nghiên cứu thành phần hóa học cây cỏ mực (eclipta prostrata l., asteraceae

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
***






Nguyễn Thị Thơi





NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC
(ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE)







LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2011
2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
***




Nguyễn Thị Thơi




NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC
(ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE)


Chuyên ngành: Hóa Học Hữu Cơ
Mã số: 60 44 27




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Phan Minh Giang



Hà Nội – 2011
7

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU …….1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN …….2
1.1 Khái quát về Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.) (Asteraceae) …….2
1.1.1 Đặc điểm thực vật …….2
1.1.2 Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam …….3
1.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata …….3
1.3 Hoạt tính sinh học của Eclipta prostrata và các hợp chất thành phần …….8
Chƣơng 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU … 11
2.1. Nhiệm vụ của Luận văn … 11
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu … 11
2.2.1 Các phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất.11
2.2.2 Các phƣơng pháp xác định cấu trúc … 14
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN … 14
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu … 14
3.2. Điều chế các phần chiết hữu cơ từ cây Cỏ mực … 14
3.3. Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết thân cây Cỏ mực … 15
3.3.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết thân cây Cỏ mực … 15
3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EA1) … 16
3.3.3 Phân tách phần chiết điclometan (EA2) … 16

3.3.4 Phân tách phần chiết etyl axetat (EA3) … 16
3.3.5 Phân tách phần chiết nƣớc (EA4) … 17
3.4 Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết phần trên mặt đất cây Cỏ mực
(EP)………………………………………………………………………………….19
3.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết phần trên mặt đất cây Cỏ mực
(EP) … 19
3.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (EP2)………………………………….19
3.4.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (EP3) … 19
8

3.4.4 Phân tách phần chiết nƣớc (EP4) … 20
3.5. Xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập … 22
Chƣơng 4: THỰC NGHIỆM … 31
4.1. Thiết bị và hóa chất … 31
4.2. Đối tƣợng nghiên cứu … 32
4.3. Điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực … 32
4.4. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EA………………………………32
4.4.1. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1) … 32
4.4.2. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2) … 34
4.4.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3) … 34
4.4.4. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nƣớc (EA4) … 34
4.5. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EP … 35
4.5.1. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2) … 35
4.5.2 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3) … 36
4.5.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nƣớc (EP4) … 36
4.6. Phân tách sắc ký các phần chiết EA … 37
4.6.1 Phần chiết n-hexan (EA1) … 37
4.6.2 Phần chiết điclometan (EA2) … 38
4.6.3 Phần chiết etyl axetat (EA3) … 38
4.6.4 Phần chiết nƣớc (EA4) … 39

4.7. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EA … 39
4.8. Phân tách sắc ký các phần chiết EP … 40
4.8.1 Phần chiết điclometan (EP2) … 40
4.8.2 Phần chiết etyl axetat (EP3) … 41
4.8.3 Phần chiết nƣớc (EP4) … 41
4.9. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EP…… 42
KẾT LUẬN … 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO … 46

4

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng
CC (Column Chromatography): Sắc kí cột thường
FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh
Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế
1
H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton
13
C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
cacbon 13
DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Transfer): Phổ DEPT
ESI-MS (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi
điện tử

5

MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ

Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae)

Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực
Bảng 2: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1)
Bảng 3: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2)
Bảng 4: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3)
Bảng 5: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EA4)
Bảng 6: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2)
Bảng 7: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3)
Bảng 8: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EP4)

Sơ đồ 1: Chiết và phân tách sắc ký phần thân cây Cỏ mực (EA)
Sơ đồ 2: Chiết và phân tách sắc ký phần trên mặt đất cây Cỏ mực (EP)

6

MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ
1
H-NMR của Metyl gallat (II)
Phụ lục 2: Phổ
13
C-NMR và DEPT của Metyl gallat (II)
Phụ lục 3: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin I (III)
Phụ lục 4: Phổ
1
H-NMR của Eclalbasaponin I (III)
Phụ lục 5: Phổ
13
C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin I (III)

