Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tổ cung

Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
1

Đặt vấn đề
“Sự sống quá phức tạp không cho phép chỉ qua một vài nghiên cứu mà
hiểu được toàn bộ cơ thể con người” – Linus Pauling. Hiện nay trên thế giới các
ứng dụng kỹ thuật của hàng loạt công trình nghiên cứu nuôi cấy các tế bào
ung thư đã và đang giúp các nhà khoa học từng bước giải đáp những vấn đề cơ
bản trong sinh học phân tử và cả những điều bí ẩn trong cơ thể con người. Các
nhà khoa học vẫn đang tiếp tục tìm kiếm và khám phá ra những dòng tế bào
đồng nhất về mặt di truyền. Các tế bào được chọn lọc này là mục tiêu cho việc
tiến hành các liệu pháp sinh học nhằm góp phần ngăn chận căn bệnh hiểm
nghèo.
Khoa học về nuôi cấy tế bào ung thư có phạm vi ứng dụng rất rộng và
phong phú cả trong nghiên cứu khoa học và trong thương mại. Dòng tế bào ung
thư được sử dụng như một vật liệu để sản xuất ra các cơ chất. Các protein người
có thể được phân lập trực tiếp từ việc nuôi cấy tế bào. Các dòng tế bào đóng
vai trò quan trọng trong các kỹ thuật tái tổ hợp DNA trong sinh học phân tử.
Người ta còn sử dụng dòng tế bào để thử nghiệm các loại thuốc có độc tính để
điều trò các bệnh di truyền, ung thư. Việc nuôi cấy tế bào còn góp phần mở ra
kỹ thuật dung hợp tế bào. Kỹ thuật này giúp chúng ta hiểu biết những điều bí
ẩn xãy ra bên trong cơ thể con người như các cấu tạo và chức năng của gen
người, các biểu hiện và các cơ chế di truyền, các phản ứng sinh học bình
thường và quá trình phát triển của những gen bệnh.
Mục tiêu chính của luận văn này là giới thiệu nền tảng cơ bản và
phương pháp luận cần thiết để tiến hành nuôi cấy tế bào ung thư nói chung và
đặc biệt là thử nghiệm phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào ung thư cổ tử cung
từ các mẫu mô sinh thiết của các bệnh nhân được chẩn đoán bò tổn thương
loạn sản ở giai đoạn I
B

, II
A
và II
B
.
Ở Việt Nam việc nuôi cấy các tế bào còn hết sức mới mẽ. Dựa trên các
tài liệu có được với sự hướng dẫn của các Thầy Cô, các anh chò và sự hỗ trợ của
bệnh viện Ung bướu thành phố Hồ Chí Minh em đã cố gắng tiến hành công
việc nuôi cấy dòng tế bào ung thư cổ tử cung trong phạm vi khả năng, thời gian
và các điều kiện kỹ thuật hiện có. Kết quả cũng mới chỉ dừng ở mức độ xác
đònh tế bào ung thư cổ tử cung có thể nuôi cấy trong một môi trường nhất đònh
với các thao tác chuẩn, kèm theo điều kiện môi trường và các dụng cụ thí
nghiệm cần phải được vô trùng tuyệt đối. Mặc dù tỷ lệ thành công ở lần thử
nghiệm phân lập và nuôi cấy đầu tiên của em là 1/20 mẫu sinh thiết nhưng
đây là tiền đề để em có thể tiếp tục theo đuổi đề tài này trong tương lai.
Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 – 2004
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
2

1.1. MỘT SỐ MỐC LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU VỀ UNG THƯ
Theo các tài liệu được ghi chép từ thời cổ đại, các nhà khoa học đã tìm thấy dấu
vết của một khối u ác tính ở mẫu xương hóa thạch của xác ướp Ai Cập (cách đây
5.000 năm) và một bản thảo được viết trên giấy cỏ lau mô tả 8 trường hợp bò khối u
hay vết loét ở phần ngực. Trong bản mô tả người viết còn ghi thêm “không có cách
điều trò”. Lúc bấy giờ thuật ngữ “cancer” chưa được sử dụng.
Hyppocrate, người thầy thuốc Hy Lạp cũng xác nhận ung thư có thể làm chết
người. Vào thời này đã sử dụng thuật ngữ carcinoma để mô tả hai loại ung thư: loại
sùi ra ngoài nhiều chân như loài cua (carcinoma) và loại phát triển sâu trong thòt
(sarcom).

Tuy nhiên mãi đến thế kỷ 15, Giovanni Morgagni mới là người đầu tiên thực
hiện giải phẫu tử thi một bệnh nhân u xương với mục đích tìm hiểu bản chất và
nguyên nhân bệnh. Đây là nền tảng để phát triển khoa học về u bướu (oncology).
Năm 1846, nhà nghiên cứu bệnh học người Đức Rudolph Virchow mô tả tế bào ung
thư máu và đưa ra giả thuyết về nguồn gốc ung thư tế bào. Ôâng cho rằng tất cả các
tế bào, bao gồm cả tế bào ung thư đều có nguồn gốc từ một tế bào khác. Giả thuyết
của ông vào thời đó đã rất tiến bộ và vài thập kỹ sau giả thuyết này được chứng
minh là đúng.
Đầu thế kỷ 19, các nhà khoa học mới hé mở phần nào sự bí ẩn của ung thư.
Năm 1911, Peyton Rous đã khám phá được một trong những virút gây ung thư đầu
tiên đặt tên là RSV. Đó là một retrovirus (virút phiên mã ngược) mà vốn di truyền
được cấu tạo bằng RNA. Thời điểm này một vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học là
làm thế nào RSV có thể nhập vào vốn di truyền của tế bào cấu tạo bằng DNA. Năm
1960, Temin nghó ra rằng RNA có thể tạo ra DNA nhờ một chất men. Mười năm
sau, Temin và Baltimore đã chứng minh được sự hiện hữu của enzym này, đó là
enzym sao chép ngược và các virút gây ung thư loại RNA được gọi là virút phiên
mã ngược. Khám phá này nhận được giải thưởng Nobel Sinh lý và Y học năm 1975.
Năm 1976, nhà nghiên cứu người Pháp Dominique Stehelin cùng với các đồng
nghiệp người Mỹ Michel Bishop và Harold Varmus khám phá một điều gây sửng sốt
là nhiễm sắc thể của nhiều động vật, kể cả người chứa các gen có thể chuyển đổi
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
3

thành các gen gây u, nhờ vậy xác đònh trên 60 loại gen của tế bào có thể chuyển
thành gen gây ung thư.
Kiến thức của nhân loại về di truyền học, về cơ chế sinh học phân tử đã tiến
triển nhanh trong những năm gần đây.Vào giữa thế kỷ 20 các nhà khoa học mới bắt
đầu giải quyết những vấn đề phức tạp của di truyền học. James Watson và Franci
Crick với hai trang thông báo ngắn gọn về mô hình phân tử của DNA trên tạp chí

Nature đã làm đảo lộn nhận thức của giới khoa học đương thời. Trong lòch sử sinh
học ít có mốc nghiên cứu nào có tác động rộng rãi như mạch xoắn kép DNA của họ.
Mô hình của Watson và Crick đem lại ý nghóa mới mẻ cho việc nghiên cứu chủ đề
di truyền học và ung thư.
Cũng vào thời điểm này thuật ngữ kháng thể đơn dòng xuất hiện. Kỹ năng tạo
các kháng thể đơn dòng đã cho ra đời một công nghệ mới áp dụng phổ biến trong
việc chẩn đoán sớm và điều trò một số bệnh ung thư. Nhà bác học tìm ra các kháng
thể đơn dòng được trao giải thưởng Nobel vào năm 1981 là Cesar Milstein.
Chúng ta phải thừa nhận rằng đến cuối thế kỷ 20, nhân loại đã có những bước
tiến vượt bậc về việc nghiên cứu ung thư trên cơ sở di truyền học, đồng thời tìm ra
những liệu pháp điều trò mới mà mục tiêu nhằm vào việc tiêu diệt các tế bào ung
thư chuyên hóa. Tuy nhiên, những điều này đến nay vẫn chưa làm thay đổi sự thật
về một căn bệnh nan y. Nhưng dù sao chúng ta cũng có quyền hy vọng đến năm
2010 hay lâu hơn nữa bản phân loại về gen con người sẽ được hoàn tất, đó sẽ là nền
tảng để các nhà khoa học tìm ra các tín hiệu điều khiển quá trình tái tạo khối u và
tìm ra các gen bảo vệ cơ thể chống lại căn bệnh này.

