một số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc adn và những ứng dụng trong nghiên cứu vi khuẩn

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự bùng nổ của các bệnh nhiễm trùng thường do kết quả của tình trạng
phơi nhiễm với nguồn lõy. Nhìn chung, những căn nguyên gõy ra sự bùng nổ
của bệnh nhiễm trùng hay bắt nguồn từ một loại tế bào vi sinh vật riêng lẻ. Vì
vậy, các thế hệ sau của chúng giống nhau về gen hoặc có quan hệ gần với vi
sinh vật bắt nguồn gõy bệnh (source organism). Trong nghiên cứu về các giai
đoạn dịch tễ học, những vi sinh vật có liên quan đến sự bùng nổ dịch đều có
mối liên quan về dòng tế bào, tức là có nguồn gốc chung. Vi sinh vật có liên
quan về dòng tế bào, là thành viên của cùng một loài giống nhau nên có
chung yếu tố độc lực, những đặc điểm sinh hóa và đặc điểm về gen. Tuy
nhiên, nếu những chủng vi sinh vật được phõn lập từ các nguồn khác nhau ở
thời điểm và địa lý khác nhau thì có thể đủ sự khác biệt ở mức độ loài hoặc
phõn loại dưới typ (subtype) hay chủng (strain).
Quy trình phõn loại dưới typ rất quan trọng trong dịch tễ học để xác
định sự bùng nổ của các bệnh nhiễm trùng, phát hiện sự lõy truyền chéo của
các nguồn bệnh trong bệnh viện, xác định nguồn gốc của nhiễm trùng, phát
hiện những chủng vi sinh vật độc lực cụ thể và kiểm soát chương trình tiêm
chủng vacxin [32].
Phõn loại dưới loài (subtyping) hoặc phõn loại các chủng đã được thực
hiện bởi nhiều phương pháp khác nhau, những phương pháp này phải có khả
năng đưa ra tiêu chuẩn chung để dễ dàng sử dụng rộng rói. Trong phõn loại
dưới loài, tất cả các vi khuẩn trong một loài phải được phõn loại bởi nhiều
phương pháp khác nhau đã được sử dụng. Tuy nhiên, với những phương pháp
phõn loại dựa theo đặc điểm kiểu hình (phenotype), chẳng hạn như: phương
pháp dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể hoặc sự xuất hiện receptor
của bacteriophage hoặc bằng các đặc điểm sinh học cụ thể không xuất hiện ở
tất cả những chủng vi khuẩn trong cùng một loài. Typ huyết thanh (serotype)
1
có thể chỉ xác định được bằng sự xuất hiện của dấu ấn huyết thanh học
(serological marker). Ví dụ: 10 – 15% chủng Mycobacterium avium không có
khả năng định typ huyết thanh bởi vì những chủng này không ngưng kết với

bất kỳ kháng huyết thanh mẫu. Tương tự, phương pháp phõn loại theo
bacteriopgage thường được áp dụng để đánh giá đặc điểm của Staphylococcus
aureus, trong đó một số chủng S. aureus phõn lập được thiếu receptor của
bacteriophage, do đó không thể phõn được loại theo phương pháp này [25].
Một số phương pháp phõn loại dưới loài có khả năng phõn biệt
(differentiation power) cao nên phõn loại rừ ràng được các chủng vi khuẩn
không có mối liên quan với nhau, chẳng hạn do sự khác biệt về địa lý và
nguồn gõy nhiễm trùng [36].
Vấn đề rất quan trọng đối với những phương pháp phõn loại dưới loài
là phải có độ tái lặp (reproducibility) [36]. Độ tái lặp của một kỹ thuật là khả
năng tạo ra những kết quả lặp lại giống nhau với một chủng cụ thể sau nhiều
lần thực hiện. Độ tái lặp đặc biệt quan trọng để giải thích cơ sở số liệu một
cách tin cậy trong phõn loại vi khuẩn, bao gồm các chủng chưa biết trong
cùng một loài hay đối với những chủng chưa biết rừ loài đều có thể được so
sánh để phõn loại. Phối hợp với những phương pháp xác định sự khác nhau
của đặc điểm kiểu hình (phenotypic characteristics), cũng như sự biểu hiện
lác đác (sporadic) của các gen độc lực hoặc đặc điểm kháng nguyên cũng có
thể góp phần vào việc nõng cao mức đánh giá độ tái lặp [36].
Nhiều kỹ thuật sinh học phõn tử được dùng hiện nay để phõn loại
(genotype) vi khuẩn dựa trên phõn tích các đoạn ADN với những độ dài khác
nhau trên thạch điện di, kết quả được thể hiện bởi tớnh đa dạng của các mẫu
(pattern) băng (band) điện di trên thạch (gel). Mỗi mẫu băng này rất phức tạp,
do đó để thuận tiện cho phõn tích các mẫu băng cần phải dựa trên cơ sở giải
thích và xác định mối liên hệ. Đõy là một yếu tố hữu ích trong đánh giá từng
2
phương pháp phõn loại cụ thể [25][36]. Vì vậy, cùng với việc đánh giá mức
độ thuận tiện của những phương pháp phõn loại cụ thể, khả năng giải thích
kết quả và sự thuận tiện trong tiến hành kỹ thuật cũng rất quan trọng. Những
khó khăn về kỹ thuật, giá cả và thời gian thực hiện cũng phải được đánh giá
trong việc lựa chọn của mỗi phương pháp phõn loại cụ thể [24][36].

