nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký

ĐA
̣
I HO
̣
C QUÔ
́
C GIA HA
̀
NÔ
̣
I
TRƢƠ
̀
NG ĐA
̣
I HO
̣
C KHOA HO
̣
C TƢ
̣
NHIÊN



BÙI MINH THÁI



NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT
BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ

LUÂ
̣
N VĂN THA
̣
C SI
̃
KHOA HO
̣
C





HÀ NỘI – 2011

ĐA
̣
I HO
̣
C QUÔ
́
C GIA HÀ NỘI
TRƢƠ
̀
NG ĐA

̣
I HO
̣
C KHOA HO
̣
C TƢ
̣
NHIÊN


Bùi Minh Thái


NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT
BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ

Chuyên nga
̀
nh: Hóa Phân Tích
M số: 60 44 29

LUÂ
̣
N VĂN THA
̣
C SI
̃
KHOA HO
̣
C

NGƢỜI HƢỚNG DN KHOA HC:
PGS.TS. Nguyễn Văn Ri




HÀ NỘI – 2011
MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ

MỞ ĐẦU …………………………………………………………………
1
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ……………………………………………….
2
1.1. Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)………
2
1.1.1. Cấu trúc phân tử …………………………………………………
2
1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole ………….
2
1.1.3. Tính chất dược lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole
4
1.1.4. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole
4
1.1.5. Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu ……… ………………
7

1.2. Phƣơng pháp xác định……………………………………………….
9
1.2.1. Một số công trình nghiên cứu xác định Sas bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ……………………………………………
9
1.2.2. Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) …………………………………….
13
1.2.3. Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và
metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ……….
14
Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……
16
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu…………………
16
2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu …………………………………
16
2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu ……………………………………………
16
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………
17
2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC …….
17
2.2.2. Phân tích định lượng bằng HPLC …………………………
19
2.3. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết pha rắn ….………….
20
2.4. Hóa chất và dụng cụ……………………………………………
21
2.4.1. Hoá chất …………………………………………………

21
2.4.2. Dụng cụ ………………………………………………………
22
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………….
23
3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký ……………………………………….
23
3.1.1. Chọn bước sóng của detector ……………………………………
23
3.1.2. Thăm dò khả năng tách của các Sulfamit trên cột RP-C18 ……….
26
3.2. Chọn pha tĩnh ……………………………………………………
28
3.3. Tối ƣu hóa pha động …………………………………………………
28
3.3.1. Nồng độ đệm axetat của pha động ………………………………
28
3.3.2. Độ pH cho dung dịch đệm axetat ………………………………….
30
3.3.3. Tỉ lệ thành phần pha động ………………………………………
33
3.3.4. Tốc độ pha động
35
3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích …………………………………
38
3.4.1. Khảo sát lập đường chuẩn trong khoảng nồng độ 0,05 – 1,000ppm
38
3.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD); Giới hạn định lượng (LOQ)
42
3.4.3. Độ đúng, độ lặp lại của phép đo ………………………………….

44
3.5. Mẫu thực, quy trình xử lý và kết quả phân tích …………………
48
3.5.1. Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi …………………
48
3.5.2. Phân tích mẫu thực ………………………………………………………
51
KẾT LUẬN ……………………………………………………………….
59
TÀI LIỆU THAM KHẢO





DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT





STT
Viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
1

ACN
Acetonitrin
Axetonitrin

2

BNNPTNT

Bộ Nông nghiệp phát
triển nông thôn
3

CV
Coeficient Variation
Hệ số biến thiên
4
HPLC
High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
5

RP
Reversed phase
Hấp phụ pha đảo
6

LOD
Limit of Detection
Giới hạn phát hiện
7

LOQ

Limit of Quantity
Giới hạn định lượng
8

TT

Thông tư
9

UV - Vis
Untraviolet - Visibet
Tử ngoại – Khả kiến

DANH MỤC BẢNG BIỂU


Bảng 3.1:
Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector…………………
25
Bảng 3.2:
Thời gian lưu và thứ tự ra pic của các chất phân tích………………
27
Bảng 3.3:
Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat của pha động……………
29
Bảng 3.4:
Hệ số dung tích ở các giá trị pH khác nhau………………………….
31
Bảng 3.5:
Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN trong pha động……………
33-34
Bảng 3.6:
Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động
36
Bảng 3.7:
Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ các chất phân tích………
38-39
Bảng 3.8:
Bảng giá trị các F

tính
của các chất phân tích
42
Bảng 3.9:
LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy
43
Bảng 3.10:
Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm)
45
Bảng 3.11:
Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,4ppm)
46
Bảng 3.12:
Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,8ppm)
47-48
Bảng 3.13:
Chiều cao píc sắc ký mẫu tôm ở các nồng độ thêm chuẩn khác nhau
50
Bảng 3.14:
Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các chất phân tích………………
51
Bảng 3.15:
Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm rảo…………………….
52
Bảng 3.16:
Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm rảo…………………
53
Bảng 3.17:
Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm chân trắng…………….
54

Bảng 3.18:
Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm chân trắng……………….
54
Bảng 3.19:
Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm sú……………………
55
Bảng 3.20:
Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm sú……………………
55
Bảng 3.21:
Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm lớt…………………….
56
Bảng 3.22:
Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm lớt……………………….
57



DANH MỤC HÌNH VẼ


Hình 1.1:
Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein…………………
5
Hình 2.1:
Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đủ………………………………
19
Hình 3.1:
Phổ hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến của các Sas……………
23-24

