nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, đa hình di truyền và tính kháng với hóa chất diệt côn trùng nhóm loài anopheles leucosphyrus ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Nguyễn Thị Hồng Ngọc





NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC,
ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG
CỦA NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC





Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Hồng Ngọc

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC,
ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG
CỦA NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.70.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Trịnh Đình Đạt
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên
2. PGS.TS. Hồ Đình Trung
Viện sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ƣơng


Hà Nội – 2014

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trịnh Đình Đạt,
PGS.TS. Hồ Đình Trung, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong
quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này.
Tôi chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn
trùng Trung ương, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện giúp cho tôi nghiên
cứu và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm tạ các thầy cô, anh chị trong
bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, phòng Đào tạo sau đại học, trường
Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn
tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và tạo điều kiện giúp đỡ tôi bảo vệ

luận án.
Tôi gửi lời cảm ơn tới các cô chú, bạn bè đồng nghiệp trong khoa Sinh
học Phân tử, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương, những người
đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng xin gửi lòng
biết ơn sâu sắc tới dự án hợp tác Song phương Việt – Bỉ, Quỹ toàn cầu phòng
chống sốt rét Việt Nam và trường đại học Nagasaki Nhật Bản đã hỗ trợ tôi
các phương tiện, công cụ, máy móc, hoá chất để hoàn thành các thí nghiệm
trong luận án. Cảm ơn bạn bè thân thiết luôn là nguồn cổ vũ động viên tôi
phấn đấu.
Với tất cả lòng biết ơn sâu nặng, tôi xin dành cho gia đình, bố mẹ
những người đã dắt dìu, cổ vũ động viên yêu thương và cảm thông sâu sắc.
Tác giả

Nguyễn Thị Hồng Ngọc

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các số
liệu, kết quả trong luận án này là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong
bất kỳ công trình hoặc tài liệu nào.
Tác giả


Nguyễn Thị Hồng Ngọc

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
LỜI CẢM ƠN iii
LỜI CAM ĐOAN iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC CÁC BẢNG x
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ xi
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS
TRÊN THẾ GIỚI 5
1.2. TỔNG QUAN NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT
NAM 10
1.3. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN Ở MUỖI SỐT
RÉT 12
1.3.1. Đa hình enzyme và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 13
1.3.2. Các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 16
1.4. TỔNG QUAN SỰ KHÁNG HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG Ở
VECTOR TRUYỀN BỆNH 22
1.4.1.Cơ sở di truyền của tính kháng hóa chất diệt côn trùng 22
1.4.2. Các cơ chế kháng hóa chất diệt côn trùng 23
1.4.3. Tình trạng đáp ứng với hóa chất diệt của một số loài Anopheles tại
Việt Nam. 33
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 35
2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 35
2.2.1. Thời gian nghiên cứu 35
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu 36
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 36
2.3.2. Mẫu nghiên cứu 36
2.3.3. Phƣơng pháp thu thập và xử lý mẫu vật tại thực địa 37
2.3.4. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 38

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 53
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53
3.1.1. Phân bố, đặc điểm sinh học và vai trò truyền bệnh của nhóm loài
Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 53
3.1.2. Đa hình di truyền isozyme của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở
Việt Nam 69
3.1.3. Đa hình di truyền của nhóm loài Anopheles leucosphyrus dựa vào
các chỉ thị phân tử 76
3.1.4. Kết quả tạo chủng muỗi An. dirus kháng với permethrin chủng phòng
thí nghiệm 82
3.1.5. Kết quả thử nghiệm sinh học đối với hai quần thể muỗi thu thập tại
thực địa 84
3.1.6. Kết quả xác định gen kháng ngã gục muỗi An. dirus bằng PCR-RFLP 86
3.1.7. Kết quả xác định sự biểu hiện quá mức của gen P450 88
3.2.BÀN LUẬN 89
3.2.1. Phân bố của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 89
3.2.2. Đặc điểm sinh học, vai trò truyền bệnh của nhóm loài Anopheles
leucosphyrus ở Việt Nam 92
3.2.3. Tính đa hình của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 94
3.2.4. Tính kháng hóa chất của An. dirus 97

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102
KẾT LUẬN 102
KIẾN NGHỊ 103
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 104
TÀI LIỆU THAM KHẢO 105
PHỤ LỤC 120
Phụ lục 1: Đạo đức nghiên cứu 120
Phụ lục 2: Đọc kết quả điện di và đặt tên cho các locus, các elen kiểm soát
phổ hoạt tính các enzyme 121
Phụ lục 3: Các bƣớc tiến hành kỹ thuật ELISA 126
Phụ lục 4: Bảng nồng độ thử nghiệm trong tạo chủng muỗi kháng với
permethrin từ muỗi An. dirus chủng nuôi phòng thí nghiệm 128

