tìm hiểu hiện trạng nhiễm mầm bệnh vi-rút trên tôm thẻ chân trắng nuôi ở đồng bằng sông cửu long

1
Phần 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là một đồng bằng châu thổ lớn, có hệ thống
sông ngòi chằng chịt, bờ biển dài với những điều kiện khí hậu thuận lợi cho việc
phát triển thủy sản và đã trở thành nơi sản xuất thủy sản chủ lực, chiếm hơn 80%
sản lượng thủy sản của cả nước.
Nuôi trồng thủy sản đang ngày càng phát triển, thành phần nuôi cũng đa dạng
hơn. Hiện nay tôm thẻ chân trắng cũng được nuôi rất phổ biến ở các tỉnh ĐBSCL
như: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Thẻ chân trắng là đối tượng có giá trị kinh
tế cao thị trường tiêu thụ rộng, thời gian sinh trưởng ngắn (3 – 3,5 tháng), năng
suất cao (trên 4 tấn/ha), thâm canh có thể đạt đến 20 tấn/ha. Nhờ có giá trị dinh
dưỡng cao mà hiện nay tôm chân trắng đang được người tiêu dùng ở các thị
trường lớn ưa chuộng. Mỹ là thị trường tiêu thụ tôm chân trắng lớn nhất sau đó là
Châu Âu và Nhật Bản (Ts. Trần Viết Mỹ, 2009).
Tuy không có lịch sử lâu đời như tôm sú nhưng TTCT đang là đối tượng nuôi có
nhiều triển vọng. Tuy nhiên TTCT cũng tiềm ẩn nhiều nguy cơ bộc phát dịch
bệnh nguy hiểm do vi-rút gây ra như: vi-rút gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan
tạo máu (IHHNV), vi-rút gây Hội chứng Taura (TSV), vi-rút gây bệnh hoại tử cơ
(IMNV), …gây thiệt hại lớn đến sản lượng (tỉ lệ chết cao 40-90%). Để đưa thẻ
chân trắng vào hệ thống nuôi thủy sản ở vùng ĐBSCL một cách an toàn và hiệu
quả là phải kiểm soát được dịch bệnh một cách chặt chẽ ngay từ giai đoạn đầu
chọn giống, nhằm phát hiện sớm mầm bệnh cũng như đề ra biện pháp phòng
ngừa hiệu quả cho hệ thống nuôi. Do đó đề tài: “Tìm hiểu hiện trạng nhiễm
mầm bệnh vi-rút trên tôm thẻ chân trắng nuôi ở ĐBSCL” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài
Tìm hiểu sự hiện diện một số mầm bệnh vi-rút trên tôm thẻ chân trắng nuôi ở
ĐBSCL.

1.3 Nội dung nghiên cứu
Xác định sự hiện diện của một số loại vi rút (WSSV, TSV, IHHNV, MBV) trên
TTCT giai đoạn giống.


2
Xác định sự hiện diện của một số loại vi rút (WSSV, TSV, IHHNV, MBV) trên
TTCT giai đoạn nuôi thương phẩm.

3
Phần 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan tình hình dịch bệnh trên tôm thẻ chân trắng
2.1.1 Trên thế giới
Sản lượng ngành nuôi trồng Thủy Sản không ngừng tăng qua các thập niên gần
đây. Trong đó, nghề nuôi tôm trên thế giới được phát triển mạnh từ năm 1970.
Năm 1975, Ecuador đã dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi ở Tây Bán Cầu và Đài
Loan. Sản lượng tôm nuôi trên thế giới tiếp tục tăng từ 50.000 tấn năm 1975 lên
đến 450.000 tấn năm 1988. Theo FAO, đến năm 1990 sản lượng tôm nuôi trên
thế giới đạt 900.000 tấn/năm. Năm 1992, Thái Lan trở thành nước có sản lượng
tôm nuôi đứng đầu thế giới (Trần Ngọc Hải, 2004). Tuy nhiên, cùng với sự phát
triển nghề nuôi thì dịch bệnh bùng phát ngày một nhiều hơn, trong vòng chưa đầy
15 năm dịch bệnh đã gây thiệt hại trên 100.000 tấn tôm nuôi, làm sản lượng tôm
nuôi trên thế giới từ 733.000 tấn năm 1993 giảm xuống còn 600.000 tấn năm
2007 (Nguyễn Văn Hảo, 2002).
Vào năm 1984 Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) lần đầu được
phát hiện ở Hawaii gây chết hàng loạt tôm P. stylirostris (90%). Sau đó phát hiện
ở Mỹ và các vùng nuôi ven bờ biển Thái Bình Dương. Khi nhiễm IHHNV, tôm
thẻ chân trắng thường bị dị hình như chũy biến dạng hoặc mất, thân bị cong,
chậm lớn làm tỉ lệ tôm nhỏ cao khi thu hoạch. Trong khi đó, tôm sú lại không
biểu hiện bất cứ triệu chứng nào khi nhiễm IHHNV và có khả năng mang mầm
bệnh trong suốt thời gian sống của chúng. Do vậy, khả năng lây lan mầm bệnh
IHHNV sang tôm thẻ chân trắng khi có điều kiện thuận lợi là rất cao (Flegel,
2002).
Tiếp theo đó là bệnh đốm trắng (WSSV) đây cũng là một loại vi rút gây bệnh
nguy hiểm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng với tỉ lệ chết lên đến 90%. Lần đầu
tiên bệnh được công bố ở Nhật Bản năm 1993. Sau đó vi rút nhanh chóng lây lan
nhanh trên khắp các vùng nuôi tôm Châu Á. Năm 1995, WSSV nhiễm và gây ảnh

hưởng trên tôm thẻ chân trắng. Ngoài ra WSSV còn lây nhiễm đến một số lượng
lớn các loài tôm và giáp xác khác như P. merguiensis, Metapenaeus ensis,
Metapenaeus monoceros, Macrobrachium rosenbergiii, Palaemon setiferus,
Euphausia superba và các ký chủ này cũng là nguyên nhân lây truyền WSSV
(Flegel, 1997; Hossain, 2001).