Hình 3.2:
Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector………………
25
Hình 3.3:
Thời gian lưu của các sulfamit……………………………………
26-27
Hình 3.4:
Sự phụ thuộc của k’ vào nồng độ đệm axetat trong pha động……
29
Hình 3.5:
Píc sắc ký ở các giá trị nồng độ đệm khác nhau
29-30
Hình 3.6:
Sự phụ thuộc của K’ vào pH của pha động
31
Hình 3.7:
Sắc đồ sắc ký ở pH khác nhau
32
Hình 3.8:
Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN trong pha động
34
Hình 3.9:
Sắc đồ píc sắc ký tại các tỉ lệ thành phần pha động khác nhau
34-35
Hình 3.10:
Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động
36
Hình 3.11:
Sắc đồ tốc độ khác nhau của pha động
37

Hình 3.12:
Đường chuẩn của chất phân tích trong khoảng nồng độ 0,05-1,00ppm….
39-40
Hình 3.13:
Sắc đồ của các chất phân tích nồng độ khác nhau tại bước sóng 270nm…
40
Hình 3.14:
Sắc đồ của các chất phân tích nồng độ khác nhau tại bước sóng 320nm…
41
Hình 3.15:
Sắc đồ của 5 chất phân tích với nồng độ 0,01ppm…………………
43
Hình 3.16:
Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,08ppm ….
45
Hình 3.17:
Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,4ppm ……
47
Hình 3.18:
Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,8ppm ……
48
Hình 3.19:
Sơ đồ xử lý mẫu Tôm
49
Hình 3.20:
Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tôm
50
Hình 3.21:
Đường chuẩn SGU trong mẫu tôm rảo khi phân tích thêm chuẩn….
53

Hình 3.22:
Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong mẫu tôm rảo………
53
Hình 3.23:
Đường chuẩn SGU trong mẫu tôm chân trắng khi phân tích thêm chuẩn
54
Hình 3.24:
Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong mẫu tôm chân trắng
54
Hình 3.25:
Đường chuẩn của SGU, SMP trong mẫu tôm sú khi phân tích thêm chuẩn
55
Hình 3.26:
Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU, SMP trong tôm sú……….
56
Hình 3.27:
Đường chuẩn SGU trong mẫu tôm lớt khi phân tích thêm chuẩn…
57
Hình 3.28:
Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong tôm lớt…………….
57

MỞ ĐẦU
Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hết các
cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng sinh thông thường
(chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) bản thân nó có thể gây ra tác
động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, một số loại khác như các kháng sinh nhóm
nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra những hợp
chất có độc tính cao đối với cơ thể sống. Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit (SAs) là
nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong trong nuôi trồng, chế
biến nông thủy sản, v.v
Việc sử dụng chất này một cách tùy tiện có thể dẫn đến tồn dư một lượng lớn
quá giới hạn cho phép trong cơ thể động vật. Khi người tiêu dùng sử dụng thực phẩm
có dư lượng lớn sulfamit hay các chất kháng sinh trong thời gian dài gây ra một loạt
các phản ứng như rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu, rối loạn chuyển hóa
porphyrin. Cho nên việc xác định chính xác lượng các sulfamit, các chất kháng sinh
trong thức ăn chăn nuôi và lượng tồn dư trong sản phẩm từ động vật là rất quan trọng.
Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các
điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit
như sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis, phương
pháp này có độ chọn lọc, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm của
nước ta, có tính khả thi và ứng dụng vào thực tế cao.

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN
1.2. Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole(MTD)
1.1.1. Cấu trúc phân tử [3,6]
Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát:
R
2
N SO
2
NH R
1

Khi thay thế các nhóm R
1
, R
2
bằng các gốc khác nhau, chúng ta có các SAs khác
nhau.Vì thế có cả một họ SAs.
Khi R
2
= H thì sulfamit mới có hoạt tính kháng khuẩn. Khi R
2
# H, thì chất đó là
tiền thuốc. R

1
có thể là mạch thẳng, dị vòng. Tuy nhiên nếu R
1
là dị vòng thì hiệu lực
kháng khuẩn mạnh hơn, thông thường các dị vòng 2-3 dị tố.
Cấu trúc Metronidazole(MTD):

Là một thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt đối với vi
khuẩn kỵ khí và động vật nguyên sinh. MTD là một trong những thành phần có mặt
trong thức ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản (với tên thương
mại là Enro DC).
1.1.3. Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole [3]
1.1.2.1. Tính chất vật lý
SAs ở dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, thường ít tan trong
nước, tan trong dung dịch axít, tan trong dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin).
MTD là tinh thể hoặc bột kết tinh, hơi vàng, không mùi, bền ngoài không khí,
sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng. Nóng chảy ở khoảng 159
o
C – 163
o
C.
Metronidazol khó tan trong nước, aceton.
1.1.2.2. Tính chất hoá học
- SAs có tính chất lưỡng tính:
 Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung dịch axít. Ví
dụ: cho kết tủa muối picrat trong dung dịch HCl loãng.
 Có tính axít do có nguyên tử H ở N-amit linh động, nên dễ tan trong dung
dịch kiềm tạo muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin):
NH
2

SO
2
N
R
H
NH
2
SO
2
N
R
H
NH
2
SO
2
N
R
Na

- SAs tạo muối phức kết tủa với ion Ag
+
, và tạo phức màu kết tủa với ion Cu
2+
,
Co
2+
, …
- Ở nhóm amin bậc một của SAs có đôi điện tử tự do, giúp SAs thực hiện phản
ứng tạo phức chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho phức màu tím có bước

sóng hấp thụ cực đại ở 270-273 nm.
- Nhóm amin thơm tự do cho phản ứng diazo hoá, rồi ngưng tụ với naphtol
cho sản phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ ở bước sóng 460nm.
Ar-NH
2
+ NaNO
2
+ 2HCl = [Ar-N
+
≡N]Cl
-
+ NaCl + 2H
2
O
Muối diazoni
Ở đây, Ar – là thành phần -C
6
H
5
-SO
2
NH-R
1
của phân tử SAs.
Nhờ thế mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp này diễn ra dễ dàng.