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ABTS: 2,2' – azino – bis (3-ethylbenzothiazoline-6sylphonic acid)
ADN: Acid Deoxyribonucleic
ALDOX: aldehyde oxidase
An. : Anopheles
ATP: Adenosine triphosphate
bp: Base pair (cặp bazơ )
COI: Cytochrome C oxidase I gene
COII: Cytochrome C oxidase II gene
cs: Cộng sự
D
N
: Genetic distance (Khoảng cách di truyền )
D3: Dopamine receptor gene
DDT: Diclo- diphenyl- triclo- ethane

dATP: deoxyadenosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dNTP: deoxynucleoside triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
(E.C): Enzyme code (Mã số enzyme )
EC: European commission (Cộng đồng Châu Âu )
EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
(Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme )
EST: Esterase
et al: và những ngƣời khác
EtBr: Ethidium bromide
FUM: Fumerate hydratase
HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase
HK: Hexokinase

GABA: Gama aminobutyric acid
GPI: Glucosephosphate isomerase
GPDH: Glycerophosphate dehydrogenase
GOT: Glutamate oxaloacetate transminase
GST: Glutathion S transferase
HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase
IGS: Intergenic spacer (Vùng đệm nội gen)
ITS: Internal transcripbed spacer (Vùng đệm nội phiên mã)
IDH: Isocitrate dehydrogenase
I
N
: Genetic Identity (Hệ số tƣơng đồng di truyền )
KST: Ký sinh trùng

KST SR: Ký sinh trùng sốt rét
LAP: Leucine aminopeptidase
LC
50
:
Lethal concentration 50% (Nồng độ chết 50%)
LDH: Lactate dehydrogenase
mAB: Monoclonal antibody (Kháng thể đơn dòng )
MP: Maximum parsimony (Hà tiện tối đa)
MDH: Malate dehydrogenase
ME: Malic enzymee
MPI: Manose phosphate isomerase
NAD: 1-Naphthaleneacetamide
NBT: Nitroso Blue Tetrazolium
NJ: Neighbor joining
ND5: NADH dehydrogenase 5 gene
ND6: NADH dehydrogenase 6 gene
nAchR: Nicotine acetylcholine receptor
NST: Nhiễm sắc thể
ODH: Octanol dehydrogenase
P.: Plasmodium

PCR: Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp )
PGM: Phosphate glucomutase
6 PGD: 6 Phosphogluconate dehydrogenase
QT: Quần thể
qRT-PCR: Quantitative reverse transcriptase - PCR
RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA
(Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên)
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

(Đa hình các đoạn phân cắt giới hạn)
Rf: Tốc độ chuyển dịch tƣơng đối của cấu tử điện di
r
ARN: Acid ribonucleic Ribosome
SSCP: Single Strand Conformational polymorphism
(Đa hình cấu tạo sợi đơn)
SDS: Sodium dodecyl sulfate
TBE: Tris-Borate-EDTA
TE: Tris-EDTA
Viện SR-KST-CTTƢ: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ƣơng
WHO: World Health organization
(Tổ chức y tế thế giới )


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự mồi để xác định KST trong muỗi 41
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR lần 1 nhân bản đoạn gen chung của
giống Plasmodium 42
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR đa mồi phát hiện 4 loài KST SR 43
Bảng 2.4. Trình tự mồi nhân bản đoạn COI và ND6 44
Bảng 2.5. Trình tự mồi nhân bản đoạn CYP6P4, CYP6P9 và RSP7 50
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng qRT-PCR 52
Bảng 3.1. Các điểm điều tra có muỗi thuộc nhóm loài Anopheles
leucosphyrus 54
Bảng 3.2. Tần số alen của các quần thể nghiên cứu 71
Bảng 3.3. Khoảng cách di truyền và hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các
quần thể nghiên cứu 75
Bảng 3.4. Giá trị LC
50

của permethrin sử dụng trong phòng thí nghiệm để
lựa chọn chủng An. dirus kháng (Tháng 6/2009- 6/2011) 83
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm sinh học của muỗi An. dirus thu thập tại xã
Eachrang, Sơn Thành, Phú Yên (Tháng 10/ 2010) 85
Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm sinh học của muỗi An. dirus thu thập tại Đảo
lớn Côn Đảo, Bà Rịa Vũng Tàu (Tháng 10/2009 và 11/2011). 85













DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Phân bố của 7 thành viên thuộc phức hợp Dirus (An. cracens ở
Sumatra không có trong hình) (theo Manguin và cs., 2008)[71] 6
Hình 1.2. Bản đồ phân bố các thành viên nhóm loài Anopheles leucosphyrus
(theo Valerie Obsomer, 2007)[80] 7
Hình 1.3. Cơ chế khử độc của DDT 26
Hình 1.4. Cơ chế kháng do thay đổi vị trí đích ở mức độ phân tử (theo
Brogdon WG., 1998) [42]. 27
Hình 1.5. Cơ chế tác động gây chết muỗi của 4 nhóm hóa chất (WHO,
2006) [110] 28

Hình 1.6. Cấu trúc của GABA 31
Hình 3.1. Địa điểm thu thập mẫu muỗi trong nhóm loài Anopheles
leucosphyrus 55
Hình 3.2. Sinh cảnh của muỗi thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus 56
Hình 3.3. Hình ảnh ổ bọ gậy muỗi thu thập tại Bắc Kạn 58
Hình 3.4. Sơ đồ mô tả hình thái cánh điển hình An. dirus (theo Sallum,
2005) 59
Hình 3.5. Hình thái cánh của An. dirus Phú Yên 59
Hình 3.6. Hình thái cánh của muỗi thu thập tại Bắc Kạn 60
Hình 3.7. Một số đặc điểm của bọ gậy Anopheles dirus 60
Hình 3.8. Sơ đồ mô tả hình thái bọ gậy Anopheles dirus (theo Sallum, 2005) 61
Hình 3.9. Một số đặc điểm của bọ gậy thu thập tại Bắc Kạn 62
Hình 3.10. Sơ đồ mô tả hình thái điển hình bọ gậy Anopheles takasagoensis
(theo Sallum, 2005) 63
Hình 3.11. Một số đặc điểm của quăng Anopheles dirus 64
Hình 3.12. Sơ đồ mô tả hình thái quăng Anopheles dirus (theo Sallum,
2005) 65
Hình 3.13. Một số đặc điểm của quăng thu thập tại Bắc Kạn 66
Hình 3.14. Sơ đồ mô tả hình thái điển hình quăng Anopheles takasagoensis
(theo Sallum, 2005) 67


Hình 3.15. Kết quả thử nghiệm ELISA phát hiện KST trong muỗi thu thập
tại Phú Yên và Quảng Trị 68
Hình 3.16. Kết quả xác định ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật PCR 69
Hình 3.17. Hình ảnh điện di của hệ isozyme IDH của các quần thể An. dirus 70
Hình 3.18. Hình ảnh điện di của hệ isozyme 6-PGD (A), αPGD (B), GPI (C)
của các quần thể An. dirus 72
Hình 3.19. Hình ảnh điện di của hệ isozyme GOT của các quần thể An.
dirus 74

Hình 3.20. Hình ảnh điện di hệ isozyme PGM của các quần thể An. dirus 74
Hình 3.21. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các quần thể An.
dirus nghiên cứu dựa trên số liệu điện di isozyme. 76
Hình 3.22. Hình ảnh sản phẩm PCR khuếch đại gen COI của các quần thể
nghiên cứu 77
Hình 3.23. Hình ảnh sản phẩm PCR khuếch đại gen ND6 của các quần thể
nghiên cứu 77
Hình 3.24. Cây chủng loại phát sinh theo phƣơng pháp NJ của nhóm loài
Anopheles leucosphyrus theo trình tự gen COI và ND6 79
Hình 3.25. Cây chủng loại phát sinh theo phƣơng pháp MP của nhóm loài
Anopheles leucosphyrus theo trình tự gen COI và ND6 81
Hình 3.26. Biểu đồ biểu thị giá trị LC
50
của permethrin với An. dirus qua
các thế hệ 84
Hình 3.27. Sản phẩm PCR sử dụng đôi mồi Agd1 và Agd2. 86
Hình 3.28. Sản phẩm đƣợc hình thành do sử lý bằng enzyme giới hạn Fsp1 87
Hình 3.29. Sản phẩm PCR khuếch đại locus gen CYP6P9a 88
Hình 3.30. Đồ thị so sánh mức độ biểu hiện gen CYP6P9a và CYP6P9b của
hai dòng muỗi kháng và nhạy 89

