệt Lớp:11 Hóa 1
2. Phạm Ngọc Diệu Anh Lớp:11 Anh 1
Hà Nội, tháng 11 năm 2014

PHẦN 1
LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Tuy có diện tích trồng chè xanh rất lớn, chất lượng vào loại tốt nhất thế giới
nhưng nước ta chỉ chú trọng vào việc sử dụng làm đồ uống mà bỏ qua
Kaempferol, một hoạt chất quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh ung thư –
căn bệnh nan y của thế giới.
Sau khi được học xong bài tách chiết các chất hữu cơ, cùng với các tư liệu
mà các thầy cô giáo cung cấp, chúng em thấy việc tách Kaempferol là không khó

nên chúng em quyết định thực hiện ý tưởng này.
Mục đích đề tài của chúng em là chiết tách kaempferol từ lá chè xanh nhằm
tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có trong nước, góp phần giảm bớt giá
thành thuốc chữa ung thư – thường có giá rất cao. Đồng thời nếu thành công và
ứng dụng trong thực tế chúng ta còn có thể chủ động nguồn nguyên liệu trong
nước mà không phụ thuộc vào nước ngoài.
Từ những lý do trên, nhóm chúng em đã chọn đề tài: " NGHIÊN CỨU CHIẾT
TÁCH KAEMPFEROL TỪ LÁ CHÈ VIỆT NAM"
PHẦN 2
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về đề tài
Thực trạng bệnh ung thư: Theo thông tin từ Bộ Y tế Việt Nam và Tổ chức Y
tế Thế giới (WHO), hàng năm, Việt Nam có khoảng 150.000 -200.000 người mắc
bệnh ung thư mới và khoảng 75.000 - 100.000 người tử vong vì căn bệnh này. Ung
thư hiện nay đang là nguyên nhân thứ hai gây tử vong ở Việt Nam và thực sự là
mối quan tâm của cả quốc gia.
Kaempferol là một trong những dược chất được các nhà nghiên cứu trên
thế giới và Việt Nam nghiên cứu trong việc điều trị và phòng tránh nhiều bệnh ung
thư như: ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư khoang miệng…
Qua nhiều nguồn tin điện tử và sách báo, chúng em được biết rằng ở nước
ta có nhiều loài cây có chứa Kaempferol như: Bạch quả, Bạch thược, Bát giác liên,
Bòng bong, Bóng nước, Bông, Cây cứt lợn, Chàm lá nhỏ, Chè, Cỏ lào, Dầu giun, Đại
táo, Đào, Đậu tây, Đơn lá đỏ, Địa liền…Vì vậy, chúng em mong muốn thực hiện đề
tài chiết tách Kaempferol từ các loài cây gần gũi và phổ biến ở Việt Nam.
2.2. Tính mới của đề tài:
Ở Việt Nam chưa có đề tài nào nghiên cứu tách chiết Kaempferol từ lá chè xanh.
PHẦN 3
QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ
3.1. Hóa chất, thiết bị, nguyên liệu:
3.1.1. Nguyên liệu:

Lá chè xanh tươi được thu mua tại Hoà Bình, loại tạp, sau đó đem phơi khô.
Bảo quản nơi khô ráo
3.3.2. Hóa chất nghiên cứu:
TT Tên hóa chất Nguồn gốc
1 Methanol Merck
2 Cloroform Trung Quốc
3 Ethyl acetat Trung Quốc
4 Aceton Merck
5 Silicagel Trung Quốc
6 Sephadex LH20 Singapore
7 Natri clorua Trung Quốc
8 Natri sunphat Trung Quốc
9 Nước cất Viện KNVSATTP quốc gia
3.3.3. Thiết bị nghiên cứu:
Các thiết bị dụng cụ tại Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc
gia, Học viện Quân y, Viện Hoá học - Viện hàn lâm khoa học Việt Nam gồm có:
Máy móc
– Máy cất quay chân không Eyela (Nhật Bản)
– Tủ sấy Memmert (Đức).
– Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức).
– Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S ( Thụy Sỹ).
– Máy cất quay chân không Büchi R-220 (Thụy Sỹ).
– Bếp ôm bình cầu có bảo ôn Heating Mantle (Trung Quốc).
– Máy đo nhiệt độ nóng chảy Memmert (Đức).
– Máy UV – VIS (Nhật).
– Thiết bị xác định phổ hồng ngoại (IR) Perkin Elmer.
– Thiết bị xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500 FT-
NMR Spectrometer.
– Thiết bị xác định phổ khối lượng Varian 320 MS (Mỹ).
– Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản)

