đánh giá một số phương pháp phát hiện ß–lactamase phổ rộng (ESBL) của escherichia coli và klebsiella pneumoniae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI



NGUYỄN SÂM


ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
ß – LACTAMASE PHỔ RỘNG (ESBL) CỦA
ESCHERICHIA COLI VÀ KLEBSIELLA PNEUMONIAE

Chuyên ngành: Vi Sinh Vật
Mã số: 60.72.68

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC



Người hướng dẫn khoa học:
TS. ĐOÀN MAI PHƯƠNG


Hà nội - 2009
Lêi c¶m ¬n
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
TS Đoàn Mai Phương, Phó trưởng khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai, đã
tận tình hướng dẫn khoa học và giúp em hoàn thành luận văn này.
Các thầy cô Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà Nội:
- GS. TS Lê Huy Chính, nguyên chủ nhiệm bộ môn

- PGS. TS. Đinh Hữu Dung
- PGS. TS. Lê Văn Phủng, chủ nhiệm bộ môn
- PGS.TS. Nguyễn Thị Tuyến
- PGS.TS. Bùi Khắc Hậu
- PGS.TS. Lê Hồng Hinh
- PGS.TS. Nguyễn Thị Vinh
- TS. Nguyễn Vũ Trung
- TS. Phạm Hồng Nhung
Cùng các thầy cô nhiều bộ môn khác Trường Đại học Y Hà Nội đã tận tình
hướng dẫn em trong quá trình học tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới
- Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học - Trường Đại học Y Hà
Nội đã cho phép và tạo điều kiện giúp em trong quá trình học tập cũng như
hoàn thành luận văn này.
- Ban giám đốc, Phòng tổ chức cán bộ, Khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch
Mai đã cho phép và tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực
hiện đề tài luận văn.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn người thân, bạn bè và đồng nghiệp
đã động viên em rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2009

Nguyễn Sâm


MỤC LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN 4
1.1 Khái quát lịch sử và phân loại ESBL 4

1.1.1 Vài nét về lịch sử phát hiện ESBL 4
1.1.2 Đặc ñiểm phân loại ESBL 6
1.2. Các vi khuẩn nghiên cứu 13
1.2.1 Escherichia coli 13
1.2.2 Klebsiella pneumoniae 14
1.2.3 Kháng sinh nhóm ß– lactam và cơ chế ñề kháng KS của vi khuẩn
Gram âm sinh ESBL 15
1.3 Các phương pháp phát hiện ESBL 19
1.3.1 Tiêu chuẩn sàng lọc vi khuẩn sinh ESBL 19
1.3.2 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 20
1.4 Các nghiên cứu về E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL trên thế giới
và Việt Nam 25
1.4.1 Trên thế giới 25
1.4.2 Việt Nam 27
1.5 Đặc ñiểm lâm sàng và ñiều trị vi khuẩn sinh ESBL 28
1.5.1 Điều trị nhiễm khuẩn sinh ESBL 28
1.5.2 Phòng ngừa vi khuẩn sinh ESBL 29
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 30
2.1 Đối tượng nghiên cứu 30
2.2 Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu 30
2.2.1 Địa ñiểm nghiên cứu 30

2.2.2. Thời gian nghiên cứu 30
2.3 Vật liệu nghiên cứu 30
2.3.1 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn gây bệnh 30
2.3.2 Vật liệu, dụng cụ sinh phẩm làm kháng sinh ñồ 31
2.3.3 Vật liệu và sinh phẩm xác ñịnh vi khuẩn sinh ESBL 31
2.4 Phương pháp nghiên cứu 32
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu 32

2.4.2. Cỡ mẫu nghiên cứu 32
2.4.3 Phương pháp nghiên cứu 33
2.5 Phương pháp xử lý số liệu 46
2.6 Vấn ñề y ñức trong nghiên cứu 46
2.7 Hạn chế sai số 46
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47
3.1 Kết quả thử nghiệm phát hiện E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL 47
3.1.1 Kết quả của thử nghiệm ChromID ESBL, ñĩa ñôi, E-test ESBL phát
hiện E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL 47
3.1.2 Kết quả so sánh thử nghiệm phát hiện E. coli và K. pneumoniae sinh
ESBL 49
3.1.3 Kết quả phối hợp các thử nghiệm phát hiện E. coli và K. pneumoniae sinh
ESBL 50
3.1.4 Kết quả ñối chiếu thử nghiệm E-test ESBL phát hiện 151 chủng E. coli và K.
pneumoniae sinh ESBL với ñường kính khoanh giấy kháng sinh AMC 51
3.2 Kết quả phân bố giá trị MIC cefotaxime và ceftazidime của E. coli
và K. pneumoniae 52
3.2.1 Kết quả phân bố giá trị MIC cefotaxime của E. coli 52
3.2.2 Kết quả phân bố giá trị MIC ceftazidime của E. coli 54
3.2.3 Kết quả phân bố giá trị MIC cefotaxime của K. pneumoniae 56

3.2.4 Kết quả phân bố giá trị MIC ceftazidime của K. pneumoniae 57
3.3 Một số ñặc ñiểm lâm sàng của E. coli và K. pneumoniae 59
3.3.1 Kết quả phân bố E. coli và K. pneumoniae theo khoa ñiều trị 59
3.3.2 Kết quả phân bố E. coli và K. pneumoniae theo loại bệnh phẩm 60
Chương 4: BÀN LUẬN 61
4.1 Thử nghiệm phát hiện E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL 61
4.1.1 Thử nghiệm ChromID ESBL, ñĩa ñôi, E-test ESBL phát hiện E. coli
và K. pneumoniae sinh ESBL 61
4.1.2 So sánh các thử nghiệm phát hiện E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL65