1

MỞ ĐẦU
Bệnh sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng trong máu
Plasmodium spp. gây ra và thƣờng gặp ở các nƣớc nhiệt đới. Bệnh lây lan chủ
yếu từ ngƣời này sang ngƣời khác qua trung gian là muỗi Anopheles. Bệnh sốt
rét có thể gây tử vong cho con ngƣời.
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), sau nhiều năm tiến hành chiến
lƣợc “tiêu diệt sốt rét” (từ năm 1955- 1991), trên thế giới vẫn còn trên 2 tỷ

ngƣời/100 quốc gia sống trong vùng sốt rét lƣu hành. Ở Việt Nam, tình hình
sốt rét những năm gần đây có cải thiện nhƣng nguy cơ sốt rét quay trở lại vẫn
còn là điều lo ngại của ngành Y tế và các cấp chính quyền. Việc giám sát
vector truyền bệnh có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chiến lƣợc phòng
chống và tiêu diệt bệnh sốt rét. Tuy nhiên, công việc này còn gặp nhiều khó
khăn do các vector truyền bệnh rất đa dạng về tập tính, sinh lý, sinh thái, di
truyền cũng nhƣ khả năng kháng hóa chất diệt côn trùng. Do đó việc xác định
chính xác và nắm rõ bản chất sinh học của các vector là hết sức cần thiết.
Nhóm loài Anopheles leucosphyrus thuộc series Neomyzomya, giống
Anopheles (Cellia). Nhiều loài trong nhóm loài này đóng vai trò là vector
chính truyền bệnh sốt rét cho ngƣời tại vùng Đông Nam Á: Anopheles
balabacensis, Anopheles latens, Anopheles leucosphyrus [94], Anopheles
baimaii, Anopheles dirus. Ở Việt Nam, Toumanoff (1936) đã phát hiện thấy
muỗi thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus và đặt tên là An.leucosphyrus,
về sau loài muỗi này đƣợc chuyển tên thành An. balabacensis[19]. Những
nghiên cứu sau này cho rằng ở Việt Nam có An. dirus và An. takasagoensis
thuộc nhóm loài này [16]. Ngoài 2 loài trên, theo Peyton còn có dạng Côn
Sơn và một mẫu muỗi cái ở Quảng Ninh chƣa đƣợc phân loại đến loài [84].
Tuy nhiên, những nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử của Manguin và cs

2

(2002) lại kết luận rằng ở Việt Nam chỉ có một loài là An. dirus A (An. dirus
s.s)? Nhƣ vậy thành phần loài của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt
Nam là chƣa rõ ràng. Các nghiên cứu tại Việt Nam chủ yếu tập trung vào loài
An. dirus. Hàng loạt công trình nghiên cứu từ năm 1962 đến nay đã khẳng
định An. dirus là loài muỗi hoang dại truyền sốt rét nguy hiểm, tuổi thọ dài,
có vùng phân bố trùng với vùng phân bố của ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc
P. falciparum, gây ra các vụ dịch dai dẳng từ Thanh Hóa trở vào Nam, đặc
biệt vào mùa mƣa là mùa truyền bệnh sốt rét mạnh nhất của khu vực miền

Trung - Tây nguyên.
Để góp phần đánh giá thành phần loài, đặc điểm di truyền và đề xuất
những ý kiến đóng góp vào việc lựa chọn những biện pháp phòng chống thích
hợp với vector truyền sốt rét nguy hiểm này, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, đa hình di truyền và tính kháng với
hóa chất diệt côn trùng của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt
Nam”
Với Mục tiêu nhƣ sau:
1. Xác định đƣợc đặc điểm sinh học và sự đa hình di truyền của các thành
viên trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam
2. Xác định tính kháng hóa chất diệt côn trùng của loài An. dirus ở Việt
Nam.







3

Nội dung nghiên cứu của luận án:
1. Điều tra đặc điểm sinh học, thu thập mẫu vật tại thực địa.
2. Phân tích isozyme và ADN để đánh giá tính đa hình di truyền của
các thành viên trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam.
3. Phân tích tính kháng của các quần thể An. dirus ngoài thực địa và
chủng kháng phòng thí nghiệm.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
 Ý nghĩa khoa học: Luận án ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào
nghiên cứu đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của nhóm loài

Anopheles leucosphyrus cho kết quả chính xác, sâu sắc và toàn diện
hơn so với các nghiên cứu trƣớc. Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc
số loài, số dạng của nhóm loài này ở Việt Nam.
 Ý nghĩa thực tiễn: Xác định đúng đƣợc thành phần loài, tỷ lệ nhiễm
KST sốt rét, tính đa hình di truyền của một nhóm loài truyền bệnh sốt
rét chính nhƣ nhóm loài Anopheles leucosphyrus tại Việt Nam rất quan
trọng. Điều này giúp cho các nhà dịch tễ học đánh giá đúng tình hình
vector truyền bệnh tại điểm nghiên cứu từ đó đề xuất những chính sách,
chiến lƣợc phòng chống bệnh hiệu quả và làm giảm gánh nặng sốt rét
cho xã hội.








