nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ p - lactam trong các mẫu sinh học và dược phẩm

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
1
ĐA
̣
I HO
̣
C QUÔ
́
C GIA HA
̀
NÔ
̣
I
TRƯƠ
̀
NG ĐA
̣
I HO
̣
C KHOA HO
̣
C TƯ
̣
NHIÊN



TRẦN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH THUỐC KHÁNG
SINH HỌ β – LACTAM TRONG CÁC MẪU SINH HỌC VÀ
DƯỢC PHẨM



LUÂ
̣
N VĂN THA
̣
C SI
̃
KHOA HO
̣
C


Hà Nội - 2011


Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
3
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
Chương 1. Tổng quan 2
1.1. Giới thiệu chung về chất kháng sinh 2

1.1.1. Lịch sử ra đời 2
1.1.2. Phân loại 2
1.1.3. Đánh giá tác dụng 2
1.2. Kháng sinh β – Lactam 3
1.2.1. Định nghĩa 3
1.2.2. Cấu trúc và phân loại 3
1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học 7
1.2.4. Tác dụng 7
1.2.5. Điều chế 8
1.2.6. Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện
nay 9
1.3. Các phương pháp định lượng β – Lactam 11
1.3.1. Các phương pháp quang học 11
1.3.2. Các phương pháp điện hóa 12
1.3.3. Các phương pháp điện di mao quản 12
1.3.4. Sắc kí bản mỏng 13
1.3.5. Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 17
2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 17
2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 17
2.1.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP- HPLC 18
2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC 18
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
4
2.2.2. Sắc ký hấp phụ pha ngược RP-HPLC 20
2.2.3. Detector huỳnh quang 22
2.2.4. Một số đại lượng đặc trưng của HPLC 23
2.2.5. Phân tích định lượng bằng HPLC 25

2.3. Kỹ thuật dẫn xuất hóa các β- Lactam với thuốc thử NBD-F 26
2.4. Dụng cụ và hóa chất 28
2.4.1. Máy móc và dụng cụ 28
2.4.2. Hóa chất 28
Chương 3: Kết quả và thảo luận 30
3.1. Khảo sát các điều kiện tạo dẫn xuất giữa β- Lactam và thuốc thử
NBD-F 30
3.1.1. Khảo sát nhiệt độ phản ứng dẫn xuất hóa 30
3.1.2. Khảo sát thời gian phản ứng dẫn xuất hóa 33
3.2. Khảo sát các điều kiện chạy sắc ký 36
3.2.1. Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop) 36
3.2.2. Chọn bước sóng của detector 37
3.3. Chọn pha tĩnh 37
3.4. Chọn pha động 38
3.4.1. pH dung dịch đệm 38
3.4.2. Tỉ lệ thành phần pha động 40
3.4.3. Nồng độ đệm acetat của pha động 44
3.4.4. Tốc độ pha động 47
3.5. Đánh giá phương pháp phân tích 50
3.5.1.Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 50
3.5.2.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 54
3.5.3. Độ đu
́
ng của phép đo 55
3.5.4. Độ lặp lại của phép đo 57
3.6. Phân tích mẫu thực 58
3.6.1. Phân tích mẫu dược phẩm 58
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
5

3.6.2. Phân tích mẫu sinh học 63
3.7. Kết quả một số phương pháp khác xác định kháng sinh cùng loại 68
3.8. Hướng phát triển của đề tài 70
KẾT LUẬN 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO 73
PHỤ LỤC 79




















Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
6
DANH MỤC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số Penicillin
4
2
Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số Cephalosporin
5
3
Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu
7
4
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của S
píc
vào nhiệt độ phản ứng
32
5
Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của S
píc
vào thời gian phản ứng
35
6
Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất vào pH
pha động
38
7
Bảng 3.4. Sự phụ thuộc k’ vào pH pha động
39

8
Bảng 3.5. Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa dung môi
hữu cơ và đệm
41
9
Bảng 3.6. Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa ACN và
MeOH
43
10
Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của k’ vào tỉ lệ giữa ACN và MeOH
43
11
Bảng 3.8. Thời gian lưu của chất phụ thuộc vào nồng độ đệm
44
12
Bảng 3.9. Diện tích píc chất phân tích tại nồng độ đệm khác nhau
45
13
Bảng 3.10. Thời gian lưu của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc
độ pha động
47
14
Bảng 3.11. Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc
độ pha động
47
15
Bảng 3.12. Sự phụ thuộc của S
pic
vào nồng độ chất phân tích
51

16
Bảng 3.13. Các giá trị F
tính
, F
bảng
và phương trình đường chuẩn của
các kháng sinh β - Lactam
53
17
Bảng 3.14. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất
chuẩn kháng sinh β - Lactam
55
18
Bảng 3.15. Độ đu
́
ng của phép đo tại nồng độ các chất 0,15ppm
56
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
7
19
Bảng 3.16. Độ đu
́
ng của phép đo tại nồng độ các chất 0,40ppm
56
20
Bảng 3.17. Độ đu
́
ng của phép đo tại nồng độ các chất 0,80ppm
57

21
Bảng 3.18. Khảo sát độ lặp lại của phép đo theo diện tích pic
58
22
Bảng 3.19. Thông tin mẫu thuốc phân tích
59
23
Bảng 3.20. Kết quả độ thu hồi xác định β-Lactam theo phương pháp
thêm chuẩn trong mẫu thuốc
61
24
Bảng 3.21. Kết quả tính nồng độ C
x
và sự sai khác hàm lượng so
với kết quả in trên nhãn thuốc
63
25
Bảng 3.22. Hiệu suất thu hồi của mẫu nước tiểu
64
26
Bảng 3.23. Hiệu suất thu hồi của mẫu máu
66

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
8
MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người
ngày càng được quan tâm, đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe
con người.
Trong y học hiện đại, các β - Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng
chữa bệnh con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường vào năm
1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Nhờ các thuốc kháng
sinh mà y học có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả,
thương hàn, và điều trị hiệu quả nhiều bệnh gây ra bởi vi khuẩn. Nhưng, nếu liều
lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng
thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn. Ngoài ra, còn gây lãng phí cho người bệnh
vì có những bệnh do vi rút không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng
kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe
người bệnh. Đối với những người cao tuổi , lươ
̣

ng dư kha
́
ng sinh trong nư ớc tiểu
nhiều, còn gây ra các bệnh về thn . Đồng thời, lươ
̣
ng dư na
̀
y tha
̉
i ra môi trươ
̀
ng se
̃

gây lên như
̃
ng hâ
̣
u qua
̉
vô cu
̀
ng nghiêm tro
̣
ng . Vì vy, kiểm soát và phân tích thuốc
kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng
chúng.
Có rất nhiều phương pháp tách khác nhau. Trong đó, phương pháp tách sắc
ký là phương pháp tách chọn lọc có độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít, thời gian phân
tích ngắn.

Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector huỳnh quang trong mẫu sinh học và
dược phẩm là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu điểm của nó ngày càng
được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Trên cơ
sở đó, chúng tôi chọn đề tài là: “Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng
sinh họ β - Lactam trong các mẫu sinh học và dƣợc phẩm ”.

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Kháng sinh β - Lactam
1.1.1. Định nghĩa
Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm:
penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ
biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin.
Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và
Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).
Các cephalosporin tự nhiên được phân lp từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic
(7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên [1].
1.1.2. Cấu trúc và phân loại
* Các penicillin
Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-
Lactam
N
S
CH
3
CH

3
N
H
O
CO
R
COOM
2
3
4
1
56
7

Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin
Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R
3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid
Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,
5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác
nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H.
Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác
nhau [1].

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
10
Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin
Tên kháng sinh
R
Hoạt tính

Nhóm penicillin
tự nhiên
PenicillinG
(PENG)
Benzathin
CH
2
-
Benzyl
Gồm các Penicillin tự
nhiên và dẫn chất.Phổ
hẹp: vi khuẩn gram(+).
Không kháng β-
lactamase
Nhóm penicillin kháng penicilliiase
Oxacillin
(OXA)
N
C-
O
CH
3

6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4-
carbonyl)amino]
Là các Penicillin bán
tổng hợp. Phổ hẹp như
nhóm I. Kháng
penicilliiase, không tác
động vào vòng β –

Lactam được.
Cloxacillin
(CLO)
Cl
N
O
C-
CH
3

6-{[3-(2-chlorophenyl )-5-methyl-
oxazole-4-carbonyl]amino}
Nhóm penicillin phổ rộng
Ampicillin
(AMP)
CH-
NH2NH2

6-([(2R)-2-amino-2-
phenylacetyl]amino)
Phổ rộng, tác dụng cả
khuẩn gram (+) và (-).
Không kháng β-
lactamase và
penicilliiase
Amoxicill
(AMO)
CH-
NH2NH2
HO

6-{[(2R)-2-amino-2-(4-
hydroxyphenyl)-acetyl]amino}


Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
11
* Các cephalosporin
Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn
với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các
gốc R
N
H
O
CO
R1
N
S
R3
R2
COOM
1
2
3
4
5
6
7
8

Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin
Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-
thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid
Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.
Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng
trên gram âm yếu hơn thế hệ sau [1].
Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin

Kháng sinh
R1
R2
R3
I: tác dụng
mạnh nhất
trên vi khuẩn
gram (+), yếu
nhất trên
gram (-).
Không bền và
dễ bị β-
lactamase phá
hủy
Cephalexin
(CEP)
CH-
NH
2

H
-CH
3
Cephapirin
SCH
2
-

H
-CH
2
-OCOCH
3

Cephazolin
N
N N
N
CH
2
-

H
N N
CH
3
S-CH
2

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
12
II: tác dụng
yếu hơn trên
vi khuẩn
gram (+),
mạnh hơn trên
gram (-) so
với thế hệ I.
Bền với β-
lactamase.
Cefaclor
(CEF)
CH-
NH
2

H
Cl
Cefprozil
CH-
NH
2
OH

H
-CH=CH-CH
3
III: tác dụng

yếu hơn trên
vi khuẩn
gram (+) so
với thế hệ I,
tác dụng
mạnh trên
gram (-). Bền
với β-
lactamase
Cefixim
S
N
N
NH
2
HOOCCH
2
O

H
-CH=CH
2
Ceftazidim
S
N
N
NH
2
HOOCC(CH
3

)
2
O

H
N
+
-CH
2

IV: hoạt phổ
tác dụng như
thế hệ III
nhưng tốt hơn
và kháng
nhiều β-
lactamase hơn
Cefepim
S
N
N
NH
2
CH
3
O

H
N
+

CH
3
-H
2
C




Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
13
1.1.3. Tính chất vật lý và hoá học
Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong
nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi
hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa
đồng thời nhóm –COOH và –NH
2
.
Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ
thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp
thụ).
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pK
a
= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc
phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân
tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.
Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu [2]
Tên kháng
sinh

pK
a1
Tên kháng sinh
pK
a1
Tên kháng
sinh
pK
a1

AMP
2,7
CEP
2,6
CEF
2,75

1.1.4. Tác dụng
Cơ chế:
Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá
trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị
ngừng lại và ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt
hóa enzim tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả
là vi khuẩn bị tiêu diệt.
Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu
kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ
rộng [13].

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
14
Kháng thuốc:
Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam,
theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các
cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi
là kháng methicillin) [13]
Độc tính:
Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị
ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thn, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc
phản vệ [13].
Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và bà mẹ trong thời kỳ cho con bú. Chống
chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc.
Đánh giá tác dụng kháng sinh:
Theo đơn vị tác dụng: 1 IU là tác dụng của 0,6

g penicillin G natri tinh
khiết trên một chủng mẫu tụ cầu. Hoạt lục của 1mg chất này là 1667 IU.
1 IU sẽ ứng với 0,672

g penicillin G kali tinh khiết, với 1mg chất này ứng
với 1585 IU [13].
1.1.5. Điều chế
Sinh tổng hợp:
Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc
Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp. Chiết xuất dạng
kết tinh và muối natri hoặc kali. Để cho hiệu suất cao thường gây đột biến bằng mù
tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn, đồng thời thêm
vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng cho quá trình sinh

tổng hợp. Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào là acid phenylacetic.
Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá trình lên men. Trong
môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid → polypeptide. Penicillin tạo
thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men.


Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
15
Bán tổng hợp:
Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6-amino penicillanic
(A6AP).
Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, khi đó môi trường dồi dào
A6AP, chiết lấy trực tiếp.
Tách phần phenylacetyl (C
6
H
5
-CH
2
-CO-) khỏi phân tử penicillin G bằng
acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP. Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi
trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thu HCl giải phóng ra trong phản ứng
được penicillin khác.
Tổng hợp hoá học:
Chưa được ứng dụng rộng rãi.
1.1.6. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Ta biết rằng, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế
khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh
do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị

bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì
thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các
nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần
thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách. Từ đó, làm cho các vi khuâ
̉
n dần
dần kháng thuốc, việc chữa trị bệnh ngày càng khó khăn và sự ô nhiễm môi trường
do kháng sinh gây ra càng trầm trọng hơn [42].
Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275
triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R.
Gonzales [4,46], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp
trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần
và không điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến
enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng
vancomycin. Theo báo cáo của A.W. McCormick [15] năm 2003, tỉ lệ
pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004,
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
16
41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao
khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.
Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương
tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong
vòng 24 giờ. Theo D.P. Raymond [26], mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị
nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng
thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la.
Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [9], năm
1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh
nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian dưới 5 ngày).
Theo [9], qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch

Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít
trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử
vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết
tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi
Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhn, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60%
tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng
hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng
huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi
khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của
Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%.
Các nhà chuyên môn đã báo động về hu quả nguy hiểm của sự lạm dụng
kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các
nhà chuyên môn đã thành lp “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý”
(Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm
chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát
triển.
Năm 2001, Tổ chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm
Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cp đến mọi hoạt động y tế của tất cả
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
17
các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng
cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và
chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu.
Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của các
thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo,
không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất.
Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ
bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế
được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.

1.2. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng β-lactam
1.2.1. Phương pháp quang học
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang
học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương
pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-
lactam, đặc biệt trong dược phẩm.
Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp phụ, chúng cũng
tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều
trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.
Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy
khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các
β-lactam.
A. Fernández-González và cộng sự [17] dùng Cu
2+
thủy phân và tạo phức với
AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu
được 4.10
-7
M (0,16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho
hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống,
huyết thanh…
Theo [30], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống
bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của
kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl
2
, KCl 2M. Kết quả tạo ra
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
18
phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và

giới hạn phát hiện của AMO là 0,73 mg/l, AMP 0,76 mg/l.
Wei Liu và cộng sự [49], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ
luminol- K
3
Fe(CN)
6
kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích
một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP) trong sữa đa
̣
t giơ
́
i ha
̣
n pha
́
t
hiê
̣
n thấp: PEN là 0,5 mg/l, cefradine 0,04 mg/l, cefadroxil là 0,08 mg/l; 0,1 mg/l
CEP. Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS,
nồng độ CEP trong mẫu là 0,1 mg/l.
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp,
các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng
sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân
tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân
tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.
1.2.2. Phương pháp điện hóa
Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam
nhưng không phổ biến nhiều. Theo [26], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng
sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trong

môi trường đệm axetat 0,1M, pH= 5,2.
1.2.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu
quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng
dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác
nhau.
L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [37] sử dụng phương pháp điện di
mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện
di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8,5. Tiến hành phân tích tại thế điện di
10 kV, nhiệt độ 20
0
C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng
sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích
trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0,14 đến 0,27
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
19
mg/l, độ lệch chuẩn tương đối cho thời gian lưu từ 0,25 đến 0,86%, diện tích pic 1,3
đến 4,15%; độ thu hồi trên 96%.
Biyang Deng và cộng sự [19] đã sử dụng phương pháp điện di với detector
điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp
0,31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độ
lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu.
Attila Gaspar và cộng sự [16] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh
họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone
electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6,8.
Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện
14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,
cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim,
ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 – 1,62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới

hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục
đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ
Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -18
0
C). Kết quả cho
thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi
pha loãng.
M.I.Bailon-Perez và cộng sự [38] sử dụng phương pháp CZE và detector UV
– DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH =8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ
thut chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP,
AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước (nước sông,
nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0,8; 0,8; 0,25; 0,30; 0,30; 0,9; 0,08 μg/l
cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%.
1.2.4. Sắc ký bản mỏng ( TLC)
Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để kiểm
tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích có tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu cùng một
lúc song song rất tiện lợi. Khi TLC được trang bị phần phát hiện là một máy đo
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
20
quang có thể phân tích định tính và định lượng. Tuy nhiên phương pháp này chỉ
dùng để định tính.
1.2.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất
là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất
thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các
chất.
Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh


-lactam bằng phương pháp HPLC
Theo [50], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích
penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thn và sữa. Điều kiện
chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2

(4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN –
(C
2
H
5
)
3
N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong
sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg.
J.M. Cha và cộng sự [32] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-
lactam trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C
18
(2,1
mm×50 mm, 2,5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C =
Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút
A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25 ml/phút; nhiệt độ cột
45
0
C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin
có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l
với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý.
Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang,
với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [19] C.Y.W Yang và cộng sự
dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò
(pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5,6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346

nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5 μg/kg và 0,3 μg/kg. Tuy vy, do
các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
21
quang hóa [17, 25] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ
không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được.
Trong [33, 34], Boison J.O. và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2
(250mm*4,6mm, 5μm); pha động : ACN –Na
2
S
2
O
3
15,7mM trong đệm photphat
0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng thời
AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2-5

g/kg.
Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ
dẫn… để phân tích các β-lactam.
Trong [24], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO,
OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt hiệu suất thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91%. Còn
trong [46], WJ Blanchflower và cộng sự dung diclometan và hexan để tách
penicillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thn, thịt và sữa, hiệu suất đạt
89-117%.
Khi tách và làm giàu các β - Lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thut SPE
thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C
18
) và trao đổi ion

dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ.
K. Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C
18
và dung môi rửa
giải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt hiệu suất
thu hồi 83-89%.
Còn trong [32] sử dụng cột Oasis HLB (60mg, 3ml) để tách và làm giàu
AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin trong mẫu nước môi trường đạt hiệu suất
thu hồi 77,1 - 95,9%.
Trong [28] sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion) để tách
AMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillintrong nước
thải cho hiệu suất thu hồi 76-100%.
Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như
thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp
đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu
và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ. Do đó việc kết hợp phương pháp sắc ký lỏng
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
22
hiệu năng cao và kỹ thut chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu đạt độ tối ưu
cao trong việc phân tích β – Lactam do có độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại cao.

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
23
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất độc hại là một vấn đề
cấp thiết đang được quan tâm. Trong đó, chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong mẫu
thuốc và mẫu sinh học là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng. Như chúng tôi
đã đề cp trong bản lun văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng
sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.
Trong đề tài này, chất phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là
ampicillin (AMP), cephalexin (CEP), cefaclor (CEF) là các kháng sinh β - Lactam
được sử dụng phổ biến hiện nay.

2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Tp trung vào nghiên cứu các vấn đề sau:
1. Tối ưu hóa các điều kiện để điều chế dẫn xuất giữa các chất phân tích và
thuốc thử 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F).
- Chọn nhiệt độ của phản ứng dẫn xuất hóa.
- Chọn thời gian của phản ứng dẫn xuất hóa.
2. Tối ưu hóa điều kiện tách bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha
đảo sử dụng detector huỳnh quang (RP-HPLC).
- Chọn bước sóng của detector
- Chọn pha tĩnh
- Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ và các điều kiện khác,…
3. Điều kiện định lượng.
- Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
(LOQ)
- Độ đúng và độ lặp lại của phép đo

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
24
4. Phân tích mẫu thực, đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp.
- Phân tích mẫu dược phẩm (mẫu thuốc)
- Phân tích mẫu sinh học (mẫu nước tiểu và mẫu máu)
- So sánh với một số phương pháp khác.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu – Phƣơng pháp RP-HPLC
2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC
Sắc ký lỏng là một kỹ thut tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình
vừa có tính chất hoá học lại vừa có tính chất lý học. Nó là những cân bằng động xảy
ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vn chuyển và phân bố lại liên
tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha
tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách. Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được

phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một tốc
độ và thành phần pha động nhất định, hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử
chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều
lần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký. Mặt khác cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi
phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ di chuyển trung bình của mỗi chất tan là
khác nhau. Quá trình sắc ký có thể xảy theo 3 cơ chế sau:
- Tương tác hấp phụ
- Tương tác trao đổi ion
- Tương tác theo cơ chế rây phân tử
Tương tác với 3 cơ chế trên có 3 phương pháp tiến hành tách khác nhau:
- Sắc ký hấp phụ (chất hấp phụ pha thường NP-HPLC) và hấp phụ pha ngược
RP-HPLC).
- Sắc ký trao đổi ion (EX-HPLC)
- Sắc ký rây phân tử (Gel-HPLC)
Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
25


Hình 2.1. Sơ đồ chức năng của thiết bị HPLC
1. Bộ phn cấp dung môi (pha động)
2. Bơm cao áp
3. Van bơm mẫu
4. Cột tách (pha tĩnh)
5. Detector
6. Máy ghi tín hiệu
7. Bơm mẫu tự động
8. Phần điều khiển, xử lý kết quả
2.2.2. Sắc ký hấp phụ pha ngƣợc RP-HPLC

- Pha tĩnh trong hệ RP-HPLC
Cũng như sắc ký cột ở áp suất thường, pha tĩnh (stationary phase) trong HPLC
chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích. Nó
là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt 3-7

m, diện
tích bề mặt riêng thường từ 80-500m
2
/g. Pha tĩnh trong HPLC là một yếu tố rất
quan trọng quyết định sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu phân tích.
Trong RP-HPLC thì pha tĩnh là vt liệu kém phân cực, thông thường chất mang
trong pha tĩnh là các loại silica trung tính đã được thế hoá bề mặt bằng các loại hợp
chất kém phân cực như C
18
, C
8
, Pha tĩnh này thường dùng để tách các hợp chất
hữu cơ có độ phân cực khác nhau. Khi tiến hành chạy sắc ký trên bề mặt pha tĩnh
xảy ra các cân bằng động như sau:
S
r
+ X
i
↔ S
r
X
i
(Quá trình hấp phụ)
S
r

X
i
+ M ↔ MX
i
+ S
r
(Quá trình giải hấp)
Trong đó: S
r
là pha tĩnh
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
26
X
i
là chất phân tích
S
r
X
i
chất phân tích hấp phụ trên pha tĩnh
M là pha động
MX
i
chất phân tích trên pha động.
Ngoài bản chất của nền pha tĩnh, kích thước hạt nhồi và chiều dài cột tách cũng ảnh
hưởng rất lớn đến khả năng phân tách các chất. Do vy, trong điều kiện phân tích
thực tế chúng ta phải nghiên cứu, khảo sát chọn pha tĩnh có cỡ hạt, chiều dài cột
tách như thế nào để đạt được độ phân giải theo yêu cầu phân tích. Thông thường đối
với một hỗn hợp chất phân tích nhất định, yếu tố quyết định đến hiệu quả tách ở đây

là các điều kiện về bản chất của pha tĩnh và thành phần pha động trong hệ HPLC.
Sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC) là phương pháp được dùng phổ biến nhất
trong quá trình tách phân tích và điều chế các hợp chất đang được quan tâm trong
các đối tượng sinh học, hoá học, dược học và y học. Hệ RP-HPLC có các ưu điểm
nổi trội sau:
1. Có độ linh động và độ chọn lọc cao
2. Có khả năng cân bằng cột nhanh, cột có hiệu lực cao, các pic cân đối.
3. Pha động là nước hay hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thân thiện với môi
trường.
Nói chung, hệ RP-HPLC có độ linh hoạt và độ chọn lọc cao, dung môi làm pha
động có thể là dung môi hữu cơ hoà tan tốt trong nước như methanol, acetonitril,
hay có thêm những dung dịch đệm pH được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định.
Trong nhiều trường hợp nước là thành phần chính của pha động.
- Pha động trong RP- HPLC
Pha động là yếu tố thứ hai sau pha tĩnh quyết định đến hiệu quả tách của quá trình
sắc ký.
Pha động thường là các dung môi phân cực như H
2
O, MeOH, ACN,…hay hỗn hợp
của 2 hay 3 dung môi này theo những tỷ lệ nhất định. Các dung môi hữu cơ trên có
thể hoà tan thêm một lượng nhỏ axit hay bazơ hữu cơ.