4
Theo tổ chức thú y thế giới, hội chứng Taura xảy ra đầu tiên ở Ecuador vào năm
1992 ở gần sông Taura làm thiệt hại gần 90% sản lượng tôm thẻ chân trắng, giảm
15-25% sản lượng thế giới. Đồng thời bùng phát ở Honduran làm giảm 18% sản
lượng năm 1994 và 31% năm 1995 (Corral et al.,1999). Sau đó bệnh lan nhanh ra
các khu vực Châu Mỹ Latinh : Colombia, CostaRica, Salvado, Guatemale,
Brazil,…Bệnh xảy ra ở Châu Á vào năm 1999 ở Trung Quốc và Đài Loan rồi lan
sang các quốc gia khác như: Thái Lan, Malaysia, Indonesia,… Theo công bố của
OIE thì ở vùng Châu Á- Thái Bình Dương có nhiều báo cáo về sự xuất hiện của
TSV ở một số quốc gia như : Myanma, Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan và Việt
Nam (OIE, 2009).
Gần đây nhất là bệnh hoại tử cơ (IMNV) được phát hiện năm 2002 ở các ao nuôi
tôm thẻ chân trắng ở miền Đông Bắc Braxin. Sau đó bệnh lây lan sang các nước
khác thuộc khu vực Châu Á như Indonesia, Thái Lan và tỉnh Hải Nam, Trung
Quốc. Đây là loại virus có khả năng phát dịch trên các đối tượng tôm nuôi như
tôm thẻ chân trắng, tôm sú và tôm càng xanh. Khi xảy ra bệnh, các ao tôm có thể
bị thiệt hại từ 40 -70%. Quá trình lây lan của IMNV qua các châu lục khác nhau
được ghi nhận là do sự nhập chuyển của tôm bố mẹ P.vannamei. Vi rút này đã
được đưa vào danh sách cần theo dõi của NACA/FAO/OIE vào tháng 2 năm
2006. (Poulos et al., 2006).
2.1.2 Ở Việt Nam
Tôm thẻ chân trắng được du nhập vào Việt Nam từ những năm đầu thế kỷ 21,
trong đó Quảng Ngãi là một trong những địa phương có nghề nuôi tôm thẻ chân

trắng sớm nhất và hiện là tỉnh có diện tích, năng suất, sản lượng và kỹ thuật nuôi
cao nhất trong cả nước. Từ một vài ha nuôi tôm thẻ chân trắng ở năm 2003, đến
nay diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi đã đạt đến
gần 600 ha. Năng suất nuôi bình quân đạt khoảng 7tấn/ha/vụ, đặt biệt ở vùng
nuôi tôm trên cát năng suất đạt trên 18tấn/ha/vụ, sản lượng tôm thẻ chân trắng
nuôi năm 2008 trên toàn tỉnh đạt 5.440 tấn ()
Từ tháng 6 năm 2002, tôm thẻ chân trắng chính thức được Bộ Thủy sản cấp phép
nuôi nhưng chỉ với qui mô nhỏ và thử nghiệm tìm hiểu sự ảnh hưởng tích cực
cũng như tiêu cực đến môi trường cũng như nghề nuôi tôm. Trong thời gian đầu,
chín công ty thương mại được Bộ Thủy sản cấp phép nhập khẩu 48 triệu tôm P.
vannamei bột, 5900 tôm bố mẹ từ Hawaii và Trung Quốc, được kiểm dịch
nghiêm ngặt để đảm bảo nguồn tôm không mang mầm bệnh. Tuy nhiên, trong


5
thời gian gần đây tôm thẻ chân trắng được nuôi tương đối phổ biến nên nguồn
tôm giống nhập vào Việt Nam là rất lớn và các cơ quan quản lý khó có thể quản
lý được tất cả các nguồn tốm giống nhập vào nước ta.
Theo Báo cáo kết quả Nuôi Trồng Thủy Sản năm 2003: cả nước có 546.757 ha
nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là
30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha
nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước.
Chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV) bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh
do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện
thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi. (Hà Anh, 2004)
Đầu năm 2008, Bộ NN&PTNT chính thức cho phép các tỉnh Nam Bộ nuôi thâm
canh tôm TCT và nó đã khẳng định vị thế quan trọng trong cơ cấu sản xuất, xuất
khẩu tôm của Việt Nam. (Năm 2010, XK tôm đạt trên 2 tỉ USD, chiếm hơn 1/3
tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước (5 tỉ USD), trong đó tôm TTCT
đóng góp 26% giá trị xuất khẩu).

Năm 2010, tại Phú Yên dịch bệnh trên tôm thẻ chân trắng bùng phát
nhanh chóng làm thiệt hại trên 238,6 ha, chiếm 61,2% diện tích thả nuôi, dịch
bệnh xảy ra chủ yếu tập trung ở huyện Tuy An 3,6 ha và huyện Đông Hòa 235 ha
(Nguyên Lưu, 2010).
Theo thống kê của tổng cục thủy sản Việt Nam trong năm 2011, ở 8 tỉnh
ĐBSCL thiệt hại diện tích thả tôm có đến 66.593ha (trong đó 64.758ha tôm sú và
1.835ha tôm thẻ chân trắng), tăng gấp 2,3 lần so với cùng thời điểm năm 2010.
Cụ thể, từng địa phương có diện tích nuôi tôm bị thiệt hại nặng như Sóc Trăng
20.514ha, Bạc Liêu 13.536ha, Kiên Giang 11.252ha, Cà Mau trên 9.933ha, Trà
Vinh 7.628ha, Long An 2.072ha,…đã làm ảnh hưởng đến sản lượng chung của cả
nước. Theo ghi nhận chung thì tôm sau khi thả nuôi chết phổ biến ở giai đoạn từ
15-40 ngày tuổi (www.agroviet.gov.vn).
2.2 Sơ lược một số bệnh vi rút trên tôm
2.2.1 Bệnh đốm trắng
2.2.1.1 Tác nhân gây bệnh
Bệnh đốm trắng do White spot syndrome virus (WSSV) gây ra, có dạng hình
trứng. Thuộc giống Whispovirus, họ Nimaviridae. Có 3 dòng vi rút đã được giải


6
mã hoàn chỉnh trình tự gen, vi rút có DNA mạch đôi (dsADN), đường kính 120 –
150 nm, chiều dài 270 – 290 nm.
WSSV có thể tồn tại ít nhất 30 ngày ở 30
0
C trong nước biển ở phòng thí nghiệm.
Trong ao nuôi WSSV tồn tại ít nhất 3 – 4 ngày. Vi rút đốm trắng bất hoạt ở 50
0
C
(dưới 120 phút) và ở 60
0

C (dưới 1 phút). Một chu kỳ sao chép của vi rút mất 20h
ở nhiệt độ là 25
0
C.
2.2.1.2 Dấu hiệu bệnh lý
Tôm bị bệnh đốm trắng thường có dấu hiệu tiêu thụ thức ăn giảm sút rõ ràng, đặc
biệt có trường hợp tăng cường độ bắt mồi hơn bình thường, sau vài ngày mới có
hiện tượng bỏ ăn. Tôm bệnh dạt vào bờ, lờ đờ, tôm yếu ở tầng mặt với các dấu
hiệu đặc trưng là xuất hiện các đốm trắng tròn dưới lớp vỏ kitin đường kính 0,5 –
2 nm, đặc biệt các đốm trắng tập trung ở giáp đầu ngực. Tôm bệnh có khi chuyển
sang màu đỏ. Hiện tượng chết có thể xảy ra ngay sau đó, tỷ lệ chết cao có thể lên
tới 100% trong vòng 3 – 10 ngày.