4

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Lần đầu tiên phối hợp nhiều kiểu dấu hiệu từ hình thái đến điện di
enzyme và phân tích phân tử ADN để nghiên cứu một nhóm loài đồng
hình có vai trò truyền sốt rét ở Việt Nam và đã xác định đƣợc mối quan
hệ di truyền giữa các thành viên trong nhóm loài Anopheles
leucosphyrus
2. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tồn tại của một dạng mới có cấu trúc di
truyền khác biệt so với các loài muỗi khác trong nhóm loài Anopheles
leucosphyrus. Dạng muỗi này ở miền Bắc Việt Nam (tỉnh Bắc Kạn ) và
tạm gọi là dạng Anopheles Bắc Kạn.

5

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS
TRÊN THẾ GIỚI
Nhóm loài Anopheles leucosphyrus thuộc series Neomyzomya, giống
Anopheles (Cellia). Hơn một thế kỷ qua, đặc biệt là trong 5 thập niên trở lại
đây, nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh đây là một nhóm loài bao
gồm 14 loài đã đƣợc định tên, 2 dạng địa lý và 6 loài mới đƣợc mô tả [80].
Phân bố địa lý của nhóm loài Anopheles leucosphyrus trải dài từ Tây Nam Ấn
Độ đến phía Nam Trung Quốc, Đài Loan, lục địa Đông Nam Á, Indonesia và
Philippine. Nhóm loài này đƣợc Peyton (1989) [84] chia làm 3 phân nhóm:
Phân nhóm Leucosphyrus, phân nhóm Hackeri và phân nhóm Riparis, trong
đó các loài trong phân nhóm Leucosphyrus đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Phân
nhóm Leucosphyrus gồm các phức hợp Dirus, phức hợp Leucosphyrus, An.
baisasi Colless và dạng địa lý Côn Sơn. Phức hợp loài Dirus gồm 7 loài thành

viên là An. dirus (= An. dirus A) phân bố rộng rãi ở vùng Đông Á- có mặt ở
Myanmar, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam và đảo Hải Nam (Trung
Quốc). An. cracens (= An. dirus B) có ở miền nam (bán đảo) Thái Lan, bán
đảo Malaysia và Sumatra (Indonesia). An. scanloni (= An. dirus C) có mặt ở
một vùng tƣơng đối hẹp dọc theo biên giới Nam Myanmar, phía Tây và Nam
Thái Lan, có liên kết mật thiết với môi trƣờng đá vôi. An. baimaii (= An. dirus
D) có mặt từ các vùng Tây Nam Trung Quốc (tỉnh Vân Nam), Tây Thái Lan,
Myanmar, Bangladesh đến đông bắc Ấn Độ và đảo Andaman (Ấn Độ) [92].
An. elegans (= An. dirus E) giới hạn ở vùng rừng có nhiều đồi núi (hilly
forests) của Tây Nam Ấn Độ. An. nemophilous (= An. dirus F) phân bố rải rác
dọc theo bán đảo Thái-Malay, vùng biên giới Thái Lan với Myanmar và
Campuchia. Cuối cùng là An. takasagoensis chỉ có ở Đài Loan. Sự phân bố

6

của các thành viên trong phức hợp Dirus nói riêng và trong nhóm loài
Anopheles leucosphyrus đƣợc chỉ rõ trên hình 1.1. và 1.2.


Hình 1.1. Phân bố của 7 thành viên thuộc phức hợp Dirus (An. cracens ở Sumatra
không có trong hình) (theo Manguin và cs., 2008)[71]

7


Hình 1.2. Bản đồ phân bố các thành viên nhóm loài Anopheles leucosphyrus (theo
Valerie Obsomer, 2007)[80]