Phụ lục 6: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin II (IV)
Phụ lục 7: Phổ
1
H-NMR của Eclalbasaponin II (IV)
Phụ lục 8: Phổ
13
C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin II (IV)
Phụ lục 9: Phổ
1
H-NMR của Norwedelolacton (V)
Phụ lục 10: Phổ
13
C-NMR và DEPT của Norwedelolacton (V)
Phụ lục 11: Phổ
1
H-NMR của Hesperidin (VI)
Phụ lục 12: Phổ
13
C-NMR và DEPT của Hesperidin (VI)

9

LỜI MỞ ĐẦU
Trong các nghiên cứu y dược hiện đại các hợp chất thiên nhiên từ các cây
thuốc bao gồm các flavonoit, tecpenoit và ancoloit tiếp tục là nguồn cung cấp các
hợp chất có tiềm năng cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học. Eclipta prostrata L.,
syn. Eclipta alba L. (Asteraceae) là cây thuốc dùng phổ biến trong Y học cổ truyền
Việt Nam và một số nước trên thế giới. Các nghiên cứu hóa học các loài Eclipta
prostrata của Trung Quốc, Nhật Bản và Ấn Độ đã xác định được các nhóm hợp
chất tritecpen (oleanan và taraxastan) glycozit, các flavonoit, các coumarin, các
ancaloit-steroit và các thiophen polyacetylen trong các bộ phận của cây Eclipta
prostrata. Dựa trên các kiến thức dược lý học dân tộc và các hoạt tính sinh học của
các phần chiết nhiều hoạt chất có tác dụng chống ung thư, kháng viêm và chống
HIV của các chất được phân lập từ Eclipta prostrata đã được phát hiện.
Sự đa dạng về các nhóm cấu trúc lý thú của Eclipta prostrata, sự tương quan
của các cấu trúc này với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng và ý nghĩa khoa học và
thực tiễn của việc đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc Cỏ mực (Eclipta
prostrata L., Asteraceae) của Việt Nam đã thúc đẩy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu
một cách hệ thống về hóa thực vật của cây Cỏ mực. Luận văn này đặt mục tiêu
nghiên cứu phân lập sắc ký và xác định cấu trúc các thành phần hóa học đặc biệt là
các hợp chất phân cực từ phần trên mặt đất của cây Cỏ mực của Việt Nam. Các kết
quả nghiên cứu theo hướng này sẽ là các bước đầu tiên trong các chương trình hiện
đại hóa Y học cổ truyền Việt Nam. Các hợp chất phân cực chưa được xác định
trong một số nghiên cứu trước đã được phân lập trong nghiên cứu này sử dụng các
phương pháp sắc ký hiện đại.

10

Chƣơng 1:
TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.) (Asteraceae)
1.1.1. Đặc điểm thực vật [1]
Họ Cúc (danh pháp khoa học: Asteraceae hay Compositae), còn gọi là họ Hướng
dương, họ Cúc tây, là một họ thực vật có hoa hai lá mầm. Họ Asteraceae phân bố rộng
khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất tại các khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới. Các chi
trong họ này được chia thành 13 tông. Chỉ có một trong số 13 tông này là Lactuceae, có
thể là có đủ khác biệt để có thể coi là một phân họ (phân họ Cichorioideae), các tông còn
lại, phần lớn là chồng ghép lẫn nhau, được đưa vào phân họ Asteroideae.
Các loài thuộc về họ Cúc có các đặc trưng sau: cụm hoa dạng đầu, bao
phấn hữu tính, tức là với các nhị hoa kết hợp lại với nhau tại các gờ của chúng bởi
các bao phấn, tạo thành ống, bầu nhụy với sự phân bổ cơ bản của các noãn hoa,
các noãn hoa trên một bầu nhụy, mào lông (chùm lông trên quả), quả là loại quả
bế (tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi chín).
Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.), họ Cúc (Asteraceae), có tên thông dụng
ở Việt Nam là Cỏ mực, Cỏ nhọ nồi, Nhọ nồi, hạn liên thảo, mặc hạn liên, kim lăng thảo.

Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae)
11

Cỏ mực thuộc loại cây thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có
khi gần như thẳng đứng, có lông trắng, cứng, thưa. Thân màu lục hay màu nâu nhạt
hay hơi đỏ tía. Lá mọc đối, phiến lá dài và hẹp cỡ 2,5  1,2 cm. Mép lá nguyên hay
có răng cưa cạn, hai mặt đều có lông. Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay
đầu cành, các hoa cái hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa. Qủa bế
dẹt có 3 cạnh, có cánh dài 3 mm. Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá
rộng vì nó là loài cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát.
1.1.2. Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam [1]
Cỏ mực được dùng để điều trị các bệnh như: nôn ra máu từ dạ dày, chảy máu
cam, đái ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột, lỵ, trẻ em suy
dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da, ezecma, vết
loét, bị thương, chảy máu, viêm da. Ngoài ra Cỏ mực còn được dùng làm thuốc sát
trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau
dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc.
Cách dùng: dùng tươi hay giã lấy nước uống, hoặc sao cháy đen với liều 15-
30 g sắc uống. Dùng riêng hoặc phối hợp với ngó sen, lá trắc bá. Trong trường hợp
sát trùng cũng dùng sắc uống hoặc giã tươi lấy nước uống, bã đắp. Có thể dùng tươi
xoa tay chữa rát do vôi, chữa nấm ngoài da và nhuộm tóc có màu tím đen.
Viện chống lao Trung ương và Bệnh viện lao K71 đã pha chế thành thuốc
tiêm cầm máu, tiêm bắp thịt, mỗi ngày 1-3 ống (2 ml). Có nơi đã sản xuất thành
công dạng cao nén thành viên dùng cầm máu.
1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata
Năm 1966: F. Bolhman và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức)
đã phân lập từ lá khô Eclipta alba 2 dẫn xuất thiophen 1 và 2 và polyacetylen 3 [5].

1
S
(C C)
2
CH=CH
2
H
3
C-C C
12


2 3
Sau đó năm 1966, N. R. Krishnaswamy và cộng sự (Đại học Delhi, Ấn Độ)
đã xác định được cấu trúc của một polythienyl, α-terthienyl methanol (4) từ Eclipta
alba [5].


4
Năm 1985: P. Sing và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức) đã
phân lập được một thành phần dithienyl acetylen (5) từ rễ và phần trên mặt đất cây
Eclipta erecta (một tên gọi khác của Eclipta prostrata) [10].


5
Phân tách sắc kí cột phần trên mặt đất và rễ cây Eclipta erecta cho một hợp
chất dithienyl acetylen, 5-isovalennyloxymetylen-2-(4-isovalennyloxy-but-3-inyl)
dithiophen (6) và 5-angeloyloxy-methylen-2-(but-3-en-1-ynyl)-dithiophen (7);
stigmasterol (8) và sitosterol (9) là các thành phần từ phần trên mặt đất [8].

Năm 1985: T. R. Govindachari và M. S. Premila đã phân lập từ Eclipta alba
wedelolacton (10), norwedelolacton (11) và axit norwedelic (axit 5,6-dihydroxy-
2(2,4,6-trihydroxyphenyl)-benzofuran-3-carboxylic) (12) [4].





10 R
1
=Me, R
2
=H 12
11 R
1
=R
2
=H

S S
C C-CH=CH
2
(C C)
5
-CH=CH
2
CH
3
-
S S S

CH
2
OH
O
O
R
1
O OR
2
O
R
2
O
R
2
O
O
OH
COOH
HO OH
HO
HO
S S
ValH
2
C C CCH
2
CH
2
OVal

13

Năm 1992: P. Sihgh và S. Bhagrava (Đại học Rajasthan, Ấn Độ) đã phân lập
được một hợp chất từ phần rễ Eclipta erecta [9].



13
Năm 1997: S. Yahara và cộng sự (Đại học Kumamoto, Nhật Bản) đã phân
lập từ cây khô Eclipta alba ở Trung Quốc bốn taraxastan triterpen glycozit, các
eclalbasaponin VII-IX (14-17) cùng với các eclalbasaponin I-VI. Cấu trúc của các
eclalbasaponin đã xác định được là 3β,20β,16β- và 3β,20β,28-trihydroxytaraxastan
glycozit và các saponin sulfat của chúng [15].