Hình 2.1: Những đốm trắng trên vỏ đầu ngực và trên thân tôm nhiễm WSSV.
Khi tôm bị bệnh WSSV, trong mô của một số cơ quan như: mang, dạ dày,
biểu mô dưới vỏ kitin, cơ quan tạo máu có những biến đổi đặc thù. Những tế
bào bị nhiễm vi-rút thể hiện sự hơi phình to của nhân tế bào, trong đó chứa duy
nhất một thể vùi (Inclusion bodies), hình cầu, hoặc hình trứng bắt màu tím hồng
của Haematoxylin và Eosin. Khi bệnh nặng, các thể vùi thường chiếm hết thể tích
của nhân tế bào phình to.

7








Hình 2.2 Mang tôm bị nhiễm WSSV ( T.W. Flegel)
2.2.1.3 Phân bố và lan truyền bệnh
Bệnh đốm trắng lần đầu tiên được phát hiện ở khu vực Đài Loan – Trung Quốc
vào năm 1991 – 1992. Ở Nhật phát hiện vào 1993 từ tôm nhập khẩu của Trung
Quốc Sau đó cũng phát hiện bệnh ở một số nơi khác như: Hàn Quốc, Đông Nam
Á, Nam Á, Ấn Độ, Địa Trung Hải, Trung Đông và một số nước ở Châu Mỹ
(OIE,2008).
Bệnh xảy ra từ tôm giống đến tôm trưởng thành của các khu vực nuôi thâm canh
và quảng canh. Bệnh phát hiện ở nhiều động vật giáp xác tự nhiên như các loài
tôm he, tôm nước ngọt, cua, tôm hùm, chân bèo và ấu trùng, côn trùng. Động lực
hầu hết với các loài tôm có giá trị kinh tế (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004).
WSSV được truyền theo hai con đường:
Truyền dọc: từ bố mẹ bị nhiễm bệnh. Noãn bào tôm nhiễm vi rút đốm trắng thì
không thành thục được,nhưng trong quá trình tôm mẹ đẻ trứng của nó có thẻ thải
ra môi trường có vi rút đốm trắng do đó ấu trùng tôm nhiễm vi rút.
Truyền ngang: vi rút từ tôm bệnh, vật chủ trung gian (giun nhiều tơ,artermia…)
mang mầm bệnh truyền sang hoặc mầm bệnh sẵn có trong nước rồi truyền sang
cho tôm khỏe.
2.2.1.4 Phương thức chẩn đoán
Theo tài liệu của FAO về Hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản Châu Á thì

có các phương pháp để chẩn đoán WSSV:
Dự chẩn


8
Các quan sát chung (Mức độ 1)
Bệnh đốm trắng thường được báo hiệu trước bằng việc tôm ngừng ăn
trong một vài ngày, tôm sắp chết bơi gần mặt nước ở bờ ao nuôi. Những con tôm
này sẽ có các thể vùi màu trắng lẫn trong biểu bì và thân tôm thường hay biến đỏ.
Các thể vùi ở lớp vỏ thay đổi từ những chấm nhỏ thành những đĩa có đường kính
vài mm và chúng có thể liên kết lại với nhau thành những mãng lớn. Chúng rất dễ
nhận thấy nhờ việc bóc lớp vỏ kitin khỏi giáp đầu ngực, loại bỏ các mô bám và
vỏ kitin soi ra ngoài ánh sáng. Sự xuất hiện những đốm trắng trong lớp vỏ kitin
có thể do một vài nguyên nhân khác tạo ra. Riêng trong trường hợp mà Wang và
cộng sự, 2000 đã thông báo được gọi là Hội chứng vi khuẩn đốm trắng (BWSS)
rất dễ nhầm lẫn với bệnh đốm trắng (WSSV). Do đó, kiểm tra mô bệnh học là cần
thiết để chẩn đoán khẳng định.
Làm tiêu bản ép nhanh (Mức độ 2)
Hai kiểu làm tiêu bản nhanh có thể dùng để dự chẩn bệnh đốm trắng: (i)
mẫu tôm tươi, không nhuộm màu, được cố định trong Formalin 10%, và soi trên
nền tối của kính hiển vi với kính tụ quang ướt, (ii) các mô đã cố định được
nhuộm màu H&E.
Mô bệnh học (Mức độ 3)
Tôm nghi bị bệnh đốm trắng sắp chết cần được cố định trong dung dịch
Davidson’s và nhuộm màu bằng Heamatoxylin và Eosin (H&E). Mô bệnh học
của bệnh đốm trắng là rõ rệt và cho phép chẩn đoán khẳng định.
Tôm sắp chết do vi-rút đốm trắng có biểu hiện hủy hoại các mô trung bì và
ngoại bì. Nhân của tế bào bệnh bị phình to và khi nhuộm màu với H&E sẽ nhìn
thấy các thể vùi trung tâm bắt màu thuốc nhuộm kiềm từ nhạt đến sẫm và được
bao bởi chất nhiễm sắc. Cũng có thể nhìn thấy các thể vùi nội nhân này trong

mẫu ép mang và mô ở lớp dưới kitin hoặc trong các lát cắt mô. Những mô biểu
hiên rõ nhất để xét nghiệm là dưới mô ở lớp dưới kitin của dạ dày, giáp đầu ngực
hoặc các mô mang.
Kiểm khẳng định
Việc chẩn đoán bệnh được trọn vẹn có thể được hoàn thành bằng kỹ thuật
PCR, kỹ thuật lai tại chỗ, ,
Phương pháp kính hiển vi điện tử