1.2. NHỮNG ĐẶC TÍNH CỦA UNG THƯ NGƯỜI

1.2.1. Bản chất của bệnh ung thư và sự phân biệt giữa u lành vớiø u ác tính
Ung thư là một bệnh lý ác tính. Vì sao ung thư lại làm cho người ta thật sự sợ hãi
khi mắc phải? Ta có thể hình dung tế bào ung thư như một sinh vật phát triển ngoài
vòng kiểm soát. Mà cái gì hoặc điều gì nằm ngoài vòng kiểm soát đều đáng lo ngại.
Trong phân hoá tế bào bình thường, các cơ chế kiểm soát ở mức tế bào thường
hạn chế sinh trưởng và phân bào ở những mức xác đònh. Nhưng đôi khi một tế bào
thoát khỏi mức kiểm soát này và nhân bản lên một cách thái quá. Sinh trưởng thái
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
4

quá có thể dẫn đến hậu quả tạo ra khối u, tức là một khối tế bào bất thường so với
những mô chuẩn mực bình thường.
Có phải tất cả khối u đều là ung thư không? câu trả lời là không. Có hai loại u. U
lành tính thường gọi là u lành. Đó là một khối tế bào bất thường vẫn giữ lại ở vò trí
gốc nơi chúng đã phát sinh trong cơ thể. Các u lành cũng có thể gây sự cố nếu
chúng sinh trưởng lớn chèn ép ở một số cơ quan bò khung xương bọc kín như não hay
phổi. Nhưng thông thường ở các vò trí không chèn ép các mô khác người ta có thể
dùng phẫu thuật tại chỗ cắt bỏ hoàn toàn khối u ra khỏi cơ thể.
Trái hẳn với u lành là các u ác tính là một khối mô bất thường có thể phát triển
lan vào trong các mô lân cận và thường di căn vào những bộ phận ở xa khác của cơ
thể. Một u ác phát sinh từ một tế bào ung thư duy nhất và dời chỗ ra khỏi mô bình
thường nó đã phát sinh. Nếu không tiêu diệt hay cắt bỏ, một vài tế bào ung thư đó
sẽ xâm nhiễm vào trong các mô bao quanh và khối u gốc sẽ bành trướng. Các tế
bào cũng có thể tách khỏi khối u, xâm nhập vào hệ tuần hoàn (vào các mạch bạch
huyết và mạch máu) và có thể lan đến các vò trí mới, tạo ra những khối u mới tại
những chỗ đó. Sự dời chỗ của các tế bào ung thư ra khỏi vò trí nguyên thủy của
chúng được gọi là sự di căn (malignant progression).

Hình 1: Sự di căn


Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
5

Nói chung, để phân biệt giữa u lành tính và u ác tính có thể dựa trên các đặc
điểm biệt hoá và mất biệt hóa, tỷ lệ phát triển, tính chất xâm nhập tại chỗ và sự di
căn.
Thuật ngữ biệt hóa và mất biệt hóa áp dụng cho các tế bào biểu mô của khối u.
Sự biệt hóa để chỉ mức độ phát triển của các tế bào biểu mô giống các tế bào bình
thường cả về hình thức và chức năng. U biệt hóa cao là u gồm những tế bào giống
các tế bào của mô sinh ra u. Nói chung các u lành tính đều biệt hóa cao.
Các u ác tính xếp từ biệt hóa cao đến không biệt hóa. Các u ác tính gồm những
tế bào không biệt hóa được gọi là mất biệt hóa (anaplasia). Sự mất biệt hóa được
coi là dấu ấn của chuyển dạng ác tính. Sự mất biệt hóa được đánh dấu bởi một số
thay đổi về hình thái và chức năng như cả tế bào và nhân tế bào đều biểu hiện đa
hình thái – thay đổi về kích thước và hình dạng. Các tế bào có thể lớn hơn nhiều lần
những tế bào kế cận cùng loại trong khi các tế bào khác có thể cực kỳ nhỏ, dạng
nguyên thủy.
Một hình ảnh khác của sự mất biệt hóa là sự tạo thành những tế bào khổng lồ,
một số tế bào có một nhân đa dạng khổng lồ duy nhất và một số khác có hai hay
nhiều nhân. Trong tế bào khổng lồ ung thư, nhân tế bào tăng sắc và lớn so với tế
bào. Ngoài các bất thường về tế bào học mô tả trên, sự phân cực của các tế bào mất
biệt hóa bò rối loạn rõ rệt. Các dải hoặc các khối lớn tế bào u phát triển vô tổ chức.
Mặc dù các tế bào đang phát triển này đòi hỏi được cung cấp máu, nhưng do mô
đệm huyết quản nghèo nàn nên vùng trung tâm u thường bò hoại tử vì thiếu máu.

1.2.2. Sinh sản của tế bào ung thư

1.2.2.1. Sự bất thøng của nhân và các nhiễm sắc thể

Trong các tế bào ung thư có thể biểu hiện các dạng bất thường của phân chia
như không có thoi vô sắc có thể dẫn đến chết tế bào hoặc nhiều nhân chia nhỏ.
Nhân chia với nhiễm sắc thể cực có đặc điểm là còn tồn tại trong gian kỳ, một vài
nhiễm sắc thể không được huy động đến gần một hoặc hai trung thể có thể dẫn đến
chết tế bào hoặc tạo thành hai nhân có số nhiễm sắc thể không đều. Tuy nhiên
những dấu ấn đặc hiệu của tế bào ung thư thường biểu hiện ở sự bất thường nhiễm
sắc thể.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
6

Các phương pháp xét nghiệm gần đây còn cho phép nhận biết những bất thường
nhiễm sắc thể của các dạng u khác nhau. Ví dụ như nhiễm sắc thể Ph1 quan sát thấy
trong bệnh bạch cầu loại tủy mãn tính. Các u nguyên bào võng mạc là do sự thiếu
hụt một phần nhiễm sắc thể 13. Phần lớn các trường hợp u màng não thiếu hoàn
toàn hay một phần nhiễm sắc thể 22.

1.2.2.2. Quan niệm đơn dòng

Ngày nay người ta cho rằng một ung thư phát triển từ một tế bào chuyển dạng.
Thực ra người ta không thể xác đònh một ung thư trên vi thể trước khi nó đã tạo
thành nhiều tế bào, nhưng có nhiều bằng chứng chứng minh rằøng ung thư là một
quần thể tế bào đồng nhất, một dòng tế bào. Ví dụ như sự chế tiết globulin miễn
dòch đơn dòng trong các u tương bào và trong các u lympho tế bào B, tất cả các tế
bào u chỉ chế tiết một dạng duy nhất của globulin miễn dòch.

Người ta cũng thấy rằng hiện tượng ghép một tế bào duy nhất có thể có hiệu quả
trong một số ung thư thực nghiệm (bệnh bạch cầu chuột). Trong quá trình tiến triển
của u, quần thể tế bào ung thư chòu những đột biến mới. Sự tiến triển dòng này biểu
hiện bởi sự xuất hiện những chủng bất thường hơn, có tính chất xâm lấn hơn và đề
kháng hơn với các biện pháp điều trò.

1.2.2.3. Thời gian nhân đôi u

Thời gian nhân đôi u là thời gian trung bình cần thiết để tăng gấp đôi số lượng tế
bào ung thư. Người ta có thể đo trên nuôi cấy hoặc tính trên vivo từ khối lượng u.
Thời gian nhân đôi là một tháng cho những u phôi, hai đến ba tháng cho những ung
thư biểu mô dạng biểu bì, bốn đến sáu tháng cho những ung thư biểu mô dạng
tuyến, bốn đến mười hai tháng cho những u tủy.
Có mối liên hệ giữa thời gian nhân đôi và sự phát triển của u. Thời gian nhân
đôi ngắn u phát triển nhanh, thời gian nhân đôi dài u phát triển chậm, không có thời
gian nhân đôi u ngưng phát triển. Trong phần lớn thời gian phát triển khối u, thời
gian nhân đôi luôn hằng đònh và sẽ càng dài hơn khi u đã phát triển lớn.
Thời gian nhân đôi trước hết phụ thuộc vào hệ số tăng sinh, hệ số mất tế bào.
Hệ số tăng sinh biểu lộ tỷ lệ các tế bào trong chu kỳ. Hệ số mất tế bào biểu lộ tỷ lệ
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
7

phần trăm các tế bào bò mất đi do hoại tử hoặc do bong. Cũng cần phải nhấn mạnh
rằng ở các mô bình thường sự mất tế bào là 100%, số tế bào sinh ra không nhiều
hơn tế bào mất đi – đó là sự cân bằng nội mô của mô. Trong ung thư hệ số tăng sinh
tế bào thường tăng cao nhất trong khi sự mất tế bào cũng trầm trọng nhất. Trong các
dạng ung thư, các u mất biệt hóa nhất cũng là các u có tốc độ phát triển và hệ số
tăng sinh cao nhất.
Trong các tế bào ung thư thời gian trung bình của một chu kỳ tế bào là một đến

ba ngày, pha S có thời gian khá hằng đònh (trung bình 16 giờ) nhưng pha G1 hay
thay đổi nhiều hơn. Chu kỳ của tế bào ung thư không ngắn hơn chu kỳ của các tế
bào bình thường, thậm chí chậm hơn do sự kéo dài của phân bào nguyên nhiễm. Ví
dụ chu kỳ của các nguyên bạch cầu của bệnh bạch cầu cấp là 50-60 giờ, trong khi
chu kỳ của các nguyên bào tủy bình thường là 24 giờ.