1.1.6. Tính chất dƣợc lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole [3,6,9]
Với liều điều trị, SAs không diệt vi khuẩn, chỉ làm vi khuẩn yếu đi, không phát
triển và sinh sản được, dễ bị bạch cầu tiêu diệt.
SAs có phổ tác dụng và hoạt phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vi

khuẩn tả, Shigella, E.coli, trực khuẩn Hansen Ít hoặc không tác dụng trên một số vi
khuẩn: liên cầu khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia Không có tác dụng đối
với virut (trừ virut gây đau mắt nhạy cảm với sulfacylum). Nhưng lại có tác dụng lên
một số ký sinh trùng, đặc biệt ký sinh trùng sốt rét.
Tính hấp thu và đào thải: trừ nhóm SAs điều trị đường ruột, các SAs nói chung
đều được hấp thu nhanh ở ruột non, đào thải chủ yếu qua đường thận với tốc độ khác
nhau nên thời gian có tác dụng khác nhau.
Metronidazole cũng có hoạt phổ rộng bao gồm động vật nguyên sinh và các vi
khuẩn yếm khí bao gồm: nhóm Bacteroides(gồm cả B. fragilis), Fusobacterium
Veillonella, nhóm Clostridium (bao gồm cả C. difficile và C. perfringens),
Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus. Nó là hiệu quả đối với B. fragilis phân
lập kháng với clindamycin
Metronidazole cũng có những hoạt động ức chế miễn dịch và kháng viêm, và nó
đã được sử dụng trong các bệnh nhân bị bệnh rosacea. Các hoạt động kháng khuẩn của
metronidazole làm thay đổi trao đổi chất của vi khuẩn acid mật trong đường ruột, giảm
ngứa ở những bệnh nhân bị ứ mật thứ cấp đến xơ gan mật tiền phát.
1.1.7. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole [3]
1.1.4.1. Cơ chế kháng khuẩn của SAs
- Ức chế enzym chuyển hóa acid folic
Các sulfamit có hiệu lực điều trị tốt đều có gốc R mang dị vòng, dị vòng 2 dị tố
tốt hơn dị vòng 1 dị tố. Ví dụ: sulfamethoxazol: ức chế enzym dihydrofolat synthetase
nên ngăn chặn giai đoạn chuyển acid folic thành axit hydrofolic.
- Ngăn cản tổng hợp axít folic của vi khuẩn
Vi khuẩn tổng hợp và chuyển hoá axít folic thành nucleo protein (cần thiết cho
mọi tế bào sống) theo sơ đồ sau:

N
NN
N
NH

2
OH
CH
2
NH CO NH CH
COOH
CH
2
CH
2
COOH
pterin
A.PAB
(vitamin H
+
)
acid glutamic
pteoryl
Acid folic (acid pteoryl glutamic)
Dihydrofolat syntetase
(enzym)
Acid Dihydrofolic
Dihydrofolat sreductase
(enzym)
Acid Tetrahydrofolic
Acid folinic
Nucleoprptein

Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein
Theo sơ đồ trên sự đối kháng giữa A.PAB và SAs là sự cạnh tranh vào vị trí của

A.PAB trong thành phần phân tử axít folic trong quá trình vi khuẩn tổng hợp axít này.
Khi nồng độ đủ cao thì SAs sẽ chen vào vị trí của A.PAB làm cho việc tổng hợp axít
folic bị gián đoạn, ngưng trệ. Sự tranh chấp giữa A.PAB và SAs rõ ràng tuân theo quy
luật khối lượng, nên cần duy trì nồng độ có tác dụng ở máu trong suốt thời gian dùng
SAs.
SAs thay được A.PAB vì chúng giống nhau về hình dạng, kích thước và nhóm
chức hoá học:

Ở ngoài mặt phẳng
A.PAB Sulfamit
Như vậy những vi khuẩn không cần đến axít folic hoặc lấy được axít foclic có sẵn
trong môi trường thì không bị SAs tác dụng. Tế bào của người và động vật lấy axít
folic từ bên ngoài vào như một vitamin (axít folic là vitamin B
9
), nên không bị ảnh
NH
2
C
O
OH
NH
2
S
NH - R
O
O
6.7
A
o

A
o

A
o

A
o

2.3
6.9
2.4
hưởng bởi SAs. Khi dùng SAs để chữa bệnh thì nó chỉ có tác dụng chọn lọc trên vi
khuẩn.
N
H
H
S N R
N
H
H
S O
O
O
O
(-)
(-)