8

Một số loài trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus đã đƣợc xác định
có vai trò truyền bệnh sốt rét chủ yếu hoặc thứ yếu ở ngƣời nhƣ An. dirus, An.
baimaii, An. sracens, An. scanloni, An. leucosphyrus, An. latens.
Trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus, phức hợp Dirus đƣợc nghiên
cứu kỹ và toàn diện nhất. Phức hợp Dirus bao gồm các loài vector sốt rét rừng
chính, chủ yếu là An. dirus và An. baimaii, là 2 loài lan truyền cả P.
falciparum và P. vivax. Các nghiên cứu cho thấy rằng đây là các loài thích
gần ngƣời, chủ yếu tiêu máu ngoài nhà (exophagic) và có khả năng truyền sốt
rét cao [37]. An. cracens là loài thích gần ngƣời, loài này cũng có thể có vai
trò trong lan truyền sốt rét, cũng giống nhƣ An. scanloni và An. elegan. Các
phƣơng pháp xác định bằng hình thái và phân tử hiện có cho phép các nhà
nghiên cứu khảo sát về mức độ truyền bệnh qua đó xác định loài nào có thể
liên quan đến vai trò lan truyền sốt rét. Hai loài khác trong phức hợp là An.
nemopilous và An. takasagoensis không có vai trò lan truyền sốt rét do tập
tính thích súc vật của chúng (Zoophilic) [37,84].
Các loài trong phức hợp Dirus là các loài muỗi rừng (rừng đồi thấp,
rừng sâu, rừng trồng), nhƣng thỉnh thoảng thu thập đƣợc ở vùng bìa rừng. Bọ
gậy của các loài muỗi này chủ yếu sống ở vũng nƣớc nhỏ, thƣờng là tạm thời,
chủ yếu là nƣớc đọng, sạch có bóng râm, vũng nƣớc mƣa, dấu chân động vật,
suối thậm chí trong giếng ở các vùng núi đồi có rừng sơ cấp, thứ cấp hoặc
rừng có lá rụng, rừng tre, và các đồn điền trồng cao su, cây ăn quả [37].
Các thành viên trong phức hợp loài Dirus khác nhau về đặc điểm hình
thái, phân bố, tập tính sinh học, vai trò truyền bệnh đặc biệt sự sai khác đặc
điểm di truyền tế bào (số lƣợng và vị trí vùng dị nhiễm sắc ở bộ nhiễm sắc thể
nguyên phân và nhiễm sắc thể khổng lồ) [33,34,35,36,38], khác nhau về đặc
điểm điện di enzyme [62]. Gần đây, kỹ thuật PCR sử dụng các mồi đặc hiệu

9

đã đƣợc áp dụng tại Thái Lan để phân biệt 3 loài An. dirus, An. cracens
Sallum & Peyton, An. scanloni Sallum & Peyton và loài An. baimaii Sallum
& Peyton thuộc phức hợp loài Dirus [67]. Tƣơng tự nhƣ vậy, Xu và cs. 1998
đã sử dụng kỹ thuật PCR dựa trên sự khác biệt về trình tự đoạn ITS2 của
ADN ribosome để nghiên cứu quần thể An. dirus A và An. dirus D của Trung
Quốc [115]. Walton và cs (1999) chỉ ra rằng trình tự ITS2 của loài An. dirus
D ở Trung Quốc theo nghiên cứu của Xu (1998) là khác với mẫu ở Thái Lan
và đó có thể là một loài chƣa đƣợc công nhận trong phức hợp loài Dirus
[104].
Walton và cs (2000, 2001) cũng đã đƣa ra những bằng chứng di truyền
chứng minh An. dirus và An. scracens là loài chị em, có quan hệ gần hơn so
với giữa An. dirus và An. scanloni [103,104]. Năm 2002, Manguin và cs đã
dùng kỹ thuật PCR đa mồi để phân biệt An. dirus, An. cracens, An. scanloni
và An. baimaii ở Đông Nam Á [72]. Nghiên cứu xem xét lại nhóm loài
Anopheles leucosphyrus của Sallum và cs. (2005) cho thấy các đặc điểm hình
thái xuất hiện ở các giai đoạn trong chu kỳ sống của muỗi có thể dùng để
phân biệt các loài [92]. Tuy nhiên tác giả cũng nhấn mạnh “do sự biến thiên
thay đổi phức tạp về hình thái của chúng, nên việc tách biệt nhiều loài trong
nhóm này (nhóm Anopheles leucosphyrus) bằng các đặc điểm hình thái sẽ
luôn luôn là một sự thách thức”.
Tóm lại, lịch sử tiến hóa cũng nhƣ mối quan hệ di truyền và chủng loại
phát sinh của các loài trong phức hợp loài Dirus nói riêng và nhóm loài
Anopheles leucosphyrus nói chung vẫn chƣa có những kết luận chính xác và
cần phải có những nghiên cứu sâu hơn.

10

1.2. TỔNG QUAN NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở
VIỆT NAM
Trƣớc năm 1962, ở Việt Nam đã phát hiện ra loài muỗi thuộc nhóm

