Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào trần từ lá cây tắc Tắc (Fotunella japonica) in vitro

ii
LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin gởi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ
Sinh Học trường Đại học Bách Khoa – Đại Quốc Gia Tp HCM đã truyền đạt những
kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Xin cảm ơn cha mẹ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi có thể học tập tốt
và an tâm hoàn thành tốt luận văn.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam đã tạo
điều kiện cho tôi được nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt nghiệp tại Viện.
Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thanh Bình đã tận tình
hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chò thuộc phòng Công nghệ sinh
học – Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam đã động viên tinh thần và nhiệt tình
giúp đỡ tạo điều kiên để tôi thực hiện tốt luận văn.
Các bạn sinh viên lớp HC06BSH đã cùng tôi học tập trao đổi kiến thức giúp
tôi học tập tốt.


iii
TÓM TẮT
Ứng dụng công nghệ sinh học trong việc tạo giống cây trồng mới đã được
các nhà khoa học trên thế giới thực hiện rất thành công, một trong những ứng dụng
này là việc nuôi cấy-dung hợp tế bào trần tạo được nhiều giống cây trồng mới có
năng suất và chất lượng cao góp phần đa dạng di truyền nguồn gene cây trồng trên
toàn thế giới.
Các ứng dụng này trên các giống loài cây có múi khác nhau cũng được các
nhà khoa học trên thế giới thành công rất nhiều, do đó việc ứng dụng này để cải
thiện các giống cam quýt của Việt Nam là cần thiết đặc biệt là các giống bưởi, qt
ngon của Việt Nam còn nhiều đặc tính cần cải thiện như nhiều hạt và mẫn cảm với

nhiều loại bệnh hại đặc biệt là bệnh VLG.
Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào trần từ lá cây tắc Tắc (Fotunella
japonica) in vitro, bao gồm hai nội dung chính là 1. Nghiên cứu Xác đònh nồng độ
các loại enzyme và thời gian xử lý nhằm phân lập tế bào trần từ lá cây tắc có hiệu
quả cao nhất, và xác đònh quy trình ly tâm tinh sạch tế bào trần và 2. Thử nghiệm
nuôi cấy tế bào trần cây tắc trên các môi trường nhằm tái sinh tế bào trần thành
mô sẹo.
Sử dụng phương pháp phân lập tế bào trần qua 2 bước với việc áp dụng các
enzyme phân giải vách tế bào là cellualse (2%) và pectinase (0,2 – 0,3%) đã được
áp dụng để phân lập tế bào trần từ lá cây Tắc đạt được số lượng tế bào trần nguyên
vẹn rất cao 5,51 x 10
7
tế bào/1 g lá sau 16 giờ ủ trong dung dòch enzyme và tinh
sạch qua dung dòch rửa và ly tâm 850 vòng/phút trong 10 phút. Đã nuôi cấy thành
công tế bào trần cây tắc tạo mô sẹo trên môi trường MT (Murashige and Tucker
1969) cơ bản không có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng.

iv
MỤC LỤC
CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH ix
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu cần đạt 3
1.3 Nội dung nghiên cứu 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Phân loại và nguồn gốc cây có múi 4
2.1.1 Phân loại 4
2.1.2 Nguồn gốc cây có múi 4

2.1.3 Tổng quan về bệnh VLG trên cây có múi 5
2.1.4 Các nghiên cứu về cây có múi 7
2.2 Thành phần và cấu trúc vách tế bào thực vật 11
2.2.1 Cellulose 12
2.2.2 Hemicellulose 12
2.2.3 Pectin 12
2.2.4 Lignin 12
2.3 Tế bào trần 13
2.3.1 Đònh nghóa 13
2.3.2 Đặc điểm của tế bào trần 13

v
2.3.3 Ứng dụng của tế bào trần 14
2.4 Phân lập tế bào trần 14
2.4.1 Nguyên liệu dùng để phân lập tế bào trần 14
2.4.2 Tạo mô sẹo và huyền phù tế bào làm nguyên liệu phân lập tế bào trần
15
2.4.3 Enzyme dùng để tách tế bào trần 18
2.4.4 Phương pháp chung phân lập tế bào trần 21
2.5 Cấy tế bào trần 24
2.5.1 Môi trường nuôi cấy tế bào trần 24
2.5.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào trần 25
2.6 Sơ lược một số thành tựu của kỹ thuật tế bào trần trên cây có múi 26
2.7 Giới thiệu một quy trình phân lập và nuôi cấy tế bào trần cây tắc [10] 29
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
3.1 Thời gian và đòa điểm nghiên cứu 31
3.2 Vật liệu và dụng cụ 31
3.2.1 Vật liệu 31
3.2.2 Dụng cụ 31
3.2.3 Hóa chất và thiết bò 32

3.3 Các bước thực hiện 33
3.3.1 Chuẩn bò dung dòch phân lập tế bào trần 33
3.3.2 Chuẩn bò mẫu lá tắc 35
3.4 Phương pháp 36

vi
3.4.1 Phương pháp phân lập tế bào trần từ mô lá tắc 36
3.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào trần thu được từ lá tắc 37
3.4.3 Bố trí thí nghiệm 37
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42
4.1 Ảnh hưởng các nồng độ enzyme lên tổng số tế bào trần thu được từ mô lá
cây tắc sau khi phân lập 42
4.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme lên số TBT thòt lá cây tắc sau khi
phân lập 43
4.3 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm lên số tế bào trần thòt lá cây tắc 43
4.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự hình thành dòng mô sẹo từ tế
bào trần cây tắc in vitro 44
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
5.1 Kết luận 46
5.2 Đề nghò 46
Phương pháp phân lập tế bào trần từ mô lá tắc 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
PHỤ LỤC 53