4.1.3 Phối hợp các thử nghiệm phát hiện E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL66
4.1.4 Đối chiếu thử nghiệm E-test ESBL phát hiện 151 chủng E. coli và K.
pneumoniae sinh ESBL với ñường kính khoanh giấy kháng sinh AMC 66
4.2 Phân bố giá trị MIC cefotaxime và ceftazidime của E. coli và
K. pneumoniae 67
4.3 Một số ñặc ñiểm lâm sàng của E. coli và K. pneumoniae 68
KẾT LUẬN 73
KIẾN NGHỊ 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tóm tắt hệ thống phân loại ß–lactamases và ESBL theo Ambler và
Bush-Jacoby- Medeiros
7
Bảng 1.2: Phân loại các lớp ESBL theo nguồn gốc ñột biến và số lượng các
biến thể
11
Bảng 1.3: Tiêu chuẩn sàng lọc vi khuẩn sinh ESBL theo CLSI – 2006
20
Bảng 2.1: Nhận ñịnh kết quả vi khuẩn sinh ESBLtrên môi trường ChromID ESBL
36
Bảng 2.2: Nhận ñịnh kết quả vi khuẩn sinh ESBL theo phương pháp ñĩa ñôi
38
Bảng 2.3: Nhận ñịnh kết quả E-test ESBL.
41
Bảng 3.1: Kết quả thử nghiệm ChromID ESBL phát hiện E. coli và
K. pneumoniae sinh ESBL
47

Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm ñĩa ñôi phát hiện E. coli và K. pneumoniae sinh
ESBL
48
Bảng 3.3: Kết quả thử nghiệm E-test ESBL phát hiện E. coli và
K. pneumoniae sinh ESBL
48
Bảng 3.4: Kết quả so sánh thử nghiệm phát hiện E. coli và K. pneumoniae
sinh ESBL
49
Bảng 3.5: Kết quả phối hợp các thử nghiệm phát hiện E. coli và
K. pneumoniae sinh ESBL
50
Bảng 3.6: Kết quả ñối chiếu thử nghiệm E-test ESBL với ñường kính khoanh
giấy kháng sinh AMC trong thử nghiệm ñĩa ñôi
51
Bảng 3.7: Kết quả phân bố giá trị MIC cefotaxime của E. coli
52
Bảng 3.8: Kết quả phân bố giá trị MIC ceftazidime của E. coli
54
Bảng 3.9: Kết quả phân bố giá trị MIC cefotaxime của K. pneumoniae
56
Bảng 3.10: Kết quả phân bố giá trị MIC ceftazidime của K. pneumoniae
57
Bảng 3.11: Phân bố E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL theo khoa ñiều trị
.59
Bảng 3.12: Phân bố E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL theo loại bệnh phẩm
60


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu ñồ 3.1: So sánh thử nghiệm phát hiện E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL 50
Biểu ñồ 3.2: Phân bố giá trị MIC cefotaxime của E. coli 53
Biểu ñồ 3.3: Phân bố nồng ñộ MIC ceftazidime của E. coli nghiên cứu 55
Biểu ñồ 3.4: Phân bố nồng ñộ MIC cefotaxime của K. pneumoniae nghiên cứu 56
Biểu ñồ 3.5: Phân bố giá trị MIC ceftazidime của K. pneumoniae 58


10,31,36,38,39,40,42,43,44,50,53,55,56,58 mau
1-9,11-30,32-35,37,41,45-49,51,52,54,57,59-80 den
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

AMC Amoxicillin/clavulanic acid
ATCC American Type Culture Collection (chủng quốc tế)
CAZ Ceftazidime
CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm
phòng chống bệnh tật Hoa Kỳ)
Clav Clavulanic acid
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CS Cộng sự
CTL Cefotaxime/ clavulanic acid
CTX Cefotaxime
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ESBL Extended Spectrum ß-Lactamase (men beta-lactamase phổ rộng)
I Intermediate (trung gian)
ID Identification
KKS Kháng kháng sinh
KS Kháng sinh
MIC Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)
PCR Polymerase Chain Reation

R Resitance (Đề kháng)
S Susceptible (Nhạy cảm)
TZL Ceftazidime/clavulanic acid
WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn ñề kháng kháng sinh luôn là vấn ñề cần phải quan tâm của các
nước trên thế giới, ñặc biệt là các nước ñang phát triển. Kháng kháng sinh ñã
trở thành nguy cơ ñối với sức khỏe mọi người. Vi khuẩn và gen kháng thuốc
của vi khuẩn nhanh chóng lan truyền khắp mọi nơi, kể cả bệnh viện, cộng
ñồng và trong chăn nuôi. Trong khi tốc ñộ ñề kháng kháng sinh ngày càng gia
tăng thì việc nghiên cứu tìm ra các loại kháng sinh mới ñể ñiều trị ngày càng
giảm. Như vậy trong cuộc chạy ñua dành ưu thế, vi khuẩn luôn vượt lên
trước, khoảng cách giữa khả năng vi khuẩn biến ñổi ñể trở thành kháng kháng
sinh và khả năng con người kiểm soát ñược vi khuẩn ñã cách xa. Vì vậy nếu
chúng ta không có các biện pháp làm giảm tốc ñộ kháng thuốc kịp thời sẽ dẫn
ñến hậu quả không còn kháng sinh ñể ñiều trị.
Việt Nam là một nước nhiệt ñới, vì vậy bệnh nhiễm khuẩn luôn chiếm
vị trí hàng ñầu trong mô hình bệnh tật. Khác với những năm 1990, hiện nay
nhiễm khuẩn do các vi khuẩn Gram âm ñang chiếm ưu thế so với các vi
khuẩn Gram dương. Nhiều nghiên cứu cho thấy ña số căn nguyên nhiễm
khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn, thậm chí bệnh nhân bị tử vong ñược xác ñịnh
khoảng 70% là nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm [3]. Các vi khuẩn Gram
âm gây bệnh thường gặp tại các bệnh viện là Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii.
Kháng sinh nhóm ß -lactam ñược biết ñến sớm nhất trong lịch sử kháng