1.2.3. Nguyên nhân gây ra ung thư

Ngày nay cuộc chiến chống ung thư trên thế giới được tiến hành toàn diện trên
nhiều mặt. Những nghiên cứu thực nghiệm và dòch tễ đã đóng góp lớn lao trong việc
xác đònh một số nguyên nhân chủ yếu của ung thư ở người. Các nhà khoa học đã
chứng minh rõ ràng rằng sự phát triển ung thư thường là kết quả từ sự tiếp cận với
nhiều yếu tố rủi ro trong môi trường sống.
Hiện nay, theo đánh giá của IARC (International Agency for Resarch on Cancer-
1998) có 75 tác nhân được kết luận gây ung thư cho con người. Nhóm tác nhân gây
hư hại về di truyền và gây chuyển dạng u của tế bào thuộc các loại sau đây: (1) chất
gây ung thư hoá học, (2) năng lượng tia, (3) vi khuẩn sinh ung thư, chủ yếu là các
virút. Mỗi nhóm tác nhân có đặc điểm riêng, nhưng nhiều tác nhân có thể cùng tác
động và làm tăng hiệu quả các tác nhân khác.
Các tác nhân gây ung thư làm thế nào để gây được ung thư. Như chúng ta đã biết
hầu hết ung thư là kết quả từ nhiều dạng thay đổi di truyền. Các thay đổi này là kết
quả từ hàng chục năm tiếp xúc với các tác nhân ung thư có ảnh hưởng gây đột biến.
Nói chung khi tỷ lệ phân bào càng cao thì xác suất sinh đột biến càng cao do hệ quả
từ dễ sinh nhầm lẫn trong tự nhân đôi và tổ hợp lại DNA. Một vài tác nhân gây ung
thư dường như có cả hai tác dụng đó. Chẳng hạn các hocmon gây ra ung thư vú và
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
8

ung thư tử cung vừa gây ra tăng phân bào vừa có thể gây ra các thay đổi di truyền sẽ

dẫn đến ung thư.
Những năm gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu và biết được nhiều tập tính
hoạt động gây bệnh của các tế bào ung thư. Như việc nhiễm virút viêm gan B kéo
dài có thể sinh ung thư gan. Nhiễm virút u nhú (papilloma) gây ra u nhú ở bộ phận
sinh dục có thể dẫn đến ung thư cổ tử cung. Virút gây ung thư trở thành một dạng
thường trú trong các tế bào vật chủ, thường do chèn nhân acid nucleic vào trong
DNA của các thể nhiễm sắc vật chủ.
Theo Zibbert, virút sau khi xâm nhập tế bào đã làm thay đổi đặc tính di truyền
của tế bào gây rối loạn phân bào. Do đó tế bào tăng sản hỗn loạn và mang những
đặc tính di truyền mới. Ở bên trong tế bào, virút đã mất hết hình thái bình thường
nên không được phát hiện nữa. Chất màu của acid nucleic của virút đã hoà nhập kết
hợp với chất màu của tế bào, một DNA được hình thành mang tính chất của tế bào
ung thư. Tế bào bệnh đó tiếp tục nhân lên mà không cần sự hiện diện của virút nữa.
Thống kê các ca ung thư liên quan đến virút chiếm khoảng 15% các dạng ung thư
người trên toàn thế giới.
Tuy nhiên còn rất lâu chúng ta mới biết hết được các nhân tố đã góp phần gây
ung thư. Các nhà khoa học đang tiếp tục tìm kiếm những tác nhân bí ẩn này bằng
phương pháp dòch tễ học.

1.3. CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA UNG THƯ

Tất cả sinh vật sống đều được cấu tạo từ tế bào. Một số loài sinh vật, ví dụ như
vi khuẩn, có thể tồn tại như sinh vật đơn bào. Những sinh vật khác, bao gồm cả động
vật hữu nhũ được cấu tạo từ vô số tế bào, tất cả tế bào kết hợp với nhau để tạo nên
một sinh vật sống. Nhiều tế bào cấu tạo thành mô như mô liên kết, mô cơ, nhiều mô
cấu tạo thành cơ quan như gan, phổi. Ngoài ra cơ thể người còn phụ thuộc vào
những tế bào nhỏ chuyên biệt, chúng sẽ cấu tạo nên những cơ quan chuyên biệt như
tim hay phổi. Như vậy, sự hoạt động của tế bào giúp duy trì sự sống. Tuy nhiên
trong trường hợp ung thư, sự thay đổi chức năng và cấu trúc của tế bào là nguyên
nhân chính.

1.3.1. Các gen gây ung thư (oncogen)

Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
9


Theo quan điểm hiện nay ung thư được xem là bệnh của gen bởi vì người ta phát
hiện ra hàng loạt các gen gây ung thư (oncogen) và gen ức chế ung thư
(antioncogen) có trong tế bào. Khi các gen này bò biến dò thì dễ dẫn đến ung thư.
Gần 50% các ung thư đã được nghiên cứu, chẩn đoán bằng sự biến dò của một gen là
gen p.53. P.53 là một antioncogen hay còn gọi là gen ức chế ung thư.
Các nhà khoa học đã chứng minh rằng trong cơ thể lành mạnh của con người có
chứa tiền gen kích thích sự phát triển (growth promoting protoocogen) hay còn gọi
là tiền gen gây u. Đó là gen cần thiết cho việc hài hoà sự sống.
Vai trò chuẩn mực của các tiền gen gây u trong tế bào là gì? Nhiều tiền gen gây
u mã hóa cho các nhân tố loạn sinh trưởng – các protein kích thích phân bào hoặc
mã hóa cho các protein khác ảnh hưởng đến tổng hợp hay chức năng của các nhân
tố sinh trưởng. Khi chúng thể hiện chức năng bình thường, đúng lượng phù hợp, vào
đúng lúc cần thiết thì các protein này kiểm soát phân bào và kiểm soát sự phân hóa
đúng chuẩn mực.
Để một tiền gen gây u chuyển thành gen gây u phải có một thay đổi hoặc một
đột biến xảy ra trong DNA của tế bào. Có thể là do một nhiễm sắc thể bò chuyển
đổi vò trí. Sự chuyển vò xảy ra khi các nhiễm sắc thể trao đổi lẫn nhau các mảng nhỏ
của chúng. Thí dụ sự biến hình ác tính trong bệnh bạch cầu tủy thì liên quan đến sự
chuyển vò trí protooncogen từ vò trí bình thường ở thể nhiễm sắc 9 lên thể nhiễm sắc
22. Đó thực ra là một nhiễm sắc thể phối hợp gồm thân là nhiễm sắc thể số 9, trên
đó một mảnh cuối của nhiễm sắc thể 22 gắn vào. Protooncogen myc trong ung thư
lymphoma Burkitt là do chuyển vò trí thể nhiễm sắc 8 lên 14.