vii
CÁC TỪ VIẾT TẮT
IAA : 3-indolyl-acetic acid

BAP : 6-benzynlaminopurine
MES : 2(N-morpholino) ethanol sulfonic acid
MS : (Murashige và Skoog, 1962)
MT : (Murashige và Tucker, 1969)
NAA : 1-naphthalene acetic acid
TBT : Tế bào trần
VLG : Vàng lá Greening
CCM : Cây có múi
RCC : Rầy chổng cánh

viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Một số loại cây có múi 4
Bảng 2.1 Các giống và loài cây có múi được tái sinh trong phòng thí nghiệm. 28
Bảng 3.1 Dung dòch A (DD Enzyme) 34
Bảng 3.2 Dung dòch B (DD rửa) 34
Bảng 3.3 Dung dòch C (ly tâm thu nhận TBT) 34
Bảng 3.4 Dung dòch D (ly tâm thu nhận TBT) 35
Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 1 38
Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm 2 39
Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm 3 40
Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm 4 41
Bảng 4.1: Ảnh hưởng các nồng độ enzyme lên tổng số tế bào trần thu được từ mô
lá cây tắc (tế bào x 10
7
/g) 42
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme lên số TBT thòt lá cây tắc (tế bào
x 10
7
/g) 43

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm lên số tế bào trần thòt lá cây tắc (tế bào x
10
6
/g) 44



ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc tế bào thực vật 11
Hình 2.2 Cấu trúc vách tế bào thực vật 11
Hình 2.3 Vò trí phân cắt của enzyme cellualase 18
Hình 2.4 Một số loại enzyme thông dụng phân lặp tế bào trần 19
Hình 3.1 Enzyme cellulase 32
Hình 3.2 Enzyme pectinase 33
Hình 3.3 Mẫu lá cắt thành mảnh vuông. 35
Hình 3.4 Mẫu lá cắt dọc theo gân chính 35
Hình 4.1 Tế bào trần lá tắc (vật kính 40X) 42
Chương 1: Mở đầu
1
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây có múi thuộc họ Rutaceae và có khoảng 150 chi, 1600 loài được
trồng ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới. Họ Rutaceae được chia ra thành bảy họ
phụ gồm 93 chi (Enger, 1931). Cây có múi có nguồn gốc ở chân núi Hy Mã Lạp
Sơn ở miền đông bắc Ấn Độ và được trồng ở rất nhiều vùng trên thế giới (FAO,
1998 ). Ở Việt Nam, cây có múi được trồng từ Bắc tới Nam, diện tích tập trung
chủ yếu ở 3 vùng trọng điểm: đồng bằng sông Cửu Long (trên 80% tổng diện
tích), vùng trung du miền núi phía Bắc (khoảng 17%) và Bắc Trung bộ (khoảng
12%) (Vũ Mạnh Hải, 1999). Ở miền Bắc nhiều giống cây có múi đặc sản nổi

tiếng như Bưởi Diễn, Cam Canh Hà Nội, Cam Sành Hà Giang, cam Xã Đoài
Riêng ĐBSCL, cây có múi tập trung ở các tỉnh Tiền Giang, Vónh Long, Đồng
Tháp và Cần Thơ với các chủng loại đặc sản như bưởi Năm Roi, bưởi Da Xanh,
quýt Tiều, quýt Đường, cam Mật, cam Sành, v.v. Tuy đem lại nguồn kinh tế cao
nhưng cây có múi nhiễm không ít bệnh nguy hiểm và ngành trồng cây có múi
vẫn đang đứng trước những thách thức rất lớn.
Bệnh Greening là một trong những bệnh hại quan trọng trên cây có múi.
Bệnh được ghi nhận đầu tiên tại Nam Phi vào năm 1947 và hiện nay bệnh này
đã và đang lan rộng trên 50 quốc gia, gây thiệt hại cho ngành sản xuất cây ăn
quả có múi trên toàn thế giới. (Bar Joseph at al., 1989). Ở Việt Nam, bệnh được
ghi nhận từ năm 1960 và hiện nay nhiều vườn cây đã bò chặt bỏ hoàn toàn chỉ
sau vài năm trồng do người dân chiết hoặc ghép từ cây đã bò nhiễm bệnh.
Kết quả điều tra đã ghi nhận hầu hết các vườn trồng cây có múi ở các tỉnh
phía Bắc - Việt Nam như Hà Giang, Tuyên Quang, Nghệ An đều có tỷ lệ cây
nhiễm bệnh greening cao lên tới 60-65%. Ở đồng bằng sông Cửu Long một số
Chương 1: Mở đầu
2
diện tích trồng cam Sành có năng suất thấp, bò bệnh đã bò người nông dân phá
bỏ để trồng lúa hoặc thay thế bằng cây trồng khác.(Hà Minh Trung, 2008). Bệnh
lây lan nhanh trên đồng ruộng thông qua nhân giống vô tính và môi giới truyền
bệnh là rầy chổng cánh (Diaphorina citri).
Để hạn chế bệnh lây lan trên đồng ruộng nhiều giải pháp đã được đề xuất
như trồng mới bằng cây giống sạch bệnh, phòng trừ tổng hợp vector truyền bệnh
VLG trong đó chú ý biện pháp quản lý cây giống sạch bệnh trước khi trồng, thời
điểm trồng và biện pháp trồng xen cây giống sạch bệnh trong vườn ổi. Nghiên
cứu giống kháng hoặc chống chòu bệnh VLG cũng được các nhà nghiên cứu trên
thế giới quan tâm đầu tư nghiên cứu chọn tạo giống kháng/chống chòu đối với
bệnh này. Trong một báo cáo gần đây, Toru Iwanami, 2010 báo cáo xác đònh
được giống qt Unzoki (C. keraji hort. ex Tanaka var. unzoki hort. ex Tanaka)
có khả năng chống chòu tốt bệnh VLG, cây qt này sau hai năm nhiễm bệnh