sinh và có vai trò ñặc biệt quan trọng trong ñiều trị các nhiễm khuẩn. Hiện
nay nhóm ß-lactam có số lượng kháng sinh lớn nhất, chiếm gần ba phần tư
tổng số loại kháng sinh hiện ñang lưu hành. Trong những năm gần ñây, các
kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 ñang ñược các bác sĩ lâm sàng sử dụng một
cách rộng rãi như kháng sinh ñầu tay, ñồng thời cũng là thứ “vũ khí” cuối

2

cùng ñể ñiều trị cho bệnh nhân. Do ñược sử dụng rộng rãi nên tỷ lệ vi khuẩn
ñề kháng các kháng sinh này rất cao, nhất là ở các vi khuẩn Gram âm. Hiện
nay ñã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn Gram âm sinh men ß-lactamases phổ
rộng (ESBL: Extended Spectrum ß-lactamase) ñề kháng các kháng sinh nhóm
ß-lactam, bao gồm cả các kháng sinh phổ rộng như cephalosporin thế hệ 3 và
4. Sinh ESBL vẫn là nguyên nhân chủ yếu gây gia tăng ñề kháng KS nhóm ß-
lactam ở những vi khuẩn Gram âm, ñặc biệt E. coli và K. pneumoniae và một
số vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn ñường ruột Enterobacteriacae. Gen mã hoá
sinh ESBL nằm trên plasmide, một kiểu di truyền nằm ngoài NST. Khác với
việc truyền gen ñề kháng do ñột biến, lan truyền gen ñề kháng qua trung gian
R–plasmide có khả năng lan truyền ngang, các loài vi khuẩn có thể truyền cho
nhau gen sinh ESBL một cách nhanh chóng dù chỉ qua một thế hệ, làm cho
chủng loại và số lượng vi khuẩn Gram âm sinh ESBL có thể lan rộng nhanh
tới mức khó kiểm soát [15]. Vi khuẩn sinh ESBL sẽ ñề kháng toàn bộ các
penicillin, cephalosporin và aztreonam. Hơn nữa chúng còn có khả năng ñề
kháng chéo với nhiều nhóm kháng sinh khác như aminoglycoside,
fluoroquinolone, tetracyclin, co-trimoxazol [19], [51]. Điều này ñã gây không
ít khó khăn cho ñiều trị do việc lựa chọn kháng sinh bị thu hẹp. Những bệnh
nhân nhiễm khuẩn do vi khuẩn sinh ESBL có bệnh cảnh lâm sàng thường
nặng, tỷ lệ tử vong cao do vi khuẩn ñề kháng.
Việc phát hiện các vi khuẩn sinh ESBL nhanh, chính xác của phòng xét
nghiệm Vi sinh tại các bệnh viện là việc làm hết sức cần thiết, giúp cho các

bác sĩ lâm sàng sớm lựa chọn ñược kháng sinh thích hợp, giảm chi phí ñiều
trị, cứu sống bệnh nhân. Tuy nhiên hiện nay nếu chỉ thực hiện kỹ thuật
khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán thông thường (phương pháp Kirby-
Bauer) các khoa Vi Sinh lâm sàng của các bệnh viện sẽ không phát hiện ñược
những vi khuẩn Gram âm như E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL. Nhiều tài

3

liệu trên thế giới ñã ñề xuất một số phương pháp sàng lọc như sử dụng môi
trường ChromID ESBL, hoặc khẳng ñịnh bằng phương pháp “ñĩa ñôi”,
khoanh giấy phối hợp, E-test ESBL…
Tại Việt Nam, tùy theo ñiều kiện của từng bệnh viện, một số khoa Vi
sinh lâm sàng ñã tiến hành thử nghiệm phát hiện vi khuẩn sinh ESBL bằng
các phương pháp khác nhau. Tuy nhiên một câu hỏi ñược ñặt ra là nên lựa
chọn phương pháp nào ñể phát hiện vi khuẩn sinh ESBL nhanh và có ñộ tin
cậy cao vẫn ñang cần ñược trả lời.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành ñề tài:
“Đánh giá một số phương pháp phát hiện ß–lactamase phổ rộng (ESBL)
của Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae”
Với các mục tiêu sau:
1. Đánh giá các phương pháp ChromID ESBL, ñĩa ñôi, E-test ESBL phát hiện
E. coli và K. pneumoniae sinh ß–lactamase phổ rộng (ESBL).
2. Xác ñịnh phân bố giá trị MIC ceftazidime và cefotaxime của các chủng E.
coli và K. pneumoniae nghiên cứu.
3. Mô tả một số ñặc ñiểm lâm sàng của các chủng E. coli và K. pneumoniae
sinh ESBL phân lập ñược.