Dụng cụ
– Phễu chiết 500mL và 1000mL ( Đức)
– Pipet
– Ống đong 100mL ( Đức)
– Cột thủy tinh
– Bình hút ẩm
– Bình cô quay 100mL, 250mL và 500mL
– Và các dụng cụ thuỷ tinh khác…
3.2. Khảo sát quá trình chiết xuất flavonoid từ lá chè xanh
Lá chè xanh được đem sấy ở 60
0
C trong 24h, sau đó đem xay thành bột rồi
đem chiết xuất theo quy trình như sau:
Cân 100g lá chè rồi cho vào bình cầu 2L. Cho thêm 1L MeOH ở các nồng độ
khác nhau (60%, 70%,80%). Ngâm trong khoảng 6 giờ rồi rút dịch chiết lần thứ
nhất. Thực hiện ngâm bã dược liệu trên với 500ml MeOH trong khoảng 2 giờ rồi
rút dịch chiết lần thứ hai. Gộp các dịch chiết methanol, cô cạn dung môi dưới áp
suất giảm bằng máy hút chân không thu được cắn. Thêm một ít nước nóng vào
hòa tan cắn bám quanh thành ống nghiệm sau cô cạn. Kết quả thu được dung
dịch có màu xanh lá đậm.
Dung dịch được xử lý theo 2 cách:
Cách 1 (không acid hoá): Lắc đều 3 lần với CHCl
3
với thể tích của CHCl
3
mỗi
lần 50mL. Cả 3 lần đều lọc bỏ phần phân lớp màu xanh lắng xuống. Cho HCl 10%
vào để cân bằng pH của dung dịch về khoảng 3 – 4 sau đó đem chiết tiếp với
etylacetat mỗi lần 50mL. Lọc dịch chiết etylacetat, cho bột Na
2

SO
4
khô để hút
nước rồi cô cạn dưới áp suất giảm thu được cắn flavonoid toàn phần.
Cách 2 (acid hoá): Cho 10mL HCl đậm đặc vào dung dịch, thủy phân trong
khoảng 8 tiếng rồi cho dung dịch thu được vào bình chiết. Sau đó tiến hành tương
tự như phương pháp 1.
Sau khi thực hiện theo các cách đem đi xác định khối lượng cắn flavonoid
toàn phần. Mỗi thí nghiệm lặp 3 lần và lấy kết quả trung bình.
Bảng1. Kết quả khảo sát hàm lượng cắn flavonoid toàn phần từ lá chè
Dung môi
Hàm lượng cắn flavonoid thu được (g)
Cách 1 Cách 2
Methanol 60% 2,55 3,55
Methanol 70% 2,99 3,87
Methanol 80% 3,08 4,00
Nhận xét:
Ở cả 2 phương pháp chiết, dung môi chiết xuất là methanol 80% đều cho
hiệu suất cao nhất và ở các trường hợp dịch chiết được acid hoá cho hiệu quả tốt
hơn.
Sau khi thu được cắn flavonoid toàn phần, chúng em tiến hành xác định
xem trong đó có chứa kaempferol hay không bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
(TLC) với các điều kiện như sau: Bản mỏng silica gel GF
254
(Merck) được hoạt hóa ở
110
0
C trong 1 giờ. Hệ dung môi triển khai: Toluen : Ethyl acetat : Acid formic (5 : 4:
1). Hiện vết bằng hơi ammoniac bão hòa .
Kết quả:

Trên sắc ký đồ cho thấy các vết đã được tách rõ ràng. Các vết này đậm màu
hơn khi hơ trên miệng lọ amoniac đặc, chứng tỏ trong đó có chứa hỗn hợp nhiều
flavonoid. Vết trên cùng (có Rf là 0,54) tương ứng với vết Kaempferol chuẩn,
chứng tỏ trong hỗn hợp này có chứa kaempferol.