VLG (phản ứng dương tính khi chẩn đoán bằng PCR) có khả năng sinh trưởng tốt
không kém so với cây không bò nhiễm bệnh (số liệu chưa công bố). Do Việt
Nam là một trong những quốc gia vùng lãnh thổ nằm trong khu vực khởi nguyên
nguồn gốc cây có múi với tập quán trồng từ hạt có từ rất nhiều năm trước đây, vì
vậy, Cây có múi Việt Nam có một sự đa dạng di truyền rất lớn và có ý nghóa
khoa học trong việc chọn lọc giống cây có múi có khả năng kháng hoặc chống
chòu tốt với bệnh này. Việc điều tra, thu thập và đánh giá nguồn gene cây có
múi Việt Nam có tính chống chòu bệnh VLG là một công việc cấp thiết, tạo tiền
đề cho việc chọn tạo giống kháng/chống chòu bệnh VLG để phát triển ngành
công nghiệp CCM Việt Nam. Một trong những kết quả đạt được gần đây mà các
tác giả đã báo cáo cây Tắc (còn gọi là cây Quất) có khả năng chống chòu tốt với
bệnh VLG và đang được các nhà khoa học trên thế giới chú ý đến công tác lai
tạo giống mới tạo ra giống có khả năng kháng hay chống chòu với bệnh này, do
Chương 1: Mở đầu
3
vậy, đề tài Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào trần từ lá cây Tắc
(Fotunella japonica) in vitro được thực hiện nhằm đáp ứng việc nghiên cứu cơ
bản, tạo tiền đề cho những nghiên cứu lai tạo giống mới bằng dung hợp tế bào
trần tạo giống kháng bệnh VLG hoặc có những đặc tính mong muốn
1.2 Mục tiêu cần đạt
Hoàn thiện quy trình phân lập tế bào trần từ lá cây tắc và bước đầu xác đònh
môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo từ tế bào trần cây tắc.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Bao gồm 2 nội dung chính:
Xác đònh nồng độ các loại enzyme và thời gian xử lý nhằm phân lập tế bào
trần từ lá cây tắc có hiệu quả cao nhất, và xác đònh quy trình ly tâm tinh sạch tế
bào trần.
Thử nghiệm nuôi cấy tế bào trần cây tắc trên các môi trường nhằm tái sinh tế
bào trần thành mô sẹo.

Chương 2: Tổng quan và tài liệu
4
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Phân loại và nguồn gốc cây có múi
2.1.1 Phân loại
Cây có múi (Citrus) có vò trí phân loại là:
Ngành Angiospermae (hạt kín)
Lớp dicotyledones (hai lá mầm)
Bộ Rutales (cam)
Họ Rutaceae (cam)
Bảng 2.1 Một số loại cây có múi
Tên Tiếng Anh
Tên La Tinh
Tên Việt Nam
Calamondin
Citrofortunella mitis
Tắc, quất
Sour orange
Citrus aurantium
Cam chua
Mandarin
Citrus reticulata
Quýt
Orange
Citrus sinensis
Cam
Lemon
Citrus limon
Chanh
Grapefruit

Citrus paradisi
Bưởi
2.1.2 Nguồn gốc cây có múi
Hầu hết các loại thuộc cây có múi có nguôn gốc ở vùng nhiệt đới châu Á, từ
những vùng này phổ biến đến các khu vực khác trên thế giới. Theo Viện Tài
Nguyên Di Truyền Thực Vật Thế Giới (IBPGR, 1986) chỉ có chanh giấy (Citrus au-
rantifalia Swingle) là một trong những loài thuộc nhóm cây có múi còn được tìm
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
5
thấy mọc hoang dại, còn việc xác đònh nguồn gốc nguyên thủy của hầu hết các loài
khác trong nhóm này đều rất giới hạn. Cũng theo IBPGR(1986), cam mật (Citrus
sinensis Osbeck) có thể có nguồn gốc từ miền nam Trung Quốc, Đông Dương hoặc
miền nam Việt Nam, cam chua (Citrus aurantium L.) có thể có nguồn gốc từ các
nước Đông Nam Á, quýt (Citrus reticulata Blanco) có thể khởi thủy từ Philippine
hoặc vùng Đông Dương, chanh giấy (Citrus aurantifolia Swingle) hoang dại ở vùng
bắc Ấn Độ và vùng quần đảo Malayxia có thể cho thấy những vùng này là khởi
nguyên của chúng.
Cây bưởi (Citrus maxima Merr.) và chanh tây (Citrus limon Burn.) cả hai có
thể có nguồn gốc từ vùng Đông Nam Á. Khu vực phía đông của Hy Mã Lạp Sơn
thuộc vùng Bắc Miến Điện và miền nam Trung Quốc được xem như vùng khởi
thủy của loài chanh tây. Bưởi chùm (Citrus paradise Macf.) xuất hiện khá gần đây,
giống này có thể có nguồn gốc từ sự biến dò của bưởi hoặc do sự giao phấn của
bưởi và cam mật vào khoảng trước năm 1750 trong vùng quần đảo Tây Ấn [2].
2.1.3 Tổng quan về bệnh VLG trên cây có múi
VLG là bệnh gây thiệt hại nặng nề cho nền sản xuất CCM trên thế giới, nhất
là ở Châu Phi và Châu Á. Bệnh được gọi bằng nhiều tên khác nhau ở mỗi quốc gia:
Huanglongbing hay vàng đọt (Trung Quốc), Likubin (Đài Loan), Vàng đốm lá (Phi-
lippine),Vàng chết nhanh (Ấn Độ).
Bệnh VLG xuất hiện từ năm 1894 tại Trung Quốc, vào năm 1919 Reinking đã có
bài báo cáo về bệnh và 1947 một lần nữa bệnh được báo cáo tại Nam Phi mặc dù trước