4

Chương 1
TỔNG QUAN

1.1 Khái quát lịch sử và phân loại ESBL
1.1.1 Vài nét về lịch sử phát hiện ESBL
Năm 1928 chất kháng sinh ñầu tiên ñược phát hiện là penicillin từ loài
nấm Penicillium bởi Alexander Fleming, ñây cũng chính là kháng sinh ñầu
tiên của nhóm ß-lactam. Đến năm 1941 nhóm tác giả tại Oxford gồm Flory,
Chain và Harley ñã tinh chế ñược penicillin G có tác dụng diệt S. aureus
nhưng kém hiệu quả với trực khuẩn Gram âm. Cùng thời gian này Abraham
và Chain ñã phát hiện ở các trực khuẩn Gram âm có sinh một loại enzyme
kháng lại penicillin. Tuy vậy, vào ngày 12/02/1941 nhóm tác giả này ñã ñưa
penicillin vào ñiều trị trên người, mở ra một kỷ nguyên sử dụng kháng sinh
ñiều trị bệnh nhiễm khuẩn cứu sống hàng triệu người [15], [17].
Đến năm 1944 lần ñầu tiên xuất hiện S. aureus kháng penicillin do sinh
enzyme penicillinase. Sau ñó vào những năm 1948 ñến năm 1956 các
cephalosporins thế hệ ñầu tiên ñược nghiên cứu và ñưa vào sử dụng gọi là
cephalosporins thế hệ 1 [17].
Năm 1961 thế hệ pencillin phổ rộng ñầu tiên là ampicillin ñược ra ñời
có tác dụng ñiều trị với cả trực khuẩn Gram âm và cầu khuẩn Gram dương.
Chỉ vài năm sau, vào năm 1963 tại Athens Hy Lạp từ máu một bệnh nhân tên
là Temoneira người ta phân lập ñược chủng E. coli kháng ampicillin có sinh
loại enzyme ß-lactamase và lấy luôn tên bệnh nhân ñặt tên cho enzyme này là
TEM-1 [32], [54].
Năm 1965 cũng ở nơi ñây từ E. coli người ta phát hiện ra TEM-2 là do
TEM-1 biến ñổi một amino acid. Nhờ TEM-1và TEM-2 ñã làm cho vi khuẩn
Gram âm kháng lại các penicillins, ampicillin và cephalosporins thế hệ 1

5

trong một thời gian dài sau ñó, như các thông báo về N. gonorrhoeae kháng
pencicllin, H. influenzae và Shigella spp ñề kháng KS vào những năm 1971 -
1973 ở Châu Á và nhiều nơi trên Thế giới [32], [54].
Cho ñến năm 1974 chủng K. pneumoniae có gen mã hoá enzyme ß-
lactamase trên plasmide ñược phát hiện, enzyme này có nhiều thay ñổi về
amino acid so với TEM-1 và TEM-2 nên ñặt tên là SHV-1 (Sulphyryl
Variable), như vậy vi khuẩn ñã có TEM-1, TEM-2 và SHV-1 nên các
penicillins, cephalosporins thế hệ 1 ñã bị kháng lại rất nhiều [54].
Đầu những năm 1980 thì các kháng sinh ß-lactam phổ rộng như
cephalosporins thế hệ thứ 2, thế hệ thứ 3 và monobactams ñược ñưa vào ñiều
trị các vi khuẩn kháng thuốc. Sự ra ñời các kháng sinh ß-lactams mới này ñặc
biệt là cephalosporins thế hệ 3, ñã là thành công lớn của khoa học trong cuộc
chiến ñấu dài lâu với vi khuẩn gây bệnh có TEM-1, TEM-2, SHV-1. Nhưng
rồi một loại enzyme ß-lactamse có khả năng phân huỷ các cephalosporins thế hệ
2, cephalosporins thế hệ 3 và monobactams, có nguồn gốc do TEM-1, TEM-2,
SHV-1 ñột biến thay ñổi một số amino acid gọi là ESBL ñã xuất hiện [54].
Năm 1983 ở Đức ñã phát hiện chủng K. ozaenae sinh enzyme ß-
lactamase phân huỷ cefotaxime ñược ñặt tên là SHV-2, ñây là trường hợp
sinh ESBL ñầu tiên ñược ghi nhận. Năm 1984 ñến 1987 tại Pháp ñã phát hiện
chủng K. pneumoniae có gen mã hoá ESBL trên plasmide kháng cefotaxime ñặt
tên là CTX-1. Cũng vào những năm 1986 ở Nhật bản Masumato và năm 1989 ở
Đức Bauernfein phát hiện E. coli sinh ESBL kháng cefotaxime không phải TEM
và SHV nên ñặt tên là CTX-M-1. Đáng ngại là CTX-M có khả năng phân huỷ hầu
hết cephalosporins thế hệ 3 và cả cephalosporins thế hệ 4 [38], [54].
Như vậy, với việc sử dụng các kháng sinh nhóm beta-lactam ngày càng
nhiều ñặc biệt là các cephalosporin thế hệ 3 (oxyimino-beta-lactam) và có
nhiều ESBL ñược mã hoá qua R- plasmide, nên ngày càng làm gia tăng tỉ lệ

