Khảo sát sự tạo rễ bất định cà rốt daucus carota l. Và đánh giá khả năng sinh tổng hợp carotenoid

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ TẠO RỄ BẤT ĐỊNH CÀ RỐT
DAUCUS CAROTA L. VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP CAROTENOID


SVTH: TRẦN TIẾN ĐẠT
MSSV: 60600468
CBHD: TS. LÊ THỊ THỦY TIÊN
BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC



Tp. Hồ Chí Minh, 1/2011

i

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của:
Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên - Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách
Khoa Tp.HCM - đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về các tài liệu, thao tác thí nghiệm
về các vấn đề có liên quan tới nuôi cấy thực vậy in vitro trong đề tài mà tôi thực hiện.
Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương - Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học
Bách Khoa Tp.HCM - đã cho mượn một số đề tài luận văn của các anh chị khóa trên
tham khảo và giúp tôi có thêm tài liệu cần thiết trong quá trình làm luận văn.
Các cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108, 117 của Bộ môn Công nghệ Sinh
Học, Đại học Bách Khoa Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử dụng
các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.
Cha, mẹ, em gái và bạn bè tôi đã luôn động viên tinh thần và giúp đỡ tôi
về mặt kinh tế để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Các bạn sinh viên lớp HC06BSH - Đại học Bách Khoa Tp.HCM - đã
cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc.
Xin gởi đến lời cảm ơn chân thành tới mọi người!.

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Carotenoid là một chất màu rất cần thiết trong đời sống con người với vai trò
cung cấp vitamin A và cũng là một nguồn nguyên liệu thiên nhiên mà ngành công
nghệ thực phẩm đang tập trung khai thác nhằm thay thế cho chất màu tổng hợp. Nuôi
cấy và tăng sinh rễ bất định cây mầm carrot in vitro nhằm đánh giá khả năng thu nhận
hợp chất carotenoid từ rễ. Kết quả cho thấy rễ bất định trong môi trường lỏng B5 bổ
sung saccharose 40 g/l, NAA 1.5 mg/l, trong điều kiện tối với mật độ khởi đầu 0.5 g/5
ml có sự gia tăng sinh khối cao nhất. Hàm lượng carotenoid thu được cao 4.69 µg/g
khi chuyển rễ sang nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí tạm thời trong 4 ngày và 4.61 µg/g
khi môi trường được bổ sung glucose 10 g/l.

iii

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH viii
DANH MỤC ẢNH ix
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu cần đạt 1
1.3. Nội dung nghiên cứu 1
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1. Tổng quan về cà rốt. 2
2.1.1. Đặc điểm sinh học 2
2.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến 2
2.1.3. Thành phần hóa học 3
2.1.4. Công dụng 3
2.2. Carotenoid 4
2.2.1. Tổng quan 4
2.2.2. Cấu trúc và công thức cấu tạo của một số carotenoid. 5
2.2.3. Sinh tổng hợp carotenoid 6
2.2.4. Vai trò của carotenoid đối với đời sống của thực vật và con người 7
2.2.5. Phương pháp tách chiết carotenoid 8
2.2.6. Hướng nghiên cứu mới về sự thu nhận carotene trong tế bào thực vật. 10
2.3. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật. 11
2.3.1. Auxin 11
2.3.1.1. Những ảnh hưởng sinh lý 11
2.3.1.2. Sự thành lập rễ bất định từ cành giâm 12

2.3.2. Gibberellin 13
2.3.3. Cytokinin 14

iv

2.4. Rễ và các phương pháp nuôi cấy rễ để thu hợp chất thứ cấp 15
2.4.1. Vai trò 15
2.4.2. Cấu trúc và sự tăng trưởng của rễ 15
2.4.3. Phân loại rễ 16
2.4.4. Phương pháp nuôi cấy rễ để thu hợp chất thứ cấp 17
2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ bất định in vitro 18
2.6. Một số nghiên cứu về nuôi cấy rễ để thu hợp chất thứ cấp 20
CHƢƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. Vật liệu 22
2.2. Phương pháp 22
2.2.1. Tạo cây mầm in vitro từ hạt giống cây rau mầm cà rốt Nhật TN 10. 23
2.2.2. Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt. 24
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự gia tăng sinh khối rễ. 25
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng saccharose bổ sung lên sự tăng sinh khối
của rễ 25
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng glucose lên sự sinh tổng hợp carotenoid
25
2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện ky. khí tạm thời lên sự sinh tổng hợp
carotenoid ở rễ bất định cà rốt. 26
2.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng carotenoid. 26
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28
3.1. Tạo cây mầm in vitro từ hạt giống cây rau mầm cà rốt Nhật TN 10 28
3.2. Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt. 29
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự tăng sinh khối rễ. 31
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên sự tăng sinh khối của rễ. 32