loài Anopheles leucosphyrus ở vùng đồi núi và cao nguyên miền Trung với
tên gọi là Anopheles leucosphyrus [101]. Sau đó, nó lại đƣợc đổi tên là
Anopheles balabacensis, tên gọi này vẫn còn dùng cho đến đầu những năm 80
của thế kỷ 20 [19]. Sau khi công bố loài mới Anopheles dirus Peyton &
Harrison 1979, tên gọi của An. balabacensis ở Việt Nam lại đƣợc chuyển
thành An. dirus. Phân bố của loài muỗi này từ Nam Thanh Hoá trở vào miền
Nam Việt Nam. An. dirus là loài truyền sốt rét rất mạnh [7]. Những nghiên
cứu sau này cho rằng có sự tồn tại của loài thứ hai trong nhóm loài này ở Việt
Nam là An. takasagoensis phân bố miền Bắc [16]? Ngoài hai loài trên, mẫu
vật thu thập tại miền Nam còn có thêm dạng Côn Sơn (Peyton, 1989) [84] và
ở miền Bắc còn có một mẫu muỗi cái ở Quảng Ninh thu thập năm 1970 chƣa
đƣợc định loại đến loài.
Hầu hết các nghiên cứu tại Việt Nam mới chỉ tập trung vào loài An.
dirus, vì là một vector truyền bệnh sốt rét chủ yếu ở miền Trung Tây Nguyên.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học loài muỗi quan trọng này đã đƣợc tiến hành từ
năm 1993, đặc biệt tại Khánh Phú 9,10,11. Nghiên cứu ngoài tự nhiên cho
thấy: bọ gậy An. dirus có mật độ cao vào các tháng cuối mùa khô khi có trận
mƣa nhỏ, rải rác (tháng 7,8,9) và những tháng mùa mƣa (tháng 10, 11, 12)
sau đó mật độ giảm dần và xuống thấp vào các thàng mùa khô (từ tháng 1 đến
tháng 6). Ổ bọ gậy ở trong rừng, cách khu dân cƣ chừng 100- 500m, là những
vũng nƣớc đọng, trên những hốc đá hay trong các suối cạn vào mùa khô.
Nƣớc hầu nhƣ không lƣu thông, đáy có cát, sỏi hay đất sỏi có lá cây mục. Ổ
bọ gậy có đƣờng kính từ 20 - 60 cm, độ sâu mức nƣớc 10 - 40 cm, độ pH từ 6
đến 7, nhiệt độ không khí 26,7˚C- 31˚C (trung bình 28,2˚C), ẩm độ từ 71 -

11

86% (trung bình 80,5%), phía trên là các bụi cây, đƣợc che bằng tán cây lớn,
ánh sáng không chiếu trực tiếp vào đƣợc. Đặc biệt là trong các ổ nhân tạo (vại
sành) thƣờng gặp bọ gậy loài muỗi này trong tất cả các tháng của năm.

Mùa phát triển của An. dirus ngoài tự nhiên: An. dirus phát triển chủ
yếu trong mùa mƣa, đỉnh cao vào các tháng 10, 11 hàng năm ở Khánh Hoà,
Phú Yên. Vào các tháng mùa khô (từ tháng 2- 6) mật độ muỗi giảm rất thấp
29,31. Tuy nhiên loài muỗi này có mặt hầu nhƣ quanh năm tại khu vực dân
cƣ ở Vân Canh, Bình Định 30,32 còn ở Sê - Đăng, Quảng Nam lại có đỉnh
vào tháng 6,7 24,25
Tính ƣa thích vật chủ: An. dirus đốt ngƣời cả trong nhà và ngoài nhà
song mật độ đốt ngƣời ngoài nhà bao giờ cũng cao hơn trong nhà (ngƣời ngồi
ngoài nhà cách thôn bản 200-300m, gần rừng hơn) đặc biệt nhà rẫy sát rừng
mùa khô có mật độ muỗi đốt ngƣời đạt tới 1,3 con/ngƣời/ đêm cao hơn mồi
ngƣời trong nhà trong làng khoảng 0,4 con/ngƣời/đêm [31.
Muỗi An. dirus vào nhà đốt ngƣời suốt đêm từ 18 giờ tối đến 6 giờ
sáng, đỉnh cao vào 22 giờ đến 23 giờ. Tính chung trong đêm số lƣợng An.
dirus vào nhà đốt ngƣời tập trung từ chập tối đến nửa đêm. Số lƣợng muỗi hút
máu nhiều hơn vào những đêm trăng sáng 31. Tại Khánh Phú, Khánh Hoà
thu thập muỗi bằng phƣơng pháp soi trong nhà ban ngày chỉ bắt đƣợc muỗi
trong màn hoặc trong bẫy muỗi. Trong đó 97% muỗi vừa hút máu vào đêm
hôm trƣớc (Sella II), chỉ có 3% muỗi đói. Điều này khẳng định đây là loài
muỗi hoang dại có tập tính trú đậu tiêu máu ngoài nhà 31. Ở các địa
phƣơng từ Nghệ An tới Quảng Trị, An. dirus có mặt ở 30 điểm điều tra. Tuy
vậy không nơi nào trong số các điểm này bắt đƣợc muỗi trú đậu trong nhà
mặc dù tiến hành bắt muỗi ngay khi trời vừa sáng. Ở Vân Canh, Bình Định đã
tiến hành thu thập muỗi trong nhà liên tục 12 tháng trƣớc khi sử dụng DDT