Ở một trường hợp khác là sự đột biến trên DNA, một nhầm lẫn trong tự nhân đôi
DNA hoặc trong tái tổ hợp phát sinh khi nhân bản các gen đã được sao mã hay dòch
mã toàn bộ, hậu quả là quá thừa protein kích thích phân bào so với mức chuẩn.
Trong các trường hợp này mức biểu hiện gen chuẩn bò thay đổi và tế bào bò kích
thích sinh sôi nẩy nở một cách tùy tiện.
Hiện nay các oncogen tạo ra các protein tham gia kiểm tra sự lớn lên của tế bào
có thể được phân loại theo chức năng như sau:
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
10

Nhóm thứ nhất là gen mã hóa cho các yếu tố tăng trưởng như sis, int-2. Những
oncogen yếu tố tăng trưởng này có thể kích hoạt sự nhân lên của tế bào nhưng
không đủ khả năng gây nên thay đổi về kiểu hình..
Nhóm thứ hai của oncogen mã hóa cho các thụ thể của yếu tố tăng trưởng nhiều
thụ thể trong số đó gắn với hoạt tính tyrosine kinase.
Nhóm thứ ba là các thụ thể không có hoạt tính tyrosine kinase đó là sản phẩm
gen mas.
Nhóm thứ tư là các họ protein gắn trên màng như ras.
Nhóm thứ năm là những oncoprotein trong tế bào chất với hoạt tính
serine/threonine kinase gồm có sản phẩm raf, pim-1, mos và cot.
Nhóm thứ sáu gồm các oncogen mã hóa cho các yếu tố điều hoà trong tế bào
chất.
Nhóm thứ bảy, một nhóm oncogen lớn mã hóa cho những yếu tố phiên mã ở
nhân như myc, myb, fos, jun, rel.

1.3.2. Các gen ức chế ung thư (antioncogen)

Trong khi các tiền gen u mã hóa các protein khởi động sự phát triển tế bào, thì
các sản phẩm của các gen ức chế khối u có chức năng là điều hòa sự phát triển tế

bào. Sự đột biến hay mất gen ức chế khối u có thể gây ra ung thư. Trong bệnh bướu
nguyên bào võng mạc, một loại ung thư của trẻ em mang tính di truyền, gần đây các
nhà khoa học đã khám phá ra được nguyên nhân là do mất một đoạn của nhiễm sắc
thể 13. Đoạn bò mất đó mang các gen kiềm chế không cho các oncogen của ung thư
này phát triển.
Thêm nhiều bằng chứng xác nhận rằng bất kỳ đột biến nào ngăn chặn gen triệt
khối u đều góp phần gây loạn phát phân bào, tức không kiểm soát nổi mức phân
bào chuẩn mực và có thể sinh ra một tế bào ung thư.
Ở ung thư đại tràng như ở nhiều dạng ung thư khác ở người, người ta nhận thấy
quá trình di căn của một ung thư đại tràng phát triển từ từ qua ba chặng. Dấu hiệu
đầu tiên là trong các tế bào bình thường của biểu mô lót đại tràng xuất hiện tần số
phân bào bất thường. Sau đó xuất hiện một u lành (chồi polip) trong vách đại tràng.
Và cuối cùng xuất hiện một khối u ác tính. Những thay đổi ở mức tế bào này diễn ra
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
11

song song với ba thay đổi ở mức độ DNA bao gồm sự hoạt hóa của một gen gây u
trong tế bào và sự vô hiệu hóa của hai gen ức chế khối u.

1.3.2.1. Gen Rb


Gen làm phát triển bướu nguyên bào võng mạc (retinoblastoma) ở người được
gọi tên là gen Rb (retinoblastoma supectability gene). Đột biến ở gen Rb làm phát
triển dạng ung thư khác ở người như sacôm xương (osteosarrcom). Khác với bệnh
retioblastoma do di truyền, những đột biến của Rb thøng xuất hiện ở tế bào sinh
dưỡng hơn là do di truyền từ bố mẹ. Retinoblastoma tạo ra do đột biến hai lần ở
phạm vi gen Rb của thể nhiễm sắc 13.
Thông qua các nghiên cứu người ta biết sản phẩm protein của gen Rb tham gia

trong điều hòa tăng trưởng tế bào.

1.3.2.2. Gen p53

Gen này nằm trên nhánh ngắn của thể nhiễm sắc 17. Protein p53 có vai trò ngăn
cản sự lan tràn của các tế bào bò hư hại về di truyền. Protein p53 khu trú ở trong
nhân tế bào và khi tác động, nó có chức năng đầu tiên là kiểm soát sự phiên mã cả
các gen khác. Sự biến đổi p53 xảy ra ở gần một nửa số ung thư ở người. P53 được
huy động để làm ngừng sự hư hại DNA và hỗ trợ cho việc sửa chữa DNA bằng cách
gây dừng ở G1 và kích thích các gen DNA được sửa chữa. Một tế bào có DNA bò hư
hại nếu không được sửa chữa sẽ được p53 điều khiển đi vào chết tế bào theo chương
trình.
Do các hoạt động này p53 đáng được gọi là “người canh gác bộ gen”. Nếu mất
đồng hợp tử của gen p53, tổn hại p53 không được sửa chữa, đột biến trở thành cố
đònh trong các tế bào đang phân chia và tế bào sẽ chuyển dạng sang ác tính, đặc
biệt là ở mô liên kết.
Gen p53 đã được phát hiện gần 20 năm nay và được xem là gen duy nhất giữ vai
trò trung tâm trong cơ chế gây bệnh ung thư.

1.3.2.3. Gen p73

Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
12

Đến cuối năm 1977, các nhà nghiên cứu phát hiện ra gen p73, gen này mã hóa
một protein mang nhiều đặc điểm tương tự như gen p53. Gen p73 có một vùng gắn
DNA giống một vùng tương ứng của p53, nó có thể gây dừng chu kỳ tế bào và gây
chết tế bào theo chương trình trong những điều kiện thích hợp.
Nhiều nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào gen họ hàng của p53 này. Gen

p73 phổ biến trong nhiều loại u như u nguyên bào thần kinh, ung thư đại tràng.
1.3.3. Gen điều hoà chết tế bào theo chương trình


Sơ đồ 1: Hiện tượng chương trình hóa sự chết tế bào

Apoptosis – là hiện tượng chương trình hóa sự chết của tế bào (programmed
cell death – PCD) – hiện tượng này trở nên cần thiết trong giai đoạn phát triển nào
đó của tế bào. Người ta cũng quan sát thấy hiện tượng này trong ung thư như giết tế
bào ung thư bằng tế bào NK (natural killers) hay bằng tế bào độc cũng như tế bào
lymphocyt độc phủ kháng thể. Nhưng tế bào ung thư dễ đi vào apoptosis là khi gây
ra DNA hư hại được quyết đònh sự có mặt trong chuyển dạng biến dò của gen p53
hoặc sử dụng các thuốc ở pha G
1
hoặc các tia ở pha G
2
.
Cơ chế điều hòa vòng tế bào pha p53 chưa được biết chính xác nhưng có lẽ nó là
chất điều hòa sao mã của các gen tham gia photphoryl hóa nhiều chỗ qua nhiều
enzym kinaza, ví dụ kinaza cdk1 (cell division kinase) làm photphoryl hóa protein
p53, p73 vò trí Ser-315. Khi được photphoryl hóa, p53 cũng có ảnh hưởng đến các
protein biến dạng của các virút gây ung thư loại DNA. Chính chỗ này p53 có thể

Chiếu xạ Bax Apoptosis

Chemo’s p53 Bcl-2

Oncogens p21 Chu trình tế bào
E1A, tTAg, Gadd45
c-myc

Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
13

đóng vai trò chủ yếu trong điều hòa lớn lên, biệt hóa và sự chết tế bào theo chương
trình đònh sẵn.
Sự biểu hiện gen của protein p53 được điều hòa qua nhiều kháng nguyên, trong
đó kháng nguyên PCNA (proliferation cells nuclear antigen). Kháng nguyên này là
cofactor của enzym polymeraza sao chép S. Bởi vậy khi giảm hoạt tính p53 thì
phong bế sự đi vào pha S của chu kỳ phân chia tế bào.
Cuối cùng, người ta phát hiện protein kìm hãm hoạt tính các kinaza cdk khác
nhau được gọi là CKI (cyclin dependent kinases inhibitors) và quan trọng nhất trong
chúng là p21 – sản phẩm của gen ở đỉnh 1 (p53 mediated inhibitor of cdk).
Một chất ức chế kinaza cdk khác nhau là protein p16 INK 1 (Inhinitor of cdkS),
gen mã hóa nó khu trú trong nhiều dòng tế bào ung thư. Gen này kìm hãm nhiều
ung thư mang tên MTS 1 (multiple tumor suppressor 1) hay CDK 4 I (CDK 4
inhibitor).
Kiến thức có liên quan tới cơ chế apoptosis tế bào ung thư rất cần trong nghiên
cứu điều trò ung thư. Cũng cần nhớ rằng gen p53 có thể hợp tác với gen Rb trong
cảm ứng apoptosis và biến hình ung thư.
Hiểu biết về gen p53 và gen Rb bình thường, người ta có thể tách dòng (cloning)
chúng để dùng trong điều trò ung thư, đó là một trong những vấn đề hấp dẫn của
sinh học phân tử.