14 R=H 15 R=H
16 R=SO
3
H 17 R=SO
3

Năm 1998: M. S. Kader và cộng sự (Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã

phân lập từ phần chiết metanol Eclipta alba tám hoạt chất ancaloit có khung steroit
18-25. Ancaloid chính được phân lập là (20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22(N)-
dien-3β-ol (verazin, 20); và các hợp chất khác là 20-epi-3-dehydro-4,5-
dehydroverazin (18), 20-epi-verazin (19), ecliptabin (21), 20-epi-4β-hydroxyverazin
(22), 4β-hydroxylverazin (23), 20-epi-25β-hydroxyverazin (24) và 25β-
hydroxyverazin (25) [3].


O
H
OH
OH
H
O
OR
OH
OH
HO
O
H
OH
H
O
OR
OH
OH
HO
OH
S S
C C-CH-CH

2
-O
O-CH
2
O
O
14






18 21










19 R
1
=R
2
=H 20 R
1

=R
2
=H
22 R
1
=OH, R
2
=H 23 R
1
=OH, R
2
=H
24 R
1
=H, R
2
=OH 25 R
1
=H, R
2
=OH

Năm 2008: M. K. Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã
phân lập được một flavonoit, diosmetin (26) và hai isoflavonoit, 3-
hydroxybiochanin (27) và 3-O-methylorobol (28) từ phần chiết metanol Eclipta
prostrata [7]

26 27 R
1
=OH, R
2
=OCH
3

28 R
1
=OCH
3
, R
2
=OH
N
N
HO
HO
N
HO
R
1
R
2
N
HO

R
1
R
2
O
OH O
HO
OH
OH
OHO
OH O
R
1
R
2
15

Năm 2008: M. K. Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã
phân lập từ dịch chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata năm oleanan
tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất glycozit của 29, eclalbasaponin I
(30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III (32) và eclalbasaponin V (33) [6].







29 30 R
1

=H, R
2
=GlC
31 R
1
=H, R
2
=H
32 R
1
=GlC, R
2
=GlC
33 R
1
=SO
3
, R
2
=H

Năm 2011: Sáu hợp chất đã được S. Tewtrakul và cộng sự (Đại học Prince of
Songkla, Thái Lan) phân lập từ Eclipta prostrata là 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-
terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl angelat (35), 5-
hydroxymethyl-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat (37), orobol (38) và
wedelolacton (39) [13].


34 35

HO
H
3
C
CH
3
CH
3
COOH
H
3
C
CH
3
OH
CH
3
CH
3
O
O
H
3
C
CH
3
CH
3
COOR

2
H
3
C
CH
3
CH
3
OH
CH
3
HO
HO
HO
R
1
O
S
S S
O
CH
3
CH
3
O
S
S S
O
O CH
3

CH
3
16



36 37




38 39

1.3 Hoạt tính sinh học của Eclipta prostrata và các hợp chất thành phần
1.3.1 Hoạt tính ức chế HIV-1 của các terthienyl, orobol và wedelolacton
Sáu hợp chất đã được phân lập từ phần chiết toàn cây Eclipta prostrata trong
một nghiên cứu phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học trong thử nghiệm ức
chế enzym HIV-1 integrase (IN) [12]. Các hợp chất này đã được xác định là 5-
hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-
terthyenyl angelat (35), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat
(37), orobol (38) và wedelolacton (39). Wedelolacton (39) đã được xác định là có
hoạt tính mạnh nhất đối với HIV-1 IN với IC
50
là 4,0 ± 0,2 µm, tiếp đó là hợp chất
38 (IC
50
= 8,1 ± 0,5 µm), các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính với IC
50
>
100 µm. Đối với hoạt tính ức chế HIV-1 protease (PR) hợp chất 34 thể hiện hoạt

tính chống lại HIV-1 PR với IC
50
= 58,3 ± 0.8 µm, hợp chất 37 (IC
50
= 83,3 ± 1.6
µm) và hợp chất 36 (IC
50
= 93,7 ± 0,8 µm) trong khi các hợp chất 33, 38 và 39
không thể hiện hoạt tính (IC
50
> 100 µm). Các tác dụng ức chế HIV-1 IN của
wedelolacton, một dẫn xuất coumarin và orobol, một dẫn xuất isoflavon là các hoạt
tính đáng chú ý của nghiên cứu này.