Hình 1. Kết quả sắc ký lớp mỏng cắn flavonoid
Như vậy, có thể khẳng định trong cắn flavonoid toàn phần chiết được có
chứa kaempferol. Chúng em tiếp tục đem các mẫu cắn đi xác định hàm lượng
kaemprefol, nhằm mụch đích tối ưu hoá quá trình lựa chọn dung môi chiết.
Tiến hành như sau: Cân một lượng chính xác cắn EtOAc, hòa tan trong
methanol, định mức thành 25 ml dung dịch. Lọc qua màng lọc kích thước 0,45
μm. Dung dịch này được bơm vào hệ thống HPLC với điều kiện sắc kí như sau: Cột
sắc kí ODS-3 (250mm x 4,6mm x 5μm), nhiệt độ cột 40
0
C, detector DAD, λ = 370
nm, pha động: đệm phosphat 10mM, pH = 2,5: Acetonitril (60 : 40), tốc độ dòng
pha động: 1,2 ml/phút, thể tích bơm mẫu là 50μl, thời gian chạy sắc kí 12 phút.
Với mỗi cắn EtOAc, tiến hành định lượng 3 mẫu, tính kết quả trung bình.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900

1000
1100
1200
mAU
366nm,4nm (1.00)
/14.797/8413554
Hình 2. Sắc đồ kaempferol với điều kiện lựa chọn
Bảng 2. Hàm lượng kaempferol trong cắn flavonoid
Dung môi
Hàm lượng kaemferol trung bình trong cắn (%)
Cách 1 Cách 2
Methanol 60% 0,14 0,50
Methanol 70% 0,16 0,48
Methanol 80% 0,13 0,78
Kết quả thu được với phương pháp chiết bằng methanol 80% và acid hoá
cho hàm lượng kaempferol thu được là cao nhất, vì vậy chúng em quyết định lựa
chọn phương pháp này để tiến hành thực nghiẹm các bước tiếp theo.
Từ các kết quả khảo sát thu được ở trên, nâng khối lượng lá chè nên 500g
chúng em đề ra quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần trong lá chè như sau:
Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá chè:
Cân 500g lá chè rồi cho vào bình cầu 10L. Cho thêm 5L MeOH 80%. Ngâm
trong khoảng 6 giờ rồi rút dịch chiết lần thứ nhất. Thực hiện ngâm bã dược liệu
trên với 2,5L MeOH 80% trong khoảng 2 giờ rồi rút dịch chiết lần thứ hai. Đuổi bớt
dung môi ở các lần chiết, gộp các dịch chiết methanol, cô cạn dung môi dưới áp
suất giảm bằng máy hút chân không thu được cắn. Thêm nước nóng vào hòa tan
cắn bám quanh thành ống nghiệm sau cô cạn, thu được dung dịch có màu xanh lá
đậm. Cho 50mL HCl đậm đặc vào dung dịch, thủy phân trong khoảng 8 tiếng rồi
cho dung dịch thu được vào bình gạn. Lắc đều 3 lần với CHCl
3
với thể tích của

CHCl
3
mỗi lần là 250mL. Cả 3 lần đều lọc bỏ phần phân lớp màu xanh lắng xuống.
Cho HCl 10% vào để cân bằng pH của dung dịch về khoảng 3 – 4 sau đó đem chiết
tiếp với etylacetat mỗi lần 250mL. Lọc dịch chiết etylacetat, cho bột Na
2
SO
4
khô
để hút nước rồi cô cạn dưới áp suất giảm thu được cắn flavonoid toàn phần.
Hình 3. Cô quay chân không dịch chiết
Hình 4. Bột flavonoid toàn phần
Như vậy, quy trình chiết xuất flavonoid được tóm tắt như sau:
Sơ đồ 1. Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá chè xanh
3.3. Phân lập Kaempferol từ flavonoid toàn phần của lá chè xanh
3.3.1. Phân tách trên cột silicagel
Chuẩn bị cột:
Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính 2 cm, chiều dài 40 cm, lắp
thẳng đứng trên giá, phía dưới cột có van để điều chỉnh tốc độ dung môi. Khóa
van, cho một ít dung môi rửa giải vào cột. Lót một lớp bông mỏng ở phía đáy cột,
ngay trên van để chất nhồi sau khi được nhồi vào cột không gây tắc cột
Nhồi cột:
Cân 20 g chất nhồi cột silica gel 60 , thêm 30 ml cloroform, trộn đều, đổ từ
từ lên cột. Mở khóa cột để dung môi chảy từ từ để các hạt chất nhồi cột lắng
xuống .Trong quá trình này luôn bổ sung CHCl
3
lên cột, tránh để không khí tiếp xúc
với silica gel. Ổn định cột trong khoảng 20 phút, đến khi khoảng cách từ mặt trên
lớp chất nhồi đến mặt trên dung môi rửa giải còn khoảng 1 cm thì đóng khóa cột.
Xử lý mẫu:

Hòa tan 4 g flavonoid toàn phần trong cloroform, 4 g chất nhồi cột silica gel
60 ,trộn đều, cô cạn dung môi thu được hỗn hợp bột. Chuyển nhẹ nhàng vào cột,
tránh xáo động lớp chất nhồi trong cột, dùng pipet tráng vòng quanh bên trong
cột trước khi thêm dung môi rửa giải. Dùng hệ dung môi giửa rải lần lượt như sau:
Lần 1: 80mL CHCl
3
Lần 2: 40mL CHCl
3
+ 0,5mL Aceton + 0,5mL CH
3
COOC
2
H
5
+ 0,5mL CH
3
OH
Lần 3: 40mL CHCl
3
+ 1mL Aceton + 1mL CH
3
COOC
2
H
5
+ 1mL CH
3
OH
Bỏ qua dịch rửa giải của phân đoạn 1 và 2, chỉ thu dịch rửa giải của phân
đoạn 3. Tiến hành lặp lại cho đến khi hết cắn flavonoid toàn phần. Cô cạn dịch rửa

giải thu được 1,0g cắn.
Hình 5. Sản phẩm sau khi qua cột silica gel
3.3.2. Phân tách trên cột Sephadex
Chuẩn bị cột:
Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính 2 cm, chiều dài 40 cm, lắp
thẳng đứng trên giá, phía dưới cột có van để điều chỉnh tốc độ dung môi. Khóa
van, cho một ít dung môi rửa giải vào cột. Lót một lớp bông mỏng ở phía đáy cột,
ngay trên van để chất nhồi sau khi được nhồi vào cột không gây tắc cột
Nhồi cột:
Cân 20 g Sephadex LH-20 ngâm trong methanol. Khuấy đều để tạo hỗn dịch
sau đó rót liên tục và từ từ lên cột (dùng một đũa thủy tinh giúp rót hỗn dịch lên
thành cột, tránh tạo bọt khí). Mở khóa cột để dung môi chảy từ từ, hứng dung
môi đổ ngược trở lại cột, tránh để khô cột. Cho dung môi chảy tiếp tục như trên
đến khi cột ổn định. Đến khi khoảng cách từ mặt trên lớp chất nhồi đến mặt trên
dung môi rửa giải còn khoảng 1 cm thì đóng khóa cột.
Xử lý mẫu:
Hòa 0,2g cắn với 4ml MeOH rồi đổ vào trong cột (đổ từ từ vào thành cột để
tránh xáo động lớp chất nhồi trong cột), dùng pipet tráng vòng quanh bên trong
cột trước khi thêm methanol. Rửa giải bằng methanol, bỏ qua dung dịch đầu cho
đến khi màu của cắn chạm tới đáy cột. Cô cạn dịch rửa giải thu được 0,8g chất.
Quy trình tách kaempferol từ flavonoid toàn phần được tóm tắt như sau:
Sơ đồ 2.Quy trình phân lập kaempferol từ flavonoid toàn phần
3.4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm
3.4.1. Nhiệt độ nóng chảy
Tiến hành đo điểm chảy của sản phẩm Kaempferol theo phương pháp đo
trong mao quản. Kết quả đo điểm chảy cho thấy điểm chảy của sản phẩm là 279,1
± 0,3. So với giá trị lý thuyết là 277 ± 1.
Nhận xét: Điểm chảy đo được của các hợp chất nghiên cứu phù hợp với
điểm chảy lí thuyết của hợp chất này.
3.4.2. Sắc ký lớp mỏng