3.5. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng glucose lên sự sinh tổng hợp carotenoid. . 33
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện kỵ khí tạm thời lên sự sinh tổng hợp .
carotenoid ở rễ bất định cà rốt. 34
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36
4.1 Kết luận 36
4.2 Kiến nghị 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

v

PHỤ LỤC 40

vi

DANH MỤC VIẾT TẮT

2,4-D 2,4-dicholorophenoxyacetic acid
BPA (6-benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine)
CDP-MEP 4-(Cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol
cs cộng sự
DMAPP Dimethylallyl diphosphate
DXP 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate
FPP Fernesyl diphosphate

3
GA
Gibberellin acid
GGPP Geranyl geranyl diphosphate
GPP Geranyl diphosphate
HMBPP Hydroxymethylbutenyl 4-diphosphate

IAA indole-3-acetic acid
IBA indole-3-butyric acid
IPP Isopentenyl diphosphate
kxd không xác định
MEC 2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate
MEP 2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate
NAA naphthaleneacetic acid
Sac Saccharose
USDA United States Department Of Agriculture


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số loại rau củ 3
Bảng 1.2. Hàm lượng các carotenoid ở từng loại củ cà rốt . 9
Bảng 2.1. Thời gian xử lý hiếu khí và kỵ khí. 26
Bảng 3.1. Tỷ lệ hạt nảy mầm và phát triển thành cây mầm hoàn chỉnh trên môi trường
MS sau 14 ngày. 28
Bảng 3.2. Sự tạo rễ bất định từ tử diệp cây mầm cà rốt 30
Bảng 3.3. Sự tạo rễ bất định từ trụ hạ diệp cây mầm cà rốt 30
Bảng 3.4. Nồng độ carotenoid trong rễ bất định sau 14 ngày nuôi cấy trong môi trường
có bổ sung glucose thay đổi. 34
Bảng 3.5. Nồng độ carotenoid trong rễ bất định nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí tạm
thời 34



viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây cà rốt và củ cà rốt 2
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử isoprene 5
Hình 1.3. Một số hợp chất thuộc nhóm carotenoid quan trọng 5
Hình 1.4. Quá trình tổng hợp carotenoid 6
Hình 1.5. Carotenoid trong màng thylakoid 7
Hình 1.6. Lát cắt dọc ngọn rễ 15
Hình 1.7. Hệ thống rễ cọc và rễ chùm 17
Hình 2.1. Quy trình tạo cây mầm in vitro 23
Hình 2.2. Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp 24
Hình 3.1. Hệ số tăng sinh của rễ bất định sau 14 ngày nuôi cấy. 32
Hình 3.2. Hệ số tăng sinh và hàm lượng carotenoid của rễ bất định sau 14 ngày nuôi
cấy 33


ix

DANH MỤC ẢNH
Ảnh 1.1. Màu sắc các loại cà rốt. 8
Ảnh 2.1. Hạt giống cà rốt TN 10 22
Ảnh 2.2 Nút gòn và nút cao su. 26
Ảnh 3.1. Cây mầm sau 14 ngày trên môi trường MS 28
Ảnh 3.2. Rễ bất định từ trụ hạ diệp ứng với NAA 0.5, 1, 1.5 (mg/l) sau 14 ngày nuôi
cấy. 29
Ảnh 3.3. Rễ bất định từ tử diệp ứng với NAA 0.5, 1, 1.5 (mg/l) sau 14 ngày nuôi cấy.
29
Ảnh 3.4. Rễ bất định ở các thể tích môi trường 5, 7.5, 10 ml sau 14 ngày nuôi cấy. 31
Chương 1: Mở đầu
1

CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Trong thực phẩm, carotenoid (là nhóm chất màu rất phổ biến ở thực vật) được dùng
để tạo màu cho nhiều loại sản phẩm khác nhau như bánh kẹo, đồ uống, nước sốt,
kem nhằm thay thế chất màu tổng hợp, tăng giá trị dinh dưỡng nhờ có hoạt tính sinh
học. Nguồn thu nhận hợp chất carotenoid đã được nghiên cứu từ nhiều nguồn nguyên
liệu khác nhau như cà rốt, cà chua, gấc nhưng hiệu suất thu được khá thấp, cần diện
tích lớn đề thu nhận nguyên liệu. Với sự phát triển của công nghệ tế bào thực vật, thu
nhận carotenoid từ rễ bất định in vitro đang được nghiên cứu và phát triển rộng rãi vì
năng suất thu được sản phẩm cao hơn, điều khiển được các yếu tố nuôi cấy nên có thể
công nghiệp hóa được.
Từ thực trạng trên, cây mầm cà rốt được chọn là nguồn nguyên liệu tạo rễ bất định
để đánh giá khả năng thu nhận hàm lượng carotenoid.
1.2. Mục tiêu cần đạt
- Xác định nguyên liệu thích hợp cho sự tạo rễ bất định.
- Thành phần môi trường thích hợp cho sự gia tăng sinh khối rễ.
- Xác định vài yếu tố ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp carotenoid của rễ bất
định cây mầm cà rốt.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Bao gồm 3 nội dung chính:
Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt.
Khảo sát ảnh hưởng của saccharose và thể tích môi trường nuôi cấy lên
sự gia tăng sinh khối rễ.
Khảo sát ảnh hưởng của glucose và điều kiện kỵ khí tạm thời đến sự sinh
tổng hợp carotenoid ở rễ bất định.