9
Các mô thích hợp nhất cho việc kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử là các
mô ở dưới lớp kitin, mang và các chân bò đã được kiểm tra trước đó bằng mô học
hoặc nhuộn ép nhanh sẽ thấy rõ nhân bị phồng với các thể vùi Cowdry type A
hoặc chất nhiễm sắc bao quanh thể vùi bắt màu kiềm. Cố định mô ít nhất 24 giờ
trong chất cố định.
Kính hiển vi điện tử nhuộm màu âm bản
Các tiêu bản huyết tương cuả tôm nhuộm âm bản có thể cho thấy virion có
các phần phụ dạng đuôi bên trong các tế bào bệnh có nhân trương phồng, nhưng
không thấy rõ có thể vùi.
2.2.2 Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu
2.2.2.1 Tác nhân gây bệnh
Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô do vi rút Infectious
hypodermal and haematopoietic necrosis virus – IHHNV gây ra, họ
Parvoviridae, acid nucleic ADN đơn mạch, chiều dài 4,1kb, đường kính 22nm.
IHHNV có trong nhân tế bào tuyến anten, tế bào hệ bạch huyết, tế bào mang, tế
bào dây thần kinh, tồn tại nhiều dòng vi rút khác nhau phân bố theo địa lý (Trần
Thị Tuyết Hoa, 2004)
2.2.2.2 dấu hiệu bệnh lý
Tôm nhiễm bệnh IHHNV thường lờ đờ, hoạt động yếu, chủy biến dạng (hình
2.4). Tùy từng loài tôm khác nhau mà có các dấu hiệu bệnh lý khác nhau. Đặc

trưng như: Tôm sú (Penaeus monodon) bị bệnh lúc sắp chết thường chuyển màu
xanh, cơ phần bụng màu đục. Còn Tôm chân trắng (P. vannamei) thể hiện hội
chứng dị hình còi cọc, tôm giống (Juvenile) chủy biến dạng, sợi anten quăn queo,
vỏ kitin xù xì hoặc biến dạng. Tuy vi rút này không gây chết cho tôm sú nhưng
lại là một trong những tác nhân gây chậm lớn, dị hình, đặc biệt nguy hiểm cho
tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) và gây chết hang loạt ở tôm Penaeus
stylirostris (Flegel, 1997). Hệ số còi cọc trong đàn tôm giống chân trắng bị bệnh
IHHNV thường từ 10-30%, khi bị bệnh nặng hệ số còi cọc lớn 30% có khi tới
50%. Tôm P. stylirostris bị bệnh dạng cấp tính, tỷ lệ chết rất cao (có thể lên đến
90%) (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). Khi tôm nhiễm bệnh, IHHNV được tìm thấy ở
rất nhiều bộ phận như mang, biểu bì ruột trước, tuyến râu, dây thần kinh.


10









Hình 2.3: Vi rút của IHHNV đường kính 22nm ở trong hệ bạch huyết
của tôm sú nuôi trong ao ương (DV Lightner)
2.2.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh
Năm 1984 IHHNV lần đầu tiên phát hiên ở Hawai gây chét hàng loạt tôm
Penaeus stylirostris (90%). Sau đó phát hiện ở Mỹ và các vùng nuôi ven bờ biển
Thái Bình Dương (OIE,2009). Những loài tôm bị nhiễm IHHNV: (theo
V.A.Graindorge & T.W. Flegel, 1999) P.Vannamei, P. Mondon, P.Stylirostris,

P.Occidentalis, P. Californiensis, P. Semisalcatus, P. Japonicus. Bệnh IHHNV
lan truyền cả chiều dọc và chiều ngang ở cả 2 loài tôm (P. stylirostris,
P.vannamei). Vi rút có thể truyền từ tôm bố mẹ sang tôm ấu trùng hoặc lây
nhiễm ở giai đoạn sớm của ấu trùng tôm. Có khả năng lây qua nguồn nước hoặc
do ăn xác tôm nhiễm IHHNV. Vi rút bệnh lây từ mẹ sang ấu trùng (phương dọc)
nhưng không phát bệnh, thường đến postlarvae 35 dấu hiệu bệnh quan sát là tỷ lệ
chết cao, vi rút lây lan theo chiều ngang ở tôm giống ảnh hưởng rất mãnh liệt,
tôm trưởng thành đôi khi có dấu hiệu bệnh hoặc chết (Trần Thị Tuyết Hoa,
2004).



11

Hình 2.4: Tôm chân trắng bị bênh chủy biến dạng, anten quăn queo
2.2.3 Bệnh Còi
2.2.3.1 Tác nhân gây bệnh
Tác nhân gây bệnh MBV (Monodon Baculovirus) là virus type A Baculovirus
monodon, cấu trúc nhân là dsDNA, có lớp vỏ bao, dạng hình que. Theo Mari và
ctv., 1993 trích dẫn Bùi Quang Tề, 2004, thì chủng MBV của tôm sú từ Ấn Độ
Thái Bình Dương có kích thước nhân 42 ± 3 x 246 ± 15 nm, kích thước vỏ bao
75 ± 4 x 324 ± 33 nm. Chủng PMV của tôm (P.plebejus, P. monodon, P.
merguiensis) từ Úc có kích thước nhân 45-52 x 260-300 nm, kích thước vỏ bao
60 x 420 nm.
Vi rút ký sinh ở tế bào biểu mô hình ống gan tuỵ (Hepatopancreas) và tế bào biểu
bì phía trước ruột giữa, vi rút tái sản xuất bên trong nhân tế bào vật nuôi, bao
gồm các giai đoạn sau:
 Giai đoạn O (tiềm ẩn): Sau khi tế bào nhiễm MBV là giai đoạn sớm của tế
bào chất biến đổi.
 Giai đoạn 1: Nhân tế bào sưng nhẹ, các nhiễm sắc thể tan ra và di chuyển

ra sát màng nhân. Tế bào chất mất dần chức năng của chúng và hình thành
giọt mỡ. Vi rút bắt đầu gây ảnh hưởng.
 Giai đoạn 2: Nhân sưng nhanh, số lượng virus tăng nhanh, xuất hiện thể ẩn
(Occlusion bodies) trong nhân.
 Giai đoạn 3: Tế bào bị bệnh, nhân tăng lên gấp 2 lần, đường kính bình
thường và tăng 6 lần về thể tích, bên trong nhân có 1 đến nhiều thể ẩn,
trong thể ẩn chứa đầy các vi rút. Các virus phá huỷ các tế bào ký chủ, tiếp