6

lẫn chủng loại ESBL trong ñó có các ESBL ngoài TEM, SHV, CTX-M như
OXA-, PER-, VEB-… Đến nay các ESBL mới vẫn ñang tiếp tục ñược thông
báo. Điều này cảnh báo một nguy cơ gia tăng vi khuẩn ñề kháng KS và hết
kháng sinh ñiều trị trong một tương lai rất gần. Tuy nhiên, việc phát hiện sớm
các vi khuẩn sinh ESBL tại các bệnh viện vẫn chưa ñược quan tâm nhiều, các
phương pháp phát hiện ESBL và thông báo còn chưa có sự thống nhất [44].
1.1.2 Đặc ñiểm phân loại ESBL
Hiện nay các nghiên cứu trên thế giới ñã biết ñến trên 200 loại ESBL.
Những enzyme này ñược nhiều nhà khoa học phân loại theo các cách khác
nhau và cũng khá phức tạp. Tuy vậy, có hai hệ thống phân loại chính ñược
thống nhất sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Hệ thống phân loại của Ambler
R. P và hệ thống phân loại của nhóm tác giả Bush Karen, Jacoby G A và
Medeiros A. A gọi tắt là hệ thống phân loại Bush- Jacoby- Medeiros.
1.1.2.1 Hệ thống phân loại theo Ambler
Ambler chia các ß–lactamases thành 4 lớp: A, B, C và D, dựa trên cấu
trúc enzyme có sự giống nhau về các amino acid. Trong ñó các lớp A, C, D
chỉ có serin trong cấu trúc ở vị trí khởi ñộng nên gọi là các Serin-ß-
lactamases, còn lớp B do có Metallo ở vị trí khởi ñộng trong cấu trúc enzyme
và các ion Zn nên gọi là các Metallo-ß-lactamases, một số ß–lactamases lớp
A và lớp D ñược gọi là ESBL [18 ], [19], [26], [27].
1.1.2.2 Hệ thống phân loại theo Bush- Jacoby- Medeiros
Cơ sở của hệ thống phân loại này là dựa vào các yếu tố sau:
- Khả năng hoạt ñộng của enzyme hay gọi là phổ tác dụng của enzyme
ñối với các kháng sinh.
- Tầm ảnh hưởng của enzyme ñối với các chất ức chế ß-lactamase
(thường dùng là clavulanic acid) ở các mức khác nhau như bị ức chế,
giảm ức chế hay kháng chất ức chế.

7

- Vị trí gen mã hoá ESBL nằm trên NST hay trên plasmid.
- Loài vi khuẩn sinh ESBL thuộc nhóm thường gặp hay hiếm gặp…
Hệ thống phân loại này chia ß-lactamases ra 4 nhóm chính: 1, 2, 3, 4
Trong ñó nhóm chính 2 lại ñược chia thành 8 nhóm phụ gồm: 2a, 2b, 2be,
2br, 2c, 2d, 2e và 2f.
Bảng 1.1: Tóm tắt hệ thống phân loại ß–lactamases và ESBL theo Ambler
và Bush-Jacoby- Medeiros [26], [27], [28], [54].
Lớp Ambler Nhóm Bush

Type enzyme
2a Penicillinase
2b TEM-1-2, SHV-1
2be
ß-lactamase phổ rộng
phân huỷ penicillins, cephalosporins phổ rộng,
bị ức chế bởi clav (ESBL)
2br ß-lactamase kháng chất ức chế
2c Carbenicillinase, ức chế bởi clav
2e Cephalosporinase
A
2f ß-lactamase phân huỷ carbapenem, bị ức chế
bởi clav
B 3 ß-lactamase Zinc-metallo phân huỷ carbapenem
và các ß-lactams, bị ức chế bởi EDTA
C 1 AmpC các Cephalosporinase có gen mã hoá
trên NST thỉnh thoảng trên plasmide, không bị
ức chế bởi clav
2d Oxacillinase/cloxacillinases, bị ức chế yếu bởi
clav
D

4 ß-lactamase ức chế bởi clav, các type thay ñổi
* Lớp A:
Gồm các nhóm 2a, 2b, 2be, 2br, 2c, 2d, 2e và 2f theo phân nhóm của Bush
- Nhóm 2a

8

Gồm các penicillinase, không bị ức chế bởi clavulanic acid thường xuất
hiện ở những vi khuẩn Gram dương như S. aureus, Enterococcus spp.
- Nhóm 2b
Gồm các type enzyme cổ ñiển như TEM-1-2, SHV-1, bị ức chế bởi
clavulanic acid các type này thường gặp ở E. coli, chúng không phân huỷ
ñược các cephalosporins phổ rộng thế hệ 3 [54].
- Nhóm 2be
 Đây là nhóm các ß-lactamase phổ rộng phân huỷ penicillin, các
cephalosporins phổ rộng, không phân huỷ carbapenems và cả
cephamycins (cefoxitin, cefotetan, cefmetazole…) các enzyme này ñược
gọi là ESBL, bị ức chế bởi clavulanic acid, sulbactam và tazobactam.
Xuất hiện nhiều ở E. coli, K. pneumoniae và các Enterobacteriacae.
 Các type TEM-3 , SHV-2 hiện có hơn 100 loại, nguồn gốc ñột biến
từ TEM, SHV và OXA- cổ ñiển thường gặp ở Enterobacteriacae
 Type K1 beta-lactamase có gen mã hoá nằm trên NST, là enzyme phân
huỷ cefotaxime, có thể giảm nhạy cảm ñến phân huỷ ceftazidime.
Enzyme này thường thấy ở K. oxytoca. Các type CTX-M có nguồn gốc
từ K1 phân huỷ cefotaxime, có thể giảm nhạy cảm ñến phân huỷ
ceftazidime thường gặp ở Enterobacteriacae. Type PER-1 và VER-1
gặp chủ yếu ở P. aeruginosa [54].
- Nhóm 2br
Gồm các ß-lactamase type TEM kháng chất ức chế clavulanic acid,
sulbactam, nhưng còn bị ức chế bởi tazobactam (IRT: Inhibitor resistant