Chương 2: Tổng quan tài liệu
2

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về cà rốt.
Còn gọi là hồ la bặc (Trung Quốc). Tên khoa học Daucus carota L., thuộc họ Hoa
tán Umbelliferae [5] .
2.1.1. Đặc điểm sinh học
Cà rốt là một cây sống hai năm, có rễ trụ nhẵn hay có lông. Lá mọc so le,
không có lá kèm, bẹ khá phát triển, phiến lá xẻ lông chim, càng gần phía đầu càng hẹp.
Hoa hợp thành tán kép, tán nhỏ mang hoa trắng hồng hay tía, lá bắc của tổng bao cũng xẻ
lông chim, lá bắc của tiểu bao đơn hay xẻ ba. Đế hoa khum lõm. Lá dài nhỏ ba cạnh, cánh
tràng, mọc so le. Trong tán thì ở giữa bất thụ, màu tía, còn hoa khác thì màu trắng hay
hồng. Quả bế, mỗi đôi gồm hai nửa (phân liệt quả) mỗi nửa dài 2-3mm, hình trứng, hai
phân liệt quả dính với nhau ở mặt giáp nhau, sống phụ có phủ đầy sợi tương ứng với các
ống bài tiết giả. Hạt có phôi nhũ sừng. Rễ trụ, hình dáng thay đổi tùy theo loại. Theo
nghiên cứu của Beille thì cây cà rốt mọc hoang không có củ. Loại hiện nay chúng ta trồng
là một loại lai của hai loài Daucus carota L và Daucus maximus L [5].


Hình 1.1. Cây cà rốt và củ cà rốt
2.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến
Người ta cho rằng cây cà rốt vốn nguồn gốc từ Pháp nhưng hiện nay được
trồng phổ biến ở khắp các nước phương Tây và phương Đông. Đầu tiên là một cây thực

Chương 2: Tổng quan tài liệu
3

phẩm, nhưng hiện nay lại thêm vai trò cây làm thuốc và nguồn nguyên liệu provitamin A.

Trong việc trồng cà rốt người ta còn phân biệt ra ba loại cà rốt: Cà rốt dài và đỏ có thể
trồng ở bất kỳ đất nào, loại củ cà rốt đỏ và dài vừa phải trồng ở những nơi đất ẩm và loại
cà rốt làm thức ăn cho gia súc có năng suất cao hơn có thể trồng ở những nơi đất khô. Cà
rốt phát triển tốt nhất ở 59-65°F [5].
2.1.3. Thành phần hóa học
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số loại rau củ

Nguồn: USDA Natls.
1RAE= 1µg retinol= 2 µg β-carotene trong dầu= 12 µg trong thực phẩm hỗn hợp=
24 µg các dạng provitamin A, carotenoid khác từ thực phẩm hỗn hợp [25].
Ngoài thành phần hóa học của cà rốt như trên bảng 1.1, người ta còn chiết từ cà rốt
một chất insulin thực vật có khả năng làm giảm 1/3 đường của máu. Trong thành phần
chất đạm người ta xác định được asparagine, trong thành phần chất béo gồm palmitic acid
và oleic acid, trong thành phần glucid người ta xác định saccharose (4,6%), glucose (4-
6%) Trong củ và quả có chứa tinh dầu với hàm lượng 0,8-1,6%, trong tinh dầu thành
phần chủ yếu là pinene, limonene, và glycol [5].
2.1.4. Công dụng

Chương 2: Tổng quan tài liệu
4

Các carotene khi vào cơ thể người mới chuyển thành vitamin A nên được gọi là
tiền sinh tố A, nó có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học tương tự vitamin A nhưng ở
người nó được dự trữ ở khắp các mô còn vitamin A được dự trữ ở gan. So với vitamin A
thì carotene ít độc hại hơn vì nó được chuyển dạng theo nhu cầu của cơ thể và ít bị phá
hủy hơn. Một số nhà khoa học đã khuyến cáo nên dùng carotene hơn là vitamin A. Ngoài
ra cà rốt còn có các công dụng:
Tác dụng tăng trưởng: cơ thể phát triển bình thường theo lứa tuổi nhờ có vai trò của
nội tiết tăng trưởng ở tuyến yên. Khi chức năng này bị rối loạn thì trẻ em bị còi xương,
chậm lớn và người trưởng thành thì mau già. Tuy nhiên, các thực phẩm giàu carotene như

