đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu việt nam thuộc chỉ đảng sâm (codonopsis sp) bằng kỹ thuật and mã vạch

i
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN






Nguyễn Thị Thanh Nga




ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY
DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM
(Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC




Hà Nội – 2012
ii
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thanh Nga





ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY
DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM
(Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Đinh Đoàn Long


Hà Nội – 2012
iii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Chi Codonopsis 4
1.1.1. Phân loại học 4
1.1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố 4
1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ

truyền…………… 8
1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode) 11
1.3. Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu 13
1.3.1. Mã vạch ADN ở động vật 13
1.3.2. Mã vạch ADN ở thực vật 14
1.4. Ứng dụng mã vạch ADN trên thực vật 19
1.4.1. Ứng dụng ở thực vật nói chung 19
1.4.2. Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dược liệu 24
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Vật liệu nghiên cứu 32
2.1.1. Vật liệu thực vật 32
2.1.2. Hóa chất 32
2.1.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33
2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 33
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 33
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số 33
2.2.2. Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết 34
2.2.3. Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR 35
2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự 36
2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu 37
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Tách chiết ADN tổng số 38
iv
3.2. Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR 39
3.3. Phân tích kết quả 40
3.3.1. Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên các vùng gen nghiên cứu 41
3.3.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

v
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1. Bảng liệt kê một số các nghiên cứu sử dụng mã vạch ADN như một công cụ
nhận diện [25] 21
Bảng 2. Một số dự án mã vạch ADN thực vật đang thực hiện hay đang trong giai
đoạn dự kiến năm 2011 [30] 23
Bảng 3. Những cặp mồi được sử dụng thông dụng trong việc khuyếch đại và giải
trình tự các mã vạch ADN 26
Bảng 4. Địa điểm thu mẫu và thông tin mẫu sử dụng trong nghiên cứu 32
Bảng 5. Các cặp mồi sử dựng trong nghiên cứu 33
Bảng 6. Thành phần của phản ứng PCR 35
Bảng 7. Chu trình nhiệt cho gen ITS 35
Bảng 8. Chu trình nhiệt cho gen matK 35
Bảng 9. Kết quả đo OD một số mẫu nghiên cứu 39
Bảng 10. Bảng thống kê các điểm sai khác trong trình tự ADN giữa các loài
Codonopsis trên vùng gen ITS 45
Bảng 11. Tỷ lệ % nhận diện của gen ITS (nửa trên đường chéo) và số khác biệt (nửa
dưới đường chéo) của 21 mẫu Codonopsis 50
Bảng 12. Bảng thống kê các điểm đa hình trong trình tự gen matK giữa các loài
Codonopsis nghiên cứu 53
Bảng 13. Tỷ lệ phần trăm nhận diện của gen matK (nửa trên đường chéo) và số khác
biệt giữa các loài (nửa dưới đường chéo) của 16 mẫu Codonopsis 56

vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Loài Codonopsis pilosula 5
Hình 2. Hoa của loài C. javanica 6
Hình 3. Codonopsis tangsheng 7

Hình 4. Hoa của các loài (a) C. nervosa (b) C.lanceolata (c) C. ussuriensis 7
Hình 5. Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%,
marker 1kb … 38
Hình 6. Ảnh điện di sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen ITS của mẫu Codonopsis
trên gel agarose 1%, marker 100bp 40
Hình 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK của mẫu Codonopsis trên
gel agarose 1% 40
Hình 8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp MP chạy trên khung
đọc gen ITS, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 58
Hình 9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp MP chạy trên khung
đọc gen matK, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 59
Hình 10. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Bayesian trên khung
đọc gen ITS, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x10
6
thế
hệ……… 60
Hình 11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Bayesian trên khung
đọc gen matK, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x10
6
thế
hệ…………………………………………………………………………………… 61

vii
BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Nghĩa tiếng Anh
Nghĩa tiếng Việt
ADN
Deoxyribonucleic acid
Axit deoxyribonucleic

Bp
Base pair
Cặp bazơ nitơ
dNTP
Deoxyribonucleotide triphosphate
Deoxyribonucleotit triphosphat
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetic
Acid
Axit ethylene diamine tetraacetic
Kb
Kilobase (= 1000 bp)
1000 cặp bazơ
MP
Maximum Parsimony
Thuật toán tiết kiệm tối đa
OD
Optical density
Mật độ quang học
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi polymerase
Rcf
relative centrifugal force
Lực ly tâm tương đối
mtDNA
mitochondrial DNA
ADN ty thể
IGS intergenic spacer vùng liên gen

1
MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có
nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam
hiện đã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 loài Rêu, 600
loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo. Trong đó có nhiều loài được dùng làm thuốc. Theo
kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), tính đến năm 2005 đã ghi nhận được
3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng
vật có công dụng làm thuốc. Trong tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90 % là các cây
mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % là các cây
thuốc trồng. Bộ Y tế cũng đã thống kê, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn
dược liệu khác nhau để dùng trong y học cổ truyền hoặc làm nguyên liệu cho công
nghiệp dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 được khai thác từ nguồn cây thuốc
mọc tự nhiên hoặc trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung
cấp tới hơn 20.000 tấn mỗi năm. Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao
gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện
nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ
trong cộng đồng và hiện chưa có những con số thống kê cụ thể. Những số liệu này
cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú và đa dạng, việc sử dụng dược
liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và rất phổ biến, có vai trò quan trọng trong nền kinh
tế - xã hội. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được dùng
làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác? Đặc biệt giữa các loài có đặc
điểm hình thái tương tự nhau.
Trên thế giới, thực vật cũng được sử dụng làm thuốc ngay từ thời tiền sử [8],
[47], và được ghi nhận sử dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau, phổ biến nhất
là các loài gần gũi với con người [58]. Trong y học cổ truyền các nước, nhìn chung
các nguồn dược liệu, các hợp chất bổ sung và các loại thuốc thảo dược thường được
xác định ở cấp độ loài qua tên khoa học (tên La tinh) của chúng, và đây là đơn vị cơ
bản cho việc chuẩn bị của các công thức thảo dược [73]. Dược điển quốc gia Trung
Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm và các nhà quản lý luôn bắt đầu mô

