Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

MỤC LỤC
Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin 3
Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin 5
Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu 6
1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 7
Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 16
Hình 2.2. Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC 20
Từ phương trình Hi = k1.Ci khi tăng nồng độ chất phân tích thì chiều
cao pic sắc ký cũng tăng lên, song lý thuyết chỉ ra rằng tỉ lê đó chỉ đúng
trong một khoảng nhất định. Vì vậy chúng tôi phải khảo sát khoảng
tuyến tính của chất phân tích. 48
Bảng 3.8 Chiều cao pic β-Lactam tại các nồng độ khác nhau. 48
Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của phương pháp 51
Bảng 3.13: Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích 55
MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người
ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe
β-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú
y từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được
dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi
khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn. Ngoài ra còn
gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do virut không chữa được bằng kháng sinh
nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng
sức khỏe của người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận,
1
đặc biệt ở người cao tuổi. Vì vậy kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người
bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng.
Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời các
kháng sinh β-Lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi trường chủ
yếu là các công trình phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Phương pháp
HPLC là phương pháp tách chọn lọc, độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít thời gian phân tích

ngắn. Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm là phải sử dụng một lượng
lớn dung môi để rửa cột, giá thành phân tích cao. Ngược lại, phương pháp điện di mao
quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) lại sử dụng một lượng hóa chất không đáng kể,
tiết kiệm chi phí từ 3 – 4 lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl,
cho độ tin cậy cao.
Tách và xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam bằng phương pháp điện di mao
quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) trong mẫu dược phẩm và sinh học là một
hướng nghiên cứu mới, song với ưu điểm của nó thì phương pháp sẽ ngày càng thông
dụng được áp dụng nhiều trong phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Vì vậy
chúng tôi quyết định chọn đề tài là “ Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng
sinh học bằng phương pháp điện di mao quản”
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,25]
Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin,
cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn
nhất là penicillin và cephalosporin.
Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và
Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).
Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA)
xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên.
2
Cấu trúc và phân loại:
* Các penicillin
Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-
Lactam
N
S
CH
3

CH
3
N
H
O
CO
R
COOM
2
3
4
1
56
7
Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin
Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-
dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid
Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,
5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau. Với
M là gốc cation thường là: K, Na, H.
Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác
nhau.
Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin
Tên kháng sinh R Hoạt tính
Nhóm penicillin tự
nhiên
Penicillin
G (PENG)
Benzathin
CH

2
-
Benzyl
Gồm các Penicillin tự
nhiên và dẫn chất.Phổ
hẹp: vi khuẩn gram(+).
Không kháng β-
lactamase
3
Nhóm penicillin kháng penicilliiase
Oxacillin
(OXA)
N
C-
O
CH
3
6-[(5-methyl-3-
phenyl-1,2-oxazole-4-carbonyl)amino]
Cloxacillin
(CLO)
Cl
N
O
C-
CH
3
6-{[3-(2-
chlorophenyl )-5-methyl-oxazole-4-
carbonyl]amino}

Là các Penicillin bán
tổng hợp. Phổ hẹp như
nhóm I. Kháng
penicilliiase, không tác
động vào vòng β –
Lactam được.
Nhóm penicillin phổ rộng
Ampicillin
(AMP)
CH-
NH2NH2
6-([(2R)-2-amino-2-
phenylacetyl]amino)
Amoxicilli
n (AMO)
CH-
NH2NH2
HO
6-{[(2R)-2-amino-2-(4-
hydroxyphenyl)-acetyl]amino}
Phổ rộng, tác dụng cả
khuẩn gram (+) và (-).
Không kháng β-
lactamase và
penicilliiase
* Các cephalosporin
Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1
dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R
N
H