cà rốt lại có thể khắc phục khó khăn này bằng cách bổ sung đều đặn vào chế độ ăn của trẻ.
Tác dụng tiêu hóa: cà rốt chữa chứng tiêu chảy ở trẻ em rất hiệu quả. Cà rốt còn có tác
dụng "băng" niêm mạc ruột, tạo ra màng bảo vệ niêm mạc tránh khỏi sự tấn công của các
tác nhân độc hại, tái tạo niêm mạc bị tổn thương.
Tác dụng đối với mắt: vitamin A giúp tăng thị lực, phòng chống các bệnh quáng gà,
nhất là chứng khô mắt dẫn đến mù lòa ở trẻ em.
Tác dụng trên da: do β-carotene có tác dụng bảo vệ và tăng cường phần biểu mô trên
da và niêm mạc, cải thiện dinh dưỡng.
Tác dụng tim mạch: cà rốt chống tích lũy cholesterol gây xơ cứng động mạch ở người
lớn và phòng chống béo phì- là bệnh đáng lo ngại ở trẻ em hiện nay.
Chống ung thư: các nhà khoa học ở Viện Đại học Oxford (Anh) chứng minh β-
carotene là yếu tố quyết định quá trình phòng chống ung thư và đã tạo nên một bước
ngoặt quan trọng trong phòng chống ung thư một cách an toàn, hiệu quả và kinh tế [28].
2.2. Carotenoid
2.2.1. Tổng quan
Carotennoid là nhóm chất màu hòa tan trong chất béo làm cho quả và rau có màu
da cam, màu vàng và màu đỏ. Nhóm này gồm từ 65 đến 70 chất màu tự nhiên, tiêu biểu là
carotene, lycopene, lutein và zeaxanthin. Carotenoid có trong đa số cây (trừ một số nấm)
và hầu như có trong tất cả cơ thể động vật.

Chương 2: Tổng quan tài liệu
5

2.2.2. Cấu trúc và công thức cấu tạo của một số carotenoid.
Năm 1831, Wackenroder đã cô lập carotene từ cà rốt. Năm 1837 Berzelius đặt tên
cho sắc tố màu vàng là xanthophyll được ông chiết xuất từ lá mùa thu. Kể từ đó
carotenoid trở thành đối tượng quan tâm của những nghiên cứu liên ngành trong hóa học,
sinh học, y học, vật lý học và nhiều ngành khoa học khác. Cơ sở cấu trúc hóa học của các
carotenoid là cấu trúc polyisoprene gồm 40 nguyên tử carbon, mỗi carotenoid chứa 8
phân tử isoprene.

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử isoprene
Phần trung tâm phân tử gồm 18 nguyên tử carbon hình thành một hệ thống các
liên kết đôi xen kẽ liên kết đơn, trên đó có gắn thêm 4 nhóm CH3 Vòng ở 2 đầu có thể
giống hoặc khác nhau: ở lycopene, phần trung tâm nối liền với 2 vòng theo kiểu 1-1, ở γ-
carotene là 1-2, ở β-carotene là 2-2 Một số caroteneoid quan trọng như:

β-carotene α-carotene

Cryptoxanthin Zeaxanthin

Lutein Violaxanthin

Hình 1.3. Một số hợp chất thuộc nhóm carotenoid quan trọng


Chương 2: Tổng quan tài liệu
6

2.2.3. Sinh tổng hợp carotenoid
Pyruvate + Glyceraldehyde 3-phosphate
DXP
MEP
CDP-MEP
MEC
HMBPP
Acetyl-coA Mevalonate Isopentenyl diphosphate (IPP)
IPP Isomerase
Dimethylallyl diphosphate (DMAPP)
IPP

H

, PPi
Geranyl Diphosphate (GPP)
FPP synthase
Fernesyl diphosphate (FPP)
GPPP synthase
Geranyl geranyl diphosphate (GGPP)
Phytoene synthase
Phytoene
Phytoene desaturase
Lycopene
Lycopen α-cyclase Lycopen β-cyclase
α-carotene β-carotene

zeinoxanthin β-cryptoxanthin
VitaminA
Lutein Zeaxanthin

Hình 1.4. Quá trình tổng hợp carotenoid [23].


Chương 2: Tổng quan tài liệu
7

2.2.4. Vai trò của carotenoid đối với đời sống của thực vật và con ngƣời
Thực vật: chức năng của carotenoid rất quan trọng đối với sự sinh sản. Màu vàng của
phấn hoa ở cây thụ phấn nhờ sâu bọ là nhờ có carotenoid. Nhưng hiện nay người ta đã
thấy vai trò rất lớn của carotenoid đối với quang hợp. Carotenoid không có khả năng

chuyển hóa trực tiếp năng lượng ánh sáng hấp phụ được thành năng lượng hóa năng trong
các sản phẩm pha sáng của quang hợp (NADPH, H+ và ATP) như diệp lục a mà chỉ có
thể truyển năng lượng hấp thụ được cho diệp lục b (thu chủ yếu ánh sáng lam và cam và
phản chiếu ánh sáng màu vàng lục, có cấu trúc giống diệp lục tố a, chỉ khác nhóm formyl
thay thế cho nhóm methyl ở vòng II) để diệp lục b truyền tiếp cho diệp lục a (thu chủ yếu
ánh sáng lam-tím và đỏ, có màu xanh của lá vì truyền suốt hay phản chiếu phần lớn ánh
sáng này) [8].
Carotenoid + hʋ → carotenoid*
Carotenoid* + diệp lục → carotenoid + diệp lục*