12
tục di chuyển sang tế bào khác hoặc theo chất bài tiết ra ngoài môi trường,
tạo thành virus tự do tồn tại trong bùn và nước.
2.2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý
Khi tôm mới nhiễm vi rút MBV, dấu hiệu bệnh không biểu hiện rõ ràng. Khi tôm
nhiễm bệnh nặng và phát bệnh thường có biểu hiện một số dấu hiệu sau:
Tôm có màu tối hoặc xanh tái, xanh xẫm. Tôm kém ăn, hoạt động yếu và sinh
trưởng chậm (chậm lớn).
Các phần phụ và vỏ kitin có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh vật bám (ký sinh
trùng đơn bào, tảo bám và vi khuẩn dạng sợi).
Gan tuỵ teo lại có màu trắng hơi vàng, thối rất nhanh.
Tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% hoặc có thể tôm chết hầu hết trong ao.
2.2.3.3 Phân bố và lan truyền bệnh
Bệnh MBV được phát hiện đầu tiên năm 1980 ở đàn tôm sú (Penaues monodon)
đưa từ Đài Loan đến nuôi ở Mehico (Lightner và ctv, 1981, 1983, trích dẫn Bùi
Quang Tề, 2004). Tiếp theo các nhà nghiên cứu đã phát hiện bệnh MBV có xuất
phát từ Đài Loan, Philippines, Malaysia, Polynesia thuộc Pháp, Singapore,
Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Cho đến nay người ta biết bệnh MBV phân
bố rất rộng rãi: châu Á, Thái Bình Dương, châu Phi, miền Nam châu Âu, châu
Mỹ. Tôm sú (P. monodon) thường xuyên nhiễm bệnh MBV và một số tôm khác
cũng nhiễm bệnh MBV: P. merguiensis, P. semisulcatus, P. kerathurus, P.

plebejus, P. indicus, P. penicillatus, P. esculentus, P. vannamei (có khả năng).
MBV nhiễm từ Post-larvae đến tôm trưởng thành.
Bệnh MBV lan truyền theo phương nằm ngang, không truyền bệnh theo phương
thẳng đứng.
Ở Việt Nam tháng 10-11/1994 Bùi Quang Tề lần đầu tiên đã nghiên cứu về mức
độ nhiễm bệnh MBV trên tôm sú nuôi các tỉnh ven biển phía nam. Tôm sú nuôi
nhiễm vi rút MBV khá cao, tôm thịt ở Minh Hải: 50-85,7%, ở Sóc Trăng 92,8%;
tôm giống ở Bà Rịa-Vũng Tàu 5,5-31,6%, tôm giống Nha Trang 70-100%. Bệnh
MBV là một trong những nguyên nhân gây chết tôm ở các tỉnh phía Nam năm
1993-1994. Đến nay kiểm tra tôm post sản xuất từ miền Bắc ở Quảng Ninh đến
các tỉnh phía Nam ở Cà Mau hầu hết chúng đều nhiễm mầm bệnh MBV, ở mức
độ khác nhau. Bệnh MBV không làm tôm chết hàng loạt, nhưng làm tôm chậm


13
lớn và chết rải rác. Khi thu hoạch tỷ lệ tôm sống rất thấp đây là vấn đề nan giải
của nghề nuôi tôm biển ở các tỉnh ven biển. (Bùi Quang Tề và ctv, 1997)
2.2.4 Hội chứng Taura
2.2.4.1 Tác nhân gây bệnh
Theo Bonami et al và Mari et al. (1997), hội chứng Taura là do Taura
Syndrome Virus gây ra. Theo hệ thống phân loại của ICTV thì TSV thuộc họ
Dicistroviridae, vi rút có dạng hình cầu 20 mặt, kích thước khoảng 32nm, không
có màng bao, mật độ nổi 1,338g/ml. Vật chất di truyền là RNA sợi đơn với kích
thước phân tử 10,2kb.
2.2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý
Bệnh được chia làm 3 giai đoạn (OIE, 2009)
Giai đoạn cấp tính: hậu ấu trùng hay tôm lớn của loài P. vannamei khi bị
bệnh có sự chuyển màu đỏ nhợt ở đuôi và các chân bơi (do sự phình to của các
sắc tố đỏ trong biểu mô vỏ) nên được gọi là bệnh đỏ đuôi (hình 2.5). Có sự hoại
tử cục bộ ở mép chân bơi, chân bơi và đuôi tôm. Tôm bệnh kèm theo các dấu

hiệu khác như: mềm vỏ, ruột rỗng, thường chết khi lột xác và sự tấn công của các
loài chim biển.
Giai đoạn chuyển tiếp: chỉ diễn ra trong thời gian ngắn (vài ngày) với các
dấu hiệu như: nhiều điểm bị tổn thương màu nâu, đen trên vỏ kitin (hình 2.6).
Màu đen của sắc tố melanin là sản phẩm của cơ chế hoạt động miễn dịch tự
nhiên. Trong giai đoạn này có thể có hoặc không có hiện tượng mềm vỏ, đổi màu
phụ bộ. Tôm bệnh trong thời kỳ này vẫn có thể bắt mồi bình thường.
Giai đoạn mãn tính: tôm bệnh sống sót sau giai đoạn cấp tính và giai
đoạn chuyển tiếp sẽ chuyển sang giai đoạn mãn tính. Thời kỳ này có thể kéo dài
cho đến cuối đời của những con tôm bệnh, sau vài lần lột xác cơ thể tôm trở lại
bình thường, các dấu hiệu bệnh lý ở các thời kỳ trước biến mất, nhưng trong cơ
thể tôm vẫn mang vius gây bệnh cho đến suốt cuộc đời.






14






Hình 2.5: Đuôi tôm bị phồng và đỏ do TSV gây ra ở giai đoạn cấp tính
(Lightner, 2006).

Hình 2.6: Cơ thể tôm bị những đốm đen do hiện tượng melanin hóa do
TSV gây ra ở giai đoạn mãn tính (Lightner, 2006).
2.2.4.3 Phân bố và phương thức lây truyền bệnh
Bệnh xuất hiện lần đầu tiên tại vùng nuôi tôm gần sông Taura, Ecuador
năm 1992 sau đó lan nhanh ra các nước ở khu vực Châu Mỹ Latinh: Colombia,
Costarica, Salvado, Guatemale, đảo Hawai, Brazil, Venezuala, các bang Florida,
Texas,…
Bệnh xuất hiện ở Châu Á năm 1999 ở Trung Quốc và Đài Loan sau đó lan
sang các quốc gia khác như: Thái Lan, Malaysia, Indonesia,

Phương thức lây nhiễm:
Phương thức lây nhiễm theo chiều ngang: những tôm bệnh sẽ truyền mầm
bệnh sang tôm nhạy cảm với bệnh. Côn trùng và chim mòng biển cũng là vật
mang mầm bệnh. Cụ thể, loài Tricholoxira reticulara (Coraxidae) ăn tôm chết
được coi là vật làm lây lan TSV trong quá trình di chuyển từ ao này sang ao khác.