Sơ đồ 2: Vai trò của Protein p.53
Protein p.53


Kích thích tổng hợp p.21 Phong bế Kìm hãm GTP
(ức chế cdk) Sao chép AND Kìm hãm gen điều hòa

Kích thích gen ức chế tăng trưởng dương tính
tăng trưởng tế bào

Làm ngừng sinh sản tế bào ở giai đoạn G
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
14


Ngày nay đã xác đònh được rằng các gen đề phòng hay gây chết tế bào theo
chương trình cũng tham gia tạo những biến đổi quan trọng trong sự cân bằng ung
thư. Một nhóm lớn các gen điều hòa chết tế bào theo chương trình đã được xác đònh,
các gen này được ghi nhớ bằng các nhóm ba chữ bắt đầu bằng chữ b.
Gen chống chết tế bào theo chương trình lần đầu tiên đã xác đònh, bcl-2 là một
thành phần của một nhóm lớn protein homodime và heterodime hóa, một số protein
này ức chế tế bào chết theo chương trình (như chính bcl-2 và bcl-xL) trong khi các
gen khác (như bax, bad, và bcl-xS) tạo điều kiện cho tế bào chết theo chương trình.
Việc phát hiện ra gen bcl-2, một gen prototyp trong loại này bắt đầu với nhận
xét là khoảng 85% các u lympho tế bào B của loại nang có mang một chuyển đoạn
điển hình t(14:18)(q22:q21). Cần nhắc lại rằng 14q32 là vò trí các gen chuỗi nặng
của globulin miễn dòch cũng liên quan đến u lympho Burkitt. Việc xếp cạnh vò trí
hoạt động phiên mã với bcl-2 (khu trú ở 18q21) gây bộc lộ quá mức bcl-2.
Theo những cơ chế chưa biết rõ, việc bộc lộ quá mức bcl-2 bảo vệ các lympho
bào khỏi bò chết theo chương trình và cho phép chúng sống lâu dài, vì vậy gây nên
sự tích lũy quá mức của lympho bào B, gây bệnh hạch và xâm nhập tủy xương. Vì
các u lympho bộc lộ quá mức bcl-2 phần lớn phát sinh là do giảm chết tế bào theo
chương trình hơn là do bùng nổ tăng sinh tế bào, nó có xu hướng lành tính (phát
triển chậm) so với phần lớn các u lympho khác.
Chứng minh cho vai trò của bcl-2 trong tạo u lympho là nhận xét rằng chuột
chuyển gen với bcl-2 phát sinh u lympho tế bào B. Không chỉ chức năng của bcl-2 là

bất thường mà sự khu trú của nó cũng khác với hầu hết các gen ung thư khác. Nó
nằm ở lá ngoài của màng ty thể, lưới nội nguyên sinh và màng nhân. Sự đònh vò ty
thể của gen bcl-2 và các thành viên khác của họ bcl-2 cũng biểu hiện chức năng của
các gen này.
Cơ sở sinh hóa của hoạt động bcl-2 chưa được hoàn toàn hiểu biết rõ. Chết tế
bào theo chương trình là điểm cuối cùng của chuỗi các sự kiện phân tử gây nên bởi
nhiều kích thích và về sau dẫn đến sự hoạt hóa các men thuỷ phân protein gây chết
tế bào (men caspase). Các thành viên của họ bcl-2 ảnh hưởng một cách chính xác
tới sự hoạt hoá của các caspase như thế nào đang được khảo sát tường tận.
Trong nhiều mô hình chết tế bào theo chương trình, việc giải phóng cytochrom C
khỏi ty thể là bước quan trọng trong chuỗi các sự kiện dẫn đến chết tế bào theo
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
15

chương trình. Một chức năng của cytochrom C đïc giải phóng hình như là hỗ trợ
cho sự hoạt hoá men caspase 9 phân hủy protein. Khu trú một cách chiến lược ở
màng ngoài ty thể bcl-2 và yếu tố tương đồng của nó được cho là có vai trò điều hoà
sự đi ra của cytochrom khỏi nhiễm sắc thể vào trong bào tương tế bào.
Sự đi ra của cytochrom C này được điều hoà một cách chính xác như thế nào thì
chưa được biết rõ, nhưng có một số bằng chứng là bax, một thành viên trước chết tế
bào theo chương trình của họ bcl-2 tạo thành một kênh trong màng nhiễm sắc thể
cho phép sự đi ra của cytochrom C (và vì vậy dẫn đến chết tế bào theo chương
trình), trong khi bcl-2 phong tỏa hoạt động tạo kênh của bax.
Các thành phần trước chết tế bào theo chương trình và chống chết tế bào theo
chương trình của họ bcl-2 tác động như một cái biến trở trong điều hoà chết tế bào
theo chương trình. Tỷ lệ của các chất chống chết (bcl-2, bclXL) với chất gây chết
(bax, bcl-xS, bad, bid) sẽ quyết đònh một tế bào đáp ứng với một kích thích chết tế
bào theo chương trình như thế nào. Cái biến trở này sẽ hoạt động ít nhất một phần
do sự dime hóa cạnh tranh giữa các thành phần khác nhau của các nhóm chất. Vì

vậy trong khi các homodime của bcl-2 tạo điều kiện cho sự sống sót của tế bào (có
lẽ do sự thay thế bax tạo kênh từ màng ty thể), các homodime bax tạo thuận lợi cho
chết tế bào theo chương trình.
Cuối cùng mặc dù họ bcl-2 của các gen bcl-2 đóng vai trò quan trọng trong điều
hoà chết tế bào theo chương trình, ít nhất có hai gen kết hợp với ung thư khác cũng
liên quan đến chết tế bào theo chương trình là gen p53 và protooncogen c-myc. Cơ
chế phân tử của chết tế bào theo chương trình gây nên do hai bước cắt ngang của
đường bcl-2. Gen c-myc gây chết tế bào theo chương trình khi các tế bào bò điều
khiển bởi hoạt hóa c-myc, nhưng sự phát triển được giới hạn bởi khả năng giới hạn
của các yếu tố môi trường.
Khi đối mặt với các tín hiệu như vậy, tế bào được lập chương trình chết bởi điều
hoà tăng p53 và các tín hiệu chưa được xác đònh khác. Biểu lộ quá mức của bcl-2 có
thể giải thoát cho tế bào không bò chết theo chương trình gây nên do c-myc. Vì vậy
hình như myc và bcl-2 có thể hợp tác trong tạo u - c-myc kích thích sinh sản và bcl-2
ngăn cản chết tế bào ngay cả khi các yếu tố phát triển trở nên bò hạn chế. Đây là
một trong nhiều ví dụ trong đó hai hay nhiều gen ung thư hợp tác để gây phát sinh
ung thư.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
16


1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO UNG
THƯ

1.4.1. Lòch sử phát triển nuôi cấy của tế bào ung thư

Khoa học về nuôi cấy mô và tế bào đã phát triển một cách vững chắc trong suốt
thế kỷ 20. Từ những năm 1885, Wilhelm Roux ghi nhận rằng phôi gà có thể phát
triển ở dung dòch muối sinh lý trong vài ngày. Nhiều thử nghiệm trước đó cũng

chứng minh rằng mô của các loài động vật lưỡng cư có thể tái sinh trong quá trình
nuôi cấy. Năm 1887 Arnold cho rằng các lymphô bào của ếch cũng có thể sống
trong dung dòch muối sinh lý. Ngay sau đó vào 1998 Ljunggren chứng minh tế bào
da của người có thể phát triển nếu được nuôi cấy trong dung dòch asetic.
Mặc dù đã có những nghiên cứu trước nhưng người được xem là cha đẻ của
phương pháp nuôi cấy mô là Ross Harrison. Harrison lấy mô từ phôi ếch đưa vào
hạch bạch huyết thì các mảnh mô không chỉ có khả năng sống sót mà còn phát triển
thành các mạng lưới. Các thí nghiệm trên bước đầu đã tạo nên làn sóng chú ý về
nuôi cấy mô in vitro, đồng thời sự thúc đẩy của y học buộc người ta quan tâm đến
các loài vật ổn nhiệt và có quá trình phát triển bình thường và bệnh lý gần giống
người.
Năm 1943, Wilton Earle - người đầu tiên tiến hành thí nghiệm về dòng tế bào
liên tục ở loài gặm nhấm từ một tế bào tách rời. Năm 1951, Geogre Gey thiết lập
dòng tế bào ung thư từ cổ tử cung người (Hela). Năm 1961, Hayflick và Moorhead
đã thực hiện những nghiên cứu về tế bào bình thường có đời sống xác đònh.