Nhược điểm của phương pháp phõn loại dựa trên kiểu hình là nguồn
gốc cho sự phát triển của các phương pháp phõn loại dựa trên kiểu gen hoặc
trình tự ADN. Những phương pháp phõn loại dựa trên cấu trúc ADN có khả
năng giảm tối đa hạn chế có liên quan đến khả năng phõn loại (typeability) và
độ tái lặp (reproducibility). Ngoài ra, trong một số trường hợp những phương
pháp phõn loại dựa vào cấu trúc ADN có thể thiết lập được một số lượng lớn
cơ sở dữ liệu về đặc điểm của các vi khuẩn. Vì vậy, tôi thực hiện chuyên đề:
"Một số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc ADN và
những ứng dụng trong nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae"
nhằm giải quyết 2 mục tiêu:
1. Xác định nguyên lý, ứng dụng của một số phương pháp phõn
loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc ADN và so sánh ưu điểm, nhược điểm
của từng phương pháp.
2. Ứng dụng của các phương pháp phõn loại sinh học phõn tử
trong nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae.
3
Chương I
NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG
CỦA MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI KHUẨN
1.1. Nguyên lý và ứng dụng của một số kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng
trong phân loại vi khuẩn
1.1.1. PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): Kỹ thuật điện di trong
trường xung điện (điện di trong trường điện thay đổi) [1], [2], [3], [25], [35]
PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) thường được xem là "tiêu
chuẩn vàng - gold standard" của các phương pháp sinh học phõn tử dùng
trong phõn loại vi khuẩn. Đối với kỹ thuật PFGE, các chủng vi khuẩn nghiên
cứu được nuôi cấy trên môi trường lỏng hoặc môi trường thạch, sau đó sẽ hòa
vi khuẩn vào thạch agarose lỏng rồi đổ vào những khuôn nhỏ (small molds),
kết quả miếng thạch sau khi đổ được cắt và tạo ra các nút thạch (plugs) nhỏ có

chứa toàn bộ tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn được cố định trong thạch sẽ chịu tác
dụng của enzym ly giải tế bào để giải phóng toàn bộ ADN, tiếp theo ADN của
vi khuẩn sẽ bị giáng hóa dưới tác dụng phõn cắt tại những vị trí đặc hiệu bởi
enzym giới hạn. Các nút thạch (plugs) chứa ADN sau khi đã được phõn cắt
được đặt vào những giếng (wells) tương ứng trên khuôn thạch agarose và tiến
hành điện di. Trong đó, bộ điện di được đặt với dòng điện thay đổi ở các
khoảng được xác định trước sao cho điện trường phải cho phép các đoạn
ADN có kích thước lớn khoảng 10 - 800 kb phõn tách rời được với nhau. Mẫu
thạch sau điện di sẽ được nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang như ethidium
bromide và quan sát dưới đốn cực tớm (UV light). Kết quả phõn tích ADN
trên thạch được chụp ảnh và số liệu có thể được lưu giữ bằng một trong các
hệ thống kỹ thuật số thương mại, như sản phẩm của Alpha-Innotech, Bio-Rad,
4
Hitachi hoặc Molecular Dyamics. Phõn tích số liệu có thể được thực hiện bởi
sử dụng một số phần mềm thương mại sẵn có ở Applied Math, Bio-Rad,
BioSystematics, Bio-numerics, Media Cybernetics hoặc Scanalytics.
Bảng 1.1: Tiêu chuẩn phân loại các mức độ liên quan về gen giữa các
chủng vi khuẩn của bằng kỹ thuật PFGE [35].
Số đoạn ADN (band)
khác nhau
Mối liên quan
0
Không thể phân biệt được
(Indistinguishabble)
2 - 3 Có mối liên quan gần (Closely related)
4 - 6 Có thể có liên quan (Possbly related)
≥ 7 Khác nhau hoàn toàn (Different)
Tenover và cộng sự [35] đã đưa ra một hệ thống tiêu chuẩn để giải
thích những mẫu PFGE trong mối tương quan để xác định sự liên quan giữa
các chủng vi khuẩn phân lập được. Trong đó, những chủng vi khuẩn này