15
Trong đợt dịch bệnh 1995 ở Texas, phân chim mòng biển (Larus atricilla) thu
được ở quanh các ao bệnh đã được xác định có nhiễm TSV. Ngoài ra, các sản
phẩm tôm đông lạnh cũng là vật mang mầm bệnh (OIE, 2009).
Phương thức lây nhiễm theo chiều dọc: những tôm ở dạng mãn tính sau
khi thành thục được chọn làm bố mẹ trong quá trình sinh sản sẽ lây sang ấu trùng.
Tuy vậy, cần phải tiến hành nghiên cứu thêm để xác nhận chính xác mối liên
quan này (OIE, 2009).
2.2.4.4 Phương pháp chẩn đoán
Theo tài liệu của OIE (2009) và FAO (2005) về hướng dẫn chẩn đoán

bệnh động vật thủy sản Châu Á thì có thể chẩn đoán TSV như sau:
Dự chẩn:
Quan sát chung ( mức độ I):
Khi tôm bị nhiễm TSV thì ở phần đuôi và chân bụng chuyển sang đỏ nhợt.
Hiện tượng tôm mềm vỏ, ruột rỗng và thường chết khi lột vỏ cũng có thể xuất
hiện. Sẽ có sự xuất hiện của các loài chim biển xung quanh ao nuôi khi có dịch
bệnh nặng.
Mô bệnh học (mức độ II)
Khi xử lý mẫu với H&E, tế bào chất bắt màu Eosin không bình thường và
nhân bị ngưng kết của các tế bào bị hoại tử. Ở giai đoạn cấp tính, các tổn thương
thường có nhiều mảnh vụn của các tế bào hoại tử và chúng giống như các thể
hình sần sùi (đường kính 1-20µm). Màu nhuộm thay đổi từ màu Eosin sang màu
kiềm sáng (màu xanh da trời). Một đặc tính khác của TSV ở giai đoạn cấp tính là
có sự ngưng kết hồng cầu hoặc các biểu hiện khác do khả năng đáp ứng miễn
dịch của vật chủ.









16

Hình 2.7: Tế bào biểu mô mang bị nhiễm TSV, mũi tên chỉ sự hiện diện
thể vùi của vi rút (Đồng Thanh Hà và Đỗ Thị Hòa, 2007)






Hình 2.8: Tế bào biểu mô chân bơi bị nhiễm TSV, mũi tên chỉ hiện diện vi
rút những ổ viêm với nhân tế bào bị thoái hóa kết đặc (Đồng Thanh Hà và
Đỗ Thị Hòa, 2007).
Ở giai đoạn chuyển tiếp: số lượng và mức độ tổn thương của lớp cutin
giảm đi và bắt đầu có sự ngưng kết hồng cầu ở các mô bệnh ( Hình 2.8).
Trong giai đoạn nhiễm TSV mãn tính: xuất hiện các tế bào lympho hỗn
độn thành các “hình cầu” lympho. Những hình cầu lympho này không có mạch
trung tâm và bao gồm các tế bào có nhân to, các không bào nổi rõ và các thể vùi
bào chất khác (Hình 2.7).
Kiểm khẳng định
Phương pháp sinh học ( Mức độ I/II): có thể sử dụng 2 phương pháp sau
- Cho ăn: tôm được xác định nhiễm TSV đem băm nhỏ và được dùng làm
thức ăn cho tôm khỏe được bố trí cảm nhiễm. Bể đối chứng với tôm khỏe
không có mầm bệnh và được bắt cùng một nguồn tôm với tôm bố trí cảm
nhiễm, đồng thời tôm trong bể đối chứng chỉ dùng thức ăn bình thường
không nhiễm TSV. Sau 3-4 ngày bố trí thí nghiệm, thì tiến hành kiểm tra


17
TSV. Nếu kết quả gây cảm nhiểm thành công thì tôm sử dụng thức ăn
nhiễm TSV sẽ có các triệu chứng chung của nhiễm TSV, đồng thời kiểm

tra mô học sẽ thấy các dấu hiệu tổn thương. Để kiểm tra chính xác TSV
phải sử dụng phương pháp PCR để xác định. Nếu kết quả dương tính TSV
thì sau 3-8 ngày tôm sẽ chết với số lượng đáng kể. Tôm bể đối chứng vẫn
khỏe mạnh và không có các triệu chứng chung hoặc sự biến đổi mô bệnh
học.
- Tiêm truyền: Nghiền mẫu tôm đã được kiểm tra dương tính với TSV để
làm thí nghiệm tiêm truyền. Ngoài ra, có thể dùng mẫu tôm nhiễm TSV ở
giai đoạn chuyển tiếp và giai đoạn mãn tính để tiêm truyền trong bố trí thí
nghiệm cảm nhiễm. Bể đối chứng được tiêm truyền với mẫu tôm đem
nghiền là sạch bệnh không nhiễm TSV.
Mô bệnh học (mức độ II):
Quan sát các tổn thương ở mức độ tế bào đã mô tả như trên có thể được
coi là phương pháp kiểm khẳng định đối với những loài nhạy cảm với bệnh ( hình
2.7 và 2.8).
Kính hiển vi điện tử (TEM) (mức độ III):
Dùng kính hiển vi điện tử để xác định những tổn thương biểu mô ở giai
đoạn cấp tính hoặc các khối cầu ở cơ quan bạch huyết; xác định trong tế bào chất
của các tế bào bị nhiễm có các tiểu phần vi rút 20 mặt, không có màng bao,
đường kính 31-32nm.
Phương pháp Dot Blot (mức độ III):
Hiện nay đã có bộ kit thử Dot Blot của DiagXotics (Wilton CT, Mỹ) và bộ
kit ELISA sử dụng để kiểm tra TSV.
Phương pháp Lai tại chổ (mức độ III):
Có thể sử dụng bộ kit thử lai tại chổ của DiagXotic (Wilton CT, Mỹ) để
kiểm tra.
Phương pháp PCR (mức độ III):
Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi, phổ biến với độ chính xác và
nhanh chóng dùng cho việc xác định tác nhân do vi rút gây ra.