2
tả các loại thuốc thảo dược bằng cách xác định tên các loài thực vật được sử dụng.
Thật không may, dược liệu thay thế hoặc được làm giả do cố ý (ví dụ vì lý do lợi
nhuận) hoặc vô ý (chẳng hạn do sai sót khi ghi chép hoặc thiếu kiến thức) xuất hiện
không hiếm trong thực tế và có thể gây nguy cơ nghiêm trọng trong việc sử dụng
các thuốc thảo mộc để trong điều trị và hỗ trợ điều trị.
Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùng
chủ yếu dựa trên phân tích hình thái vĩ mô (quan sát bằng mắt) và vi mô (quan sát
tiêu bản hiển vi) của mẫu vật. Công việc này thường được thực hiện bởi một chuyên
gia về hình thái dược liệu. Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại sau khi
các nguyên liệu thực vật đã qua xử lý hoặc sơ chế. Vì vậy, các phương pháp bổ
sung giúp xác định chính xác các loài cây thuốc dựa trên hệ gen (ADN) đặc thù của
chúng đã được phát triển vào cuối những năm 1990 [62]. Công việc này nối tiếp các
thành tựu về ứng dụng các kỹ thuật phân tích DNA trong nghiên cứu hệ thống học
thực vật được bắt đầu khoảng mười năm trước đó [20] kể từ sự phát minh phản ứng
chuỗi trùng hợp - PCR [13]. Phương pháp PCR và sau này là sự phát triển của kỹ
thuật giải trình tự ADN tự động đã tạo bước ngoặt có tính cách mạng trong các
nghiên cứu về ADN. Trong thực tế, các nhà phân loại học phân tử hiện nay đang
hình dung ra danh mục tất cả các loài sinh vật sống trên trái đất bằng cách sử dụng
kỹ thuật gọi là mã vạch ADN (DNA barcode) thông qua việc xác định được các
trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và dùng chúng như “mã vạch” để nhận biết
các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc bảo quản lâu dài [29], [66].
Theo nguyên lý đó, các phương pháp định danh dựa trên ADN cũng đã được
phát triển cho việc nhận dạng các loài cây thuốc. ADN nhân và lạp thể được
khuyếch đại (nhân bội) bằng PCR và các sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng
điện di gel, được giải trình tự hoặc được lai với các đầu dò (DNA probe) đặc hiệu
loài. “Dấu vân tay” (fingerprinting) của hệ gen có thể giúp phân biệt từng cá thể
trong loài, giữa các loài hoặc thậm chí giữa các quần thể trong cùng loài; điều này
rất hữu ích cho việc đồng nhất hóa (tiêu chuẩn hóa) dược liệu và khả năng phát hiện

các giả mẫu (tạp mẫu hay mẫu dễ nhầm lần về hình thái/hóa học) [73]. Dẫu trình tự

3
đơn gen nhân hay gen lạp thể đã được coi là hữu ích cho sự định loài, thì các nghiên
tiến hóa hoặc phân loại các loài vẫn thường yêu cầu phân tích các dữ liệu về ADN
từ nhiều hơn một gen hoặc một số locut của bộ gen. Việc phát hiện ra các mã vạch
ADN ở các loài cây thuốc sẽ có giá trị bổ sung cho các nghiên cứu tiêu chuẩn hóa
và kiểm định dược liệu nói riêng, và đóng góp vào nỗ lực xác định mã vạch cho tất
cả các loài sinh vật trên trái đất nói chung.
Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền
một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN”. Đề tài góp phần
xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng
cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp
phân tích trình tự ADN của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK.


4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Chi Codonopsis
Chi Codonopsis có tên thường gọi ở Việt Nam là Đảng Sâm. Đây là chi thực vật
hai lá mầm, thuộc họ Hoa chuông, với cấu tạo hoa đặc trưng dạng hình chuông. Chi
này gồm khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng Trung và Đông Á. Codonopsis được
coi là Nhân sâm của người nghèo vì theo y học cổ truyền, nó có nhiều công dụng giống
Nhân sâm nhưng lại sẵn và rẻ tiền hơn, thường được dùng thay thế Nhân sâm [75].
1.1.1. Phân loại học
Chi Codonopsis có đặc điểm phân loại học như sau:
 Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)
 Giới: Plantae (Thực vật)
 Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)

 Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín)
 Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm)
 Phân lớp: Asteriades
 Bộ: Asterales (Bộ Cúc)
 Họ: Campanulaceae (Họ Hoa chuông; Cát kiến)
 Phân họ: Campanuloideae
 Chi: Codonopsis
1.1.2. Sơ lƣợc đặc điểm hình thái và phân bố
Chi Codonopsis gồm những cây dạng cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân
quấn. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1,5 – 2 cm, phân nhánh, đầu rễ phình to
có nhiều vết sẹo lồi, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ nhánh, càng nhỏ về
phía đuôi, lúc tươi màu trắng, sau khi khô thì rễ có màu vàng sẫm, có nếp nhăn [1].
Thân mọc thành từng cụm vào mùa xuân, bò trên mặt đất hay leo vào cây
khác, thân màu tím sẫm, có lông thưa, phần ngọn không lông. Lá mọc cách hình
trứng hay hình trứng tròn, đuôi lá nhọn, phần gần cuống hình tim, mép nguyên, màu

5
xanh hơi pha vàng, mặt trên có lông nhung, mặt dưới mầu trắng xám nhẵn hoặc có
lông rải rác, dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm.