Hình 1.5. Carotenoid trong màng thylakoid
Ở các vùng bước sóng khác nhau của quang phổ, các sắc tố quang hợp được hấp
thụ một cách khác nhau, có vai trò hỗ trợ cho nhau rất tích cực trong quá trình quang hợp
góp phần di chuyển và tận dụng năng lượng ánh sáng vào quá trình đồng hóa thực vật [8].
Động vật: mặc dầu không có khả năng tổng hợp caroteinoid nhưng nhiều động vật lất
carotenoid từ thức ăn hàng ngày. Những động vật này thì carotenoid có vai trò như chất

Chương 2: Tổng quan tài liệu
8

chống oxy hóa, như là nguồn cung cấp tiền chất cho việc tổng hợp vitamin A và cũng là
chất tạo nên màu sắc cho chúng (màu đỏ, cam và vàng ở chim và được tạo ra từ gan) [11].
Con người: vai trò của carotenoid được biết nhiều và nghiên cứu kỹ nhất đó là nguồn
cung cấp tiền chất để tổng hợp vitamin A. β-carotene là một loại carotenoid phổ biến nhất
được tìm thấy trong thực phẩm và là tiền chất chủ yếu của vitamin A. β-carotene có màu
cam, thường thấy trong các loại trái cây và rau quả có màu cam như cà rốt, bí ngô, đào,
khoai lang đỏ, nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ vai trò và lợi ích của β-carotene trên hệ
miễn dịch, ngăn ngừa nhiều loại ung thư và giảm tác hại của ánh nắng mặt trời. Vì β-
carotene có thể chuyển thành vitamin A trong cơ thể, cho nên nó cũng có những tác dụng
tương tự loại vitamin này. Các chuyên gia còn phát hiện nhiều lợi ích từ β-carotene hoàn

toàn độc lập với tác dụng giống vitamin A của nó [13].
2.2.5. Phƣơng pháp tách chiết carotenoid
Thông thường ở thực vật lượng caroten phụ thuộc vào màu của nó. Rau xà lách
màu xanh nhạt chứa ít caroten hơn rau màu xanh sẫm. Người ta đã xác định được rằng ở
các mô của thực vật xanh giàu chlorophyll thì đồng thời hàm lượng của carotene cũng
cao. Các sản phẩm giàu carotene hơn cả là ớt, cà rốt, bí đỏ, gấc, hành lá… Hàm lượng
carotene ở thực vật cũng biến đổi theo từng bộ phận và theo mùa, vì vậy, việc nghiên cứu
sự tích lũy carotene ở thực vật có ý nghĩa quan trọng trong việc đảm bảo vitamin A cho
người cũng như cho các động vật chăn nuôi.

Ảnh 1.1. Màu sắc các loại cà rốt.

Chương 2: Tổng quan tài liệu
9

Bảng 1.2. Hàm lượng các carotenoid ở từng loại củ cà rốt [25].
Màu cà rốt
Total (ppm)
α-carotene
β-carotene
Luteine
Lycopene
Cam

Surles và cs (2004)
22
128
2.6
kxd
Sun và cs (2009)

27
69
0.4
0.6
Alasalvar và cs (2001)
40
69
kxd
kxd
Nicolle và cs (2004)
13-31
32-66
0.6-1.8
kxd
El-Quadah (2009)
47.1
47.5
kxd
kxd
Rodriquez-Amaya và cs (2008)
10-22
18-38
kxd
kxd
Grassmann và cs (2007)
57-70
45-52
4-5
kxd
Cam sẫm

Surles và cs (2004)
31
185
4.4
17
Sun và cs (2009)
45
113
0.7
0.9
Nicolle và cs (2004)
75.8
172
1
kxd
Simon và cs (1989)
96-192
215-311
kxd
kxd
Vàng

Surles và cs (2004)
0.5
1.8
5.1
kxd
Sun và cs (2009)
0.2

3.6
2.4
0.04
Alasalvar và cs (2001)
kxd
kxd
kxd
kxd
Nicolle và cs (2004)
kxd
3.3
1.4-2.3
kxd
Grassmann và cs (2007)
kxd
kxd
5-10
kxd
Đỏ

Surles và cs (2004)
1.1
3.4
3.2
61
Sun và cs (2009)
0.2
22
0.2
50

Grassmann và cs (2007)
0-4
35-40
0-3
85-100
Tím trắng

Grassmann và cs (2007)
2-3
2-3
9-10
kxd
Tím cam

Surles và cs (2004)
4
123
11
kxd
Sun và cs (2009)
10
28
1.1
0.2
Alasalvar và cs (2001)
87
161
kxd
kxd
Grassmann và cs (2007)