S S S
O CH
3
O
S
S S
CHO
OHO
OH O
OH
OH
O
O
HO
HO

O
HO OCH
3
17

1.3.2 Hoạt tính kháng viêm của các terthienyl, orobol và wedelolacton
Phần chiết toàn cây Eclipta prostrata và các hợp chất terthienyl, 5-
hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl tiglat (34), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-
terthienyl angelat (35), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl acetat (36), ecliptal
(37) cùng với falvonoit orobol (38) và coumestan wedelolacton (39) được phân lập
từ cây này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trong nghiên cứu ức chế sự
sản sinh nitơ oxit (NO), prostaglandin E
2
(PGE
2
) và TNF-α trong các tế bào
RAW264.7 gây bởi lipopolisaccarit (LPS) [13]. Orobol (38) đã được phát hiện là có
hoạt tính mạnh nhất với NO ở IC
50
= 4,6 µm, các hợp chất 34, 35 và 37 cho các giá
trị IC
50
lần lượt là 12,7, 14,9 và 19,1 µm. Hợp chất 38 ức chế PGE
2
với IC
50
= 49,6
µm trong khi không có hoạt tính với TNF-α với IC
50
> 100 µm. Cơ chế tác dụng của

orbol đã được xác định là ức chế enzym iNOs và sự biểu hiện của COX-2 mRNA.
1.3.3 Hoạt tính kháng nấm của các ancaloit khung steroit
Các hợp chất ancaloit khung steroit (18-25) được phân lập từ lá cây Eclipta
alba ở Suriname đã được thử nghiệm với bốn chủng vi nấm Saccharomyces
cerevisiae và một chủng vi nấm Candida albicans [2]. Các hợp chất 19-21 và 25 có
hoạt tính kháng nấm mạnh nhất. Hợp chất 25 có khả năng kháng nấm Candida
albicans và giá trị MIC của hợp chất này (< 3,1 g/ml) chỉ hơi yếu hơn các thuốc
kháng nấm đang được sử dụng lâm sàng là amphotericin B và ketoconazole. Các
chất còn lại có khả năng yếu chống tế bào độc hại M-109. Các hợp chất này được
xác định là có hoạt tính chủ yếu là kháng nấm do thử nghiệm hoạt tính gây độc
dòng tế bào M-109 của tất cả các hợp chất này đều cho giá trị IC
50
> 10 g/ml.
1.3.4 Hoạt tính chống tăng sinh của các tritecpenoit
Phần chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata đã được phân lập
theo định hướng hoạt tính chống tăng sinh của các tế bào HS (Hepatic Stellate) in
vitro [5]. Các tế bào HS được biết đến là có vai trò chìa khóa trong sự phát sinh
bệnh xơ hóa. Năm oleanan tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất
glycozit của 29, eclalbasaponin I (30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III
(32) và eclalbasaponin V (33) đã được phân lập. Axit echinocystic và
18

eclalbasaponin II đã được phát hiện là có khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh của
các tế bào HS. Nghiên cứu đã cho thấy nhóm axit cacboxylic tự do ở vị trí C-28 của
các dẫn xuất glycozit của axit echinocystic đối với hoạt tính chống u xơ. Trên cơ sở
nghiên cứu này hoạt tính chống u xơ của Eclipta prostrata và các tritecpenoit thành
phần có thể cho giả thiết về triển vọng điều trị sự u xơ gan.

19

Chƣơng 2:
NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nhiệm vụ của luận văn
Đối tượng nghiên cứu hóa học của Luận văn này là phần trên mặt đất cây Cỏ
mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae), một cây thuốc phổ biến trong y học cổ
truyền Việt Nam và trên thế giới. Mặc dù đã có một số nghiên cứu được công bố
trên thế giới về các hợp chất hữu cơ từ cây Eclipta prostrata cho đến này chưa có

các nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học cây thuốc này của Việt Nam, đặc
biệt là về các hợp chất phân cực. Tiếp tục các hướng nghiên cứu hóa thực vật của
thế giới về E. prostrata, Luận văn này đặt mục tiêu nghiên cứu các qui trình phân
tách sắc ký đặc biệt là đối với các hợp chất phân cực, phân lập các hợp chất thành
phần và xác định cấu trúc của chúng bằng các phương pháp phổ.
Các nhiệm vụ được đưa ra trong Luận văn này là:
- Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Cỏ
mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae);
- Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết để định tính các phần chiết và xác
định các hệ dung môi sắc ký điều chế thích hợp với chất hấp phụ silica gel;
- Phân tách sắc ký và phân lập các hợp chất thành phần chính đặc biệt là các
hợp chất phân cực bằng các phương pháp sắc ký điều chế;
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập bằng phương pháp
phổ.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp
chất
Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các hỗn hợp
chất, định hướng phân tách sắc ký, kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập sắc
ký, đặc trưng các hợp chất (TLC so sánh và co-TLC) và kiểm tra độ tinh khiết của
các hợp chất được phân lập.
Sắc kí cột thường (CC)
20