O
CO
R1
N
S
R3
R2
COOM
1
2
3
4
5
6
7
8
4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin
Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-
thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid
Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.
Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên
gram âm yếu hơn thế hệ sau. Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày thế hệ I
(CEP) và thế hệ III (CEF)
Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin
Thế hệ Kháng sinh R1 R2 R3
I: Phổ tác dụng trung bình, tác dụng
mạnh nhất trên vi khuẩn gram (+),

yếu nhất trên gram (-). Không bền và
dễ bị β-lactamase phá hủy
Cephalexin
(CEP)
CH-
NH
2
H -CH
3
III: Tác dụng tốt trên vi khuẩn gram
(-), trên vi khuẩn gram (+) thì tác
dụng kém penicillin và
cephalosporin thế hệ I. Bền với β-
lactamase
Cefixim
(CEF)
S
N
N
NH
2
HOOCCH
2
O
H -CH=CH
2
Tính chất:
Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước,
dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân
cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –

COOH và –NH
2
.
5
Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ
thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ).
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pK
a
= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc phân
tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở
vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.
Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu
Tên kháng
sinh
pK
a1
Tên kháng
sinh
pK
a1
Tên kháng
sinh
pK
a1
PEN 2.74 AMO 2.8 CLO 2.7
AMP 2.7 CEP 2.6 CEF 2.75
OXA 2.72
Tác dụng:
Cơ chế:
Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá

trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng
lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa enzym tự
phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn bị tiêu
diệt.
Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm
hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng.
Kháng thuốc:
Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo
phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các cách kháng
không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng
methicillin).
Độc tính:
6
Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng,
mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ..
Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định dị
ứng với thành phần của thuốc.
1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế
khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi
trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị bệnh
nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu
biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát
triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ
định và không đúng cách.
Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu
người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales
[6,26], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi
60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không điều trị
được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng

và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin. Theo báo cáo của
A.W. McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa
kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi
trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.
Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện
giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24
giờ. D.P. Raymond [17] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan
trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70
ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la
7
Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [4], năm
1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh
nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày).
Theo [4] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai
cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em.
Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong. Nhiều
trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết
giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn
Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc
của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn
E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở
Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm
trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là
42%
Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng
sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên
môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the
Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn
của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển.
Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm Soát

Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc
gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng
chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ
nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu. Ngành dược cần cung cấp đầy
đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành
tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc
không có hoạt chất……
8
Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo
vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiêu của kháng sinh, hạn chế được chi phí
về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.
1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam
1.3.1. Phương pháp quang học
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học
của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này
đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt
trong dược phẩm.
Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo
phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều trường
hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.
Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá
cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-
lactam.
A. Fernández-González và cộng sự [11] dùng Cu
2+
thủy phân và tạo phức với
AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được
4.10
-7
M (0.16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và

tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh…
Theo [18], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng
phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh
với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl
2
, KCl 2M. Kết quả tạo ra phức màu vàng
được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện
của AMP là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l
Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ
luminol-K
3
Fe(CN)
6
kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số
β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0.5
9
mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết quả được kiểm
chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0.1
mg/l.
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các
phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và
trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc
xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy
phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.
1.3.2. Phương pháp điện hóa
Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng
không phổ biến nhiều. Theo [7], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế
phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường đệm axetat
0.1M pH=5.2.
1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là
trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo
được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các loại mẫu khác
nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ
lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi
rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng
khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích
dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân
tích chất trong các đối tượng phức tạp.
Theo [29], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V,
PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện chạy sắc ký: cột
10
Inertsil ODS2

(4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C
2
H
5
)
3
N 0,5% (45/55), dùng
nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/
kg.
J.M. Cha và cộng sự [19] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-lactam
trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C
18
(2.1 mm×50
mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril

(ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/
B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột 45
0
C; thời gian 20 phút. Áp
dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của
phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 –
15 ng/l với nước thải sau xử lý.
Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với
ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [16] C.Y.W Yang và cộng sự dùng
cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò (pha động:
ACN/đệm photphat 10mM pH 5.6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346 nm – 422 nm) đạt
giới hạn phát hiện lần lượt 0.5 μg/kg và 0.3 μg/kg. Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức
phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [24, 16] nên chỉ áp
dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng
thời nhiều kháng sinh cùng lúc được.
Tác giả Ngô Quang Trung [5] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6 kháng
sinh β_Lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải bệnh viện tại
khu vực Hà Nội. Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250 mm x 4.6 mm, 5 µm, pha
động gồm đệm axetat 12 mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10%. Detector UV-VIS đo
ở bước sóng 212 nm. Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 0.1 – 1 mg/l,
hệ số tương quan R > 99.8%. Giới hạn phát hiện LOD và LOQ là 0.4 và 0.1 mg/l
Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn… để
phân tích các β-lactam.
11
Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực
phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi
hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu và có nhiều
chất nhiễu cần loại trừ.
1.3.4. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả

tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để
tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [21] sử dụng phương pháp điện di mao
quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di gồm 40
mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5. Tiến hành phân tích tại thế điện di 10 kV, nhiệt
độ 20
0
C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO,
AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của
trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối
thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15%. Độ thu hồi trên 96%.
Biyang Deng và cộng sự [15] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện
quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0.31 μg/l,
khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ lệch chuẩn tương
đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu.
Attila Gaspar và cộng sự [14] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ
cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis
– CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8. Phương pháp này tách
được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C,
cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF,
ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 –
1.62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l;
khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên
12
cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25,
+4 và -18
0
C). Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại
nhiệt độ phòng sau khi pha loãng.
M.I.Bailon-Perez và cộng sự [22] sử dụng phương pháp CZE và detector UV –

DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật
chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO,
dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông, nước thải…).
Giới hạn phát hiện tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l cùng độ thu hồi
đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%.
Phương pháp MEKC cũng được M.I. Bail´on P´erez, L. Cuadros Rodr´ ıguez, C.
Cruces-Blanco [23] xác định 9 loại kháng sinh β_Lactam gồm CLO, dicloxacillin, OXA,
PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược phẩm. Các điều
kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8.5 làm chất nền điện di
và thế điện di 25 kV. Giới hạn phát hiện LOD 0.35 đến 1.42 mg/l, giới hạn định lượng
2.73 đến 5.74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1.5 đến 1.7%. Độ thu hồi từ
91 – 95.6%.
.Nhìn chung, phương pháp quang học và phương pháp điện hóa rất dễ tiến hành,
đơn giản nhưng chỉ xác định từng chất riêng rẽ, điều này rất khó cho việc phân tích các
mẫu có đa thành phần. Với phương pháp HPLC kết quả tách tốt, độ chính xác, độ nhạy
cao nhưng giá thành chi phí phân tích một mẫu lớn. Vì vậy phương pháp MEKC sẽ là
bước phát triển mới khắc phục những nhược điểm của phương pháp quang, điện, HPLC
mà kết quả đáng tin cậy. Trong bản luận văn này, chúng tôi nghiên cứu theo hướng của
tác giả L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [21], M.I. Bail ´on P´erez, L. Cuadros
Rodr´ ıguez, C. Cruces-Blanco [23] trong mẫu dược phẩm và sinh học.
13
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
Xác định hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu máu là một mảng đề tài
rất thực tế và quan trọng. Như đã chúng tôi đã đề cập trong bản luận văn này, vấn đề lạm
dụng không đúng hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức
khoẻ con người
Trong đề tài này, đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là
penicillin (PENG), cloxacillin (CLO), oxacilin (OXA) ampicillin (AMP), amoxicillin