TEM beta-lactamase).
- Nhóm 2c
Gồm các enzyme CARB, PSE có khả năng phân huỷ carbapenem, thường
xuất hiện ở P. aeruginosa, Acinetobacter sp. Ngoài ra còn có enzyme
BRO gặp ở Moraxella catarrhalis.

9

- Nhóm 2e.
Gồm các ß-lactamase type FPM-1, L2, BPS-1 có gen mã hoá nằm trên
NST, chúng bị ức chế bởi clavulanic acid và thường xuất hiện ở các loài vi
khuẩn như Proteus vugaris, S. maltophilia, B. pseudomallei các enzyme
này không phải là các ESBL [27].
- Nhóm 2f
Gồm các enzyme phân huỷ carbapenem, bị ức chế bởi clavulanic acid
* Lớp B
- Nhóm 3
Bao gồm các metallo enzyme, các carbapenemases phân huỷ carbapenem
và một số beta-lactam. Chúng bị ức chế bởi EDTA nhưng không bị ức chế
bởi clavulanic acid gồm các type IMP-1 ñến 4, VIM-1&2, SPM-1, GIM-1
thường xuất hiện ở các loài vi khuẩn Staphylococci, Enterococci,
Pseudomonas sp và cả Enterobacteriacae ngoài ra còn gặp ở các vi khuẩn
kháng carbapenem tự nhiên [27].
* Lớp C
- Nhóm 1
 Enzyme AmpC gồm các Cephalosporinase có gen mã hoá nằm trên
NST, thỉnh thoảng trên plasmide, không bị ức chế bởi clav. AmpC phân
huỷ penicillin, cephalosporins các thế hệ 1, 2, 3, cephamycin
(cephoxitin, cefotetan, cefmetazole), nhưng AmpC không phân huỷ
ñược carbapenem, cefepime [54].

 Các AmpC enzymes có gen mã hoá nằm trên NST thường gặp ở
Enterobacter spp, Citrobacter spp, Seratia spp. Gen mã hoá trên NST
không nằm trên plasmide gặp ở E. coli, K. pneumoniae và có gen mã
hoá không nằm trên NST gặp ở Salmonella spp các Enterobacteriacae
tự nhiên khác [44].

10

* Lớp D
- Nhóm 2d
Gồm các oxacillinases type OXA-1, chúng có khả năng phân huỷ
carbapenem có thể thay ñổi tính ức chế với clavulanic acid.



Sơ ñồ 1.1: Phân loại ESBL cấu trúc phân tử, vị trí gen mã hóa,
chất ức chế, kháng sinh cảm thụ và nguồn gốc biến thể theo Ambler - Bush
1.1.2.3 Phân loại các type và lớp của các ESBL
Do hầu hết mối quan tâm của nhiều nghiên cứu là các ESBL nên phân
loại ESBL chỉ chú ý các type TEM-3-, SHV-2-, CTX-M ở nhóm 2be nằm

ß-lactamase


Serin enzymes



Metallo
enzymes

Lớp A
Plasmid
(ESBL)
Pen-cephs-
Inh-R

Lớp B
NST
MbL
Carbapenems

Inh-R

Lớp C
NST
AmpC
Cphs-Inh-
R

Lớp D
(ESBL)
Pens, espOxa

Inh-R


11

trong lớp A và một số type OXA- ở nhóm 2d thuộc lớp D. Các type OXA- là
ESBL ở nhóm 2d lớp D thường chỉ xuất hiện ở P. aeruginosa ít gặp ở các

Enterobacteriacae.
Trong các hệ thống phân loại trên thì lớp A và D ñược chia thành các
type enzyme dựa vào nguồn gốc và các biến thể trong cấu trúc của thành
phần enzyme cổ ñiển ban ñầu gồm các TEM, SHV, CTX-M.
Ngày nay do sử dụng nhiều kháng sinh nhóm ß–lactam, ñặc biệt là các
cephalosporin thế hệ 3 nên số lượng ESBL biết ñến vẫn không ngừng gia tăng.
Bảng 1.2: Phân loại các lớp ESBL theo nguồn gốc ñột biến và số lượng
các biến thể [19], [27], [54].