1.4.2. Một số phương pháp tách tế bào ung thư từ khối u

1.4.2.1. Phương pháp tách tế bào ung thư từ khối u cứng hay khối u di căn

Hiện nay để có thể thu nguồn mẫu ung thư, đặc biệt là từ các khối u cứng hay
khối u di căn từ cơ thể bệnh nhân bò ung thư đều phải được tiến hành phẫu thuật tại
các bệnh viện. Nguồn mẫu sau khi thu sẽ được giữ trong bình hoặc lọ chứa sẵn môi
trường nuôi cấy thích hợp (như RPMI 1640, DMEM …), đồng thời phải được giữ
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
17

trong điều kiện lạnh như ướp đá, hoặc tốt nhất là được giữ trong nitơ lỏng vì điều
này sẽ giúp duy trì được đặc tính tế bào.

Quá trình thu mẫu và xử lý mẫu phải được tiến hành nhanh chóng. Mẫu sau khi
thu sẽ được tiến hành xử lý tại phòng thí nghiệm. Quá trình xử lý mẫu phải được
thao tác trong điều kiện vô trùng. Sau khi lựa chọn phần mô còn sống và loại bỏ
phần mô hư hoặc chết, phần mô sống còn lại sẽ được rửa qua nhiều lần bằng dung
dòch muối sinh lý có chứa kháng sinh hoặc dung dòch HBSS – Hank’s balanced salt
solution để loại bỏ bớt máu. Sau đó cắt khối mô ra thành từng mảnh nhỏ (1-2 mm
3
),
thường được tiến hành trên đóa petri. Sau khi thêm vào đóa petri một ít dung dòch
nuôi cấy (1 – 2ml), dùng pipet hoặc pastette để chuyển các mảnh mô từ đóa petri
vào bình nuôi cấy, để trong tủ nuôi khoảng từ 2 – 3 giờ, điều này sẽ giúp cho sự
bám của tế bào vào bình nuôi cấy tốt hơn. Thêm vào 5 – 10ml, để yên bình nuôi
cấy cho đến từ 72 – 96 giờ. Sau nhiều ngày nuôi cấy, tế bào phát triển bám dính vào
thành bình và khi đến mật độ cần thiết sẽ được tiến hành cấy chuyền.
Đây là một trong những phương pháp ít làm tổn thương đến tế bào nhất, thời
gian thao tác ngắn, đồng thời dễ dàng thao tác. Nhưng điều cần lưu ý là thao tác
phải chuẩn, những mẫu mô phải được cắt nhỏ, quá trình thí nghiệm phải được tiến
hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối để tránh sự nhiễm.


1.4.2.2. Phương pháp tách tế bào ung thư từ mẫu dòch của cơ thể

Phương pháp này thường được sử dụng để tách tế bào từ những mẫu dòch của cơ
thể như: dòch màng bụng, dòch màng phổi…
Các mẫu dòch được thu tại bệnh viện và đem về xử lý tại phòng thí nghiệm vô
trùng, tùy theo mẫu dòch lấy với thể tích khác nhau. Đem mẫu dòch đi ly tâm,
khoảng 3000g/ 20 phút. Loại bỏ dung dòch nổi, huyền phù phần cặn với dung dòch
muối sinh lý PBS. Nếu mẫu chứa số lượng tế bào máu nhiều ta có thể loại bỏ bằng
phương pháp ly tâm với dung dòch Ficoll. Khoảng 10ml dung dòch tế bào huyền phù
với PBS hoặc HBSS cho vào dung dòch Ficoll, ly tâm khoảng 1000g/ 20 – 30 phút.

Các tế bào hiện diện trong phần dung dòch đệm, đem ly tâm khoảng 600g/ 5 phút.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
18

Quá trình này lập lại cho đến khi thu được hết phần tế bào còn lại. Toàn bộ phần tế
bào thu được sẽ được huyền phù với môi trường nuôi cấy và chuyển vào đóa nuôi.

1.4.2.3. Phương pháp tách tế bào bằng enzym

Sử dụng enzym để tách tế bào từ những mô sống là một trong những phương
pháp phổ biến nhất. Hiện nay một số enzym được sử dụng trypsin, collagenase,
hyaluronidase, elastase, dipase, và papain … tùy thuộc vào mẫu mô để chọn enzym
và nồng độ enzym thích hợp nhằm có thể tách được tế bào và đồng thời không ảnh
hưởng đến sự phát triển của chúng.
Chẳng hạn trypsin là một enzym được sử dụng phổ biến trong việc tác tế bào
động vật với hai quy trình:
(1) Quy trình trypsin ấm
- Cắt nhỏ khối mô thành những mảnh nhỏ khoảng 2 – 3mm
3
.
- Thêm dung dòch trypsin vào (1g khối mô/ 10ml trypsin), nồng độ trypsin thường
được sử dụng là 0,25% (hoặc có thể là 0,05%, 0,015%), hoặc có thể thêm vào
chất nền EDTA (0,01% -0,02%),.
- Khuấy từ ở nhiệt độ 37
o
C. Để đạt được mật độ tế bào cần thiết thì thời gian
khuấy có thể từ 15 – 45 phút.
- Đem đi ly tâm, 600g/ 5 phút, loại bỏ phần nổi, thêm môi trường vào chuyển tế
bào vào bình nuôi cấy.

- Quá trình này lập lại cho đến khi thu được hết phần tế bào còn lại.
(2) Quy trình trypsin lạnh
Có thể ủ các mảnh mô nhỏ trong dung dòch trypsin ở nồng độ thích hợp, tại nhiệt
độ khoảng 4
o
C, điều này sẽ giúp cho việc tách tế bào dễ dàng và ít ảnh hưởng đến
tế bào. Sau 6 – 8 giờ, giải đông khoảng 30 phút ở nhiệt 37
o
C. Sau khi ly tâm loại bỏ
phần nổi, thêm vào môi trường nuôi cấy.

1.4.3. Những kỹ thuật cần thiết cho việc nuôi cấy tế bào

Ngày nay việc nuôi cấy tế bào đã được thực hiện rộng khắp trên thế giới. Hơn
50 năm kể từ lần đầu tiên công bố sự xuất hiện dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở
người (Hela), đến nay các nhà nghiên cứu đã thiết lập khoảng 3.000 dòng tế bào
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
19

ung thư và có 1000 dòng được sử dụng thường xuyên, phần lớn có nguồn gốc từ ung
thư ở người.
Đây là nguồn mẫu cần thiết cho các phân tích sinh hóa của tế bào ung thư. Điều
này mở ra cơ hội cho các nhà khoa học có điều kiện nghiên cứu, tìm hiểu sâu hơn
về các đặc tính sinh học đồng thời xác đònh và mô tả đặc điểm của tế bào ung thư.
Với mục đích sử dụng các dòng tế bào này để nghiên cứu hoạt tính của các hoạt
chất kháng ung thư trong điều kiện in vitro, sản xuất vaccin điều trò.
Mặc dù những dữ liệu có được từ các phòng thí nghiệm vẫn cần phải được xem
xét một cách thận trọng, nhưng vai trò thực tiễn của việc nuôi cấy của các dòng tế
bào ung thư trong nghiên cứu và điều trò bệnh ung thư đã được thừa nhận.