1929 bệnh đã xuất hiện rộng rãi. Bệnh VLG đã lan rộng trên 50 quốc gia ảnh hưởng
nghiêm trọng đến các nước thuộc khu vực Châu Phi, Châu Á. Hiện chưa có báo cáo
chính thức về thiệt hại do bệnh gây ra tuy nhiên với thông số điển hình như ở Thái Lan
95% CCM thuộc khu vực phía Bắc và Đông nhiễm bệnh, ở Philippines mức độ nhiễm
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
6
bệnh lên đến 7 triệu CCM và nhìn chung hơn 60 triệu CCM đã bò tàn phá ở 2 châu lục
này.
Tại Việt Nam dòch bệnh VLG đã tàn phá nặng nề các vườn CCM từ Nam chí
Bắc vào những thập niên 1970-1980, tuy đã xác đònh được nguyên nhân gây bệnh
1975 nhưng hướng giải quyết còn nhiểu khó khăn, thế nên ước tính mỗi năm chỉ
riêng ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long thiệt hại khoảng 180 tỷ đồng.
Hiện cả trong, ngoài nước đã có nhiều nghiên cứu về bệnh và xác đònh bệnh lây
truyền qua 2 con đường là mắt ghép và côn trùng truyền bệnh. Theo báo cáo Gar-
nier và cộng tác viên tác nhân gây bệnh VLG là vi khuẩn Gram âm hiện diện trong
mô libe. Đặc tính của dòng khuẩn này được xác đònh thông qua việc đònh vò chuỗi
gene 16S ribosome DNA và protein trong ribosome.
Có 2 loài vi khuẩn gây bệnh VLG trên CCM: 1.dòng khuẩn gây hại ở Châu Phi
Candidatus Liberibacter africanus do rầy chổng cánh Trioza erytreae là môi giới truyền
bệnh, dòng vi khuẩn này mẫn cảm với khí hậu nóng, thể hiện triệu chứng bệnh ở nhiệt
độ khoảng 22-24
0
C . 2.dòng khuẩn Châu Á (có Việt Nam) Candidatus Liberibacter asia-
ticus do rầy chổng cánh Diaphorina citri là môi giới truyền bệnh ( Aubert và Quili-
ci,1984; Bové và cộng sự, 1980). Dòng khuẩn này được xếp vào nhóm chống chòu với
khí hậu nóng nhiệt độ thích hợp thể hiện triệu chứng bệnh từ 27-32
0
C.
Rầy chổng cánh thuộc loại côn trùng chích hút, biến thái không hoàn toàn.RCC có
kích thước 3,2 – 3,5 mm, màu nâu xám, có 9-10 đốt râu màu nâu đỏ, đầu có 2

mảnh nhọn nhô ra phía trước, cánh xếp thành hình mái nhà.Chúng thích hợp với
điều kiện nhiệt độ 30,9
0
C, ẩm độ 73,7%.
Cây bò bệnh VLG: lá có triệu chứng gân lá sưng phù do sự phân chia tế bào
luôn xảy ra, mô kế cận bò vàng sau đó vàng toàn lá gân lá sần sùi lên vàng rụng
sớm giống như triệu chứng thiếu kẽm; quả nhỏ bò lệch tâm và biến chất từ ngọt
sang chua vò đắng độ đường thấp hơn bình thường. Nguyên nhân dẫn đến tình trạng
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
7
trên do mô libe bò tắc nghẽn. Ngoài ra có giả thuyết cho rằng mật số vi khuẩn tăng
sẽ làm rối loạn hoạt động sinh lý của cây, gây xáo trộn dinh dưỡng, tắc nghẽn con
đường vận chuyển chất dinh dưỡng gây thiếu: Zn, Mn, Bo, Mg…Rễ cây bò bệnh
cũng bò nghẽn mạch dẫn, không nuôi được rễ tơ nên hầu hết bộ rễ sẽ bò huỷ hoại
theo thời gian và cây sẽ chết sau 2-5 năm tuỳ mức độ nhiễm (Aubert,1988).
Theo Lê Thò Thu Hồng (2000) bệnh VLG có thể giám đònh tương đối qua mắt
thường bằng cách nhận diện tổng hợp triệu chứng trên lá và trái ở ngoài đồng.
Hiện tại VNCCAQMN đã có bộ kit Iod dựa trên nghiên cứu các viện cho phép
chuẩn đoán nhanh bệnh VLG.
2.1.4 Các nghiên cứu về cây có múi
- Môi trường và điều kiện nuôi cấy
Năm 1969, Murashige và Tucker đưa ra một số yếu tố môi trường cần thiết
cho sự phát triển của mô cây có múi. Ngày nay môi trường Murashige và Tucker
(MT) thường được dùng như môi trường cơ bản của nuôi cấy mô cây có múi [22].
Moore (1986) sử dụng môi trường MT với 5% sucrose, 0,8% agar bổ sung
thêm BAP, NAA. Trong nuôi cấy đoạn thân ở 3 giống citrus: C. aurantium, C. si-
nensis x P. trifoliata, C.reshni [23].
Sim và cộng sự (1989) sử dụng môi trường MS + 2% sucrose và BA, NAA,
2,4-D, IBA hoặc sử dụng kết hợp chúng với nhau. Với pH 5.7 ở 26-28
0