Lớp Nguồn gốc Các biến thể
TEM (A) Các ñột biến TEM penicillinase, nguồn
gốc không rõ, các thay thế 1-7 amino
acid
Trên 100
SHV (A) Các ñột biến SHV penicillinase, ở K.
pneumoniae thì xuất phát từ NST, thay
thế trên 1 amino acid
Trên 50
CTX-M (A) Kluyvera spp, Hầu hết ñều xuất phát từ
NST
Trên 40 trong 5
phân lớp
VEB (A) Không rõ 3
PER (A) Không rõ 2
OXA-15 (D) Đột biến OXA-2, nguồn gốc không rõ 1
OXA-11, 14,
15, 16, 17 (D)
Đột biến OXA-10, ñược biết từ lâu là
penicillinase nguồn gốc không rõ
Trên 5

* Type TEM - (ESBL) lớp A.
Từ các TEM ban ñầu do ñột biến thay ñổi vị trí các amino acid tạo
thành các enzyme mới, ESBL mới có cấu trúc thay ñổi kể cả có sự thay ñổi

12

các mức ñộ ảnh hưởng ñối với chất ức chế. Hiện nay có ñến trên 100 TEM
(ESBL) ñã tìm thấy [26], [27].
* Type SHV- (ESBL) lớp A.
SHV-1 có sự tương ñồng 68% các amino acid so với TEM-1 và có cấu
trúc tương tự. Cũng như TEM type SHV- (ESBL) cũng có sự thay thế 1 hoặc
nhiều amino acid quanh vị trí hoạt hóa. Trên 50 SHV ñã ñược biết ñến. Các
type SHV- (ESBL) thường gặp là SHV-5 và SHV-12 [26], [54].
* Type CTX- (ESBL) lớp A.
Đặc ñiểm nhấn mạnh của type CTX- là khả năng phân hủy cefotaxime
mạnh hơn khả năng phân hủy ceftazidime. Hiện nay có trên 40 CTX-M ñược
biết ñến tuy nhiên cũng có một số CTX-M khả năng phân hủy cefotaxime yếu
hơn ceftazidime, các thành viên CTX-M hay gặp là CTX-M-14, CTX-M-3,
CTX-M-2 [26], [54].
* Type khác (ESBL) lớp A.
Các type ESBL khác thuộc lớp A gặp không thường xuyên chỉ xuất
hiện ở P. aeruginosa và rải rác ở một số vùng ñịa lý như PER-1 phân lập
ñược ở Thổ Nhĩ kỳ, Pháp và Ý. Các type VER-1, VER-2 tìm thấy ở Đông
Nam Á, VER-1 tìm thấy trên Acinetobacter spp ở Hàn Quốc và Thổ Nhĩ kỳ.
GES-1, GES-2 và IBC-2 thấy ở Nam Phi, Pháp và Hy Lạp. Ngoài ra còn các
ESBL lớp A hiếm gặp khác chỉ xuất hiện ở Enterobacteriacae như BES-1,
IBC-1, SFO-1 và TLA-1 [27], [54].
* Type OXA- (ESBL) lớp D.
Có tới 12 loại ESBL có nguồn gốc từ OXA-10, OXA-1 hoặc OXA-2

qua ñột biến thay thế các amino acid. Các ESBL này thường chỉ gặp ở Thổ
Nhĩ Kỳ và Pháp. Hầu hết type OXA-(ESBL) ñều giảm ức chế với clavulanic
acid, ña số chúng kháng ceftazidime riêng type OXA-17 ñề kháng nhiều hơn
với cefotaxime và cefepime [54].

13

* Ngoài ra một số enzyme khác phân hủy ß-lactam nhưng không phải
ESBL nhưng ít có gen mã hóa di truyền qua trung gian plasmid như một số
AmpC lớp C và các carbapenemase thuộc lớp A, B và D. Chúng cũng là
những ß-lactamase rất quan trọng tạo ra các cơ chế ñề kháng KS trong quá
trình kháng thuốc của vi khuẩn.
1.2. Các vi khuẩn nghiên cứu
E. coli và K. pneumoniae là hai vi khuẩn gây bệnh cơ hội thường gặp
tại bệnh viện, chúng là những thành viên chính thuộc họ vi khuẩn ñường ruột
Enterobacteriacae gây nhiễm khuẩn bệnh viện do có tỉ lệ ñề kháng KS rất
cao. Đặc biệt ñây là hai loài vi khuẩn gắn liền với lịch sử phát hiện cơ chế
sinh ESBL ở vi khuẩn Gram âm với các type enzyme TEM, SHV. Điều quan
trọng là gen sinh ESBL ở các vi khuẩn này chủ yếu di truyền qua trung gian
R-plasmide.
1.2.1 Escherichia coli [2], [4], [14], [35], [36].
E. coli phân lập lần ñầu tiên bởi Escherich vào những năm 1885. Vi
khuẩn này có mặt rất sớm ở ñại tràng sau 3 giờ trẻ sinh ra. Bình thường chúng
góp phần tiêu hoá thức ăn, phân giải muối mật, giữ thăng bằng hệ vi khuẩn
ñường ruột và có vai trò sản xuất một số sinh tố. E. coli chiếm 80% các vi
khuẩn hiếu khí ở ñại tràng.
1.2.1.1 Đặc ñiểm sinh học
- Hình thể, tính chất bắt màu: Trực khuẩn bắt màu Gram âm, di ñộng hoặc
không nếu không có long.
- Nuôi cấy: Hiếu kỵ khí tuỳ tiện, nhiệt ñộ thích hợp 37

o
C, dễ mọc trên môi
trường thông thường, khuẩn lạc dạng S, R hoặc M.
- Tính chất sinh vật hoá học: Lên men glucose (+), lactose (+/-), Oxidase (-),
citrat simmons (-), Urease (+), indole (+), H2S (-), di ñộng (+/-), VP(-),
RM (+).