Hình 1. Hình thái loài Codonopsis pilosula
Hoa màu xanh nhạt, mọc riêng lẻ ở kẽ nách lá, có cuống dài 2-6cm, đài tràng
hình chuông, gồm 5 phiến hẹp, 5 cánh có vân màu tím ở họng, lúc sắp rụng trở
thành màu vàng nhạt, chia làm 5 thùy, nhụy 5, chỉ nhụy hơi dẹt, bao phấn đính gốc.
Quả bổ đôi, hình chùy tròn, 3 tâm bì, đầu hơi bằng, có đài ngắn, lúc chín thì nứt ra.
Có nhiều hạt màu nâu nhẵn bóng.
Trên thế giới, chi Codonopsis có khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu từ
Hymalaya đến Nhật bản, trong đó có ít nhất 39 loài đã được tìm thấy ở Đài Loan và
Trung Quốc đại lục [75], Châu Á có khoảng 11 loài, Việt Nam có 2 loài đã được mô
tả và dùng làm thuốc với tên gọi chung trong dân gian là Đảng sâm.Một số loài

Codonopsis được dùng trong y học cổ truyền các nước có thể kể đến gồm có:
- Đảng sâm leo (Codonopsis pilosula): còn gọi là Rầy cấy, Mần cấy; cây này
chưa được mô tả trong tập Flore générale de l‟Indochine, đây là cây thảo lâu năm,
thân mọc bò hay leo. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể tới 1-1,7cm. Lá mọc đối có
khi mọc cách hay hơi vòng. Hoa (Hình 1) mọc đơn độc ở nách lá. Đài 5, Tràng hình
chuông màu vàng nhạt, chia 5 thùy, nhị 5. Bầu 5 ô, quả nang, phía trên có một núm
nhỏ hình nón, khi chín có màu tím đỏ. Ra hoa vào tháng 7 tháng 8, có quả vào tháng

6
9 tháng 10. Cây mọc tự nhiên ở những vùng rừng ẩm thấp miền núi đông bắc và tây
bắc (như Lạng sơn, Cao bằng và khu Tây Bắc); người ta thu hái về bán với tên gọi
là Phòng đảng sâm.
- Đảng sâm, Kim tiền báo, Thổ đảng
sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.)
còn có tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày),
Cang hô (Mèo); đó là cây cỏ lâu năm, thân
leo. Rễ hình trụ, phân nhánh, lá mọc đối, ít
khi mọc so le hình tim, nhẵn hoặc có ít lông,
đầu lá nhọn, mép lá nguyên hoặc có khía
răng nhỏ, bấm vào lá có nhựa mủ. Phiến lá
dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm. Hoa (Hình 2)
mọc riêng rẽ ở kẽ lá, hình chuông màu trắng
hoặc hơi vàng, họng có vân tím.

Hình 2. Hoa của loài C. javanica
Đài 5, tràng 5 cánh, nhị 5. Quả nang, màu tím, chứa nhiều hạt hình trái xoan,
màu vàng bóng. Cây mọc hoang ở vùng núi cao, chỗ ẩm mát, nhiều mùn. Có nhiều
ở Hoàng Liên Sơn,Sơn La, Lai Châu, Yên Bái, Tuyên Quang, còn ở Cao Bằng,
Lạng Sơn thì ít hơn, ở các tỉnh phía nam chỉ thấy ở cao nguyên Langbian (Lâm
Đồng), xung quanh chân núi Ngọc Linh (Đắc Giây-Kon Tum và Quảng Nam- Đà

Nẵng). Ở miền núi, người dân tộc đã trồng xen Codonopsis với ngô, cho kết quả tốt.
- Đảng sâm hoa xanh (Codonopsis viridiflora M.xim), ở trên thân có nhiều
lông gai ngắn, đến lúc già thì tự rụng. Lá mọc đối hay mọc cách, dài 2 – 3 cm, hai
mặt đều có lông gai ngắn, lá nguyên không có răng cưa, cuống lá tương đối ngắn,
Hoa mọc đơn trên ngọn, tràng hình chuông, dài khoảng 1 cm màu xanh vàng, trong
có nếp nhăn ngắn. Loài này mới chỉ tìm thấy ở khu tự trị A-pa tỉnh Tứ Xuyên,
Trung Quốc.
- Đảng sâm hoa ống (Codonopsis tubulosa Kom) cây thảo thân leo bò. Thân lá
đều có lông dài, lá hẹp dài hình bầu dục, 3-8cm, đuôi lá có răng thưa. Cánh hoa sâu,

7
dài bằng nửa ống hoa, tràng hình ống, dài độ 3cm, phân bố ở khu Tây Sương tỉnh
Tứ Xuyên, Trung Quốc.
- Xuyên đảng sâm (Codonopsis
tangshen Oliv); hình thái cơ bản giống loài
C. pilosula (Franch) Nannf nhưng lá hình
trứng hay hình trứng đuôi nhọn, mặt lá
không có lông, chỉ rìa lá có lông nhung.
Sau khi ra hoa (Hình 3) thì có quả đuôi
màu trắng tím, trong hoa có sọc nhỏ màu
tím, cuống dài, hình dẹt, to hơn loại trên, ở
chổ núi cao mưa nhiều về mùa thu quả chín
không nứt. Có nhiều ở tỉnh Tứ Xuyên,
Trung Quốc.

Hình 3. Hoa Codonopsis tangsheng
- Đảng sâm mõm chó (Codonopsis nervosa Nannf), thuộc cây thảo, thân đứng
thẳng, sống nhiều năm. Rễ cọc đâm thẳng xuống, trong có lõi gỗ bằng nửa thể tích
củ, cao độ 20cm, nhỏ bé lông thô dày. Lá mọc đối, hình trứng dài 1-1,5cm, mép
nguyên, hai mặt đều có lông. Hoa (Hình 4a) có tràng hình chuông dài độ 1,5cm,

màu lam nhạt, trong có thới màu tím đậm. Có ở khu tự trị dân tộc Tạng A-pa và
chuyên khu Tây Sương tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc.


Hình 4. Hoa của các loài (a) Codonopsis nervosa, (b) Codonopsis
lanceolata, và (c) C. ussuriensis.