C , chu kỳ
sáng 14 giờ hoặc 7 giờ, trên giống C.mitis cv. Blanco [31].
Duran-Vila và công sự (1989) sử dụng môi trường MS+ 3% sucrose và NAA,
BAP. Trong nuôi cấy đoạn thân của 4 giống Citrus : C.sinensis, C.aurantifolia,
C.medica, C.jambhiri. Với pH 5,7 ở nhiệt độ 25-27
0
C, ẩm độ 60% [6].
Dias và Rogers (1992) đã nghiên cứu về loại mảnh cấy và đònh hướng trong
việc tái sinh thân và rễ của giống Swingle citrusmelo (C.paradisi x Poncitrus trifo-
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
8
liata) mảnh cấy được lấy từ hạt nẩy mầm được gieo trong môi trường shocker
(pulsed) với 10, 6, 2 hoặc 0 mg/l BAP trong 48 giờ và chuyển sang môi trường MT
có bổ sung thêm 2g/l gelrite [27].
Môi trường thường được sử dụng trong nuôi cấy mô cây có múi là MS (Murashige-
và Skoog,1962), MT (Murashigevà Tucker) và Gamborg (B5). Parthasarathy và
Nagaraju (1996) đã thu được chồi từ phôi nẩy mầm của 7 giống cây có múi : Citrus
reticulata, C. madurensis, C. reshni, C. volkameriama, C. taiwanica, C. sinensis cvs.
và C. limon trên môi trường MS và B5 được bổ sung thêm BAP. Hầu hết các giống
đều phát triển tốt trên môi trường MS chỉ trừ C. reshni [27].
Kordan (1959) lần đầu tiên trình bày về tiềm năng phát triển của nuôi cấy mô có
thể thu được mô sẹo từ con tép của quả chanh. Ông ta sử dụng môi trường lỏng chỉ
chứa đường và khoáng chất [20].
Nuôi cấy invitro cây có múi
Ranga Swamy (1961) nuôi cấy phôi và phôi tâm của C. microcarpa trong môi
trường Ranga Swamy II (1961) bổ sung 1mg/l IAA tạo được mô sẹo và phôi. Khi
cấy chuyền sang môi trường có bổ sung GA
3
(1mg/l) và kinetin (0,01mg/l), phôi sẽ
tăng trưởng tạo chồi con [28].

Năm 1972, Kochba và cộng tác viên đã thành công trong việc nuôi cấy mô
sẹo có phôi tạo ra từ phôi tâm của cam mật ‘Shamouti’ (C. sinensis Osb.) bằng
cách nuôi cấy noãn chưa phát triển. Trong khi đó, Grinblat sử dụng các vật liệu
khác nhau như đoạn thân, mảnh lá của giống Citrus madurensis L. để tái tạo cây
con [19]. Nồng độ cytokinin được sử dụng trong các thí nghiệm thường ở khoảng
0,5-30 mg/l, tuy nhiên khi nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy quá cao sẽ
tạo nhiều chồi bất đònh nhưng chồi không phát triển. Nhóm auxin kích thích tạo rễ
thường được dùng ở nồng độ 0,1-5 mg/l hoặc phối hợp với cytokinins ở nồng độ
0,1-1 mg/l, auxin có tác dụng kích thích nhân chồi. Để tạo mô sẹo người ta thường
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
9
bổ sung vào môi trường 2,4D hoặc auxin ở nồng độ cao và cytokinins ở nồng độ
thấp (10 : 0,25 mg/l) [6].
Wang và Chang (1978) thành công trong việc tạo phôi của bưởi (Citrus gran-
dis) bằng cách nuôi cấy nội nhũ (endosperm) trên môi trường MT có bổ sung
2mg/l 2,4D + 5 mg/l BA + 1000 mg/l CH trong điều kiện tối ở nhiệt độ 28
o
C để tạo
mô sẹo. Sau đó tạo phôi trên môi trường MT có bổ sung 2-15 mg/l GA
3
và 0,02
mg/l kinetin. Để tạo chồi chuyển sang môi trường MT có bổ sung 2-15 mg/l GA
3
[35].
Năm 1981, Navarro và cộng tác viên đã sử dụng đỉnh sinh trưởng có kích
thước từ 0,2-0,4 mm, đã tạo được hơn 90 mẫu sạch bệnh từ các vật liệu nhiễm virus
Tristeza, Stubbom spiroplasma [24].
Kitto S.L.và Young M.J. (1981) đã thử nghiệm nhân giống 3 loại quýt trong
điều kiện in vitro là Citrus aurantium, Carrizo citrange và Cleopatra mandarin
nhưng chỉ thành công khi nhân chồi đỉnh của Carrizo citrange trên môi trường

khoáng đa lượng Knop với thành phần khoáng vi lượng MS có bổ sung thêm 5 mg/l
BA, 3-4% sucrose và chiếu sáng ở điều kiện 2200 lux. Số chồi ra trung bình là 3,1
công trình không có nghi nhận nào về tác động của kinetin, 2iP, nồng độ agar, sự
bổ sung nước cam hay nguồn nitrogen đến việc tạo chồi. Chồi tái sinh sau đó được
xử lý ra rễ trong môi trường MT có bổ sung 1 mg/l NAA và 0,5% agar [18].
Moore (1986) cấy lóng thân của C.aurantium trong môi trường MT có bổ sung
5 mg/l BAP và 1 mg/l NAA tạo đïc chồi bất đònh, các chồi này sau đó được xử lí
cho ra rễ trong môi trường có bổ sung 1 mg/l NAA [23].
Naima Beloualy (1990) cấy phôi của 3 loài: Citrus aurantium, Poncitrus trifo-
liata và Carrizo citrange (C. sinensis x Poncitrus trifoliata) trong môi trường MT có
bổ sung 2,4 D (2 mg/l), BAP (5 mg/l), sucrose (50 g/l). Phôi tạo mô sẹo sau 2 tuần
nuôi cấy trong tối. Cấy chuyền mô sẹo vào môi trường MT có NAA (1 mg/l) và BA
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
10
(5 mg/l) trên mô sẹo sẽ xuất hiện phôi hình cầu và chồi bất đònh nhiều nhất trên 2
loài Poncitrus trifoliata và Carrizo citrange, trong khi mô sẹo của Citrus aurantium
không phản ứng với môi trường trên mà lại tạo chồi và phôi mạnh nhất trên môi
trường có NAA (1 mg/l) và BA (10 mg/l). Chồi của 3 loại được tạo rễ trong môi
trường MT có bổ sung NAA (1 mg/l) và phôi hình cầu sẽ nẩy mầm và tạo thân rễ
với môi trường MT có bổ sung GA
3
(1 mg/l) [25].
Ling (1990), Kunitake (1991) đã tạo mô sẹo có phôi bằng cách nuôi cấy noãn
chưa phát triển của qt Satsuma. Trong khi Rangan (1993) sử dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô sẹo có phôi (embryogenesis callus) ở C. sinensis [21].
Eugenio Pérez-Molphe-Balch (1997) tạo chồi bằng cách nuôi cấy lóng thân
cây con gieo trong ống nghiệm của 2 loài Mexican Lime (C.auranfolia) và Manda-
rin (C.reticulata) trên môi trường MS có bổ sung 33,3 µmg BA và 5,4 µM NAA, vi-
tamin B
5