Tiến hành sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu kaempferol của viện kiểm
nghiệm thuốc trung ương thấy sản phẩm thu được có giá trị thời gian lưu

phù
hợp với chất chuẩn.
Hình 6. Kết quả sắc ký lớp mỏng của sản phẩm
3.4.3. Kết quả đo phổ
3.4.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS
Mẫu thử được hòa tan trong MeOH, nồng độ 0,01 mg/ml. Đem quét phổ
trên máy thu được λ
max
= 266,366 nm, phù hợp với giá trị lý thuyết.
3.4.3.2. Phổ hồng ngoại IR
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm xuất hiện các đỉnh: 3344 cm
-1
của nhóm
OH, và đỉnh 1611 cm
-1
của nhóm C=O
3.4.3.3. Phổ khối lượng ESI MS
Tiến hành đo phổ ESI-MS của hợp chất nghiên cứu, trên phổ đồ xuất hiện
pic 287,1 ứng với mảnh [M+H]+, tương ứng khối lượng phân tử 286,1 (C
15
H
10
O
6
).
Kết quả cho thấy chất phân tích đều cho mảnh ion phân tử phù hợp với
khối lượng phân tử tương ứng.

3.4.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ 1 chiều cho thấy các hợp chất nghiên cứu có công thức
phân tử và cấu trúc hoàn toàn phù hợp với các dữ liệu phổ đã được công bố cho
các hợp chất này.
Nhận xét chung: Từ các giá trị hằng số vật lý và dữ liệu phổ đo được, có thể
khẳng định sản phẩm thu được là kaempferol và có độ tinh khiết cao.
PHẦN 4
KẾT LUẬN
Đa số các tác giả đã nghiên cứu tách chiết hợp chất này đều đưa ra phương
pháp chiết xuất, phân lập để lấy được hợp chất tinh khiết dùng cho
nghiên cứu phổ (qui mô phân lập từ vài milligram đến vài chục milligram). Song,
các tài liệu trên các tác giả chỉ quan tâm đếnviệc lấy được hợp chất và nhận dạng
đúng chất bằng một số phương pháp phổ màchưa tiến hành khảo sát lựa chọn
phương pháp tối ưu để chiết xuất, phân lập và tinhchế hợp chất.
Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng em đã khảo sát các phương pháp chiết
xuất, phân lập để lựa chọn phương pháp phù hợp nhất cho mục đích tách được
kaempferol, mục đích để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, với các dung môi thong
dụng và rẻ tiền. Cụ thể với việc chiết xuất Kaempferol: Kaempferol là hợp chất
tương đối phân cực do có nhiều nhóm –OH trong cấu trúc phân tử, Kaempferol
tan tốt trong methanol, ethanol, diethylether, tan trong dung dịch kiềm, không
tan trong cloroform, benzen. Xuất phát từ đặc điểm này, chúng em đã lựa chọn
methanol là dung môi chiết xuất. Khảo
sát các nồng độ khác nhau và pH môi trường (có acid hóa và không acid hóa dịch
chiết nước trước khi chiết bằng ethyl acetat). Kết quả khảo sátcho thấy, trong tất
cả các phương pháp, phương pháp ngâm lạnh bằng MeOH 80%,
acid hóa là phương pháp cho hàm lượng Kaempferol cao nhất. Với nhiều nhóm –
OH trong cấu trúc phân tử, Kaempferol tan khá tốt trong các dung môi phân cực,
tuy nhiên phương pháp ngâm lạnh trong methanol 80% cho hiệu suất chiết cao
nhất có thể là vì với độ cồn cao hơn thì methanol làm đông vón tế bào thực vật
tốt hơn, giúp giải phóng các chất trong tế bào tốt.

Phân lập Kaempferol: Phương pháp phân lập Kaempferol được tiến hành
qua hai giai đoạn, giai đoạn một sử dụng cột silicagel, giai đoạn hai
tiếp tục phân lập trên cột Sephadex LH-20.
Như vậy, chúng em đã thực hiện thành công việc chiết tách Kaempferol từ
là chè Việt nam.
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Về xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế
Chúng em sẽ khảo sát độ tinh khiết của sản phẩm thu được,nếu chưa đạt
tiêu chuẩn dược dụng sẽ tiếp tục nghiên cứu để tinh chế cho đạt tiêu chuẩn
nguyên liệu dung làm thuốc.
Nếu thời gian cho phép, chúng em sẽ gửi mẫu chiết tách được đi thử
nghiệm tác dụng lâm sàng trên động vật.
2. Tiếp tục hoàn thiện báo cáo
Hoàn chỉnh nội dung, trình bày đầy đủ các hình ảnh, các bảng biểu kết quả
thực nghiệm. Các phụ lục và tài liệu tham khảo đầy đủ sẽ được hoàn thiện.