8
Ngoài ra còn có các loài Codonopsis lanceolata Benth. et Hook. (Hình 4b)
có rễ hình chùy và loài Codonopsis ussuriensis Hemsl (Hình 4c) có rễ hình củ tròn,
thường được trộn lẫn với Codonopsis để bán ở Trung Quốc.
Ở Việt Nam, trong thời gian 1961 – 1985, Viện Dược liệu đã phát hiện Đảng
sâm (Codonopsis spp.) tập trung ở 14 tỉnh miền núi phía Bắc; còn ở phía Nam, chỉ
có ở khu vực Tây nguyên. Vùng phân bố tập trung nhất là các tỉnh Lai châu, Sơn
La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà
Nẵng và Lâm Đồng [4], [2].
1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y
học cổ truyền
Bộ phận chính của Codonopsis được dùng làm thuốc là rễ. Vào mùa đông,
lúc cây đã úa vàng, rụng lá hoặc tới đầu xuân năm sau lúc cây chưa đâm chồi nảy
lộc là có thể thu hoạch, lúc này phẩm chất Codonopsis tốt nhất, sản lượng cao; đào
rễ phải dài sâu trên 0,7m, vì rễ rất dài, không làm trầy xát. Rửa sạch đất cát, phân
loại rễ to nhỏ để riêng, phơi riêng trên gìan từng loại đến lúc nào rễ bẻ không gãy là
đạt bó từng bó đem phơi Dựa vào chất lượng của rễ sau khi thu hoạch, người ta
chia ra làm 5 loại sau:
- Tây đảng sâm: khô, nhiều đường, đầu và đuôi đều tròn, màu vàng hay xám,
thịt rễ có màu ánh vàng, có vân tròn, đường kính từ 13mm trở lên, không lẫn rễ con.
- Đông đảng sâm: khô, nhiều đường, đầu và đuôi tròn với ít nếp nhăn, vỏ
màu vàng xám hay nâu xám, thịt màu trắng vàng, thoáng có vân tròn, đường kính từ
10mm trở lên.

- Lộ đảng sâm: khô, nhiều đường, mềm, rễ dài, vỏ màu vàng hay màu vàng
xám, thịt màu vàng nâu hay màu vàng, đường kính trên 10mm.
- Điều đảng sâm: khô, có chất đường, hình trụ tròn, vỏ khô màu vàng, thịt
màu trắng hay màu vàng trắng, đường kính 12mm trở lên.
- Bạch đảng sâm: khô, tương đối cứng, ít đường, hình dạng rễ không thống
nhất, vỏ màu vàng xám hay màu trắng vàng, thô mập, đường kính 10mm trở lên.

9
Về thành phần hóa học, trong rễ của Codonopsis đến nay đã tìm thấy
sucrose, glucose, fructose, galactose, arabinose, mannose, xylose, rhamnose, inulin,
nhiều loại alcaloid, scutellarein glucoside, CP1 – 4, syringin, N-Hexyl b-D-
glucopyranoside, ethyl a-D-fructofuranoide, tangshenoside I, choline.
Về nghiên cứu tác dụng dược lý về Codonopsis và các dịch chiết hoặc thành
phần của chúng có thể được tóm lược như sau:
- Tác dụng tăng lực: thực nghiệm cho thấy Codonopsis có tác dụng chống
mỏi mệt và tăng sự thích nghi của súc vật trong môi trường nhiệt độ cao. Thí
nghiệm cho thấy dịch chiết xuất thô của Codonopsis có tác dụng làm tăng sự thích
ứng của chuột nhắt trong trạng thái thiếu dưỡng khí [5].
- Đối với hệ tiêu hóa: dịch chiết Codonopsis làm tăng trương lực của hồi
tràng chuột, nồng độ thuốc tăng lên thì trương lực cũng tăng theo. Dịch Codonopsis
có tác dụng đối kháng (đối vận) với serotonin (5-HT) gây co bóp ruột nhưng không
kháng với acetylcholine. Codonopsis có tác dụng bảo vệ rõ rệt với 4 mô hình gây
loét bao tử ở súc vật: gây loét do kích thích, gây viêm, gây loét do acid acetic, loét
do thắt môn vị [5].
- Đối với hệ tim mạch: tiêm tĩnh mạch dịch chiết Codonopsis với liều 2g/kg
cho mèo gây mê có tác dụng tăng co bóp tim, tăng lưu lượng máu tới não, chân và
nội tạng. Truyền 20-25ml dịch Codonopsis với tỉ lệ 1:1 cho thỏ bị gây choáng do
mất máu, có tác dụng nâng áp, áp lực trung tâm hạ, nhịp tim chậm lại. Khi đối chiếu
với các dịch chiết nhân sâm, cam thảo, tác dụng nâng áp của Codonopsis cao hơn.
Ngoài ra, tác dụng hạ áp của Codonopsis trên súc vật là do tác dụng giãn mạch

ngoại vi và tác dụng ức chế adrenalin của thuốc gây nên.
- Đối với máu và hệ thống tạo máu: dịch chiết cồn và nước sắc Codonopsis
có tác dụng làm tăng số hồng cầu, làm giảm số bạch cầu trong đó lượng bạch cầu
trung tính tăng còn lượng tế bào lâm ba lại giảm. Dịch tiêm Codonopsis làm tăng
nhanh sự đông máu (không có tác dụng tán huyết)[5].
- Đối với điều hòa huyết áp: Tiêm mạch máu dịch Codonopsis 20% (chiết
bằng nước và bằng rượu) cho thỏ và chó đã gây mê đều thấy gây hạ huyết áp, trong