Sắc kí cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi và được
sử dụng để phân tách các phần chiết phân lập các hợp chất thiên nhiên. Sắc ký cột
CC được thực hiện trên silica gel theo cơ chế sắc kí hấp phụ.
Sắc kí cột (CC) gradient trên nhựa polyme pha đảo có kích thước lỗ cao
Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals, Nhật Bản) theo cơ chế sắc ký phân bố được

sử dụng để phân tách sơ bộ các hợp chất phân cực trong phần chiết nước.
Sắc ký cột nhanh (FC)
Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí nén trên silica
gel theo cơ chế sắc kí hấp phụ.
Sắc ký cột tinh chế (Mini-C)
Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được sử dụng để tinh chế các hợp chất hữu cơ.
Chất hấp phụ là silica gel có kích thước hạt nhỏ.
Chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE)
Chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE) được sử dụng để tinh chế các hợp chất
phân cực. Chiết pha rắn trên pha đảo là quá trình chuyển chất tan (chất cần phân
tích) từ pha lỏng sang pha rắn. Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu và làm
sạch mẫu phân tích. Pha rắn là loại chất hấp phụ kỵ nước kiểu silica biến cải (C-18)
có kích thước 40 µm với đường kính lỗ xấp xỉ 60 A
o
liên kết với nhóm
octadecylsilan, pha động là dung môi phân cực thường là MeOH-H
2
O.
Sắc ký cột loại trừ theo kích thước (SEC)
Sắc ký cột loại trừ theo kích thước được thực hiện theo chế độ CC dưới trọng
lực của dung môi với chất hấp phụ cho sắc ký là Sephadex LH-20 (cỡ hạt 25-100
µm). Sắc kí cột loại trừ theo kích thước phân tử được sử dụng để tinh chế các hợp
chất phenolic.
Phương pháp kết tinh
Phương pháp kết tinh để phân lập và tinh chế các chất rắn.
2.2.2. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc
Cấu trúc của hợp chất được phân lập được xác định bằng cách kết hợp các
phương pháp phổ. Phổ khố lượng (MS) cho các thông tin để xác định được khối
lượng phân tử và các con đường phân mảnh. Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR) vị trí của các tín hiệu NMR (nghĩa là các tần số cộng hưởng) được gọi là độ

21

chuyển dịch hóa học

. Các giá trị của độ chuyển dịch hóa học

H
và

C
trên các phổ
1
H-NMR và
13
C-NMR cho các thông tin về các phần cấu trúc và các nhóm chức có
trong các phân tử được nghiên cứu. Các hằng số tương tác giữa các proton cho phép
nhận biết các proton liên kết với nhau từ đó có thể xây dựng được các phần của
phân tử. Phổ DEPT cho tính bội của các nguyên tử cacbon.
Các kỹ thuật phổ được sử dụng trong Luận văn:
Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS);
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (
1
H-NMR);
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (
13
C-NMR) với chương trình DEPT.

22

Chƣơng 3:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nguyên liệu cho nghiên cứu hóa học của Luận văn này là phần trên mặt đất
của cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) dùng làm thuốc được thu mua ở
Gia Lâm, Hà Nội.
Mẫu được lấy làm hai lần:
Lần 1 vào tháng 4 năm 2009: nguyên liệu là phần thân được tách khỏi lá.
Lần 2 vào tháng 6 năm 2010: nguyên liệu là cả phần trên mặt đất.
Các kết quả nghiên cứu sơ bộ phần trên mặt đất mẫu cây Cỏ mực được thu
thập lần 1 cho thấy:
1) Các thành phần hóa học của phần lá và phần thân cây Cỏ mực có nhiều chất