N
H

H
S N R
N
H
H
S O
O
O
O
(-)
(-)

anion sulfamit
anion PAB
1.1.4.2. Cơ chế kháng khuẩn của Metronidazole
Metronidazole tác dụng lên vi khuẩn kỵ khí như Helicobacter pylori và
Gardnerella vaginalis, nhưng cơ chế của hành động này là chưa được hiểu rõ. Tuy
nhiên, hoạt động của nó chống lại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc xảy ra thông qua một quy
trình bốn bước:
- Tấn công vào vi sinh vật: Metronidazole là một hợp chất có khối lượng phân tử
thấp nên dễ dàng khuếch tán qua màng tế bào của vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí.
- Làm suy giảm hoạt hóa bởi sự vận chuyển protein trong tế bào: Metronidazole
làm giảm bởi pyruvat : ferredoxin(protein chứa sắt chuyển các điện tử) oxidoreductaza
(enzyme xúc tác phản ứng oxy hóa- khử) trong ty thể của vi khuẩn kỵ khí, làm thay
đổi cấu trúc hóa học của nó.
Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase thường tạo ra ATP qua decarboxylation oxy
hóa của pyruvate. Với metronidazole trong tế bào, nhóm nitro của nó hoạt động như
một chỗ cất giữ điện tử, thu giữ điện tử thường được chuyển giao cho các ion hydro
trong chu kỳ này. Tác dụng làm suy giảm của metronidazole thúc đẩy hình thành các
hợp chất trung gian và các gốc tự do độc hại đối với tế bào.

- Giảm tương tác tiểu phân trung gian với tế bào - các tiểu phân trung gian độc
tương tác với DNA chủ, dẫn đến vỡ sợi DNA và phá hủy chuỗi AND.
- Sự phá vỡ của các sản phẩm trung gian gây độc tế bào - các tiểu phân trung
gian độc hại phân hủy thành sản phẩm cuối cùng không hoạt động.
1.1.8. Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu [3;6; 9]
Như ta đã biết, các SAs có cả một họ gồm hàng nghìn chất, với những tính chất
và công dụng khác nhau. Vì vậy, chúng tôi chỉ đi sâu vào bốn SAs sẽ được nghiên cứu
trong luận văn này.
1.1.8.1. Sulfaguanidin (SGU)
Công thức:
NH
S
NH
2
NH
2
NH
O
O

Tính chất: Dạng bột tinh thể màu trắng, tan rất ít trong nước, axeton, etanol 96
o
;
không tan trong metylen clorit (CHCl
3
); không tan trong dung dịch có tính kiềm; tan
tốt trong dung dịch các axít vô cơ loãng Nhiệt độ nóng chảy 189 – 193
o
C.
SGU cũng như nhiều SAs khác có cấu trúc rất giống A.PAB - một chất không thể

thiếu cho sự phát triển của vi khuẩn. Nên dễ dàng thay thế A.PAB để kìm hãm quá
trình trao đổi chất của vi khuẩn. Vì vậy SGU là một tác nhân kháng khuẩn mạnh, được
dùng như một loại thuốc chống các bệnh dịch tả, đái tháo đường, chứng phù, tăng
huyết áp
1.1.5.2.Sulfamethoxypyridazin (SMP)
Công thức:
NH
2
S
NH
O
O
N
N
OCH
3

Tính chất: SMP ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà, dưới tác dụng của
ánh sáng sẽ bị sẫm màu, nâu dần; có vị đắng; rất ít tan trong nước, tan trong kiềm và
axít vô cơ loãng. Nhiệt độ nóng chảy của dẫn chất axetyl hoá là 228 – 229
o
C.
SMP tác dụng lên vi khuẩn tương tự như sulfadiazin nhưng hấp thụ ở ruột nhanh
hơn, nhiều hơn và đào thải rất chậm nên đạt được nồng độ cao trong máu, đồng thời
duy trì được nồng độ có tác dụng lâu, nên có tác dụng kéo dài. Vì vậy dùng liều thấp
hơn, ít nguy cơ kết tinh ở đường tiết niệu song cần đề phòng nguy cơ tích luỹ gây ngộ
độc vì sự đào thải chậm. SMP dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp,
sinh mủ, viêm (hoặc giãn) phế quản, viêm đường niệu đạo (bể thận, ruột thận), viêm
họng, màng não tuỷ, v.v
1.1.5.3.Sulfadoxin (SDO)

Công thức:
NH
2
S
NH
O
O
NN
OCH
3
OCH
3

Tính chất: SDO dạng bột kết tinh màu trắng, rất ít tan trong nước, ít tan trong
etanol 96
o
, không tan trong ete, tan trong các dung dịch axít vô cơ loãng và hydroxyt
kiềm. Nhiệt độ nóng chảy 198
o
C.
SDO chỉ định các nhiễm khuẩn do tụ cầu, lậu cầu, màng não cầu, E.coli, phế cầu.
Dung dịch muối natri tiêm tĩnh mạch cho các trường hợp nhiễm khuẩn nặng, trị sốt rét.
Muối Ag của SDO có tác dụng tốt lên trực khuẩn mủ xanh, chữa bỏng. SDO cũng có
tác dụng kéo dài.
1.1.5.4. Sulfamethoxazol (SMX)
Công thức:
NH
2
S
NH

O
O
O
N
CH
3

Tính chất: SMX dạng bột tinh thể trắng hoặc trắng ngà. Thực tế không tan trong
nước, khó tan trong ete, hơi tan trong ethanol 96
o
, dễ tan trong axeton, tan trong các
dung dịch hydroxyt kim loại kiềm loãng. Nhiệt độ nóng chảy là 169 - 172
o
C.
SMX có tính kháng khuẩn mạnh, đã được làm thuốc điều trị sốt rét phối hợp với
pyrimethamin, do ức chế men dihydropholat nên ngăn cản sự chuyển hóa axít
dihydrofolic. SMX còn được dùng rộng rãi cho các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp,
tai - mũi - họng, đường tiết niệu, thận, máu, bộ phận sinh dục, đường tiêu hoá, v.v
1.2. Phƣơng pháp xác định
1.2.1. Một số công trình nghiên cứu xác định Sas bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là
các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp
chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môi trường đặc biệt là
tách và phân tích lượng vết các chất.
Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định các kháng khuẩn SAs
trong các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác khi xác định dư
lượng các kháng khuẩn trong mẫu thực phẩm vì có độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại
cao