1.4.3.1. Môi trường nuôi cấy


Hiện nay người ta sử dụng môi trường nuôi cấy tổng hợp đã được phát triển từ
những năm 1950. Các chất cơ bản có trong môi trường nuôi cấy bao gồm amino
acid, carbohydrat, Vitamin, và muối.
Huyết thanh và các thành phần khác như yếu tố tăng trưởng hocmon được thêm
vào môi trường cơ bản để cung cấp những chất cần thiết cho tế bào phát triển. Môi
trường nuôi cấy đầu tiên là môi trường BME (Eagle’s basal medium), đây là môi
trường do Harry Eagle thiết lập có thể sử dụng cho cả tế bào bình thường và tế bào
khối u. Môi trường phát triển tiếp theo sau được gọi là môi trường tối thiểu MEM
(Eagle’s minium essential medium) cũng do Harry Eagle thành lập, MEM này được
tăng cường thêm hàm lượng amino acid. Trong khi đó thì môi trường DMEM
(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) do Dulbecco cải tiến, trong đó các thành
phần của amino acid và Vitamin tăng gấp 4 lần, glucose tăng 4,5 lần.
Môi trường IMDM (Iscove’s modified Dulbecco medium) do Iscove thiết lập
trên cơ sở cải tiến môi trường DMEM. Môi trường này chứa selenium, amino acid,
vitamin, sodium pyruvate, dung dòch đệm HEPES. Môi trường GMEM (Glasgow
minium essential medium) là sự biến đổi khác của môi trường Eagle dùng để nghiên
cứu các yếu tố gây ảnh hưởng đến tế bào. Môi trường này có chứa amino acid và
vitamin cao gấp hai lần so với môi trường Eagle.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
20

Năm 1950, Morgan và đồng sự đã cho biết môi trường có thể hổ trợ cho các mô
phát triển, đó là môi trường 199, chứa nhiều thành phần có thể tìm thấy ở môi
trường Eagle và có thể sử dụng cho nhiều loại tế bào khác nhau.
Một môi trường khác ít phức tạp hơn là CMRL 1066 được thiết lập tại Connaught

Medical Research Institue, đây là môi trường đầu tiên không sử dụng huyết thanh
nhưng có bổ sung thêm một vài chất hỗ trợ gần giống huyết thanh. Một môi trường
khác không huyết thanh được gọi là môi trường Waymouth dùng để nuôi cấy tế bào
L929 ở chuột, nhưng môi trường này cũng được chứng minh là có thể sử dụng trong
nuôi cấy các dòng tế bào khác.
Năm 1959, McCoy mô tả công thức cơ bản để tạo ra môi trường hỗ trợ cho mục
tiêu nuôi cấy sơ cấp. Môi trường RPMI 1640 do Moore và đồng sự thiết lập tại Park
Memorial Institue, được sử dụng phổ biến cho nhiều dòng tế bào khác nhau và cũng
được các phòng thí nghiệm chọn lựa để nuôi cấy tế bào và mô bạch huyết.
Môi trường có thể được cung cấp từ các nguồn thương mại với các công thức
khác nhau, như môi trường có nồng độ bình thường (có thể sử dụng từ 9 – 12
tháng), hoặc môi trường có nồng độ 10X (có thể sử dụng trong vòng 12 – 24 tháng),
hoặc môi trường có nồng độ đậm đặc (có thể sử dụng từ 2 – 3 năm).

1.4.3.2. Huyết thanh

Mặc dù môi trường có chứa nhiều chất bổ dưỡng cần thiết cho sự phát triển,
nhưng huyết thanh là yếu tố hỗ trợ cho khả năng sống và phát triển của tế bào trong
nuôi cấy. Huyết thanh kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy
chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzym gây
tổn thương tế bào. Huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh, đồng thời chúng còn có
tác dụng cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi.
Huyết thanh bao gồm hocmon, các nhân tố tăng trưởng, lipid, các protein vận
chuyển và các chất kết dính. Trong các nghiên cứu nuôi cấy tế bào ung thư, huyết
thanh bê và huyết thanh thai bò được sử dụng rộng rãi, ngoài ra cũng thể sử dụng
huyết thanh người và ngựa.
Hiện nay, trừ những dòng tế bào được thuần hóa với môi trường tổng hợp hoàn
toàn, đa số được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung từ 5 – 20% huyết thanh là tốt
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh

21

nhất và tỷ lệ này tùy thuộc vào loại tế bào nuôi cấy. Nếu sử dụng tỷ lệ huyết thanh
cao sẽ làm tăng giá thành sản phẩm.

1.4.3.3. Môi trường không có huyết thanh

Sử dụng huyết thanh cho phép các tế bào phát triển khi nuôi cấy nhưng cũng có
những điều bất lợi. Đầu tiên, mặc dù thành phần của môi trường đã được đònh rõ
nhưng lượng huyết thanh có thể thay đổi tùy thuộc vào mỗi đợt nuôi cấy. Sự thay
đổi về số lượng huyết thanh sẽ dẫn đến sự thay đổi về các thông số bao gồm tỷ lệ
sống sót của tế bào, tiến trình phát triển. Một vài thành phần trong huyết thanh có
những yếu tố ức chế sự phân bào của một số tế bào. Bên cạnh đó mặc dù huyết
thanh được thường xuyên kiểm tra nhưng vẫn có khả năng xuất hiện virut.
Vì những lý do trên cùng với sự cân nhắc về giá thành, nên đã xuất hiện các
khuynh hướng chuyển qua sử dụng môi trường khác. Vào những năm 1960 – 1970,
người ta đã tìm ra môi trường không cần sử dụng huyết thanh hay dùng với lượng
thấp. Sato và đồng sự là những người tiên phong tìm ra những chất đặc biệt hiện
diện trong môi trường cơ bản để thay thế huyết thanh. Trong khi đó Ham và đồng sự
tăng cường nồng độ trong thành phần của môi trường cơ bản bằng cách bổ sung
hocmon, các protein vận chuyển, lipid và các nhân tố kết gắn.

1.4.3.4. Môi trường vật chất


Thông thường các tế bào động vật phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36,5
o
C + 1
o
C,

tuy thế ở nhiệt độ thấp hơn tế bào vẫn phát triển, nhưng chúng sẽ chết một cách
nhanh chóng khi nhiệt độ ở khoảng 40
o
C. Đặc biệt khi nuôi cấy tế bào động vật
điều kiện về độ ẩm và nồng độ CO
2
trong không khí rất quan trọng. Nồng độ CO
2

thường là 5% thích hợp nhất.
Phần lớn các tế bào ung thư cần thiết phải ổn đònh độ pH từ 7,2 – 7,4 và môi
trường phải được thay đổi thường xuyên. Vì khi tế bào phát triển sẽ tạo nên sự hô
hấp gây ra acid hóa môi trường. Có thể kiểm tra độ pH khi thêm phenol đỏ vào môi
trường. Nếu môi trường màu vàng pH 6,5; màu cam pH 7; màu đỏ pH 7,4; màu đỏ
tía pH 7,8. Độ ẩm khi nuôi cấy cũng rất quan trọng, sự bốc hơi từ môi trường có
muối sẽ làm cho tế bào bò phân giải gây tổn hại đến màng tế bào.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
22

Hầu hết các tế bào ung thư phát triển cần thiết phải có giá đỡ và hầu như các tế
bào ung thư phát triển từ lớp đơn trên đóa thủy tinh hay đóa nhựa. Một số trường hợp
ngoại lệ là ở dòng tế bào tạo máu và tế bào ung thư phổi nhỏ thích hợp phân chia ở
thể huyền phù. Tế bào bám dính có thể tăng số lượng lớn bằng cách bám vào các
giá đỡ nhờ vào các thành phần chất nền (ECM – Extracellular matrix). Hiện nay các
protein ECM được sử dụng phổ biến bao gồm collagen, fibronectin, laminin.

1.4.4. Nuôi cấy sơ cấp

Nuôi cấy sơ cấp là lần nuôi cấy đầu tiên ở các mô được lấy trực tiếp từ cơ thể.

Nuôi cấy tế bào ung thư có thể lấy các mô từ một khối u rắn ở cơ thể (từ mô gốc
hoặc di căn) hay là tế bào ở thể huyền phù, ví dụ như là hút dòch tế bào ở màng
bụng hay màng phổi. Đặc biệt các dạng tế bào ở thể huyền phù này thuận lợi cho
việc phát triển dòng tế bào bởi vì trong dòch đã có sẵn tế bào đơn độc và các cụm tế
bào. Điều này tránh được sự tách tế bào bằng phương pháp cơ học hay sự phá hủy
của enzym.
Các thành phần cấu tạo tế bào ở lần nuôi cấy sơ cấp gồm nhiều mẫu mô thường
không đồng nhất, có nhiều dạng như mô tạo máu và các dạng tế bào stroma, nguyên
bào sợi. Tuy nhiên sau một hay hai thế hệ các dòng tế bào nuôi cấy có tính chất
đồng nhất hay ít nhất cùng dạng. Các dạng tế bào ban đầu bò chuyển dạng dưới áp
lực chọn lọc của điều kiện nuôi cấy để tạo nên sự đồng nhất của dạng tế bào mạnh
nhất. Do đó ở mỗi lần cấy chuyền mẫu sẽ giống nhau và đặc tính dòng tế bào duy
trì qua nhiều thế hệ.
Tế bào được nuôi cấy phải được kiểm tra thường xuyên (tốt nhất là mỗi ngày) kể
cả quan sát bằng đại thể và vi thể. Hình thái và mật độ tế bào được xem xét qua
kính hiển vi và phải đánh giá được sự lây nhiễm của vi khuẩn và các vi sinh vật
khác. Kiểm tra bằng cảm quan về màu sắc, tính chất môi trường (đục, dày, hoặc
mờ). Môi trường phải được thay đổi hàng ngày và không cho phép để cạn môi
trường hay thiếu các chất dinh dưỡng hoặc bò acid hóa. Độ pH của môi trường
thường được kiểm soát dễ dàng bằng phenol đỏ.