, 5% đường. Mẫu cấy được nuôi trong điều kiện 25±1
0
C, trong tối 21 ngày,
sau đó chuyển ra chiếu sáng ở 16h sáng 8h tối trong 29 ngày. Kết quả 96% mẫu tạo
trung bình 7,8 chồi đối với Mexican Lime và 88% mẫu tạo trung bình đối với Man-
darin, 70% mẫu tạo rễ trên môi trường có bổ sung NAA (2,7-5,4 µM), IBA (2,5-4,9
µM) [7].
Các phương pháp chọn tạo giống cây có múi bằng phương pháp xử lý đột
biến
Hensz, (1977) đã phát triển giống bưởi chùm không hạt Star Ruby từ giống
bưởi chùm Foster có hạt bằng cách xử lý tia X trên mầm ngủ của giống bưởi chùm
không hạt Ruby Red, nhằm cải thiện phẩm chất trái và đặc tính ra trái. Trong khi
Russo và cộng sự, 1981 xử lý chồi của giống quýt clemintine Monreal với tia gama
để tạo ra các dòng ít hạt, họ đã khảo sát một số chồi cho quả với sự giảm số lượng
hạt [15].
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
11
Hearn (1986) đã xử lý mầm ngủ của giống bưởi chùm Foster để tạo ra giống
với sự giảm số lượng hạt (không hạt thương mại), kết quả đã chọn lọc được 4 dòng
với sự giảm số lượng hột/quả ổn đònh qua 4 năm [14].
Tại trường Đại học California, Mỹ, một trong hai tiến trình chính đang được
thực hiện trong chọn tạo giống cây có múi là tạo giống không hạt từ giống thương
phẩm hiện có bằng xử lý mầm ngủ với tia gama. Trong vài năm qua, họ đã xử lý
4.500 mầm ngủ của các giống Encore, Kinnow, Fairchild, W. Murcott, Murcott,
Lee, Kara, Fremont, Ortanique, Fallglo, Daisy, Fortune, Dancy, Nova, Sue Linda
Temple, Sunburst, các con lai quýt tuyển chọn và Valencia; khoảng 50% các cây
được tạo ra, đánh giá khởi đầu trong sự trồng hỗn hợp, tuyển chọn các dòng có tri-
ển vọng cho khảo nghiệm đồng ruộng, 20 cá thể có số hạt/quả thấp được tuyển
chọn và được đánh giá ở 4-5 vò trí khác nhau. Dù các cá thể xử lý đột biến chỉ cho
trái vài trăm cá thể nhưng họ đã chọn được một số cá thể có triển vọng với số

lượng hạt/quả thấp có nguồn gốc từ giống Encore, W. Murcott và Kinnow [29].
2.2 Thành phần và cấu trúc vách tế bào thực vật


Hình 2.1 Cấu trúc tế bào thực vật [38]
Hình 2.2 Cấu trúc vách tế bào thực vật [38]

Chương 2: Tổng quan và tài liệu
12
Thành phần chính của vách tế bào là các polysaccharide có cấu trúc phức
tạp được tạo nên từ các monosaccharide đơn giản. Có 11 loại monosaccharide phổ
biến cấu tạo nên các loại polysaccharide, trong đó có glucose và galactose. Có
nhiều thành phần khác nhau cấu tạo nên vách tế bào như cellulose, hemicellulose,
pectin, lignin …[39].
2.2.1 Cellulose
Cellulose là thành phần có tỉ lệ cao nhất trong thành tế bào thực vật [17].
Một loại polysaccharide được tạo nên bởi đơn phân là các phân tử đường glucose
bởi liên kết β-1,4-D-glucoside.
2.2.2 Hemicellulose
Hemicellulose là nhóm các polysaccharide liên kết với nhau theo dạng nhánh.
Được đặc trưng bởi sự hòa tan trong kiềm mạnh. Hai loại hemicellulose phổ biến
trong tế bào thực vật là xyloglucan và glucuronoxylan. Ngoài ra còn có các loại
hemicellulose khác ít phổ biến hơn được tìm thấy trong vách thứ cấp (secondary
wall) là glucomannan, galactoglucomannan, và galactomannan [39].
2.2.3 Pectin
Là nhóm có chứa đa dạng các polysaccharide và đặc biệt rất giàu acid pectic.
Pectin có nhiều trong vách chính (primary wall) và phiến giữa hai vách tế bào liền
nhau (middle lamella). Các loại pectin bao gồm: galacturunan (homogalacturonan,
substituted galacturonans, rhamnogalacturonan-II) và rhamnogalacturonan–I[17].
2.2.4 Lignin