62-100
65
8-10
kxd
Tím vàng

Sun và cs (2009)
2
15
3
0.4
Nicolle và cs (2004)
kxd
3.1-3.8
1.8-2.2
kxd
Trắng

Surles và cs (2004)
kxd
0.06
0.09
kxd
Sun và cs (2009)
0.05
0.34
1.7
0.04
Alasalvar và cs (2001)
kxd

kxd
kxd
kxd

Chương 2: Tổng quan tài liệu
10

Phương pháp định tính: Các vitamin A và caroten cho màu xanh với dung dịch
bão hòa SbCl2 trong chloroform (phản ứng Carr & Price). Cơ chế của phản ứng là sự
halogen hóa của các liên kết đôi trong phân tử vitamin A, hợp chất thu được có màu xanh
[11].
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đã được ứng dụng để xác định một số
carotenoid quan trọng trong rau quả như lutein, zeaxanthin, lycopene, α-carotene và β-
carotene. Hai phương pháp chính được khảo sát là phương pháp của Hart và Scott (1995)
và phương pháp theo AOAC (1984). Các carotenoid được định tính và định lượng trên
sắc ký lỏng với các detector UV-VIS và PDA.
Phương pháp định lượng: hầu hết các chất thuộc nhóm carotenoid đều có tính
phân cực, có khả năng tan trong dung môi hữu cơ và sẽ tan tốt trong dung môi nào phân
cực tốt hơn. Vì vậy, 0.5g rễ cà rốt sau khi nghiền được đem trích với các dung môi
(acetone, ethanol ), sau khi phá vỡ tế bào thì cho 20ml dung môi vào, ngâm trong 5 phút.
Dịch trích sau khi được lọc cho vào ống nghiệm rồi tiến hành đo OD tại các bước sóng
663.2 nm, 646.8 nm, và 470 nm. Chlorophyl a hấp thu cực đại ở bước sóng 663.2 nm,
chlorophyl b hấp thu cực đại tại bước sóng 646.8 nm và carotenoid hấp thu cực đại tại
470 nm. Hàm lượng chlorophyl a, chlorophyl b và tổng carotene được xác định theo công
thức của Lichtenthaler và Welburn (1983) [17, 19]:
Đối với dung môi acetone 80%:
Chlorophyl a (
C
a
) = 12.25

663.2
A
-2.79
646.8
A
(µg/ml).
Chlorophyl b (
C
b
) = 21.50
646.8
A
- 5.10
663.2
A
(µg/ml).
Caroten tổng
C
(x+c)
= (1000
470
A
- 1.82
C
a
- 85.02
C
b
)/198 (µg/ml).
2.2.6. Hƣớng nghiên cứu mới về sự thu nhận carotene trong tế bào thực vật.

Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiều hợp
chất thứ cấp vẫn còn khó tổng hợp hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt.
Chẳng hạn, một số hỗn hợp phức tạp như tinh dầu hoa hồng là không thể tổng hợp hóa
học được. Với một số ưu điểm của phương pháp nuôi cấy in vitro như không phụ thuộc

Chương 2: Tổng quan tài liệu
11

vào thời tiết và địa lý, không cần bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô, có thể
kiểm soát chất lượng và hiệu suất sản phẩm và chất lượng sản phẩm thứ cấp đạt chất
lượng cao thì đây là một hướng nghiên cứu đầy tiềm năng trong tương lai. Và một hướng
mới để phân tích trực tiếp carotenoid trong các mô thực vật nguyên vẹn gần đây đã được
chứng minh bằng cách sử dụng khai triểu Fourier cho phổ Raman (Baranski và cs, 2006).
Mặc dù carotenoid có mặt trong cà rốt như một thành phần vi lượng ở mức ppm, nhưng
phương pháp xác định bằng phổ Raman có thể đạt được độ nhạy cao bởi vì có sự khuếch
đại tín hiệu cộng hưởng hiệu quả đối với cơ chất carotenoid (Ozaki). Đặc điểm này cho
phép các nghiên cứu đo lường được thực hiện tại cùng một mẫu mà không gây ra bất cứ
tổn hại nào. Do nhu cầu nhằm tăng cao lượng chất dinh dưỡng có giá trị trong cây cà rốt
đòi hỏi nhiều thông tin hơn về sự điều hòa sinh tổng hợp và tích lũy carotenoid. Phổ
Raman có thể cung cấp sự tích lũy carotenoid trực tiếp khi còn đang ở trong mô tế bào,
không cần tách ra khỏi tế bào và đây là nền tảng nghiên cứu về sự điều hòa hoạt động tích
lũy carotenoid [21].
2.3. Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật.
Sự tăng trưởng và phát triển của thực vật giống như những sinh vật khác được điều
hòa bởi bộ gen và các yếu tố môi trường. Nhiều hoạt động tăng trưởng của thực vật chịu
sự điều khiển bởi các chất điều hòa tăng trưởng thực vật hay các hormone thực vật [1].
2.3.1. Auxin
Auxin chủ yếu của thực vật là indole-3-acetic acid (IAA). Người ta chấp nhận
rằng IAA được tổng hợp từ tryptophan, một amino acid, trong hạt phấn và những mô sinh
trưởng hoạt động như mô phân sinh chồi, khối sơ khởi của lá, lá non đang lớn, hột đang