giống nhau qua phân tích TLC;
2) Các phần ít phân cực chứa chủ yếu là các sterol;
3) Có khả năng phân tách tiếp các hợp chất phân cực hơn từ phần trên mặt đất.
Phần trên mặt đất có thể là bộ phận chứa nhiều hoạt chất của cây thuốc này
do đó phần trên mặt đất cây Cỏ mực đã được thu thập lần 2 cho một nghiên cứu hệ
thống về các hợp chất phân cực trong cây Cỏ mực.
3.2. Điều chế các phần chiết hữu cơ từ cây Cỏ mực
Phương pháp chiết có một ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập các hợp
chất hữu cơ thuộc các lớp chất hữu cơ mong muốn. Trong Luận văn này nhằm đạt
được sự làm giàu sơ bộ các hợp chất theo độ phân cực trong các phân chiết riêng
biệt, nguyên liệu cây Cỏ mực được xử lý theo một qui trình chiết và phân tách hai
pha lỏng chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần.
Chiết hai pha rắn-lỏng: Bột nguyên liệu cây Cỏ mực (lần 1: phần thân
(phần trên mặt đất được tách lá); lần 2: phần trên mặt đất) được ngâm chiết với
metanol ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần trong 4 ngày). Các dịch chiết metanol
được lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở 50
o
C thu được phần chiết
metanol.
23

Phân tách hai pha lỏng: Để phân tách các hợp chất có trong phần chiết
metanol phần chiết này được hòa với nước cất cho một dịch nước của phần chiết
metanol. Chiết dịch nước này với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan,
điclometan và etyl axetat cho các dịch chiết trong n-hexan, điclometan và etyl
axetat. Cất loại kiệt dung môi các dịch chiết, thu được các phần chiết hữu cơ tương
ứng. Dịch chiết nước còn lại được cô kiệt dưới áp suất giảm cho phần chiết nước.
Qui trình này phân tách các hợp chất trong phần trên mặt đất cây Cỏ mực
thành nhóm các hợp chất ít phân cực trong các phần chiết n-hexan và điclometan,
nhóm các hợp chất phân cực trung bình trong phần chiết etyl axetat và nhóm các

hợp chất phân cực trong phần chiết nước.
Qui trình điều chế các phần chiết từ thân (EA) và phần trên mặt đất (EP) cây
Cỏ mực đượctrình bày tóm tắt trong các Sơ đồ 1 và Sơ đồ 2.
Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực được trình bày trong Bảng 1.
Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân cây Cỏ mực
STT
Phần chiết
Kí hiệu
Khối lƣợng (g)
Hiệu suất (%)
1
n-hexan
EA1
2,76
0,46
EP1
107,2
3,15
2
điclometan
EA2
1,34
0,22
EP2
4,90
0,14
3
etyl axetat
EA3
3,42

0,57
EP3
4,90
0,14
4
nước
EA4
3,40
0,57
EP4
12,09
0,36

3.3. Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết thân cây Cỏ mực
3.3.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết thân cây Cỏ mực
Phân tích TLC các phần chiết được thực hiện trên bản mỏng silica gel 60F
254

(TLC, Merck) với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton cho các phần chiết ít
phân cực (n-hexan và điclometan) và hệ ba dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic
cho phần chiết phân cực hơn etyl axetat.
Sự phân giải trên sắc kí lớp mỏng cho thấy phân tách sắc kí cột các phần
chiết này cần được thực hiện với sự rửa giải gradient.
24

3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EA1)
Phần chiết n-hexan (EA1) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient trên
silica gel với các hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1.
Phân tách đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA1 theo độ phân cực từ
EA1.1 đến EA1.4 (n-hexan-axeton 19:1), EA1.5 (n-hexan-axeton 9:1), EA1.6 (n-