Là polymer của phenolics, đặc biệt là phenylpropanoids.
Lignin là thành phần rất phổ biến trong gỗ và là thành phần chiếm tỉ lệ trung
bình lớn thứ hai về khối lượng (sau cellulose) trong toàn bộ sinh khối thực vật. Các
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
13
loại thực vật khác nhau có thành phần lignin khác nhau và thay đổi trong khoảng
một đến ba phần tư trọng lượng khô [4].
Cùng với cellulose, hemicellulose và pectin, lignin có mặt ở vách tế bào
thực vật và đặc biệt là trong vách các loại quản bào và cương bào mô mộc. Lignin
lấp đầy khoảng trống giữa các sợi và tạo liên kết ngang giữa 3 thành phần polysac-
charide trên, làm tăng tính cứng cơ học cho vách tế bào, từ đó đònh nên cấu trúc
cứng cáp của thực vật [4, 13].
2.3 Tế bào trần
2.3.1 Đònh nghóa [1]
Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào. Lúc này nguyên sinh chất
và các bào quan chỉ được bao bọc bởi lớp màng nguyên sinh chất.
2.3.2 Đặc điểm của tế bào trần [1]
Tế bào trần có khả năng tiếp nhận một đoạn DNA hoặc toàn bộ DNA lạ.
Đặc tính này chỉ thấy ở tế bào vi khuẩn. Các tế bào nguyên thủy trong mô thực vật
không có đặc tính này. Khi tế bào thực vật và tế bào nắm men được tách bỏ thành
tế để tạo ra tế bào trần thì lúc này tế bào trần có khả năng tiếp nhận vật liệu di
truyền giống như tế bào vi khuẩn.
Khi đưa vào môi trường đủ chất dinh dưỡng thích hợp thì tế bào trần có khả
năng tái sinh thành tế bào. Đây là đặc tính hết sức đặc biệt của tế bào trần. Nhờ đó
tế bào trần mới phục hồi được toàn bộ chức năng của một tế bào nguyên thủy.
Khi tế bào trần tái tạo được thành tế bào và trở lại thành tế bào nguyên thủy,
chúng có khả năng phát triển và phân chia hoàn toàn giống như tế bào bình thường.
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
14
2.3.3 Ứng dụng của tế bào trần [1]

Khi tạo ra được tế bào trần, các nhà khoa học cho thấy khả năng vô cùng lớn
của nó trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất. Những ứng dụng của tế bào trần
được liệt kê như sau:
Các nhà khoa học sử dụng tế bào trần như một đối tượng sinh học trong công
tác nhân giống. Chúng ta hoàn toàn có thể sử dụng các tế bào trần cùng loài để
tiến hành lai giống. Khi đó vật chất di truyền của các cá thể trong cùng một loài có
thể trao đổi với nhau. Kết quả là chúng ta thu nhận được tính trạng mới trong mỗi
loài. Phương pháp này giống như hiện tượng tiếp hợp ở vi khuẩn. Ngoài ra các nhà
khoa học còn dựa vào khả năng tiếp nhận không chọn lọc các vật chất di truyền
của tế bào trần để tiến hành lai khác loài và từ đó tạo ra tính đa dạng sinh học.
Các nhà khoa học còn sử dụng tế bào trần như cơ thể nhận các vật liệu di
truyền từ các giới sinh vật khác nhờ đặc tính tiếp nhận không chọn lọc của tế bào
trần. Đây là bước đột phá của rất quan trọng trong công nghệ sinh học. Từ đó các
nhà khoa học sẽ có khả năng tạo ra những giống mới không chỉ có đặc tính của một
loài, khác loài mà còn khác cả giới sinh vật. Việc tái sinh tế bào trần thành một
cây hoàn chỉnh đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất.
Các nhà khoa học cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng các tế bào trần để sản
xuất các sản phẩm thứ cấp giống như phương pháp nuôi cấy tế bào đơn.
2.4 Phân lập tế bào trần
2.4.1 Nguyên liệu dùng để phân lập tế bào trần
Mô và cơ quan dùng tách tế bào trần rất đa dạng như là: lá, chồi ngọn, bao lá
mầm, cánh hoa, quả, rễ, mắt rễ, lông hút, tế bào mẹ hạt phấn, ống phấn, hạt phấn.
Mặt khác, mô thòt lá là nguồn nguyên liệu chung nhất của việc tác phần lớn tế bào
trần bởi vì dễ dàng có được [27]. Mẫu lá lấy từ cây gieo bằng hạt trong phòng thí
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
15
nghiệm thường được sử dụng để tách tế bào trần vì không cần qua giai đoạn khử
trùng.
Tế bào trần còn được tách từ mô sẹo invitro và huyền phù tế bào. Mô sẹo và
huyền phù tế bào là nguồn tách tế bào trần được chuộng hơn bởi vì tốc độ phát tri-