12

nhƣng chỉ bắt đƣợc 11 muỗi cái bụng còn máu tƣơi bị kẹt lại do trời mƣa to
trƣớc khi sáng 23,32.
Vai trò truyền bệnh của An. dirus: mổ soi tuyến nƣớc bọt thấy tỷ lệ
nhiễm thoa trùng của loài muỗi này rất cao 3,98%. Bằng kỹ thuật ELISA thì

xác định đƣợc tỷ lệ này là 8,53%.
Bên cạnh đó đã có một số nghiên cứu về enzyme, về di truyền tế bào
cũng đã đƣợc tiến hành trên đối tƣợng này [10,11,12], tuy nhiên việc nghiên
cứu chƣa đồng bộ. Những phân tích về ADN của Manguin và cs (2002) [72]
đã đi đến kết luận toàn bộ muỗi An. dirus ở Việt Nam (kể cả một mẫu mang
những đặc điểm hình thái giống An. dirus và An. takasagoensis ở cả giai đoạn
bọ gậy và muỗi trƣởng thành do TS. Nguyễn Đức Mạnh cung cấp) đều là An.
dirus A.
1.3. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN Ở MUỖI SỐT
RÉT
Theo tổ chức y tế thế giới, muỗi đƣợc coi là vector truyền bệnh trong
mƣời bệnh sốt nhiệt đới chính, trong đó có bệnh sốt rét đƣợc coi là bệnh nguy
hiểm hàng đầu. Bệnh sốt rét mang tính toàn cầu, có 107 nƣớc và vùng lãnh
thổ chịu ảnh hƣởng của bệnh này.
Ở Việt Nam, sốt rét là bệnh nghiêm trọng và phổ biến. Đặc biệt các
vùng lƣu hành bệnh bao gồm vùng rừng núi phía Bắc, ven dọc Trƣờng Sơn,
cao nguyên miền Trung, khu vực Đông Nam, Tây Nam và miền duyên hải.
Một số loài thuộc giống muỗi Anopheles đƣợc xem là vector truyền
bệnh sốt rét. Theo những nghiên cứu gần đây thì hầu hết các loài muỗi truyền
sốt rét trƣớc đây đƣợc định loại đều là các phức hợp loài hoặc nhóm loài đồng
hình, trong đó có nhiều loài đƣợc xác định là vector truyền bệnh sốt rét quan
trọng. Các loài trong các nhóm loài này có vai trò truyền bệnh khác nhau, tính

13

kháng hóa chất diệt côn trùng cũng khác nhau, do đó việc phân loại chính xác
và mối quan hệ di truyền giữa các loài trong một nhóm loài hoặc phức hợp
loài đóng vai trò hết sức quan trọng trong chiến lƣợc phòng chống bệnh sốt
rét.
Đa hình di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị trong một loài,

một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Đây là sự đa dạng về thành phần
kiểu gen của các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau. Tính
đa dạng về gen có thể di truyền đƣợc trong một quần thể hoặc giữa các quần
thể.
Đa hình di truyền biểu hiện sự biến đổi của vật chất di truyền, biến đổi
về các cặp bazơ nitơ và sự tổ hợp trình tự của các cặp bazơ nitơ trong phân tử
ADN.
Tính đa hình di truyền có thể đƣợc xác định ở nhiều mức độ tổ chức bao
gồm từ số lƣợng, cấu trúc của ADN trong mỗi tế bào cũng nhƣ số lƣợng, cấu
trúc của nhiễm sắc thể, protein hay hình thái của mỗi loài trong các điều kiện
tự nhiên khác nhau
1.3.1. Đa hình enzyme và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở
muỗi
Tính đa hình thực chất là hiện tƣợng biến dị của một kiểu gen. Đa hình
enzyme cũng chính là một trong các hình thức biểu hiện của đa hình di
truyền. Thuật ngữ “isozyme” xuất hiện để biểu thị các enzyme có cùng chức
năng nhƣng do các locus khác nhau quy định. Các biến thể tƣơng ứng của
isozyme là allozyme. Allozyme là các sản phẩm của những alen khác nhau
của cùng một locus. Hiện tƣợng đa hình isozyme trong tự nhiên là kết quả của
đột biến gen cấu trúc của các locus kiểm soát việc tổng hợp các sản phẩm
trên, đột biến có thể xảy ra ở nhiều mức độ khác nhau. Một số axit amin có