1.4.5. Cấy chuyền

Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
23

Khi các tế bào được nuôi cấy phát triển trên toàn bộ bề mặt của bình nuôi cấy
(đối với lớp đơn) hoặc là đối với nuôi cấy tế bào ở thể huyền phù ở thời điểm mà
môi trường đã suy yếu chất dinh dưỡng lúc đó đòi hỏi tế bào phải được cấy chuyền

để nhằm duy trì khả năng phát triển của tế bào. Tuy nhiên khi thực hiện cấy chuyền
thì mật độ tế bào sẽ giảm xuống nhưng ở mức độ tế bào có thể phát triển trở lại một
cách tối ưu nhất và đảm bảo lượng môi trường đầy đủ cho tế bào phát triển tiếp tục.
Người ta sử dụng enzym như trypsin để tách tế bào và phương pháp tách này
cũng tác động đến kết quả thu hoạch tế bào trong những lần nuôi cấy. Sau khi nuôi
cấy sơ cấp, tế bào qua một vài lần cấy chuyền sẽ được tiến hành nuôi cấy thứ cấp
để tạo ra dòng tế bào.
Cấy chuyền được thực hiện tốt nhất khi tế bào phát triển ở log phase, lúc đó tế
bào được xem là khỏe mạnh nhất. Sau đó dòng tế bào cần phải được xác đònh và
nhận dạng nguồn gốc.


1.4.6. Tạo dòng

Dòng là một quần thể tế bào có nguồn gốc từ một tế bào riêng biệt và tạo dòng
là quá trình tách tế bào riêng biệt và phát triển các tế bào ở thế hệ sau. Vì vậy tạo
dòng có khả năng duy trì phân bào trong một thời gian dài mà không thay đổi đặc
tính ban đầu của mô gốc.
Hiệu quả tạo dòng được đánh giá trên tiêu chuẩn như khả năng nuôi cấy, các
dòng được sản xuất, số lượng tế bào được nuôi cấy. Thường hiệu quả tạo dòng trong
nuôi cấy sơ cấp rất thấp khoảng dưới 1%, trong khi đó vẫn có những dòng tế bào có
hiệu quả tạo dòng cao hơn trong nuôi cấy sơ cấp, tùy thuộc vào từng dòng tế bào mà
hiệu quả nuôi cấy sẽ thay đổi từ 10 – 100%. Người ta có thể tạo dòng tế bào trên
đóa hoặc trong agar.

1.4.7. Kỹ thuật đông lạnh tế bào

Bảo quản nguồn tế bào dưới nhiệt độ – 130
o
C cho phép dự trữ tế bào trong một

khoảng thời gian dài từ 20 đến 30 năm. Thông thường người ta sử dụng chất xúc tác
đông lạnh là DMSO (dimethylsulfoxide) hoặc Glycerol.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
24

Thường thời gian đông lạnh hay rã đông cũng ảnh hưởng đến khả năng sống của
tế bào và đông lạnh ở 1
o
C/phút được xem là đáp ứng tốt nhất. Ngược lại quy trình rã
đông phải được tiến hành nhanh. Điều này dễ dàng được thực hiện trong nước ấm ở
nhiệt độ 37
o
C. Thường tế bào được trữ trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196
o
C, nhưng có
thể duy trì sự sống trong thời gian ngắn ở - 80
o
C.

1.5. NHẬN DẠNG DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

1.5.1. Giới thiệu

Theo các tài liệu nghiên cứu hiện nay có khoảng 3.000 dòng tế bào ung thư được
thiết lập và có 1.000 dòng được sử dụng thường xuyên. Vì vậy cần thiết phải nhận
dạng và tìm hiểu đặc điểm của các dòng tế bào ung thư. Trong quá trình nuôi cấy
hình thức biểu hiện của tế bào có thể thay đổi và các nét đặc trưng như tính chất
biệt hóa có thể mất đi, nhưng đặc tính di truyền vẫn duy trì qua nhiều thế hệ.
Có nhiều lý do quan trọng để cần thiết xác đònh đặc điểm của các dòng tế bào

ung thư. Điều trước tiên đó là mối liên quan giữa dòng tế bào ung thư và mô gốc,
cần thiết phải xác nhận rằng dòng tế bào ung thư này có nguồn gốc từ mô gốc, điều
này có giá trò đặc biệt trong việc xác đònh các liệu pháp trò bệnh. Điều quan trọng
thứ hai là nhằm kiểm soát tính đồng nhất và khả năng lây nhiễm giữa các dòng tế
bào với nhau.
Lòch sử của quá trình nuôi cấy tế bào cho thấy rằng sự lây nhiễm giữa các dòng
tế bào vẫn thường xãy ra. Trong suốt những năm 70-80 nhiều công trình nghiên cứu
của Stanley chứng minh rằng sự lây nhiễm đã xảy ra ở dòng tế bào Hela. Hệ quả là
dẫn đến sự lây nhiễm lan tràn ở các phòng thí nghiệm và sự pha trộn giữa các dòng
tế bào đã xuất hiện.
Vấn đề lây nhiễm hiện nay vẫn còn là một vấn đề nan giải. Các nhà nghiên cứu
không chỉ quan tâm đến sự lây nhiễm giữa các dòng tế bào cùng loài mà còn là sự
lây nhiễm giữa các dòng tế bào khác loài. Vì vậy cần thiết phải có phương pháp
không chỉ xác đònh rõ nguồn gốc duy nhất của dòng tế bào mà còn phải xác nhận
nguồn gốc của loài.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
25

Người ta đã dùng các phương pháp như các marker DNA, phân tích cytogenic,
PCR… để xác nhận nguồn gốc của dòng tế bào và kiểm tra sự lây nhiễm với các
dòng tế bào khác. Mặt khác sự xác nhận đặc điểm còn bao gồm sự kiểm tra, theo
dõi các điểm đặc trưng của dòng tế bào, sự quan sát hình thái, tỷ lệ phát triển, hiệu
quả tạo dòng, các biểu hiện kháng nguyên, đặc điểm chu trình tế bào.

1.5.2. Đặc điểm phát triển của dòng tế bào ung thư

Điều quan trọng của dòng tế bào ung thư là khả năng cung cấp nguồn tế bào mới
để tiến hành các nghiên cứu về bệnh ung thư. Dòng tế bào phải phản ảnh tính chất
của mô gốc.

Hiện nay, gần như tất cả các tế bào ung thư có thể phát triển trong nuôi cấy. Hầu
hết dòng tế bào ung thư có khả năng phân chia không giới hạn, đối với các dòng tế
bào liên tục thì khả năng phân chia lên đến cả ngàn lần. Một dòng tế bào có thể trở
thành dòng tế bào liên tục (thay vì giới hạn) mặc dù tế bào hiện diện ở mức độ thấp
trong lần nuôi cấy đầu tiên nhưng những tế bào này phải có khả năng phân chia
không giới hạn, hoặc là chúng phải trải qua quá trình biến nạp. Sự biến nạp tạo nên
bởi một virut cảm ứng ung thư hay bằng hóa chất.
Khi cấy chuyền, các dòng tế bào ung thư sẽ trãi qua nhiều giai đoạn phát triển
nhất đònh. Lớp tế bào đơn ở giai đoạn cấy đầu tiên sẽ bám vào giá đỡ và khi được
tách rời bởi enzym (như trypsin) thì cần phải có thời gian để tế bào hồi phục lại
những hư hại do sự phá hủy của enzym. Ở thời điểm này tế bào phát triển tương đối
chậm, được gọi là “lag phase – pha tiềm đột biến”.
Khi việc nuôi cấy tiếp tục cộng với sự thay đổi các yếu tố tăng trưởng trong môi
trường thì sẽ làm tăng khả năng phân chia tế bào và làm tăng số lượng tế bào. Đây
là giai đoạn phát triển nhanh, được gọi là log phase, thường tế bào phát triển theo
lũy thừa.
Cuối cùng khi tế bào không còn tiếp xúc với chất nền hoặc liên quan đến việc sử
dụng lượng huyết thanh hay các thành phần khác trong môi trường lúc đó mật độ tế
bào sẽ giảm xuống, người ta gọi đó là sự bão hòa mật độ hoặc gọi là “plateau
phase”, đây là một trong những tính chất của dòng tế bào trong điều kiện nuôi cấy
đặc biệt.