(AMO), cephalexin (CEP), cefixim (CEF) là các kháng sinh β-lactam được sử dụng phổ
biến hiện nay.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung đề tài cần giải quyết là:
14
- Lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp điện di mao quản điện động
học kiểu Mixen (MEKC) với detector DAD
- Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách các kháng sinh β-lactam có thể
tách và xác định đồng thời các kháng sinh β-lactam như: pH, nồng độ
chất điện ly, điện thế, nhiệt độ….
- Đánh gía thống kê phương pháp phân tích
- Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc và mẫu máu
- Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp 25
0
C
2.2. Giới thiệu chung về phương pháp Điện di mao quản [7,8,20]
Để thực hiện được nhiệm vụ của luận văn, kỹ thuật tách được chọn là phương
pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)
2.2.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản
- Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển -
Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản
(đường kính 25 - 100 µm ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH
thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một
nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CEC là kỹ
thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách
của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất
khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng N
ef
lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh
và hiệu quả cao.

- Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao
quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan ( chất phân tích ), dưới tác dụng của lực
điện trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất (đặc trưng) của dòng
điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích và
15
kích thước của chúng. (Trong đó dòng EOF gọi là dòng điện di thẩm thấu, hay dòng điện
thẩm).
2.2.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản
- Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy
phải có các bộ phận chính như sau:
1. Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt),
2. Cột tách sắc ký (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản),
3. Nguồn cấp thế cao một chiều (15-40 kV), tạo lực điện trường E, để điều khiển quá
trình điện di (sắc ký) của các chất,
4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách),
5. Bộ phận phát hiện các chất sau khi tách (detector),
6. Bộ phận điều nhiệt cho mao quản,
7. Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu.
Các bộ phận này có thể xem trong sơ đồ nguyên lý mô tả ở hình 1.
Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản
2.2.3 . Các quá trình xẩy ra trong mao quản
16
Trong quá trình điện di, dưới tác dụng của lực điện trường E, do điện thế V đặt vào
hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là:
1. Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản,
2. Trong mao quản có dòng điện i (5 – 200 µA),
3. Xuất hiện dòng điện di thẩm thấu, EOF,
4. Sự tương tác của các chất mẫu và pha động (MP) với thành mao quản,
5. Sự khuếch tán, hay hội tụ của vùng mẫu các chất, khi di chuyển,
6. Sự phân bố của các chất giữa 2 pha (động và tĩnh), khi mao quản có pha tĩnh thật hay

pha tĩnh giả (Mixen, trong hệ MEKC),
7. Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên,
8. Sự phân tán, gradient và truyền nhiệt từ tâm mao quản ra xung quanh.
9. Sự di chuyển (sự điện di) của các chất (như các ion âm, ion dương, và phần tử
trung tính) trong mao quản. Đây là quá trình chính tạo ra sự sắc ký của các chất.
Nhưng các quá trình trên (1-8) lại có tương tác và ảnh hưởng đến quá trình 9, nó có thể
làm tốt và cũng có thể làm xấu quá trình điện di chuyển này của chất.
Đó là các quá trình luôn xẩy ra trong mao quản của HPCEC. Trong 9 quá trình
xẩy ra đó, chỉ có quá trình 9 là dẫn đến sự tách của các chất, nhưng các quá trình khác
(1-8) lại ảnh hưởng đến quá trình 9, hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp. Vì thế, muốn có kết
quả điện di tốt, nhất thiết chúng ta phải luôn xem xét tất cả các quá trình đó và các
yếu tố liên quan đến các quá trình đó trong mao quản. Tức là phải tối ứu hoá các
điều kiện điện di cho một loại đối tượng mẫu và các chất cần xác định, để có được
hiệu quả tách cao.
2.2.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản
Sắc ký điện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từ đơn giản đến hoàn chỉnh và phức
tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xẩy ra trong
ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu (Mode) khác
17
nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân biệt và sử dụng chúng cho
thích hợp. Cụ thể các kiểu đó là:
1. Điện di mao quản cổ điển (Capillary Electrophoresis: CE)
2. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE)
3. Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary Electro-
Kenetic:MEK hay MCEK).
4. Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel
Electrophoresis: Gel-CE),
5. Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF).
6. Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP).
2.2.5. Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)

Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen ( MCEK, hay viết
ngắn gọn là MEKC) là một kiểu của kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di có sử
dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản ( Capillary Electrophoresis) và
sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh. Nó là một trong các kiểu tách sắc ký (separation mode) của
kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, y học và dược. Nó là một kiểu kỹ
thuật điện di mao quản có sức mạnh, tiện lợi và được ứng dụng cho việc tách cả các chất
phân tử trung hoà và các chất mang điện tích (hợp chất liên kết ion). Vì thế nó bổ sung
và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di.
Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử Mixen
(tiểu phân Mixen - pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn dắt
và đóng góp khả năng của quá trình tách sắc ký điện di các chất trên nền của dung
dịch chất đệm và chất điện ly trong ống mao quản. Sự tách sắc kí của các phân tử chất
tan trung hoà bằng kỹ thuật MEKC được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm
trong dung dịch MP điện di. Khi chất hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ
ngưỡng của Mixen (giới hạn hình thành Mixen, CMC: Critial Micellary Concentration),
ví dụ chất hoạt động bề mặt SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), có CMC=9 mM, thì một tổ
18
hợp của các phần tử tiểu phân của chất hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình
thành (hay tạo ra) trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân SDS. Nó chính là
các Mixen (pha tĩnh giả). Các Mixen này là các tiểu phân có đầu kị nước của chất hoạt
động bề mặt, định hướng vào trung tâm của Mixen và để cho đầu ưa nước của nó ra
ngoài và sẽ tương tác với ion chất đệm, hay ion chất tan. Nghĩa là đầu mang điện tích
của chất hoạt động bề mặt sẽ hướng ra chất đệm. Cấu trúc tiêu biểu của Mixen được mô
tả trong hình 2.2. Các Mixen ở đây hoạt động như một pha tĩnh. Các phân tử của chất
mẫu (chất phân tích) được phân bố vào trong cả Mixen và cả ở ngoài Mixen (trong pha
động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố K
i
xác định, trong những điều
kiện nhất định đã được chọn để chạy điện di và mỗi chất tan X
i

sẽ có một hằng số phân
bố K
i
nhất định trong điều kiện đó. Nếu các K
i
của các chất tan là khác nhau rõ rệt thì sẽ
có được kết quả sắc kí điện di tốt.
Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có
điện tích. Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyển động hoặc là cùng
chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF, là tuỳ thuộc vào điện tích của chất hoạt động
bề mặt và cấu trúc của Mixen . Các chất hoạt động bề mặt Aniônic, ví dụ như SDS, sẽ di
chuyển về Anốt (cực dương), nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF. Trong
dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di chuyển nhanh hơn tốc
độ của Mixen , thì sự điện di thực (net movement) của Mixen là theo hướng của dòng
EOF. Trong khi di chuyển như thế, các Mixen có thể tương tác với các phần tử chất tan
(chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng rắn (R-LC) theo cả tương tác ưa
nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để tạo ra quá trình sắc ký của các chất
mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình điện di.
19
Hình 2.2. Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC
: dòng EOF. O: Chất hoạt động bề mặt. ′: Chất tan (chất PT).⇒ : Dòng điện di của chất
Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào
trong Mixen và ở ngoài Mixen (pha động điện di) theo một cân bằng động học có hằng
số phân bố K
i
nhất định trong điều kiện đã chọn. Chính sự phân bố theo kiểu cân bằng
động học này gây ra (tạo ra) sự lưu giữ khác nhau của các chất tan, và tạo ra sự tách sắc
ký các chất phân tích theo kiểu Mixen. Vì thế các Mixen trong ống mao quản của kỹ
thuật tách này được gọi là pha tĩnh giả. Nhiều chất tan tương tác với Mixen khá bền, nó
tồn tại trong Mixen dài hơn (lâu hơn) sự di chuyển của nó, khi các Mixen mang nó (các