10
khi các lô đối chứng được tiêm 4,8% glucose và dung dịch sinh lý thì không thấy hạ
huyết áp, do đó hiện tượng hạ huyết áp của dịch Codonopsis có lẽ không liên quan
đến thành phần đường của nó. Codonopsis còn có tác dụng ức chế hiện tượng cao
huyết áp gây ra do adrenalin [5].
- Đối với đáp ứng miễn dịch của cơ thể: dùng chế phẩm Codonopsis tiêm
bụng, tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch chuột đều có tác dụng làm tăng số lượng thực
bào rõ rệt, khả năng thực bào cũng tăng.
- Đối với hệ thần kinh trung ương: cho chuột dùng Codonopsis với liều 6-
7mcg/kg thấy có tác dụng ức chế.
Ngoài ra Codonopsis còn có tác dụng kháng khuẩn. Trong mô hình thực
nghiệm „in vitro‟, Codonopsis có tác dụng kháng khuẩn ở mức độ khác nhau đối với
não mô cầu khuẩn, trực khuẩn bạch hầu, trực khuẩn đại tràng, tụ cầu khuẩn vàng,
trực khuẩn lao ở người. Codonopsis cũng được tìm thấy còn có tác dụng làm hưng
phấn tử cung ở chuột cống, phát triển nội mạc tử cung, gây tăng trương lực cổ tử
cung, tiết sữa ở súc vật mẹ cho con bú, nâng cao corticosterone trong huyết tương,
nâng cao đường huyết [75].
Trong Y học cổ truyền Việt Nam, Codonopsis được ghi nhận có tác dụng bổ
trung ích khí, sinh tân, dưỡng huyết. Chủ trị chứng huyết hư hoặc khí huyết lưỡng
hư, không có sức, ăn ít, khát, tiêu chảy lâu ngày, thoát giang, trị trung khí suy
nhược, ăn uống kém, ỉa chảy do tỳ hư, vàng da do huyết hư, tiêu ra máu, rong kinh,
trị thiếu máu mạn, gầy ốm, bệnh bạch huyết, bệnh ở tụy tạng, trị hư lao, nội thương,

phát sốt, mồ hôi tự ra, băng huyết, các chứng thai sản [1].
Hiện nay ở Việt Nam, các loài thuộc chi Codonopsis được liệt vào Sách Đỏ
Việt Nam do bị khai thác thường xuyên, liên tục (gần như không có giới hạn), cùng
với nạn tàn phá rừng làm nương rẫy (ở Tây Bắc, Tây Nguyên) cũng làm cho vùng
phân bố tự nhiên của các loài này bị thu hẹp nhanh chóng. Với giá thành rẻ hơn
Nhân sâm, lại có nhiều tác dụng giống Nhân Sâm, một số sản phẩm từ Codonopsis
được thay thế bởi rễ củ phơi khô của một số loài cây khác có hình thái tương tự như
cây Thương lục (Phytolacca acinosa Roxb. ) hoặc cây Tục đoạn (Dipsacus

11
japonicus) do các lợi ích về kinh tế hoặc do nhầm lẫn khi thu hái trong tự nhiên và
phân loại sản phẩm. Trong đó nguy hiểm nhất là sự nhầm lẫn với cây Thương lục,
bởi đây là loài cây có độc ở tất cả các bộ phận, các tài liệu [1] [4] [5] đều có ghi chú
về sự nhầm lẫn chết người này. Trong sách Trồng hái và dùng cây thuốc của Lê
Trần Đức, NXB Nông nghiệp in năm 1984 đã từng lưu ý: “Hiện nay củ thương lục
được bán ở Hà Nội và chở vào miền Nam bán với tên giả mạo hồng sâm hay phòng
sâm. Củ thương lục chính là một vị thuốc công hạ mãnh liệt, có thể gây sảy thai
Dù người khỏe mạnh mà dùng thì cũng tổn thương gân cốt và hại thận”. Từ thực tế
trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với các mục đích chính:
1. Đánh giá tính đa dạng di truyền của một số loài Codonopsis được thu
thập tại Việt Nam.
2. Xác định các mã vạch có khả năng phân biệt, nhận dạng được các loài
thuộc chi Codonopsis, cùng với chỉ thị hình thái, trở thành công cụ ứng
dụng hữu hiệu trong kiểm định dược liệu.
3. Góp phần bảo tồn nguồn gen của loài cây thuốc quý hiếm đang được liệt
vào Sách Đỏ Việt Nam.
1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode)
Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng
được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy
đủ và toàn diện. Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về hình

thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa). Tuy
nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu
vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống
nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều
điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [36]; ngoài ra, phương
pháp phân loại hình thái thường chỉ thực hiện được bởi các chuyên gia hình thái
học; việc phân loại đôi khi tốn nhiều thời gian và công sức [29].
Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử,
một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và

12
được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ
liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng
(protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các
gen (đoạn ADN) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen. Trong
phương pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật thường được ứng dụng để nghiên cứu
tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, xây dựng cây chủng loại
phát sinh cũng như giúp nhận dạng đến cấp phân loại loài hoặc chi.
Ở thực vật, một số phương pháp chỉ thị phân tử được sử dụng để nhận dạng
loài như sử dụng enzym giới hạn kết hợp với lai ADN (RFLP), dấu vân tay ADN
(ADN fingerprinting), phản ứng chuỗi trùng hợp PCR, và đặc biệt việc sử dụng các
kỹ thuật mã vạch ADN (DNA barcode) ngày càng trở nên phổ biến. Các phương
pháp này đều dựa trên thực tế rằng cấu trúc hóa học của ADN từ mọi loài là giống
nhau và sự khác biệt đặc trưng duy nhất giữa chúng là trình tự các cặp bazơ.
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách để xác định loài.
Mã vạch được sử dụng là một đoạn ADN ngắn từ một phần của hệ gen và được
dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng
cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng của từng sản phẩm [59]. Trong
công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống nhau và không phân biệt

được bằng mắt thường, song qua mã vạch, máy quét có thể phân biệt được.
Việc sử dụng DNA barcode để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý
nghĩa ngày càng lớn. Theo The Barcode of Life Data Systems
() năm 2011 đã lưu trữ được hơn 1.100.000 DNA
barcoding từ hơn 95.000 đối tượng sinh vật khác nhau. Trong 10 năm qua, đã có
hơn 180.000 trình tự ADN barcode của thực vật được lưu giữ trong Ngân hàng gen
Quốc tế (GenBank, ) và liên kết với hơn 2.000 bài báo
khác nhau. Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử dụng DNA barcode, cộng
đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN có thể làm mã