phát triển và trải qua con đường khử amin, khử carboxyl và oxy hóa.
2.3.1.1. Những ảnh hưởng sinh lý
Auxin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Vài ảnh hưởng quan
trọng của auxin điều hòa các quá trình sinh lý của thực vật có thể kể đến như sau:
 Sự kéo dài tế bào: do auxin tác động làm giảm tính chống chịu của vách tế bào đối
với sức căng. Điều này gây ra sự bẻ gãy những liên kết không cộng hóa trị giữa

Chương 2: Tổng quan tài liệu
12

xyloglucans và cellulose trong vách tế bào và tạo sự thay đổi về những chế độ nước với tế
bào. Ngay cả khi áp suất thẩm thấu trong tế bào không thay đổi, thế năng nước trong tế
bào được xử lý với auxin trở nên yếu hơn do sự giãm thế năng áp suất. Sự giảm thế năng
nước cho phép nước di chuyển vào bên trong tế bào và tạo ra một áp suất về phía vách tế
bào có tính dẻo tạo ra sự vươn dài. Khi vươn dài hoàn tất, những liên kết không cộng hóa
trị giữa cellulose và những polysaccharide tái lập trở lại và quá trình này không thuận
nghịch.
 Quang hướng động.
 Địa hướng động.
 Ưu thế chồi ngọn: được biết là nguyên nhân khống chế sự phát triển của chồi bên.
Khi cắt chồi ngọn, chồi bên sẽ phát triển. Tuy nhiên theo thời gian, chồi bên phát triển trội
lên và ức chế sự phát triển của những chồi bên mọc sau.
 Sự tượng rễ: áp dụng auxin ngoại sinh có thể kích thích sự tượng rễ và sự phát
triển sớm của rễ, trái lại sự vươn dài của rễ nói chung bị ức chế trừ khi áp dụng nồng độ
đủ nhỏ.
 Sự sản sinh ethylene: sự kích thích sản sinh ethylene gây ra do auxin được ghi
nhận đầu tiên trên cà chua bởi Zimmerman và Wilcoxon (1935).
 Trinh quả sinh: là sự phát triển của trái không qua quá trình thụ tinh. Ảnh hưởng
của auxin lên trinh quả sinh thì không nổi bật bằng ảnh hưởng của gibberellin lên quá
trình này [1].

2.3.1.2. Sự thành lập rễ bất định từ cành giâm
Khả năng của nhiều loài cây và nhiều phần của cây có khả năng tạo rễ bằng
cách giâm dưới những điều kiện thích hợp là yếu tố quan trọng trong việc nhân giống khi
được kết hợp với hóa chất thích hợp, tác nhân cơ học và những điều kiện môi trường. Von
Shachs (1882) cho rằng có một chất hay những chất nào đó trong lá, nụ và tử diệp của cây
đã di chuyển đến rễ và kích thích sự tạo rễ. Hormone này đã được Bouillene và Went
(1993) gọi là zhizocaline và cho đến ngày nay vẫn là một chất mang tính giả thuyết.
Những nhóm kích thích sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin, ethylene, cũng như

Chương 2: Tổng quan tài liệu
13

những chất ức chế như abscisic acid, và phenolic đều có ảnh hưởng lên sự khởi sinh rễ.
Ngày nay, auxin được biết là nhóm có ảnh hưởng lớn nhất trên sự tạo rễ và đã được
thương mại hóa.
Các chất tổng hợp như IBA và NAA đã cho hiệu quả kích thích tạo rễ hơn
cả IAA. Có nhiều báo cáo cho rằng auxin liên quan đến sự khởi tạo rễ bất định và sự phân
chia đó của những khởi đầu thì phụ thuộc vào auxin nội sinh hay ngoại sinh. Auxin cũng
ức chế tạo rễ với nồng độ cao. Trong nhiều trường hợp, tính nhạy cảm với chất sinh
trưởng thực vật thì quan trọng hơn nồng độ. Nghiên cứu với mô thực vật chuyển gene cho
thấy rằng sự truyền plasmid Ri (root-inducing) vào trong mô thực vật đã gia tăng tính
nhạy cảm của chúng với auxin.
Nếu tỉ lệ cao của cytokinin/ auxin kích thích sự phát triển chồi và ức chế sự
phát triển rễ. Gibberellin thì ức chế sự thành lập rễ, ABA ức chế sự phát triển rễ và
ethylene kích thích sự thành lập rễ bất định [1].
2.3.2. Gibberellin
Là một nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật có sườn ent-gibberellane (tương
tự như gibberellin) và có những chức năng điều hòa tương tự như gibberellin acid (
3
GA