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi
rửa giải. Ngày nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở
rộng khả năng phát hiện được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với
phân tích dư lượng thì người ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD) nhất là tách và
phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Còn thông dụng người ta dùng detector
UV-Vis hay detector huỳnh quang. Dùng detector UV-Vis thì xác định được nhiều loại
chất hơn, nhưng detector huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc hơn và ít hơn các
tương tác do các hợp chất có trong nền mẫu.
Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004 [8], qui định phương pháp xác định hàm
lượng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfa-
methazin,sulfamethoxypiridazine,sulfacloropyridazin,sulfadoxin, sulfamethoxazone
sulfadimethoxin và sulfa-chinoxalin) trong sản phẩm thủy sản bằng HPLC- detector
huỳnh quang. Điều kiện chạy sắc ký như sau: Cột sắc ký: cột Nucleosil 250×3mm
100-5 C18 AB. Chương trình pha động (gồm: dung dịch H
3
PO
4
0,02M và hỗn hợp
metanol- axcetonitril tỷ lệ 1:1), bắt đầu với 60 % H
3
PO
4
và đến 45 phút 45 % H
3
PO
4
,
tốc độ dòng 0,6 ml/phút. Thể tích mẫu tiêm 10l. Bước sóng kích thích 405nm, bước
sóng phát xạ 495nm. Phương pháp xử lý mẫu này cho hiệu suất thu hồi nằm trong
khoảng 60-70 %, với giới hạn phát hiện nhỏ hơn 5 g/kg.

Năm 2010 Cheong và cộng sự[12] đã xác định dư lượng 4 SAs (Sulfadiazine
(SDZ),Sulfamethazine(SMZ),Sulfamethoxazole(SMX) và Sulfaquinoxaline(SQX))
trong gan gà sử dụng phương pháp HPLC pha đảo, detector UV tại bước sóng 266nm.
Điều kiện chạy sắc ký như sau: cột C18 (5 μm, 4.6 mm x 25.0 cm). Kênh A: amoni
axetat nồng độ 0,01M(pH =4,6). Kênh B: ACN. Sử dụng gariend pha động như sau:
ban đầu 95% A- 5%B, sau 18phút: 67%A -37%B, sau 23 phút95% A- 5%B. Tốc độ
pha động 1ml/phút. Nồng độ của SAs được phát hiện trong mẫu từ 11 tiểu bang trên
bán đảo Malaysia là 0,006-0,062 μg/g trong nhu mô và 0,08-0.193 μg/g trong gan .
Rodrigo H.M.M. Granja, Alfredo M. Montes Niño, Fernanda Rabone

and
Alessandro Gonzalez Salerno[25] đã sử dụng phương pháp HPLC –detector UV để
xác định sunfamit trong mật ong. Sulfonamid được trích xuất từ mật ong với
dichloromethane sau khi giải thể với clorua natri 30%, và làm sạch với chiết pha rắn
trên các cột Florisil. Dung dịch chiết được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
với phát hiện tia cực tím. Các giới hạn phát hiện được xác định tại 3 μg/kg, 4 mg/kg và
5 mg/kg cho sulfamethazine, sulfathiazole và sulfadimethoxine, tương ứng với hiệu
suất thu hồi 61,0% cho sulfathiazole; 94,5% cho sulfamethazine và 86,0% cho
sulfadimethoxine ở mức 100μg/kg.
Ngoài detector UV, huỳnh quang, là những detector thường dùng, nhiều công
trình nghiên cứu còn sử dụng detector khác như detector diode array (DAD), detector
điện hóa cho độ nhạy và độ chọn lọc cao.
Tác giả Ivan Pecorelli và các đồng sự [18], sử dụng phương pháp HPLC - DAD
để phân tích đồng thời dư lượng 10 SAs trong mẫu bắp thịt (sulfadiazin, sulfathiazol,
sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamono-methoxin, sulfa-chlorpyridazin,
sulfamethoxazone, sulfaquinoxalin, và sulfadimethoxin). Điều kiện chạy sắc ký: Cột
C8 (250mm × 3mm, 5m). Pha động là axetonitril (A) và dung dịch đệm axetat pH =
4,5(B), chạy gradient: bắt đầu với 15% B, đến 22 phút 41% B, tốc độ pha động 0,4
ml/phút. Detector DAD đặt 270nm. Chuẩn bị mẫu: Cân 10g mẫu bắp thịt đã được
nghiền đồng thể vào ống ly tâm 50ml. Thêm vào đó 10g Na