chất tan trung tính) một phần đi ngược chiều của dòng EOF.
Khi mà các chất tan lại không tương tác với các Mixen, thì nó được dòng EOF
mang một cách đơn thuần cùng với dòng EOF. Nhiều hợp chất kị nước tương tác rất
mạnh với các Mixen, và nó bị lưu lại khá lâu trong mao quản, nên làm tăng thời gian lưu
giữ của chất tan
Cơ chế của sự tách các phần tử trung tính trong MEKC về cơ bản vẫn là kiểu
tương tác phân bố của chất tan, tương tự như trong sắc ký cột lỏng-rắn (LC) hấp phụ,
nhưng lại được điều khiển bới lực điện trường E của thế cao V giữa hai đầu mao quản
tạo ra, mà không phải bằng áp suất đẩy pha động như trong HPLC. Trong kỹ thuật phân
tích MEKC, các tính toán về hệ số dung tích k
i
’, số đĩa N của cột mao quản, độ phân giải
20
R,... cũng dựa trên cơ sở tương tự với các tính toán của hệ sắc kí cột LC, và tất nhiên có
bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng đắn hơn cho hệ pha MEKC. Chính tỷ
số giữa tổng số mol của chất tan (total moles of solute) ở trong Mixen (pha tĩnh giả), và
tổng số mol của chất tan ở trong pha động (dung dịch đệm điện di), cũng được xem như
là dung lượng của cột mao quản, và nó được biểu diễn theo công thức sau.
k
i
’ = ( t
i
– t
0
)/[t
0
.(1- t
i
/t
mc

)] = K
i
.(V
MC
/V
MP
) (1)
Trong đó:
t
i
: Thời gian lưu của chất tan.
t
0
: Thời gian không lưu giữ của chất.
t
MC
: Thời gian không lưu giữ của Mixen.
K
i
: Hệ số phân bố nhiệt động của chất tan giữa hai pha (V
MC
và V
MP
).
Với V
MC
: Thể tích của pha Mixen , và V
MP
: Thể tích của pha động.
Và tỷ số q = (V

MC
/V
MP
) cũng được gọi là tỷ số pha của hệ MEKC. Đồng thời từ biểu
thức (1) chúng ta cũng rút ra được thời gian lưu của chất tan t
R
như sau.
t
i
= [ t
0
.t
MC
.( 1+ k
i
’) ] / [ t
MC
+ t
0
.k
i
’ ) ] (2)
Nếu như mà ( t
MC
<< t
0
.k’ ) thì chúng ta lại có:
t
i
= [ t

MC
.( 1 + k
i
’) ] / k
i
’ ] (3)
Nghĩa là thời gian lưu t
R
có quan hệ chặt chẽ với hệ số dung tích k
i
’. Khi hệ số k
i
’ lớn,
thì thời gian lưu t
i
cũng lớn. Mặt khác, trong MEKC, tỷ số pha q là phụ thuộc vào nồng
độ của chất hoạt động bề mặt trong mao quản, và quan hệ này được biểu diễn bởi công
thức sau đây.
q = [V.( C
SP
- C
MC
)] / [ 1 – v
mc
.(C
SP
– C
MC
)] (4)
Trong đó:

V : Điện thế sử dụng để tạo ra điện trường E của sự điện di.
C
SP
: Nồng độ của Mixen (mol/l.)
C
MC
: Nồng độ giới hạn chuẩn của Mixen (mol/l.)
V
mc
: Tốc độ trung bình của Mixen .
21
K
i
: Hệ số phân bố của chất thứ i ở trong và ngoài Mixen .
Và khi nồng độ Mixen không lớn, thì hệ số dung tích k
i
’, và tốc độ của dòng EOF, được
tính như sau.
k
i
’ = K
i
.v
mc
.( C
SP
- C
MC
) (5)
vEOF = ( µ