14

- Kháng nguyên: Hiện có 171 loại kháng nguyên thân O, 56 loại kháng
nguyên lông H, 80 loại kháng nguyên bề mặt K, có kháng nguyên ngoại
ñộc tố LT (labile toxin), ST (stable toxin). Phân loại dựa vào kháng
nguyên O, H, K có khoảng 700 type huyết thanh, dựa vào phage có 50 loại
và theo tính chất ỉa chảy có 5 loại.
o EPEC (Enteropathogenic E. coli): Gây bệnh ñường ruột
o ETEC (Enterotoxigenic E. coli): Gây ñộc tố ruột
o EIEC (Enteroinvasive E. coli): Xâm nhập ñường ruột
o EHEC (Enterohemorrhagic E. coli): Gây chảy máu ruột
o EAEC (Enteroadhenrent E. coli ): Bám dính ñường ruột
1.2.1.2 Khả năng gây bệnh
E. coli gây bệnh cơ hội khi ở ngoài ñại tràng như nhiễm khuẩn tiết niệu,
nhiễm khuẩn máu, viêm màng não, màng phổi, nhiễm khuẩn ñường mật. Tuy
nhiên gặp tại bệnh viện nhiều nhất không chỉ là E. coli gây ỉa chảy mà chính
là gây nhiễm khuẩn vết thương.
1.2.1.3 Chẩn ñoán vi sinh vật
Dựa vào nuôi cấy phân lập xác ñịnh tính chất sinh vật hoá học, ñịnh
type huyết thanh, miễn dịch huỳnh quang, ELISA phát hiện ST, PCR phát
hiện ST hoặc LT.
1.2.2 Klebsiella pneumoniae [2], [4], [35].
Thuộc họ Enterobacteriacae, cư trú ở ống tiêu hoá, trên da và ngoài

môi trường. Ở người khoẻ mạnh chúng chiếm một tỉ lệ thấp trong hệ vi khuẩn
chí ñường ruột.
1.2.2.1 Đặc ñiểm sinh học
- Hình thể, tính chất bắt màu: Là trực khuẩn Gram âm, có vỏ, không có lông
- Nuôi cấy: Nhiệt ñộ thích hợp 37
O
C, dễ mọc trên môi trường thông
thường, khuẩn lạc rất nhầy dạng S, màu ñỏ tím trên môi trường Indo

15

- Tính chất sinh vật hoá học: Lên men các ñường glucose (+), lactose
(+), ngoài ra Oxidase(-), Citrat simmons (+), Urease (+), Indole (-),
H2S (-), di ñộng (-), VP(+), RM(-).
- Kháng nguyên: Có kháng nguyên thân O, K. pneumoniae có rất nhiều
kháng nguyên bề mặt K. Phân loại dựa vào kháng nguyên O có 5
nhóm, dựa vào kháng nguyên K có 80 type huyết thanh.
1.2.2.2 Khả năng gây bệnh
Gây nhiều bệnh như viêm phổi, viêm xoang, viêm tai giữa, nhiễm trùng
máu, vết thương. Đặc biệt viêm phổi sơ sinh do K. pneumoniae tỉ lệ tử vong rất cao.
1.2.2.3 Chẩn ñoán Vi sinh
Dựa vào nhuộm soi, nuôi cấy phân lập xác ñịnh tính chất sinh vật hoá
học, ñịnh type huyết thanh.
1.2.3 Kháng sinh nhóm ß– lactam và cơ chế ñề kháng KS của vi khuẩn
Gram âm sinh ESBL
1.2.3.1 Kháng sinh nhóm ß– lactam [7], [15].
- Cấu trúc kháng sinh nhóm ß– lactam.
Tất cả các kháng sinh nhóm ß–lactam ñều có vòng ß–lactam trong cấu trúc
phân tử. Vòng beta-lactam có cấu trúc không gian hoá học 4 cạnh gồm 3
nguyên tử C và một nguyên tử N.

Sơ ñồ 1.2: Cấu trúc của vòng ß–lactam

16

- Cơ chế tác dụng của KS nhóm ß– lactam
Vi khuẩn tổng hợp vách tế bào cần enzyme transpeptidase (PBP: Penicillin
Binding Protein), xúc tác tạo các liên kết chéo trong hệ thống
peptidoglycans cấu tạo vách tế bào. Kháng sinh nhóm ß–lactam gắn ñược
vào vị trí hoạt ñộng của transpetidase này nên ức chế quá trình tổng hợp
vách tế bào vi khuẩn, từ ñó vi khuẩn dễ dàng bị tiêu diệt.
- Phân loại KS nhóm ß– lactam
Gồm có 2 phân nhóm: penicillins và cephalosporins [7].
 Phân nhóm penicillins:
o Benzylpenicillin
o Phenoxypenicillin
o Penicillin kháng penicillinase (chống tụ cầu)
o Aminopenicillin
o Carboxypenicillin
o Ureidopenicillin (phổ tác dụng rộng)
o Carbapenem
o Nhóm kết hợp chất ức chế beta-lactamase: có tác dụng bất hoạt
các ESBL kể cả lớp A và ESBL lớp D. Ví dụ: Amocillin kết hợp
clavulanic acid (AMC), ampicillin kết hợp sulbactam (SAM),
hay là piperacillin kết hợp tazobactam (TZP)…
 Phân nhóm cephalosporin gồm có:
Cephalosporins thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và thế hệ 4. Các
Cephalosporins phổ rộng như cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone
ñược gọi là oxyimino-beta-lactam. Một số kháng sinh về mặt lý thuyết
và thử nghiệm trên invitro không bị phân hủy bởi ESBL gọi là

cephamycin như: cefoxitin, cefotetan và cefmetazole. Cephamycin gồm