2
SO
4
khan và 20ml etyl
axetat lắc đều trong 15 phút. Đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Pha
hữu cơ được chuyển sang bình nón 250ml. Quá trình chiết như vậy được lặp lại lần
hai. Kết hợp hai phần chiết lại đem cô cạn bằng hút chân không. Sau đó đem pha trong
40ml etyl axetat. Chiết pha rắn: Cột Speedisk được hoạt hoá bằng 2×3ml n-hexan và
2×4ml etyl axetat. Sau khi bơm mẫu vào cột được rửa bằng 5ml nước và 5ml metanol,
rửa giải bằng 20ml hỗn hợp metanol/amoniac (tỷ lệ 97,5/2,5 về thể tích). Dung dịch
thu được làm khô trong điều kiện chân không, rồi hoà tan trong 1ml dung dịch đệm
axetat pH = 4,5 với 0,1% metanol. Lọc qua catridge 0,45 và 0,2l trước khi bơm vào
máy HPLC. Phương pháp này có hiệu suất thu hồi các SAs khá cao 55-92%, với giới
hạn phát hiện 0,05 g/kg.
W.Hela và các cộng sự [29] cũng sử dụng phương pháp HPLC - DAD để xác
định đồng thời mười hai SAs (sulfadiazin, sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin,
sulfamethizol,sulfadimidin,sulfisoxazol,sulfamethoxazone,sulfatroxazol,sulfachlorpyra
zin, sulfaphenazol và dapsone) trong mẫu bắp thịt, gan và thận của lợn, gà Điều kiện
chạy sắc ký: pha tĩnh được dùng là cột Phenonmenex Luna C
8
(250 × 2mm, kích thước
hạt nhồi 5m). Pha động là đệm amoniaxetat pH=4,6 (A) và axetonitril (B), chạy
gradient bắt đầu với 5% B đến 60 phút 40% B, tốc độ pha động 0,35 ml/phút. Detetor
DAD đặt 260nm (đối với các SAs), và đặt 294nm (đối với chất nội chuẩn). Phương
pháp này có giới hạn phát hiện các SAs là 1ppb.
Sắc ký lỏng (HPLC) là một phương pháp được lựa chọn cho việc xác định
các chất vô cơ và hữu cơ trong hỗn hợp khác nhau. Tuy nhiên, nhiều chất có thể
không được phát hiện trong HPLC vì không chứa các màu, huỳnh quang hoặc nhóm
khử oxy hóa. Điều này vấn đề có thể khắc phục bằng các phản ứng dẫn xuất hóa. Một
phản ứng dẫn xuất hóa là cần thiết để tăng độ nhạy cảm hay chọn lọc và có thể đạt

được bởi một phát hiện cụ thể, chẳng hạn như huỳnh quang hoặc hấp thụ trong ánh
sáng nhìn thấy, tại một bước sóng cao. Ngày nay, có rất nhiều công trình nghiên cứu
ứng dụng lý thuyết này để phát hiện và tách các sulfamit trong các mẫu sinh học phức
tạp.
PVinas, C.Lopez Erroz, N.Campillo, M.Hernandez [22] xác định dư lượng
sulfamit( sulfadiazine, sulfathiazole, sulfapyridine, sulfamerazine, sulfamethazine,
sulfamethizole,sulfamethoxypyridazine,sulfachloropyridazine,sulfamonomethoxine, ,
sulfamethoxazole, sulfadimethoxine) trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC với
dẫn xuất hóa huỳnh quang sau cột. Chất dẫn xuất hóa được sử dụng ở đây là OPA (o-
phthldialdehyde) kết hợp với β-mercaptoethanol (ME). Phát hiện huỳnh quang: E
ex

=302nm; E
em
= 412nm. Xây dựng đường chuẩn: Pha động ban đầu: acetonitrile-nước
(3:97) trong 5 phút sau đó gradient tuyến tính từ(3:97) đến (40:60) trong 15 phút. Cuối
cùng, lặp lại điều kiện ban đầu trong 1phút, giữ trong 15phút, tốc độ 0,5ml/phút. Chất
dẫn xuất hóa (0,01M OPA + 0,02M ME, hòa tan trong ethanol 2% 0,7M H
3
PO
4
) được
thêm bởi bơm nhu động tại tốc độ 0,25ml/phút. Chúng được trộn lẫn và phản ứng
trong cuộn PTFE (2,5 0,8 I.D) ở 40
o
C. Đường chuẩn của sulphamethoxazole từ 0,01
-2 µg/ml, các sulfamit còn lại 0,02 -2 µg/ml.
Craig D.C. Salisbury, Jason C.Sweet, Roger Munro[13]sử dụng phương pháp
HPLC với dẫn xuất huỳnh quang trước cột để xác định dư lượng sulfamit
(sulfachloropyridazine,sulfadiazine,sulfadimethoxine,sulfadoxine, sulfaquinoxaline,

sulfaethoxypyridazine, sulfamethazine, sulfathiazole) trong mô lợn, gan bò, cừu ,ngựa
, thịt gà, gan cá, thức ăn chăn nuôi. Mẫu trích được bảo quản trong đệm pH 3,0-ACN
(60:40), mẫu được dẫn xuất hóa trước cột với fluorescamine. Các chất dẫn xuất
sulfonamide được tách bằng sắc ký lỏng sử dụng cột C18 với pha động: acid
phosphoric 0,02M-ACN(60,5: 39,5) và phát hiện bằng huỳnh quang (E
ex
= 405 nm;
E
em
=