ển nhanh, màng tế bào mỏng và mức độ đồng đều cao. Việc tạo lập và duy trì
huyền phù tế bào đòi hỏi điều kiện rất nghiêm ngặt. Tuy nhiên, tế bào trần tách từ
tế bào được nuôi cấy có những thuận lợi là được phát triển trong điều kiện vô trùng
và môi trường dinh dưỡng. Tế bào trần từ các mô có nguồn gốc khác nhau có khả
năng tái sinh rất khác nhau [27].
2.4.2 Tạo mô sẹo và huyền phù tế bào làm nguyên liệu phân lập tế bào trần
2.3.2.1 Tạo mô sẹo [1]
- Vật liệu nuôi cấy
Mô sẹo có thể hình thành từ tất cả các mô thực vật một lá mầm và hai lá
mầm. Các mô thường được sử dụng để tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, cơ quan
dự trữ, trụ bì rễ, phôi nhũ, tử diệp, tế bào diệp nhục lá và mô tiền tượng tầng.
- Khử trùng vật liệu
Mặt ngoài của thực vật mọc ngoài tự nhiên, trong nhà kính hoặc trong phòng
tăng trưởng thường bò nhiễm bởi các bào tử nấm, vi khuẩn. Mô bên trong thường
không bò nhiễm mầm bệnh. Tuy nhiên, mô mạch thường bò nhiễm bởi các loại nấm
sống trong hệ thống mạch mà không gây ra bất kỳ triệu chứng nào. Vì vậy, việc
lựa chọn mô sạch bệnh để nuôi cấy là hết sức quan trọng. Trước khi mẫu cấy được
đưa vào nuôi cấy cần loại hết tất cả các nguồn gây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy.
- Chuẩn bò mẫu cấy
Kích thước và hình dạng ban đầu của mẫu cấy thường không khắt khe lắm
mặc dù mẫu cấy không thể tăng trưởng được nếu như kích thước mẫu cấy nhỏ hơn
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
16
kích thước cần thiết. Nói chung những mẫu cấy tương đối lớn thường được sử dụng
bởi vì một lượng lớn tế bào hiện diện làm tăng cơ hội thu được những mẫu cấy có
thể sống được. Lá, thân, hoa, bao phấn, trái cây, hạt, vùng chồi ngọn, rễ đều có thể
sử dụng để nuôi cấy tế bào.
- Môi trường nuôi cấy
Sự đáp ứng của những mẫu cấy, việc cung cấp tất cả các nguyên tố khác ở
mức độ tối thích phụ thuộc phần lớn vào nồng độ auxin và cytokinin. Sự đáp ứng

của mẫu phụ thuộc vào cả hai lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh và
ngoại sinh. Auxin thường được sử dụng để khởi đầu và duy trì mô sẹo gồm IAA
(10
-10
–10
-5
M) và NAA (10
-10
–10
-5
M). Một vài mô không thể tạo được mô sẹo khi
chỉ có tác dụng của auxin và đòi hỏi cần có cả sự có mặt của cytokinin.
Để duy trì mô sẹo đòi hỏi phải có sự hiện diện của các amino acid khác nhau
trong môi trường nuôi cấy. Các amino acid được sử dụng trong môi trường nuôi cấy
là glycine, arginine, hoặc hỗn hợp các amino acid như trong casein hydrolase.
Mô sẹo thường được tăng trưởng trên môi trường đặc, còn trong môi trường
lỏng thì đôi khi cũng được sử dụng. Agar là chất làm đặc môi trường thông dụng
nhất và được sử dụng với nồng độ 6–10 g/l. Agar sẽ lỏng ra ở 100
0
C và đặc lại ở
45
0
C. Đặc biệt agar không tác dụng với các thành phần của môi trường dinh dưỡng
và không bò phân hủy bởi enzyme.
- Cấy chuyền
Mô sẹo thường được chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới theo từng giai
đoạn. Sự tăng trưởng của mẫu cấy sẽ làm tích tụ các sản phẩm, cạn kiệt nguồn dinh
dưỡng và môi trường bò khô nước. Mẫu được nuôi ở 25
0
C thì nên được cấy chuyền

mỗi 4 – 6 tuần. Hầu hết mô sẹo nuôi cấy đều đòi hỏi phải được phân cắt thường
xuyên và đặt mặt úp trên môi trường dinh dưỡng. Các mẫu sẹo tốt không nên cắt ra
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
17
quá nhỏ, nếu không thì nó không thể sống được khi chuyển sang môi trường mới.
Mô sẹo có khả năng tạo phôi sẽ tăng trưởng chậm hơn mô sẹo không có khả năng
sinh phôi. Đây là những mô chắc và dễ tái sinh hơn mô không sinh phôi.
2.3.2.2 Tạo huyền phù tế bào [1]
Huyền phù tế bào được tạo ra từ những mảnh mô sẹo trong một môi trường
lỏng được lắc liên tục, tương tự huyền phù tế bào nào cũng được tạo ra từ cây mạ
hay phôi. Đối với huyền phù tế bào được tạo ra từ mô sẹo thì muốn huyền phù tế
bào được tốt, phải tạo được mô sẹo tốt tức là mô sẹo phải bao gồm các tế bào có
khả năng sinh phôi. Mô sẹo khi phát triển đến một lúc nào đó trên môi trường đặc
phải được chuyển sang môi trường lỏng trong các bình tam giác và được lắc liên
tục trên một máy lắc vòng với tốc độ lắc thích hợp. Trong quá trình tạo huyền phù
tế bào, những điều kiện sinh trưởng như môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ
hay thành phần các chất kích thích cũng tương tự như lúc tạo mô sẹo hoặc nếu có
thay đổi thì chỉ thay đổi rất ít.
Trong môi trường lỏng, từ mô sẹo có thể phóng thích ra những tế bào riêng lẻ
hay những cụm tế bào gồm vài đến vài chục tế bào có khi đến cả trăm tế bào dính
với nhau giúp tăng diện tích tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng. Ngoài ra hoạt
động lắc tròn của máy lắc giúp sự tăng sinh bình thường của mô sẹo, đồng thời
giúp sự trao đổi khí giữa môi trường và tế bào được thuận lợi hơn. Tuy nhiên khả
năng hình thành huyền phù tế bào phụ thuộc rất nhiều vào kiểu gen cũng như kiểu
tế bào. Sau vài tháng nuôi cấy (tùy theo vật liệu) trong môi trường nuôi cấy lỏng,
người ta sẽ nhận được một huyền phù tế bào ổn đònh gồm những tế bào cô lập hay
nhóm nhỏ tế bào có thể sử dụng cho những thí nghiệm về sự tái sinh thực vật hay
các kỹ thuật ở mức tế bào. Một huyền phù tế bào được cho là lý tưởng khi nó là
một dòch mòn, hầu như bao gồm những yếu tố có khả năng sinh phôi, nói cách khác
những tế bào cô lập hay họp thành từng nhóm nhỏ từ vài đến khoảng hai mươi tế