e
+ µ
MC
).E (6)
Cùng với các tham số t
R
, k
i
’ , R
ij
đã nói ở trên, hệ số phân bố nhiệt động K
i
của chất tan trong hệ MEKC, cũng là một đại lượng quan trọng có liên quan đến các quá
trình xẩy ra trong mao quản và được xác định theo biểu thức sau.
lnK
i
= (∆H
0
/R.T) + ( ∆S
0
/R ) (7)
Trong đó: ∆H
0
, ∆S
0
là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng số
khí, và T là nhiệt độ (
oK
) của cột mao quản. Biểu thức này cho chúng ta thấy hằng số
phân bố Ki luôn luôn phụ thuộc vào nhiệt độ. Nó cũng là một hằng số nhiệt động.

Nhìn chung, chúng ta thấy khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bố K
i
đều giảm dần ở
tất cả các chất. Với các chất khác nhau, thì hệ số K
i
này cũng thay đổi rất khác nhau. Đó
chính cũng là yếu tố thuận lợi cho sự tách trong kỹ thuật điện di. Đồng thời với các chất
hoạt động bề mặt khác nhau thì cũng gây ảnh hưởng đến hệ số K
i
khác nhau.
Ngoài các đại lượng trên, độ phân giải R cũng là một thông số quan trọng của kỹ
thuật MEKC. Độ phân giải R
ij
của hai chất , ví dụ như I và J trong hệ MEKC cũng được
biểu thị bằng công thức sau đây theo ba thành phần cơ bản.
R
ij
= A.z.t
i
(8)
Trong đó: ________
Hiệu lực tách A: A = √ (N/4) . (9)
Độ chọn lọc z : z = [( α - 1 )/α] với α = k
2
’/k
1
’ (10)
Thời gian lưu t
R
:

t
i
= [k
2
’/(k
2
’+ 1)].{[(1 – t
0
/t
mc
)] / [1 + k
1
.( t
0
/t
mc
)]} (11)
Trong đó: k
’
i
: hệ số dung tích
22
t
i
: Thời gian lưu của chất tan.
t
0
: Thời gian không lưu giữ của chất
t
mc

: Thời gian không lưu giữ của Mixen.
Công thức (8) và (9) này cho chúng ta thấy rằng, độ phân giải R
ij
có thể được
nâng cao (làm tốt), khi tối ưu hoá được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để có
độ chọn lọc α và hệ số dung tích k
i
’ của các chất tan là phù hợp nhất. Để có được hệ số
dung tích k
i
’ tốt, trong MEKC, có thể đạt được bằng cách thay đổi pH, thay đổi nồng độ
của chất hoạt động bề mặt, thêm dung môi hữu cơ vào pha động (dung dịch đệm điện
di). Nói chung, hệ số dung tích k
i
’ của chất tan là tăng tuyến tính cùng với sự tăng nồng
độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng nhất định. Song khi tăng nồng độ chất hoạt
động bề mặt nhiều, thì một vấn đề xuất hiện ở đây là, nhất là khi dùng các chất hoạt
động bề mặt loại ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong
mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt. Công suất điện trong vùng từ 5 - 7 W/m
mao quản trong môi trường lực ion trung bình, thì cũng đã làm nhiệt độ mao quản đã
tăng rõ rệt (có thể đến 10
o
C). Lúc này hiệu suất sắc ký bị giảm. Mặt khác với các ống
mao quản có đường kính nhỏ (từ 25 - 100 µm), việc sử dụng từ trường điện thế V càng
cao, thì đương nhiên sẽ càng làm nóng mao quản nhiều. Vì thế nên tránh dùng thế quá
cao và cột mao quản đường kính (ID) lớn hơn 100 µm và cần phải điều nhiệt mao quản.
Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với
thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự
tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất tan
và của các Mixen, là cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc

độ của dòng EOF. Nói chung, các hệ đệm điện di có pH tương đối cao, thường được sử
dụng để duy trì dòng EOF có tốc độ đủ lớn và đảm bảo hướng di chuyển ổn định của các
Mixen.
Bảng 2.1. Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC
Loại chất Ví dụ CMC (mM) Số phần tử kết tụ (Mixen)
23
Anionic SDS 14 62
Cationic DTAB 14 50
1,3 78
Non-Ionic Octylglucoside - -
(không ionic)
n-Dodecyl-β-D-maltoside
0,16 -
Triton-X 0,24 140
Ionic kép CHAPS 8 10
(Zwitterionic) CHAPSO 8 11
Bile Salts Axít Chlolic 14 2-4
2.2.6. Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản
Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian
lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao H
của pic sắc ký hay diện tích S của pic là có liên quan chặt chẽ đến nồng độ C
x
của chất.
Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta luôn có biểu thức xác định
mối quan hệ đó là:
H
i
= k
1
.C

i
(12)
và S
i
= k
2
.C
i
(13)
Trong đó: H
i
và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i.
C
i
là nồng độ của chất ứng với thời gian lưu t
Ri
.
k
1
, k
2
là hằng số điều kiện thực nghiệm.
Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật CE, chúng ta dựa theo phương
trình cơ bản trên và có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp
đường chuẩn và phương pháp thêm tiêu chuẩn để xác định nồng độ chất phân tích
trong mẫu.
2.3. Thực nghiệm
2.3.1. Máy móc và dụng cụ
- Máy điện di model 1602A của hãng HP
3D

(Đức) với detector DAD, kết nối với
phần mềm HP chemstation
- Mao quản silica trần – loại bubble cell, đường kính 50 µm, chiều dài 64.5 cm,
chiều dài hiệu dụng 58 cm của hãng HP (Đức)
24
- Mắc trắc quang UV – 1601PC của hãng Shimadzu
- Máy đo pH TITROLINE của hãng SCHOTT – Đức
- Bể siêu âm, máy ly tâm, hệ thống bơm chân không, cân phân tích, giấy lọc 0.45
μm; 0.2 μm của hãng Millipore (USA)
- Các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác của Phòng thí nghiệm phân tích
2.3.2. Hóa chất
- Các chất chuẩn PENG (Na), AMP.3H
2
O, AMO.3H
2
O, CLO (Na), CEP.H
2
O
,
CEF, OXA do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48 Hai Bà Trưng – Hà Nội) cung cấp
- Nước deion được lọc qua giấy lọc 0.45µm của hãng Millipore (USA)
- Axít Boric H
3
BO
3
, muối natri tetraborat Na
2
B
4
O

7
.10H
2
O, chất hoạt động bề mặt
Natri dodecyl sunfat SDS, NaOH, NaH
2
PO
4
.2H
2
O, Na
2
HPO
4
… của hãng Merk ( Đức).
- Đệm Borat được pha từ axit boric H
3
BO
3
, muối natri tetraborat Na
2
B
4
O
7
.10H
2
O
với nước deion. Dung dịch được siêu âm 10 phút, lọc qua giấy lọc kích thước lỗ 0.2 μm
và định mức tới thể tích mong muốn. Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH và H

3
BO
3
,
giá trị pH thay đổi cho phép ± 0.05 và được đo sau khi thêm SDS. Dung dịch được bảo
quản ở nhiệt độ thường
- Dung dịch chuẩn được pha trong nước deion từ các chất chuẩn sau đó đem siêu
âm 15 phút được dung dịch nồng độ 1000 mg/l. Dung dịch 1000 mg/l được pha loãng 10
lần thành 100 mg/l.( 1000 mg/l bảo quản trong 2 tháng và 100 mg/l bảo quản 1 tháng).
Các dung dịch nồng độ thấp được pha từ dung dịch 100 mg/l và sử dụng trong ngày.
Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh 4
0
C, tránh ánh sáng trực tiếp.
25