hexan-axeton 6:1), EA1.7 và EA1.8 (n-hexan-axeton 3:1) và EA1.9 (n-hexan-
axeton 1:1).
Các nhóm phân đoạn chính từ EA1.2 đến EA1.5 (n-hexan-axeton 19:19:1)
được rửa bằng n-hexan cho β-sitosterol (chất I) dưới dạng các tinh thể hình kim
màu trắng. Như vậy β-sitosterol đã được phân lập là thành phần chính của phần
chiết EA1.
3.3.3 Phân tách phần chiết điclometan (EA2)
Phần chiết điclometan (EA2) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient
trên silica gel với các hệ dung môi rửa giải n-hexan-axeton 6:1, 3:1, 2:1 và 1:1.
Phân tách hệ thống đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA2 theo độ phân
cực, từ EA2.1 đến EA2.4 (n-hexan-axeton 6:1), EA2.5 và EA2.6 (n-hexan-axeton
3:1), EA2.7 và EA2.8 (n-hexan-axeton 2:1) và EA2.9 (n-hexan-axeton 1:1).
Nhóm phân đoạn EA2.1 và EA2.2 (n-hexan-axeton 6:1) được rửa bằng n-
hexan cho β-sitosterol (I) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng.
3.3.4 Phân tách phần chiết etyl axetat (EA3)
Phần chiết etyl axetat (EA3) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient
trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1 và 10:19:1.
Phân tách đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA3 theo độ phân cực thành
2 nhóm phân đoạn từ EA3.1 đến EA3.6 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1) và từ
EA3.7 đến EA3.10 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 10:19:1).
Nhóm phân đoạn EA3.3 được phân tách sắc kí cột Sephadex LH-20 với
dung môi MeOH cho 5 nhóm phân đoạn từ EA3.3.1 đến EA3.3.5.Các nhóm phân
đoạn EA3.3.1, EA3.3.2 và EA3.3.3 được rửa bằng điclometan cho metyl gallat
(chất II) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng.
25

3.3.5 Phân tách phần chiết nƣớc (EAT4)
Phần chiết nước (EA4) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient trên
polime pha đảo Diaion HP-20 với gradient MeOH-H
2

O thành 5 phân đoạn EA4.1
(H
2
O), EA4.2 (20% MeOH), EA4.3 (40% MeOH), EA4.4 (60% MeOH) và EA4.5
(MeOH).
Phân đoạn 60% MeOH-H
2
O (EA4.4) được phân tách sắc kí cột Sephadex
LH-20 với dung MeOH, sau đó bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel với các hệ dung
môi CH
2
Cl
2
-MeOH 9:1, 7:1 và 4:1 cho saponin tritecpenoit eclalbasaponin I (chất
III). Chất này còn được phân lập từ phân đoạn MeOH (EA4.5) qua phân tách sắc kí
cột (CC) trên silica gel với các hệ dung môi CH
2
Cl
2
-MeOH 9:1, 7:1 và 4:1.
Quy trình chiết và phân tách phần thân cây Eclipta prostrata (EA) được trình
bày trên Sơ đồ 1.





26

Sơ đồ 1: Chiết và phân tách sắc ký phần thân cây Cỏ mực (EA)
EA4.4
0,72 g
I
10 mg
I
0,14 g
I
0,27 g
II
0,3 g
III
10 mg
EA4.5

0,89 g
III
0,1 g
1. Ngâm với MeOH ở nhiệt độ phòng
2. Chiết với n-hexan, điclometan, etyl axetat
nước
CC, silica gel, n-hexan-axeton
19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1
CC, silica gel, n-hexan-axeton
6:1, 3:1, 2:1, 1:1
CC, silica gel, n-hexan-EtOAc-HCOOH
20:19:1, 10:19:1

Diaion HP-20, 20%, 40%, 60%
MeOH-H
2
O
Rửa, n-hexan
1. Sephadex, MeOH
2. CC, silica gel CH
2
Cl
2
-MeOH 9:1, 7:1, 4:1
3. Rửa CH
2
Cl
2

1,2,3

2,3
Rửa, n-hexan
Rửa, n-hexan
1. Sephadex, MeOH
2. Rửa CH
2
Cl
2

EA
(0,6 kg)


EA4
3,4 g

EA3
3,4 g
EA2
1,3 g
EA1
2,7 g
EA1.1
0,4 g

EA1.2
0,9g
EA1.4-1.5
0,15 mg
EA1.6-1.9

0,5g
EA2.1-2.2
0,28 g
EA2.3-2.9
1 g
EA3.1-3.2
64 mg
EA3.3
0,51 g
EAT3.4-3.10
1,44 g
EA4.1-4.3
1,79 g