13
vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [16], [25], [28], [44]. Một mã vạch ADN
điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau :
(i) có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật;
(ii) trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao;
(iii) có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài.
1.3. Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu
1.3.1. Mã vạch ADN ở động vật
Việc lựa chọn các vùng ADN mã vạch liên quan đến việc lựa chọn một hoặc
một vài locut có thể thu được trình tự thường xuyên và đáng tin cậy trong bộ mẫu
lớn và đa dạng, đưa ra dữ liệu so sánh một cách dễ dàng giúp phân biệt các loài với
nhau; hay có thể nói đây là vùng thông tin di truyền có ý nghĩa thực sự có thể cung
cấp thông tin nhận dạng: nó thường phải đủ dài để chứa đủ thông tin có thể phân
biệt giữa các loài nhưng đủ ngắn để thuận tiện cho phân tích. Mã vạch ADN locut
gen CO1 ở động vật thường được dùng rộng rãi do đáp ứng được các tiêu chí này
[29]. Đây là một gen đơn bội, được di truyền từ mẹ và cho mức độ phân biệt cao.
Đó là một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi tế bào.
Ở động vật, nó có tính bảo thủ với những vùng đảo ngược nhỏ, hoặc thường xuyên
lặp đi lặp lại đơn nucleotide. Những đặc điểm này kết hợp với cặp mồi được thiết kế
tốt, hiệu quả sử dụng gen CO1 để phân biệt nhiều mẫu động vật có cùng tổ tiên

được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất sử dụng cao ngay với các mẫu đã được lưu
giữ qua thời gian dài [78]
Chẳng hạn ở các loài linh trưởng, hệ gen mỗi tế bào có khoảng 4 tỷ cặp bp.
Mã vạch gen ty thể CO1 (mã hóa cho tiểu đơn vị của cytochrome oxidase) chỉ có
kích thước 648 bp, nhưng từ người tới tinh tinh và các loài vượn khác, sự khác biệt
của CO1 là vừa đủ để phân biệt giữa mỗi loài. Loài người khác hai loài còn lại ở
một hoặc hai cặp base trong vùng mã vạch, nhưng khác biệt ở cả hệ gen người với
tinh tinh, là khoảng 60 vị trí và với khỉ đột là khoảng 70 vị trí [59]. Đối với công
nghệ mã vạch ADN, hệ gen ti thể cũng tỏ ra đặc biệt phù hợp do sự khác biệt giữa
các loài là nhiều hơn so với DNA hệ gen nhân. Vì đó, một số phân đoạn ngắn ADN

14
ti thể có thể được dùng để phân biệt các loài. Ngoài ra, ADN ti thể thường có nhiều
bản sao hơn so với ADN nhân và vì vậy dễ phục hồi từ các mẫu vật, đặc biệt là từ
các mẫu với lượng nhỏ hoặc các mẫu đã bị xuống cấp. Nhiều nghiên cứu đã được
thử nghiệm và đưa ra hiệu quả của mã vạch CO1 trong phân loại các nhóm động vật
đa dạng, phân bố trên đất liền cũng như dưới biển, từ các vùng cực đến các vùng
nhiệt đới. Nhiều nghiên cứu cho thấy CO1 giúp phân biệt được khoảng 98% các
loài với nhau. Trong phần còn lại, nó xác định hẹp đến các cặp hoặc bộ nhỏ của các
loài có mối quan hệ gần gũi, nói chung là các loài chỉ vừa mới tách ra hoặc các loài
lai thường xuyên [59]. Ngoài locut gen CO1, các đoạn gen ti thể Cytb (cytochrome
b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như ADN mã vạch trong nhận dạng ở
động vật .
1.3.2. Mã vạch ADN ở thực vật
Nếu như các gen ti thể như CO1 và Cytb được dùng rộng rãi cho động vật
[74] và một số loài tảo [68], thì khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên
cạn lại biểu hiện tính bảo thủ cao và vì vậy không phù hợp làm ADN mã vạch. Thay
vào đó, các vùng rời rạc trong hệ gen lạp thể đã được dùng trong các nghiên cứu
phát sinh loài (như các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF và matK và vùng
intron của các gen trnL và trnL-F). Những vùng ADN này đủ có ích như mã vạch

bởi tính đủ bảo thủ trong phạm vi mỗi loài nhưng đa hình giữa các loài. Một vùng
trình tự thông thường khác cho nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là
ribosome ITS nhân (vùng đệm của tiểu đơn vị lớn ADN ribosome), nhưng vùng này
không đạt hiệu quả cao ở một số nhóm thực vật do các yếu tố khác liên quan đến
các diễn biến tiến hóa phức tạp của các vùng lặp lại cao trong hệ gen nhân [44].
Tính đến năm 2009, đã có khoảng 8 locus gen được sử dụng làm mã vạch DNA ở
các loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp
1.3.2.1. Dấu chuẩn gen lục lạp đƣợc sử dụng rộng rãi
Hệ gen lục lạp là toàn bộ lượng thông tin di truyền chứa trog ADN của lục
lạp. Tuy chỉ chiếm hàm lượng ít (0,2-0,5%) nhưng cũng giống như trong ty thể,
ADN có vai trò rất quan trọng và đáng chú ý vì sự có mặt của ADN trong lục lạp có