495nm). Giới hạn phát hiện (LOD) cho tất cả các sulfamit được 0,01 μg/g, ngoại
lệ sulfaquinoxaline LOD là 0,015 μg/g.
Qiong-Hui Zou, Xiang-Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao, Jie
Han[23] cũng xác định dư lượng đồng thời là 12 sulfamit (sulphadiazine,
sulphamethazine,sulphathiazole,sulphadimethoxine,sulphamerazine,sulphapyridine,
sulphamethoxazole,suphamethizole,sulphaquinoxaline,sulphameter,sulphamonometho
xine, và sulphachloropyridazine) trong các mô động vật (gan lợn, thịt gà, bắp thịt bò)
bởi HPLC với detecto UV. Chất dẫn xuất hóa trước cột của các hợp chất sulfamit với
9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl) đã được đề xuất và các điều kiện phản
ứng đã được tối ưu hóa. Các giới hạn phát hiện cho các hợp chất sulfamit đã được cải
thiện rất nhiều sau khi bước dẫn xuất hoá. Dư lượng sulfamit trong mô động vật được
chiết bằng acetonitrile và tinh chế bằng cách chiết pha rắn với C18. Phương pháp này
có độ nhạy cao và lặp lại tốt và hiệu suất thu hồi trung bình trên 70%. Các giới hạn
phát hiện cho hầu hết các sulfamit có thể đạt 3-5 μg/kg.
1.2.2. Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phƣơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là phương pháp mới được ứng dụng để xác định Metronidazole trong
những năm gần đây.
Năm 2005, Ticiano Gomes Nascimento và cộng sự [26] sử dụng HPLC – UV

xác định đồng thời ranitidine và metronidazole trong huyết tương. 250ml huyết tương
sau khi được kết tủa với percloric 60%, ly tâm, sau đó tiêm trực tiếp vào HPLC. Điều
kiện tách: cột C18 Shimpak, pha động KH
2
PO
4
10mM(pH=3,5) – ACN(90:10,v/v),
phát hiện UV tại bước sóng 315nm. Phương pháp này cho độ chính xác cao (RSD
<15%). Hiệu suất thu hồi: ranitidine (96,22 ± 3,52); metronidazole (95,00 ± 4,50%).
Định lượng ranitidine trong huyết tương là 20ng/ml, metronidazole là 40ng/ml.
Năm 2007 Naser Tavakoli[20]và cộng sự cũng đã sử dụng HPLC để xác định
đồng thời metronidazole và amoxicillin. Điều kiện sắc ký: cột C18, pha động pH =4,
phát hiện bởi detector UV tại bước sóng 254nm. Khoảng tuyến tính của amoxicillin
0,15- 600(mg/ml); metronidazole 0,13 -300mg/ml. Giới hạn phát hiện của amoxicillin
(LOD:0,05mg/ml,LOQ:0,15mg/ml);metronidazole(LOD: 0,1mg/ml, LOQ:0,13mg/ml).
Cũng vào năm đó Han-Wen Sun[17] đã xác định đồng thời dư lượng 7
nitroimidazole:metronidazolenext,ronidazole, dimetridazole, tinidazole, Ornidazole,
secnidazole và các chất chuyển hóa chung của ronidazole và hydroxydimetridazole
trong thịt bằng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện tách: cột silica C18, pha động
H
2
O- ACN, detector UV phát hiện tại bước sóng 300nm. Hiệu suất thu hồi cho các
mẫu thịt gà, thịt lợn, thịt xông khói 71,4-99,5%. Khoảng tuyến tính từ 0,7 -60mg/kg.
Độ lệch chuẩn tương đối của 10 phép đo cho các mẫu thịt gà, thịt lợn và thịt xông khói
tăng, ở nồng độ 1mg/kg : 6,2-13,9% và 20 mg/kg : 4,0-8,7%.
Năm 2008 Hadir M. Maher và cộng sự [16] đã xác định dư lượng đồng thời
metronidazole và spiamycin trong cá sử dụng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện sắc
ký: cột tách C18 Sep-Pak, pha động: rửa giải gradient 0,05M đệm phosphate (pH
=2,4)-ACN, tốc độ dòng 1ml/phút. Khoảng tuyến tính của metronidazole: 0,005-
1,000mg/g, LOD:0,002mg/g, LOQ:0,005mg/g. Khoảng tuyến tính của piamycin:

0,025 -1,000mg/g, LOD: 0,005mg/g, LOQ: 0,025mg/g.
1.2.3. Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và
metronidazole bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Từ những tương đồng trong việc xác định SAs và MTD, rất nhiều công trình đã
xác định được đồng thời MTD và các SAs trong các đối tượng khác nhau
Năm 2002, Richard Lindberg và cộng sự[24] đã xác định đồng thời các chất
kháng sinh thuộc các họ sau: fluoroquinolones, sulfamit, trimethoprim,-β lactam
(penicillin và cephalosporines), nitroimidazoles và tetracycline trong nước thải bệnh
viện. Phương pháp phân tích là HPLC – MS. Các chất phân tích có nồng độ thay đổi
theo thời gian vì vậy 7 mẫu phân tích được lấy lúc 13h. Nồng độ chất phân tích thay
đổi trong phạm vi sau đây(mg/l):ciprofloxacin:3,6-101,0 (mg/l); metronidazole 0,1-
90,2(mg/l);sulfamethoxazole:0,4-12,8(mg/l);ofloxacin:0,2-7,6(mg/l); trimethoprim
0,6-7,6(mg/l); doxycycline 0,6-6,7(mg/l).
Năm 2007, Wang P, Li J, Zheng H [31] đã xác định đồng thời 7 sulfamit
(sulfacetamide,sulfapyridine,sulfamerazine,sulfamethazine,sulfamater,sulfamonometh
oxine, sulfamethoxazole) và metronidazole, chloramphenicol trong mỹ phẩm bằng sắc
ký HPLC-PDA. Điều kiện sắc ký: cột sắc ký Atlantis dC18 (150 mm x 4,6 mm, 5µm).
Pha động : axit formic0,1% - acetonitrile(20: 80, v/v) tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút.
Phát hiện bởi detector PDA tại 268 nm. Giới hạn định lượng 3 - 80 mg/g. Khoảng
tuyến tính của các sulfamit 20-200 mg/ml. Khoảng tuyến tính của metronidazol,
chloramphenicol 40-400 mg / ml. Hiệu suất thu hồi trung bình là 83,8% - 105,3% . Độ
lệch chuẩn tương đối thấp hơn 5%. Phương pháp này thường được sử dụng cho việc
xác định bảy sulfamit và metronidazole, chloramphenicol trong mỹ phẩm.

Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
2.5.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Ở Việt Nam nuôi tôm đã trở thành hoạt động quan trọng nhất và được xem là
mục tiêu chủ yếu của kế hoạch phát triển nuôi trồng thủy sản. Sự phát triển nhanh
chóng của nghề nuôi tôm dẫn đến tình hình sử dụng thuốc và hóa chất cũng gia tăng.
Họ thuốc kháng khuẩn SAs, MTD là nhóm có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều
trong chăn nuôi tôm để phòng ngừa và chữa nhiều loại bệnh nhiễm khuẩn cho vật
nuôi. Sau khi vật nuôi đã sử dụng các chất đó, nếu không đảm bảo thời gian cách ly để
vật nuôi tự làm sạch thì sẽ có tồn dư chất kháng khuẩn có thể gây tổn hại cho sức khoẻ
người tiêu dùng.
Dư lượng kháng sinh trong tôm tác động xấu cho người tiêu dùng đã được cảnh
báo từ nhiều năm trước nhưng đến nay vẫn còn tồn tại vì thế các nghiên cứu liên quan
đến lĩnh vực này hiện rất quan trọng và có ý nghĩa lớn nhằm cải thiện sự bền vững
trong nuôi tôm theo định hướng bảo vệ môi trường và sản xuất sản phẩm có chất
lượng và an toàn.
Vì vậy đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là Metronidazole
sulfaguanidin(SGU),sulfamethoxypyridazon(SMP),sulfadoxim(SDO),sulfamethoxazo
n (SMX) được sử dụng nhiều trong chăn nuôi.
Mục tiêu của đề tài chính là cần tìm ra phương pháp có thể tách và xác định đồng
thời các chất trên trong tôm cho độ nhạy, độ chính xác cao mà đơn giản, phù hợp với
trang thiết bị sẵn có. Xuất phát từ yêu cầu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp
nghiên cứu là phương pháp HPLC hấp phụ pha ngược, detector ghép nối là detector
UV-Vis.
2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
Với mục tiêu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu tách và xác định

đồng thời các Sas, MTD bằng HPLC sử dụng cột chiết pha ngược dùng detector UV-
Vis.
Vì vậy để xây dựng được một quy trình phân tích tốt, chúng tôi đã nghiên cứu
một cách có hệ thống các vấn đề sau:
Tối ưu hoá các điều kiện tách và định lượng đồng thời năm chất bằng HPLC:
 Chọn bước sóng của detector
 Chọn pha tĩnh
 Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ…
 Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
 Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo.
Tối ưu hoá các điều kiện xử lý mẫu phân tích:
 Chọn phương pháp xử lý mẫu và xác định hiệu suất thu hồi
Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để phân tích một
số mẫu tôm.
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu tôm, có thành phần nền rất
phức tạp. Vì vậy chúng tôi chọn phương pháp HPLC (High Performance Liquid
Chromatograghy - Sắc ký lỏng hiệu nâng cao) để khảo sát các điều kiện tách và định
lượng các chất.
2.6.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC [4 ; 8]
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất trong
đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích
thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố
của nó. Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả tách sắc ký tốt.
Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được lực rửa giải phù hợp nhất. Chất tan
sau khi chuyển tới cuối cột tách được chuyển đến detector để phát hiện. Tuỳ thuộc vào
bản chất của chất tan mà dùng các loại detector khác nhau. Trong một hệ pha
HPLC, dung lượng hấp phụ của pha tĩnh được đặc trưng bằng hệ số dung tích k’. Nếu
k’ càng lớn thì chất phân tích sẽ bị lưu giữ càng nhiều trên cột tách. Hệ số dung tích
được tính theo biểu thức :

o
oR
t
tt
k'


(t
R
: thời gian lưu tổng cộng, t
o
: thời gian không
lưu giữ).
Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:
 Tương tác hấp phụ
 Tương tác trao đổi ion
 Tương tác theo cơ chế rây phân tử
 Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau:
 Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP - HPLC và hấp phụ pha ngược RP -
HPLC)
 Sắc ký trao đổi ion (EX - HPLC)
 Sắc ký rây phân tử (Gel - HPLC)
Đối với hệ NP - HPLC, pha tĩnh là các chất phân cực, pha động là dung môi
không và kém phân cực. Ngược lại trong hệ RP - HPLC, pha tĩnh kém phân cực, thông
thường pha tĩnh là các chất phân cực đã được silan hoá bề mặt tạo thành các vật liệu
nhồi kém phân cực. Pha động trong hệ này là các dung môi phân cực. Khác với hệ pha
thường dùng cho các chất không phân cực hay ít phân cực, hệ này có thể phân tích
nhiều loại chất với độ phân cực khác nhau. Do các ưu điểm như xác định được nhiều
loại chất, hiệu quả tách tốt, dung môi ít tốn kém hơn NP – HPLC nên ngày nay sắc ký
lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ pha ngược được sử dụng nhiều hơn.

Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau: