nghiên cứu điều kiện phân tích β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



PHẠM NHO


NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH
β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐIỆN DI MAO QUẢN


Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Mã số: 1.04.03


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC



Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Ri




Hà nội-2011

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I – TỔNG QUAN 2
1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam 2
1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 6
1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 8
1.3.1 Phương pháp quang học 8
1.3.2 Phương pháp điện hóa 9
1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 9
1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 12
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 13
2.1.1 Đối tượng 13
2.1.2 Nội dung nghiên cứu 13
2.2 Giơ
́
i thiê
̣
u chung về phương pha
́
p Điê
̣
n di mao qua
̉
n 13
2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản 13
2.2.2 Các đặc trưng của phương pháp điện di mao quản 14
2.2.2.1 Độ linh động điện di và độ linh động điện di thẩm thấu 14
2.2.2.2 Dòng điện di thẩm thấu (EOF) và tính chất 15

2.2.3 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC) 17
2.2.4 Mao quản và ử lý mao quản trước khi tách 24
2.2.5 Chọn phương pháp bơm mẫu 26
2.2.6Thiết bị của phương pháp điện di mao quản 27
2.2.7 Phân loại các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản 28
2 2.8Phân tích định lượng bằng phương pháp điện di mao quản 28
2.3.1 Kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng trong phân tích các đối tượng trong
mẫu sinh học 29
2.3.1 Tổng quan chiết pha rắn (solid phase extration-SPE) Thực nghiệm 29


2.3.2 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng trong phân tích các đối tượng trong mẫu
sinh học 32
2.4. Thực nghiêm 31
2.4.1 Máy móc dụng cụ 34
2.4. Hóa chất 35

CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam 36
3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện chất 36
3.1.2 Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di 37
3.1.6 Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm 40
3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm 41
3.1.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS 43
3.1.9 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu 47
3.1.10 Khảo sát ảnh hưởng thế điện di 49
3.1.11 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ mao quản 52
3.1.12 Tổng kết điều kiện tối ưu 54
3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 55
3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 55

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của đường chuẩn
58
3.2.3 Độ chính xác của phép đo 59
3.2.4 Độ lặp lại của phép đo 62
3.3 Phân tích mẫu thực 64
3.3.1 Khảo sát điều kiện SPE mẫu nước tiểu thêm chuẩn 64
3.3.1.1 Chọn cột chiết pha rắn các β-lactam trong mẫu nước tiểu 64
3.3.1.2 Khảo sát lực rửa giải của hệ các dung môi 64
3.3.1.3 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải 66
3.3.1.4 Khảo sát pH rửa giải 67


3.3.2 Phân tích mẫu nước tiểu lấy từ người tình nguyện 70
3.4 Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu mixen
(MECC) 71
3.5 Hướng phát triển của đề tài 72
CHƢƠNG 4 - KẾT LUẬN 73
1. Khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy điện di 73
2. Đánh giá phương pháp phân tích 73
3. Phân tích hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu nước tiểu 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO 75
Phụ lục 79
1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người
ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe.
β-lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y
từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh

được dùng nhiều nhất hiện nay. Tuy nhiên sử dụng loại kháng sinh này không đúng
liều lượng và cách dùng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa
trị bệnh càng khó khăn. Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do
virut không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn
cho việc chẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng sức khỏe của người bệnh. Hàm lượng
lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận, đặc biệt ở người cao tuổi. Vì vậy
kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết
để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng.
Hai phương pháp dùng thường dùng để phân tích các β-lactam là HPLCvà
phương pháp Điện đi mao quản (CE). Phương pháp HPLC làphương pháp tách có
độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu ít và thời gian phân tích ngắn. Tuy
nhiên, phương pháp này cũng có nhược điểm là phải sử dụng một lượng lớn dung
môi trong quá trình phân tích, vì vậy làm cho giá thành phân tích cao. Ngược lại,
phương pháp CE lại sử dụng lượng hóa chất không đáng kể, tiết kiệm chi phí từ 3-4
lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao.Ở
Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời các
kháng sinh β-lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi trường
bằng kỹ thuật HPLC nhưng với kỹ thuật điện di mao quản thì chưa nhiều.
Với những lý do nêu trên, tôi chọn đề tài nghiên cứu luận văn là: “Nghiên cứu
điều kiện phân tích β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản”


2

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,35]
Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm:
penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ
biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin.

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và
Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).
Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic
(7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên.
Cấu trúc và phân loại:
* Các penicillin
Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-
Lactam
N
S
CH
3
CH
3
N
H
O
CO
R
COOM
2
3
4
1
56
7

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R
là:(2S,5R,6R3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic
acid
Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,
5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác
nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H.
Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác
nhau.

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin


3

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin
Tên kháng sinh
R
Hoạt tính
Nhóm penicillin
tựnhiên

Penicillin G
(PENG)
Benzathin

CH
2
-
Benzyl
Gồm các Penicillin

tự nhiên và dẫn
xuất.Phổ hẹp: vi
khuẩn gram(+).
Không kháng β-
lactamase
Nhóm penicillin kháng penicilliiase
Oxacillin
(OXA)
N
C-
O
CH
3
6-[(5-
methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4-
carbonyl)amino]
Là các Penicillin bán
tổng hợp. Phổ hẹp
như nhóm I. Kháng
penicilliiase, không
tác động vào vòng β-
lactam được.
Cloxacillin
(CLO)
Cl
N
O
C-
CH
3

6-{[3-(2-
chloropheny )-5-methyl-
oxazole-4-carbonyl]amino}
Nhóm penicillin phổ rộng
Ampicillin
(AMP)
CH-
NH2NH2
6-([(2R)-2-
amino-2-phenylacetyl]amino)
Phổ rộng, tác dụng cả
khuẩn gram (+) và
(-). Không kháng β-
lactamase và
penicilliiase

Amoxicillin
(AMO)
CH-
NH2NH2
HO
6-{[(2R)-2-
amino-2-(4-hydroxyphenyl)-
acetyl]amino}
4

* Các cephalosporin
Các cephalosporin có cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-lactam 4 cạnh gắn
với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các
gốc R.

N
H
O
CO
R1
N
S
R3
R2
COOM
1
2
3
4
5
6
7
8


Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là:(6R,7R) 8-oxo-5-
thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid
Khi thay các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.
Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng
trên gram âm yếu hơn thế hệ sau. Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày
thế hệ I (CEP) và thế hệ III (CEF).
Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một số cephalosprin
Thế hệ

Kháng sinh
R
1

R
2
R
3
I: Phổ tác dụng trung
bình, tác dụng mạnh
nhất trên vi khuẩn
gram (+), yếu nhất trên
gram (-). Không bền và
dễ bị β-lactamase phá
hủy
Cephalexin
(CEP)

CH-
NH
2

-H
-CH
3
Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

5

III: Tác dụng tốt trên vi

khuẩn gram (-), trên vi
khuẩn gram (+) thì tác
dụng kém penicillin và
cephalosporin thế hệ I.
Bền với β-lactamase
Cefixim
(CEF)
S
N
N
NH
2
HOOCCH
2
O

-H
-CH=CH2

Tính chất:Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan
trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung
môi hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần
chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH
2
.
Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ
thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp
thụ).
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pK
a

= 2,5–2,8 tùy vào cấu trúc
phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân
tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.

Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu
Tên
kháng sinh
pk
a1
Tên
kháng sinh
pk
a1

Tên
kháng sinh
pk
a1

PEN
2,74
AMO
2,8
CLO
2,7
AMP
2,7
CEP
2,6
OXA

2,72

Tác dụng:
Cơ chế
Các penicillin có khả năng acyl hóa các D-alanin tranpeptidase, làm cho quá
trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị
6

ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa
enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi
khuẩn bị tiêu diệt.
Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm
hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ
rộng.
Kháng thuốc
Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là các enzim có tác dụng mở vòng β-lactam,
theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các
cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi
là kháng methicillin).
Độc tính
Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị
ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc
phản vệ.
Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định
dị ứng với thành phần của thuốc.
1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ
chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các
bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để
điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích

hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở
các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần
thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách.
Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu
người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales
[4,29], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong
khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không
7

điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở
nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin.
Theo báo cáo của A.W. McCormick [14] năm 2003, tỷ lệ pneumococus kháng
penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus
sẽ đề kháng penicillin. Tỷ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4
thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.
Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương
tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong
vòng 24 giờ. D.P. Raymond [18] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng
vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử
vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô la Mỹ.
Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [6], năm
2005 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh
nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày).
Theo [7] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch
Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít
trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử
vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết
tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi
Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60%
tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện.Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng

hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng
huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi
khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của
Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%.
Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng
kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các
nhà chuyên môn đã thành lập “Liên hiệp vì sự Sử dụng Kháng sinh Hợp lý”
(Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm
8

chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát
triển.
Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế hoạch Toàn cầu để Kiểm
soát Sự Đề kháng Kháng sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả
các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng
cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và
chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu.
Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa sự lưu hành của các
thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo,
không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất……
Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ
bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế
được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.
1.3 Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng β-lactam
1.3.1 Phƣơng pháp quang học
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học
của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp
này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-
lactam, đặc biệt trong dược phẩm.
Các β-lactam hấp thụ UV nhưng độ hấp thụ không cao, chúng cũng tạo phức

với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều trường
hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.
Các phương pháp huỳnh quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy
khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các
β-lactam.
Fernández-González và cộng sự [13] dùng Cu
2+
thủy phân và tạo phức với
AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu
được 4.10
-7
M (0,16mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho
9

hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống,
huyết thanh.
Theo [23], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng
phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng
sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl
2
, KCl 2M. Kết quả tạo ra phức màu
vàng được đo tại bước sóng 335nm. Khoảng tuyến tính từ 8-40mg/l và giới hạn phát
hiện của AMP là 0,73mg/l, AMP 0,76mg/l.
Wei Liu và cộng sự [35], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ
luminol-K
3
Fe(CN)
6
kết hợp phương pháp chiết pha rắn nối trực tiếp đãphân tíchmột
số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN

là 0,5mg/l, cefradine 0,04mg/l, cefadroxil là 0,08mg/l, 0,1mg/l CEP. Kết quả được
kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong
mẫu là 0,1mg/l.
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn nối tiếp, các
phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và
trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích,
việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần
thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.
1.3.2 Phƣơng pháp điện hóa
Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam
nhưng không phổ biến nhiều. Theo [19], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng
sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92μM (0,39mg/l) trong
môi trường đệm axetat 0,1M, pH=5,2.
1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất
là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách
pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các
10

loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính
xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau
khi rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã
mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối
với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể
phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp.
Theo [36], WJBlanchflower và cộng sự dùng HPLC-MS phân tích penicillin
V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện chạy sắc ký:
cột Inertsil ODS2(4,6mm×150mm, 5μm); pha động: ACN-(C

2
H
5
)
3
N 0,5% (45/55),
dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10μg/kg, trong thịt
25-100μg/kg.
J.M. Cha và cộng sự [19] dùng phương pháp HPLC-MS để phân tích β-lactam
trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C
18
(2,1mm×50mm, 2,5μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C
=Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút
A/B/C=50:40:10, 20phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25ml/phút; nhiệt độ cột
45
0
C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin
có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8-10 ng/l với nước bề mặt, 13-18ng/l với
nước thải trước xử lý, 8-15ng/l với nước thải sau xử lý.
Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang,
với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [33] C.Y.W Ang và cộng sự
dùng cột Spherisorb ODS2 (250mmx4,6mm, 5μm) phân tích AMO trong sữa
bò(pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5,6-24/76; detector huỳnh quang: 346-
422nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5μg/kg và 0,3μg/kg. Tuy vậy, do các β-
lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang
hóa [18, 28] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không
áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được.
11

Tác giả Ngô Quang Trung [11] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6

kháng sinh β-lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải
bệnh viện tại khu vực Hà Nội. Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250mm x
4,6mm, 5µm, pha động gồm đệm axetat 12mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10%.
Detector UV-VIS đo ở bước sóng 212nm. Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh
trong khoảng 0,1-1mg/l, hệ số tương quan R >0,99. Giới hạn phát hiện LOD và
LOQ là 0,4 và 9,1mg/l .
Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn…
để phân tích các β-lactam.
Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như
thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp
đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu
và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ.
1.3.4 Phƣơng pháp điện di mao quản (Capillaryelectrophoresis - CE)
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu
quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng
dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác
nhau.
L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [23] sử dụng phương pháp điện di
mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịchđệmđiện di
gồm 40mM đệm Borat, 100mM SDS, pH 8,5. Tiến hành phân tích tại thếđiện di 10
kV, nhiệtđộ 20
0
C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh
gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong
mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0,14mg/l-0,27mg/l, độ
lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0,25 - 0,86%, diện tích pic 1,3 - 4,15%. Độ
thu hồi trên 96%.
Biyang Deng và cộng sự [16] đã sử dụng phương pháp điện di với detector
điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp
12

0,31μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l-8mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độ lệch
chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/mẫu.
Attila Gaspar và cộng sự [15] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ
cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone
electrophoresis - CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25mM có pH = 6,8,
trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin,
cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten,
cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 - 1,62mg/l.
Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89mg/l; khoảng
tuyến tính 5-200mg/l. Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ
bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4
và -18
0
C). Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại
nhiệt độ phòng sau khi pha loãng.
Phương pháp MECC cũng được M.I. Bail´on P´erez, L. Cuadros Rodr´ ıguez,
C. Cruces-Blanco [24] xác định 9 loại kháng sinh β-lactam gồm CLO, dicloxacillin,
OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược
phẩm. Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8,5
làm chất nền điện di và thế điện di 25kV. Giới hạn phát hiện LOD 0,35 đến
1,42mg/l, giới hạn định lượng 2,73 đến 5,74mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian
lưu từ 1,5 đến 1,7%. Độ thu hồi từ 91 - 95,6%.
Nhìn chung, phương pháp quang học và phương pháp điện hóa rất dễ tiến
hành, đơn giản nhưng chỉ xác định từng chất riêng rẽ, điều này rất khó cho việc
phân tích các mẫu có đa thành phần. Với phương pháp HPLC kết quả tách tốt, độ
chính xác, độ nhạy cao nhưng giá thành chi phí phân tích một mẫu lớn. Vì vậy
phương pháp CE sẽ là bước phát triển mới khắc phục những nhược điểm của
phương pháp quang, điện, HPLC mà kết quả đáng tin cậy. Trong bản luận văn này,
chúng tôi nghiên cứu theo hướng của tác giả L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M.

Valcárcel [23], M.I. Bail ´on P´erez, L. Cuadros Rodr´ ıguez, C. Cruces-Blanco [24]
trong mẫu dược phẩm và sinh học.
13

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNGVÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Đối tƣợng
Xác định hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu nước tiểu là một mảng đề
tài rất thực tế và quan trọng. Như chúng tôi đã đề cập trong bản luận văn này, vấn
đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh
hưởng xấu đến sức khỏe con người.
Trong đề tài này, đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là
penicillin(PENG), cloxacillin(CLO), oxacilin(OXA) ampicillin(AMP),
amoxicillin(AMO) và cephalexin(CEP)là các kháng sinh β-lactam được sử dụng
phổ biến hiện nay.
2.1.2Nội dung nghiên cứu
Nội dung đề tài cần giải quyết là:
- Lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp điện di mao quản mixen
(MECC) với detector Diod Array (DAD) có độ nhạy cao.
- Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách một số kháng sinh -lactam như: pH,
nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ…
- Nghiên cứu điều kiện chiết pha rắn; tách và làm giàu-lactam từ nước tiểu
- Đánh giá thống kê phương pháp phân tích
- Áp dụng phân tích một số mẫu nước tiểu
- Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp
2.2Giơ
́
i thiê
̣

u chung vê
̀
phƣơng pha
́
p Điê
̣
n di mao qua
̉
n [5,8,22]
Để thực hiện được nhiệm vụ của luận văn, kỹ thuật tách được chọn là phương
pháp điện di mao quản điện động học mixen (MECC).
2.2.1Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di mao quản
- Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển -
mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản
(đường kính 25-100m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH
thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một
14

nguồn thế cao một chiều (V: 10-30 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CE là
kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự
tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các
hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng N
ef
lớn, sự tách các chất
xẩy ra nhanh và hiệu quả cao
- Cơ chế điện di: Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force:
EFF) và dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan
sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vìđiện tích, kích thước và độ
linh động của chúng khác nhau.
2.2.2 Các đặc trƣng của phƣơng pháp điện di mao quản

2.2.2.1 Độ linh động điện di và độ linh động điện di thẩm thấu
Độ linh động tuyệt đối của cấu tử trong dung dịch điện ly chuyển động trong
điện trường được biểu diễn bằng công thức:


ef
=
q
6ɳr

cm
2
V
1
s
1

(1)
Trong đó: q - điện tích của hạt tích điện (culong)
ɳ - độ nhớt của dung dịch
r - bán kính ion
Trong dung dịch, độ linh động của một cấu tử còn liên quan đến thế zeta nên:

ef
=
D
ef
4ɳ
(cm
2

V
1
s
1
) (2)
Trong đó: D - hằng số điện môi

ef
- thế zeta

Độ linh động điện di thẩm thấu, biểu diễn tương tự phương trình

eof
=
D
eo
4ɳ
(3)
ζ
eo
là thế zeta thẩm thấu

Độ linh động điện di hiệu quả:
15

Trong dung dịch chất điện ly, mỗi ion luôn chịu ảnh hưởng bởi lực tác động
của nhiều ion khác nhau xung quanh, đặt biệt là các ion đối làm cho tác động của
điện trường tới ion sẽ giảm đi. Mặt khác, điện trường chỉ tác động tới các cấu tử
mang điện tích, mà điều này còn phụ thuôc nhiều yếu tố, đó là hằng số phân ly của
chất điên ly, pH của dung dịch và nồng độ của nó. Như vậy, độ linh động điện di

của một ion khi bị tác động của các yếu tố kể trên nên khác với độ linh động điện di
tuyệt đối.Độ linh động điện di của ion tương ứng với phần ion bị ảnh hưởng của
điện trường đó gọi là độ linh động điện di hiệu quả, kí hiệu là µ
’


[

,
=



. 


4

; trong đó µ
i
là độ linh động ion, n
i
là phần mol

2.2.2.2 Dòng điện di thẩm thấu (EOF) và tính chất
Nguyên nhân xuất hiện dòng điện di thẩm thấu
Dòng điện di thẩm thấu (EOF) trong mao quản xuất phát từ lớp điện kép trên
thành mao quản và chất điện ly chứa trong nó. Sự phân li của các nhóm chức trên
bề mặt mao quản tạo nên lớp điện tích trái dấu từ đó hình thành lớp điện kép, phía
trong là các ion cửa và phía ngoài của nó là lớp khuếch tán. Nếu lớp ion cửa mang

điện tích âm, thì lớp phía ngoài sẽ mang điện tích dương và ngượclại.



Hình 2.1 Cấu trúc các lớp điện trong thành mao quản
16

Trong bề mặt mao quản silica, các nhóm silanol (–SiOH) bị deproton thành –
SiO
-
khi tiếp xúc với dung dịch chất điện li và hình thành một lớp điện tích âm. Để
trung hòa các điện tích âm trên, cần có các điện tích dương, và do đó hình thành
một lớp điện kép, tiếp theo là các lớp khuếch tán. Ở pH=9 thì các nhóm silanol hầu
như ion hóa hoàn toàn, lớp điện kép hình thành một cách tốt nhất. Lớp điện kép này
lại liên quan mật thiết với dòng điện di thẩm thấu EOF. Bản chất của dong EOF là
sự di chuyển có hướng của các điện tích trong môi trường. Trong dung dịch đệm,
các ion tích điện dương sẽ di chuyển về phía cực âm còn các ion tích điện âm sẽ di
chuyển theo chiều ngược lại về phía cực dương.
Trong dung dịch nước và các hệ đệm khác nhau, các ion không tồn tại độc lập
mà bị hyđrat hóa, đặt biệt là các ion dương từ đó khi các ion di chuyển trong điện
trường kéo theo sự di chuyển của cả nước. Khi ta đặt một thế vào hai đầu mao
quản(cỡ 25-100µm) thì dòng dung dịch trong mao quản đã xảy ra. Ví dụ, vận tốc
dòng đạt 4nl/s với mao quản có đường kính 50µm. Đây chính là dòng điện di thẩm
thấu, EOF. Chiều của dòng điện di thẩm thấu đi từ cực dương sang cực âm.
Sự di chuyển của ion dương về cực âm mang theo nước hydrat tạo thành dòng
dung dịch mang theo cả phân tử trung hòa và cả ion âm (bị cuốn theo dòng dung
dịch vì không vượt qua dòng EOF). Trong dòng chảy về phía cực âm đi đầu là các
ion mang điện tích dương tiếp theo là các phân tử trung hòa, đi sau cùng là các ion
mang điện tích âm.

Hình 2.2 Lớp điện kép trong mao quản silic
17

Tính chất của dòng EOF
Dòng EOF di chuyển trong mao quản được điều khiển bằng điện trường cho
nên tính chất khác so với dòng EOF được điều khiển bằng áp suất. Lực tác động lên
các chất điện li trong dung dịch nền rất đồng đều, hơn nữa mao quản không có chất
nhồi nên mặt cắt tiết diện trong mao quản rất phẳng, chỉ có một phần nhỏ nơi tiếp
giáp với bề mặt của thành mao quản có sự kéo dài của chân. Điều này có thể giải
thích do sự ma sát, tuy nhiên so sánh với mặt cắt khi điều khiển bằng áp suất thì
trong trường hợp điều khiển bằng điện trường tốt hơn rất nhiều.


a) b)


Đường kính của mao quản cũng ảnh hưởng nhiều tời dòng EOF, người ta thấy
rằng đối với mao quản nhỏ trong vùng 25-50µm, sự thay đổi đường kính mao quản
không ảnh hưởng tới dòng EOF. Tuy nhiên khi đường kính mao quản lớn hơn
50µm thì khi tăng đường kính mao quản sẽ làm giảm dòng EOF, thậm chí d >
200µm dòng EOF có thể mất hẳn.
2.2.3 Phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC)
Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC) là kỹ thuật
tách điện di có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản
(Capillary Electrophoresis) và sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh. Nó là một trong các
Hình 2.3:a) Mặt cắt dòng EOF điều khiển bằng điện áp và píc tương ứng
b) Mặt cắt dòng EOF điều khiển bằng áp suất và píc tương ứng

18

kiểu tách sắc ký (separation mode) của kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong
sinh học, y học và dược. MECC là một kiểu kỹ thuật điện di mao quản có sức
mạnh, tiện lợi và được ứng dụng cho việc tách cả các chất phân tử trung hoà và các
chất mang điện tích (hợp chất liên kết ion).
Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử
Mixen (tiểu phân Mixen - pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân này
sẽ dẫn dắt và đóng góp vào khả năng của quá trình tách sắc ký điện di các chất
trên nền của dung dịch chất đệm và chất điện ly trong ống mao quản. Sự tách sắc
kí của các phân tử chất tan trung hòa bằng kỹ thuật MECC được điều chỉnh bởi các
chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch điện di. Khi chất hoạt động bề mặt ở
nồng độ cao hơn nồng độ ngưỡng của Mixen (giới hạn hình thành Mixen, CMC -
Critial Micellary Concentration), ví dụ chất hoạt động bề mặt SDS (Sodium
Dodecyl Sulfat), có CMC= 9mM, thì một tổ hợp của các phần tử tiểu phân của chất
hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình thành trong ống mao quản các tổ
hợp của các tiểu phân SDS tạo thành các Mixen (pha tĩnh giả). Các Mixen này có
đầu kị nước hướng vào trung tâm của Mixen và đầu ưa nước hướng ra ngoài dung
dịch và sẽ tương tác với ion chất đệm, hay ion chất tan. Cấu trúc tiêu biểu của
Mixen được mô tả trong hình 2.6. Các Mixen ở đây hoạt động như một pha tĩnh.
Các phân tử của chất mẫu (chất phân tích) được phân bố vào trong cả Mixen và cả ở
ngoài Mixen (trong pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố k
i

xácđịnh, trong những điều kiện nhất định đãđược chọn để chạy điện di và mỗi chất
tan x
i
sẽ có một hằng số phân bố k
i

nhất định trong điều kiện đó. Nếu các k
i
của các
chất tan là khác nhau rõ rệt thì sẽ có được kết quả sắc kí điện di tốt.
Phương pháp MECC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có
điện tích. Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyển động hoặc là
cùng chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF tùy thuộc vào điện tích của chất hoạt
động bề mặt và cấu trúc của Mixen. Các chất hoạt động bề mặt Anionic, ví dụ như
SDS, sẽ di chuyển về Anốt (cực dương), nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng
EOF. Trong dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di
19

chuyển nhanh hơn tốc độ của Mixen , thì sự điện di thực (net movement) của Mixen
là theo hướng của dòng EOF. Trong khi di chuyển như thế, các Mixen có thể tương
tác với các phần tử chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng
rắn (R-LC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để
tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình
điện di.



Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào
trong Mixen và ở ngoài Mixen (pha động điện di) theo một cân bằng động học có
hằng số phân bố k
i
nhất định trong điều kiện đã chọn. Chính sự phân bố theo kiểu
cân bằng động học này gây ra sự lưu giữ khác nhau giữa các chất tan, và tạo ra sự
tách sắc ký các chất phân tích theo kiểu Mixen. Vì thế các Mixen trong ống mao
quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh giả. Nhiều chất tan tương tác với
Mixen khá bền, nó tồn tại trong Mixen dài hơn (lâu hơn) sự di chuyển của nó, khi

các Mixen mang nó (các chất tan trung tính) một phần đi ngược chiều của dòng
EOF.
Đối với các chất tan không tương tác với các Mixen, chúng được dòng EOF
mang một cách đơn thuần cùng với dòng EOF. Nhiều hợp chất kị nước tương tác rất
Hình 2.4 Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MECC


20

mạnh với các Mixen, và nó bị lưu lại khá lâu trong Mixen, nên làm tăng thời gian
lưu giữ của chất tan.
Cơ chế của sự tách các phần tử trung tính trong MECC về cơ bản vẫn là kiểu
tương tác phân bố của chất tan, tương tự như trong sắc ký cột lỏng-rắn (LC) hấp
phụ, nhưng lại được điều khiển bởi lực điện trường E của điện thế cao V giữa hai
đầu mao quản tạo, mà không phải bằng áp suất đẩy pha động như trong HPLC.
Trong kỹ thuật phân tích MECC, các tính toán về hệ số dung tích k
i
’, số đĩa N của
cột mao quản, độ phân giải R, cũng dựa trên cơ sở tương tự với các tính toán của
hệ sắc kí cột LC, và có bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng đắn hơn
cho hệ pha MECC.
Hệ số lƣu giữ:
Tỷ số giữa tổng số mol của chất tan (total moles of solute) ở trong Mixen (pha
tĩnh giả) và tổng số mol của chất tan ở trong pha động (dung dịch đệm điện di) cũng
được xem như là dung lượng của cột mao quản, và nó được biểu diễn theo công
thức sau.
k
i

=


t
i
t
0


0

1 
t
i
t
mc

= k
i


V
mc
V
mp

(5)
Trong đó:
t
i
- thời gian lưu của chất tan
t

0
- thời gian không lưu giữ của chất
t
mc
- thời gian lưu của Mixen
k
i
- hệ số phân bố nhiệt động của chất tan giữa hai pha
V
mc
- thể tích của pha Mixen
V
mp
- thể tích của pha động.
Và tỷ số q =

V
mc
V
mp

cũng được gọi là tỷ số pha của hệ MECC.
Từ biểu thức (1) chúng ta cũng rút ra được thời gian lưu của chất tan t
R
như
sau:
Nếu (t
mc
<< t
0

*k’) thì chúng ta có:
21

t
i
=

t
mc

1 + k
i



k
i


(6)
Nghĩa là thời gian lưu t
R
có quan hệ chặt chẽ với hệ số dung tích k
i
’. Khi hệ số k
i
’

lớn, thì thời gian lưu t
i

cũng lớn. Mặt khác, trong MECC, tỷ số pha q phụ thuộc vào
nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong mao quản, và quan hệ này được biểu diễn
bởi công thức sau đây.
q =

V 

C
sp
C
mc


1 V
mc


C
sp
C
mc

(7)
Trong đó:
V - điện thế sử dụng để tạo ra điện trường E của sự điện di
C
sp
- nồng độ của Mixen (mol/l)
C
mc

- nồng độ giới hạn chuẩn của Mixen (mol/l)
V
mc
- Tốc độ trung bình của Mixen
k
i
- hệ số phân bố của chất thứ i ở trong và ngoài Mixen
Khi nồng độ Mixen không lớn, thì hệ số dung tích k
i
’
, và tốc độ của dòng EOF,
được tính như sau:
k
i

= K
i
V
mc

C
sp
C
mc

(8)
V
EOF
=


µ
e
+ µ
mc

E (9)
Cùng với các tham số t
R
, k
i
’, R
ij
đã nói ở trên, hệ số phân bố nhiệt động k
i
của chất
tan trong hệ MECC cũng là một đại lượng quan trọng có liên quan đến các quá trình
xảy ra trong mao quản và được xác định theo biểu thức sau:

lnk
i
=

H
0
RT

+

S
0

R

(10)

Trong đó: H
0
, S
0
là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng số khí,
và T là nhiệt độ (
o
K) của cột mao quản. Biểu thức này cho chúng ta thấy hằng số
phân bố K
i
luôn luôn phụ thuộc vào nhiệt độ. Nó cũng là một hằng số nhiệt động.
Nhìn chung, chúng ta thấy khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bốk
i
đều giảm dần ở
tất cả các chất. Với các chất khác nhau, thì hệ số k
i
này cũng thay đổi rất khác nhau,