15
liên hệ với hệ thống di truyền ngoài nhiễm sắc thể (di truyền ngoài tế bào chất) và
hệ tự tổng hợp protein của lục lạp. Phân tử ADN lục lạp là phân tử ADN dạng vòng
trần chứa trung bình khoảng 120 kb đủ ghi mã cho 120 gen. Những gen mã hóa cho
protein có khoảng 100 gen, thêm và đó, chúng còn có các gen tRNA và ARN
ribixomal [6].
Dựa trên sự phù hợp khác nhau của các dấu chuẩn gen lục lạp mã hóa và
không mã hóa, bốn đề xuất chính cho một mã vạch cây trồng đã được đề xuất bởi ba
nhóm nghiên cứu khác nhau. Các mã vạch được đề xuất liên quan đến sự kết hợp
khác nhau của 7 dấu chuẩn gen lục lạp, bao gồm rpoC1 + rpoB + matK hoặc rpoC1
+ matK + trnH-psbA; rbcL + trnH-psbA và atpF-H + psbK-I + matK. Sự kết hợp
khác nhau các dấu chuẩn đã được thảo luận tại Hội nghị quốc tế Barcode of Life lần
thứ 2 tại Đài Bắc. Năm sau, LaHaye và cộng sự [48] đề xuất riêng gen matK cấu
thành nên mã vạch cây trồng, đây là một trong những khu vực có tốc độ tiến hóa
nhanh nhất trong lục lạp và cho thấy khả năng phân biệt cao các loài trong thực vật
hạt kín [48].
Nhóm nghiên cứu thực vật CBOL đề nghị một mã vạch cốt lõi bao gồm phần
hai khu vực mã hóa của gen lục lạp, rbcL + matK [28]. Mã vạch rbcL bao gồm một

khu vực 599 bp ở cuối 5 'của gen, nằm ở bp từ 1-599 trong trình tự hệ gen gen lục
lạp hoàn chỉnh của Arabidopsis thaliana. Khu vực mã vạch matK bao gồm một
vùng khoảng 841 bp ở trung tâm của gen nằm giữa bp 205-1046 (bao gồm cả các
vùng mồi) trong trình tự toàn bộ hệ gen gen lục lạp của A. thaliana. Sự lựa chọn
rbcL + matK như mã vạch lõi được dựa trên sự khuếch đại đơn giản của khu vực
rbcL (rbcL được khuếch đại thành công trong phạm vi rộng bao gồm thực vật có
hoa, thực vật hạt trần và thực vật không có hoa) và khả năng phân biệt của khu vực
matK (MatK là một trong những khu vực mã hóa tiến hóa nhanh nhất của hệ gen
của gen lục lạp [30], và có thể nói là gần tương tự mã vạch CO1 ở động vật). Tuy
nhiên, matK có thể khó khăn để PCR khuếch đại khi sử dụng bộ mồi hiện có - đặc
biệt là khi thực vật nghiên cứu không phải là thực vật hạt kín. Ngược lại, khu vực
mã vạch của rbcL là dễ dàng để khuếch đại, thu trình tự, và so sánh trong hầu hết

16
các thực vật trên đất liền và cung cấp một bộ khung hữu ích cho các dữ liệu mã
vạch, mặc dù nó chỉ có khả năng phân biệt khiêm tốn. Hai dấu chuẩn mã vạch gen
lục lạp phân biệt tốt hơn so với việc sử dụng một dấu chuẩn mã vạch duy nhất,
nhưng không có 2 dấu chuẩn hoặc đa dấu chuẩn gen lục lạp cho độ phân giải tốt
hơn sự kết hợp giữa hai dấu chuẩn rbcL + matK [11]. Khi cả hai dấu chuẩn đều là
vùng mã hóa, sự đọc dịch các trình tự trên ADN thành các axit amin của protein
của gen đó có thể được sử dụng để tự động hóa kiểm tra cho việc chỉnh sửa/lắp ráp
lỗi, sự hiện diện của gen giả, và định hướng đúng trình tự. Ngoài mã vạch rbcL +
matK, dấu chuẩn mã vạch gen lục lạp được sử dụng rộng rãi nhất là trnH-psbA. Ở
hầu hết thực vật có hoa, kích thước vùng này dao động từ 340- 660 bp, dễ dàng
được khuếch đại, và là một trong những vùng liên gen (IGS-intergenic spacer) ở
thực vật [69]. Nó đã được sử dụng thành công trong một loạt các nghiên cứu mã
vạch và là một sự lựa chọn rõ ràng cho một mã vạch bổ sung. Trong những nghiên
cứu so sánh trực tiếp, nó thành công cao hơn trong việc phân biệt loài so với rbcL +
matK ở những nhóm như Ficus và Alnus [67] và giải quyết hoàn thiện các nhóm
phức tạp như Quercus và Salix [76]. Sự hiện diện của những vùng lặp lại có thể dẫn

đến vài vấn đề ở một số nhỏ của các nhóm (ví dụ như Pinus, cây mè; Eryngium ).
Một trong những mối quan tâm chính liên quan đến việc có sử dụng trnH-psbA như
là một mã vạch tiêu chuẩn hay không là vấn đề trình tự được đọc bị dừng lại sớm do
xuất hiện các đơn nucleotide lặp đi lặp lại. Tuy nhiên, thử nghiệm với các
polymerase mới đã cải thiện chất lượng đọc trình tự ngay cả khi có sự hiện diện của
các đơn nucleotide [23].
Các IGS atpF-atpH và psbK-psbI đã được đề xuất như các khu vực mã vạch
thực vật tại Hội nghị Barcode of Life quốc tế thứ hai (KJ Kim). Trong nghiên cứu
của Nhóm nghiên cứu thực vật CBOL [28], psbK-psbI cho khả năng phân biệt ở
mức độ cao, nhưng cho chất lượng trình tự kém hơn, trong khi atpF-atpH cho thấy
khả năng phân biệt tương đối khiêm tốn và chất lượng trình tự trung bình. Một số
nghiên cứu gần đây đã cung cấp các báo cáo tích cực về hiệu suất sử dụng và hiệu