18
2.3 Sơ lược về phương pháp RT-PCR
PCR phiên mã ngược (reverse transcriptase PCR) là phương pháp PCR
được sử dụng để khuếch đại, phân lập hay xác định thư viện RNA của mô hay tế
bào. Để thực hiện RT-PCR trước hết RNA sau khi ly trích phải được phiên mã
bằng men phiên mã ngược (Reverse transcriptase) để chuyển RNA thành cDNA
(complementary DNA) rồi thực hiện PCR truyền thống với cDNA (Đặng Thị
Hoàng Oanh, 2007).
Do Taq polymerase không hoạt động trên mRNA nên khi thực hiện qui
trình này cần phối hợp RT-PCR với enzyme phiên mã ngược (Reverse
Transcriptase PCR). Đây là phương pháp được sử dụng để khuếch đại, phân lập
hay xác định thư viện RNA của mô hay tế bào. Để thực hiện qui trình trước tiên
RNA sau khi ly trích tiến hành phiên mã ngược để chuyển thành cDNA
(Complementary), sau đó thực hiện qui trình PCR truyền thống với cDNA (Đặng
Thị Hoàng Oanh, 2007). Mồi sử dụng trong giai đoạn này có thể là mồi đặc hiệu
của PCR giai đoạn sau, có thể là mồi ologonucleotide oligodT (để bắt cặp với
đuôi polyA của các mRNA), mà cũng có thể là các hexanucleotide (trình tự gồm
6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA. Sau đó cDNA
được khuếch đại nhờ Taq DNA polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
2.3.1 Nguyên lý
PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại trình tự DNA
chuyên biệt trong phòng thí nghiệm mà không cần sự hiện diện của tế bào hay
còn gọi là kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp được phát minh bởi Karl Mullis et
al (1985). PCR có tính nhạy cao và cho phép phát hiện và xác định nhanh chóng
DNA của virus. Ưu điểm vượt bật của phương pháp này là có khả năng phát hiện
virus ở những cường độ nhiễm thấp hay những vi rút ẩn không có các biến đổi về
mô học. Hiện nay phương pháp PCR được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh
vực nghiên cứu như y học, quân sự,…
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) thì PCR là một chuỗi chu kì lặp lại

nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép DNA (dNTP, enzyme DNA
polymerase, Mg
2+
…), phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ
nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở 94-95
0
C trong 30-60 giây. Nếu đoạn


19
DNA khuôn có tỷ lệ G-C cao, chuỗi G-C liền nhau dài cần tính toán để có
nhiệt độ phù hợp. Giai đoạn này sẽ tách đôi mạch DNA thành 2 mạch đơn.
Giai đoạn lai (annealing): Trong giai đoạn này nhiệt độ hạ thấp hơn Tm
của các đoạn mồi cho phép bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này
dao động khoảng 40-70
0
C tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng mà thời gian
bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn quyết định
tính đặc hiệu của phản ứng.
Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (elongation): nhiệt độ được tăng lên
72
0
C, đây là điều kiện tốt nhất để DNA polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài
mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu. Thời gian khuếch
đại tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài
phút. Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150
nucleotide/giây ở nhiệt độ 75-80
0

C; 60 nucleotide/ giây ở 70
0
C; 24
nucleotide/giây ở 55
0
C; 1,5nucleotide/giây ở 37
0
C và 0,25 nucleotide/giây ở
22
0
C.
Phản ứng PCR là một chuỗi chu kỳ nối tiếp nhau và lặp lại, cứ sau mỗi
chu kỳ thì một phân tử DNA khuôn sẽ được nhân lên gấp đôi, các đoạn vừa nhân
lên lại tiếp tục làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu của sản phẩm
bổ sung với mồi. Sau mỗi chu kỳ số lượng đoạn DNA được tổng hợp sẽ tăng lên
gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2
n
bản DNA từ một khuôn
ban đầu. Do đó sau 30 chu kỳ khuếch đại sẽ là 10
6
so với lượng bản mẫu ban đầu.

20












Hình 2.9: Nguyên tắc hoạt động của phương pháp PCR
Trong phản ứng PCR, sau mỗi chu kỳ đầu thì ở các chu kỳ tiếp theo nhiệt
độ sẽ tăng lên 1-2
0
C. Do về sau lượng mồi giảm nhưng lượng khuôn tăng lên,
mặt khác enzyme Taq DNA polymerase sẽ hoạt động yếu dần do tác động của
nhiệt độ vì vậy nên tăng nhiệt độ ở các chu kỳ sau để làm tăng hiệu quả tổng hợp
DNA.
2.3.2 Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007:
DNA mẫu làm khuôn: phản ứng PCR tối ưu hóa khi DNA khuôn tinh
sạch, nhưng ưu điểm lớn của phương pháp PCR là cho phép nhân cả những mẫu
DNA không được bảo quản tốt, mẫu đã bị phá hủy từng phần như những vết máu
đã để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người chết,…hàm

lượng DNA mẫu nằm trong khoảng 100ng -1µg.
Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi: mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất
quyết định tính đặc hiệu của PCR để nhân bản một đoạn DNA đặc trưng nào đó.
Mồi luôn gắn với DNA khuôn ở đầu 3’ và Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi
tổng hợp theo chiều 5’->3’. Trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ trong


21
phản ứng PCR là những nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng PCR.
Việc chọn mồi phải tuân thủ theo một số nguyên tắc:
 Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi
“xuôi” và mồi “ngược” và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự
bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi.
 Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt nhau quá xa.
 Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại không
trùng với các trình tự lặp lại trên gen.
 Trình tự nằm giữa 2 mồi không quá lớn. Phản ứng PCR sẽ tối ưu nếu đoạn
trình tự nhỏ hơn 1kb.
Enzyme: Taq DNA polymerase càng mạnh thì phản ứng PCR càng xảy ra
triệt để, tùy vào các đặc tính của DNA polymerase, khả năng chịu nhiệt của
enzyme mà hiệu quả phản ứng khác nhau. Thông thường người ta sử dụng Taq
DNA polymerase ở nồng độ 2,5U/phản ứng. Việc tăng nồng độ Taq DNA
polymerase đôi khi làm tăng hiệu quả phản ứng PCR, nhưng phải nằm trong
khoảng nhất định. Hơn nữa đây là thành phần đắt tiền nhất của phản ứng PCR
nên việc chọn nồng độ thích hợp là rất quan trọng (Martha F. Kramer và Donald
M. Coen, 2001).
Nồng độ các loại nucleotide tự do: bốn loại nucleotide (dATP, dGTP,
dCTP, dTTP) được sử dụng ở nồng độ là 20-200µM/mỗi loại nucleotide, nếu sự
mất cân bằng trong thành phần các nucleotide xảy ra sẽ dẫn tới lỗi sao chép của
ADN polymerase. Khi nồng độ quá thấp sẽ giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng

độ nucleotide quá cao dẫn tới sự khuếch đại “ ký sinh” (Khuất Hữu Thanh,
2003).
Nồng độ ion Mg
2+
: cũng là nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR,
chính là cầu nối gắn kết dNTPs với Taq làm tăng khả năng bám nối của mồi. Nếu
nồng độ Mg
2+
quá cao sẽ tạo ra các sản phẩm phụ, ngược lại nếu nồng độ thấp sẽ
không tạo ra sản phẩm PCR. Tuy nhiên không có một quy luật chung cho vấn đề
này. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua thử nghiệm.
Chu kỳ phản ứng: trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vượt
quá 40 chu kỳ. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn ra qua 2 giai đoạn. Trong
giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với lượng mẫu ban
đầu. Sau đó hiệu quả khuếch đại giảm do các nguyên nhân sau:


22
 Hoạt tính của Taq DNA polymerase giảm theo chu kỳ ở nhiệt độ cao.
 Sự cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
 Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với
nhau.
 Sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
2.3.3 Hạn chế của phương pháp PCR
Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003): có 3 vấn đề lớn phải đặc biệt chú ý
khi sử dụng phương pháp PCR:
 Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu
tiên: trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động với
những đoạn DNA có kích thước lớn hơn 3kb. Việc sử dụng PCR đối với các
đoạn DNA có độ dài dưới 1,5kb sẽ cho kết quả tốt hơn. Với những đoạn

DNA có kích thước lớn hơn thì điều kiện phản ứng phải được xác định qua
thực nghiệm.
 Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với phương pháp PCR, gắn
liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này: nguồn ngoại
nhiễm lớn nhất thường là do các sản phẩm khuếch đại của những lần thao
tác trước. Người ta đã chứng minh rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau
mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm
sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra ống nghiệm bay lơ
lững trong không khí và bám vào tường, thiết bị, dụng cụ,…rồi nhiễm vào
các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng
một số biện pháp sau:
 Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và
phân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa
điểm cách xa nhau.
 Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng
vào thao tác khác. Đầu típ sử dụng với micropipette phải có lớp lọc
tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút
dung dịch phản ứng.
 Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại
trước.


23
 Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những
lượng nhỏ, tính toán sau cho đủ với 1, 2 lần thao tác.
 Ngoài ra, các hãng sản xuất còn tung ra thị trường nhiều hệ thống
cho phép loại bỏ hoàn toàn sự ngoại nhiễm. Chẳng hạn hiện nay
hãng Perkin-Elmer-Cetus đề xuất việc sử dụng dUTP thay vì dTTP:
việc thay thế này không ảnh hưởng đến phản ứng. Trước mỗi lần
phản ứng kế tiếp, người ta cho thêm vào dung dịch phản ứng

uracylglycosylase; enzyme này sẽ phân hủy tất cả các DNA có mang
dUTP nhiễm từ lần trước. Đồng thời, enzyme sẽ bị phân hủy bởi
nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên. Bất lợi của phản ứng này là giá
thành quá cao.
 Các sai sót gây ra do Taq DNA polymerase (khoảng 10.000 nucleotide thì
enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ
cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng
có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta
không thể loại bỏ hoàn toàn các sai xót này mà chỉ có thể giảm bớt: ví dụ
như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định
trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh
trước khi đi đến trình tự chính thức,…
2.3.4 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản
Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004) thì phương pháp PCR có các ứng dụng
như sau:
 Phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh ở dạng ẩn chưa biểu hiện ra bên
ngoài nhằm giúp cho quá trình chọn cá thể thủy sản có chất lượng tốt trong
sản xuất giống và ương nuôi.
 Chẩn đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng bổ bệnh và đưa ra cách giải
quyết.
 Phòng bệnh: kiểm tra tôm bố mẹ và tôm giống ở trại sản xuất giống.
 Kiểm soát bệnh: theo dõi và kiểm tra theo khu vực; kiểm tra giống nhập
khẩu.
 Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản (xuất khẩu)- sự nhiễm
khuẩn hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli.


24
Ngoài ra, PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau như phân
tích hệ gen của cơ thể sinh vật vì nó cho phép tạo ra lượng lớn các đoạn trình tự

đặc hiệu, xác định trình tự của DNA được nhân bản, nhân bản quần thể mRNA
để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cDNA để làm mẫu lai, xác định sinh
vật chuyển gen (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn,
virus, ký sinh trùng và nấm ở động vật thủy sản. Một số mầm bệnh thủy sản quan
trọng ở cá và tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR. Ví dụ: các mầm bệnh
gây hại cho cá như virus gây bệnh nhiễm trùng và hoại tử cơ quan tạo máu
(IHNV), virus gây nhiễm trùng và hoại tử tuyến tụy (IPNV), virus gây xuất huyết
và nhiễm trùng máu (VHSV), virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển (VNN),
virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (EHNV); ở tôm có virus gây bệnh đốm
trắng (WSSV), virus gây bệnh đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo
máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hoại tử cơ (IMNV), virus gây
hội chứng Taura (TSV), nội ký sinh trùng và vi khuẩn đặc biệt là nhóm Vibrio…















25
Phần 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm
Thu mẫu ở một số tỉnh ĐBSCL.
Phân tích mẫu tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học & Bệnh thủy sản – Khoa
Thủy Sản – Trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Dụng cụ
Phân tích PCR
 Máy ủ
 Máy khuyếch đại gen (PCR)
 Tủ lạnh
 Tủ đông
 Bàn đoc UV
 Bộ điện di
 Cân điện tử
 Đầu eppendorf
 Ống eppendorf
 Pipet
 Que nghiền.
3.1.3 Hóa chất
 Lysis buffer
 Ethanol 75%
 TE buffer
 PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2
, 0,1%
Trixton X-100)