).
Những ảnh hưởng sinh lý của gibberellin
Gibberellin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Tuy nhiên ở
những chi, loài với những yếu tố khác nhau sẽ quyết định gibberellin đặc hiệu hiệu quả
nhất. Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật
như sự phát triển thân, sự nảy mầm của hột, miên trạng, trổ hoa, phân hóa giới tính, đậu
trái và lão hóa.
Sự phát triển của thực vật sống: các gibberellin đã biết đều có khả năng kích
thích sự vươn dài của thân hay sự phân chia tế bào. Sự kích thích vươn dài của gibberellin
thể hiện rất rõ trên những cây non hoặc bộ phận non, ở cây đã trưởng thành hay cơ quan
đã già thì ảnh hưởng sẽ kém đi.

Chương 2: Tổng quan tài liệu
14

Ảnh hưởng lên tính trạng lùn: có nhiều biến dị thiếu sinh tổng hợp gibberellin
đã được phát hiện. Đây là tính trạng đơn gene, kích thước của cây biến dị có thể chỉ bằng
một phần năm cây bình thường và sự lùn chủ yếu là do lóng bị ngắn lại.
Sự nảy mầm của hột và miên trạng: gibberellin có thể kích thích hoạt động
của các enzyme thủy phân hydrolase trong hột ngũ cốc. Tác động này có tác dụng kích
thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng.
Sự trổ hoa: gibberellin có khả năng thúc đẩy quá trình trổ hoa trong nhiều loài
thực vật [1].
2.3.3. Cytokinin
Cytokinin là những hợp chất dẫn xuất từ adenine, nó kích thích sự phân chia tế
bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như kinetin (6-
furfurylaminopurin). Cytokinin được tìm thấy ở hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm, vi
khuẩn Hiện tại có hơn 200 cytokinin tự nhiên và tồng hợp đã được phát hiện.
Những ảnh hưởng sinh lý của cytokinin
Phân chia tế bào và tạo thành cơ quan: vai trò chính của cytokinin trong cây

là kích thích sự phân chia tế bào. Callus có thể được tạo thành ban đầu chỉ cần auxin hoặc
cytokinin riêng lẻ. Tuy nhiên để duy trì sự phát triển của callus, sự kết hợp của auxin và
cytokinin tỏ ra cần thiết.
Sự nảy mầm, sự mở rộng của tế bào và cơ quan: cytokinin được biết là chất
kích thích sự phân chia tế bào, tuy nhiên vẫn có những trường hợp cho thấy được ảnh
hưởng của cytokinin lên sự mở rộng của tế bào. Cytokinin kích thích sự mở rộng tế bào
trục hạ diệp được cắt từ cây củ cải, bí rợ, cây lanh và nhiều cây song tử diệp khác. Sự mở
rộng của tế bào là do sự hấp thu nước gây ra do sự giảm thế năng thẩm thấu của tế bào
được kích thích bởi sự biến đổi trở lại của lipid dự trữ trong trụ hạ diệp thành đường khử.
Sự tượng rễ và sự phát triển rễ: cytokinin có thể kích thích hoặc ức chế sự
khởi đầu và phát triển của rễ tùy theo nồng độ và thời gian xử lý. Kinetin có thể kích thích
sự gia tăng trọng lượng khô và sự vươn dài của rễ cây đậu lupin con, trái lại hai yếu tố

Chương 2: Tổng quan tài liệu
15

trên bị ức chế ở nồng độ kinetin cao. Khi kinetin được xử lý lên rễ ở nồng độ thấp, nó
kích thích quang hợp và sinh trưởng.
Sự phát triển nụ và chồi: cytokinin có khả năng kích thích chồi bên và đặc
biệt là vượt qua ảnh hưởng ưu thế chồi ngọn.
Trì hoãn sự lão hóa và kích thích sự vận chuyển chất dinh dưỡng và những
hợp chất hữu cơ: cytokinin có thể giúp làm giảm quá trình lão hóa khi tách lá ra khỏi thân
cây và hoạt động như là chất thay thế cho sự cần thiết của rễ để giảm lão hóa [1].
2.4. Rễ và các phƣơng pháp nuôi cấy rễ để thu hợp chất thứ cấp
2.4.1. Vai trò
Cây bám được vào đất nhờ hệ thống rễ. Rễ đầu tiên xuất hiện ở cây con là rễ sơ
cấp, sau đó từ rễ sơ cấp sẽ xuất hiện những rễ bên gọi là rễ thứ cấp, còn rễ bất định là
những rễ xuất hiện không từ thành phần của hệ thống rễ. Vai trò của rễ là giúp cây bám
chặt vào giá thể, hấp thu và vận chuyển nước và các chất khoáng, dự trữ các chất dinh
dưỡng hữu cơ trong cây [7].

2.4.2. Cấu trúc và sự tăng trƣởng của rễ

Hình 1.6. Lát cắt dọc ngọn rễ