17
quả của cả atpF-atpH và psbK-psbI và báo cáo đã chỉ ra rằng chúng rất hữu ích
trong các nghiên cứu về thực vật ở Hàn Quốc (Ki-Joong Kim).
Intron trnL và vùng IGS giữa trnL và trnF đã được sử dụng rộng rãi trong
các hệ thống học thực vật và phát sinh loài địa lý kể từ đầu những năm 1990. Các
khu vực này có thể thu được trình tự một cách đơn giản, mặc dù các đơn nucleotide
lặp lại có thể ảnh hưởng đến việc đọc trình tự ở một số đơn vị phân loại. Những bản
sao lặp lại của gen trnF đã được báo cáo ở họ Brassicaceae, và trong một vài đơn vị
phân loại, bộ gen lục lạp đã bị mất một IGS (ví dụ như Manihot esculenta,
Selaginella moellendorffii) và ở một vài đơn vị khác thì mất intron (ví dụ như
Lathyrus sativus, Lotus japonicus, Trifolium subterraneum ). Một số nghiên cứu đã
chỉ ra rằng các khu vực khác của bộ gen lục lạp có thể có nhiều biến đổi và cung
cấp thông tin cho nghiên cứu phát sinh loài [69], nhưng tiềm năng chính của intron
trnL cho nhận dạng loài là sự hiện diện của một cấu trúc thân-vòng nhỏ trong
intron, đó là vòng P6. Đây là một “minibarcode” ngắn đã được chứng tỏ rất hữu ích
cho các nhà sinh thái học nghiên cứu ADN thoái hóa cao và sử dụng kỹ thuật giải
trình tự ở các thế hệ tiếp theo để đánh giá sự đa dạng của các mẫu trong môi trường

phức tạp (ví dụ như chất lắng).
1.3.2.2. Các dấu chuẩn vùng gen nhân đƣợc sử dụng rộng rãi
Trình tự ITS bao gồm: ITS1- 5.8S rDNA-ITS 2 với kích thước khác nhau, từ
400 đến hơn 1000 bp. Đây là trình tự được sử dụng thường xuyên trong nghiên cứu
hệ thống phát sinh ở thực vật do nó có khả năng phân biệt loài cao nhất và dễ
khuếch đại [10], [35] và cũng là một sự lựa chọn cho một mã vạch bổ sung ở những
nhóm có thể giải trình tự trực tiếp [28]. Ở một vài thực vật ký sinh với hệ gen lục
lạp bị giảm mạnh, các nrITS có thể đại diện cho các mã vạch duy nhất khả thi hiện
đang có sẵn (mặc dù matK có thể được giữ lại trong một số thực vật dị dưỡng đầy
đủ). Khả năng phân biệt tốt hơn (nói chung) của nrITS so với các vùng gen lục lạp ở
các mức phân loại thấp cũng được thành lập trong hệ thống học phân tử thực vật, và
rõ ràng rằng trong những nhóm mà nrITS hoạt động tốt, nó sẽ thường xuyên được
sử dụng như là một mã vạch DNA.

18
Một số nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng nrITS phân biệt giữa các loài thực vật
chia sẻ haplotype gen lục lạp [67]. Tuy nhiên, có ba mối quan tâm chính về nrITS,
ngăn cản nó là một thành phần cốt lõi của mã vạch cây trồng. Đầu tiên, trong quá
trình tiến hóa, các gen liên quan trong một loài trải qua quá trình trao đổi gen không
hoàn toàn có thể dẫn đến bản sao paralogous (hiện tượng một gen nhân lên và
chiếm các vị trí khác nhau trong cùng một hệ gen) khác nhau trong cá thể [12]. Sự
xuất hiện của bản sao khác nhau này đòi hỏi những phân tích tỉ mỉ, cẩn thận trong
việc xem xét những vùng này có phải là các cơ sở đa hình không, và tệ nhất, các
bản sao khác nhau có thể ngăn cản việc thu hồi các trình tự có thể đọc được. Ngoài
ra, các biến thể khác nhau có thể được thu từ cùng một mẫu đã cho tùy thuộc vào
chiến lược khuếch đại, cặp mồi được sử dụng, và hiệu quả PCR. Một mối quan tâm
thứ hai là nhiễm nấm mốc [10], đặc biệt là trong trường hợp thực vật chứa nấm hội
sinh. Và thứ ba, mặc dù một số bộ mồi nrITS là có sẵn, và đã được sử dụng thành
công trước đó, tuy nhiên vẫn có thể gặp khó khăn trong việc khuếch đại và giải
trình tự khu vực này từ những bộ mẫu có độ đa dạng cao. Ví dụ, Gonzalez và cộng

sự [27] đã báo cáo chỉ PCR và giải trình tự thành công 41% từ mẫu của 285 cây
nhiệt đới.
Một đề xuất đã được đưa ra thay thế cho việc sử dụng toàn bộ vùng ITS1-
5.8S-ITS2 là sử dụng chỉ là một phần của khu vực này như là mã vạch, cụ thể là
nrITS2. Cách tiếp cận này đã hữu ích trong nhiều nghiên cứu và nó được lập luận
rằng việc tập trung trên khu vực nrITS2 sẽ làm giảm các vấn đề liên quan đến việc
khuếch đại và giải trình tự toàn bộ tập hợp nrITS. Do chiều dài ngắn hơn của khu
vực nrITS2 nên công việc giải trình tự cũng dễ dàng hơn nhiều so với việc thực
hiện trên toàn bộ nrITS, và khu vực nrITS2 đã được bảo tồn lâu dài hơn so với khu
vực nrITS1. Do đó, việc sử dụng các nrITS2 sẽ liên quan đến sự đánh đổi một số
lượng lớn ký tự có thể dùng được với việc chỉ sử dụng một phần nhỏ của vùng
nrITS để dễ dàng thu hồi được vùng gen cần nhân bản và so sánh dễ dàng hơn. Để
đánh giá hiệu quả khi sử dụng các trình tự ngắn hơn của nrITS2 so với toàn bộ khu
vực nrITS, Liu và cộng sự đã thu thập và xử lý nhiều mẫu hơn nữa và khả năng