tương ứng sẽ tạo ra các mẫu PFGE hoàn toàn giống nhau được xem là có
nguồn gốc từ một chủng (Indistinguishabble). Những chủng vi khuẩn phân
lập được khác nhau bởi xảy ra một biến cố về gen, sẽ phản ánh bởi sự khác
nhau 2 – 3 băng trên thạch điện di và được xem là có mối liên quan gần
(Closely related). Những chủng phân lập được khác nhau bởi 4 – 6 băng trên
thạch điện di do xuất hiện 2 biến cố độc lập của gen, được xem là có thể có
liên quan với nhau (Possbly related). Những chủng phân lập được khác nhau
bởi 6 băng hoặc nhiều hơn trên thạch điện di, do xuất hiện sự thay đổi bởi 3
hoặc nhiều hơn biến cố độc lập của gen, được xem là không có mối liên quan
với nhau (Different). Tiờu chuẩn này có thể áp dụng được đối những nghiên
5
cứu ở địa phương nhỏ, trong đó sự khác biệt về gen được xem là có giới hạn
(bảng 1.1).
Đối với những nghiên cứu lớn, xác định các mẫu băng khác nhau trên
thạch điện di của vi khuẩn dựa trên sự phõn cắt phõn tử ADN bởi enzym giới
hạn trong kỹ thuật PFGE được chứng minh là tốt hơn so với hầu hết các
phương pháp dùng trong phõn loại vi khuẩn dựa trên tớnh chất sinh hóa hay
kỹ thuật sinh học phõn tử khác. Kỹ thuật này có độ tách biệt (discriminatory)
và độ tái lặp (reproducibility) tốt hơn cả so với các phương pháp khác dùng để
phõn loại vi khuẩn, cụ thể, với các loài vi khuẩn: Escherichia coli, Entercocci
kháng vancomycin, Staphylococcus aureus, loài Acinetobacter, Pseudomonas
aeruginosa và Mycobacterium avium [25]. Ngoài ra, PFGE có hiệu quả hơn
đối với khả năng phân biệt (differentiate) các chủng Staphylococcus aureus
kháng methicillin so với các phương pháp khác. PFGE cũng có khả năng tách
biệt tốt hơn so với kỹ thuật Repetitive Element Sequence-base PCR (Rep –
PCR) được dùng để phõn biệt phức hợp Acinetobacter calcoaceticus -
Acinetobacter baumannii, Entercocci kháng vancomycin, Neisseria
gonnorhoeae và Pseudomonas aeruginosa [25]
Hiện nay, với sự giúp đỡ của máy tính và phần mềm phõn tích kết quả
điện di trên thạch, PFGE có thể tạo ra ngõn hàng số liệu về những mẫu phõn

tớch ADN với hầu hết tất cả các loại vi khuẩn. Vì vậy, những mẫu này có thể
tạo ra cơ sở dữ liệu tham khảo, so sánh đối với một số chủng mới để xác định
quan hệ phát sinh loài (phylogenetic relationship). Khả năng này được phản
ánh bởi một số báo cáo về an toàn thực phẩm, các nghiên cứu đưa ra 2 sự
chấp nhận đối với kỹ thuật này, đó là: (I) để nõng cao khả năng giám sát sự
bùng nổ ngộ độc thức ăn do vi khuẩn, cần thiết phải thực hiện kỹ thuật ADN
fingerprinting (trong đó, PFGE là tiêu chuẩn vàng) để xác định nguồn gốc của
yếu tố gõy nhiễm trùng và (II) để thiết lập một mạng lưới giúp cho việc so
6
sánh ADN fingerprinting thuận tiện, cho phép lưu giữ ở những trang web
thường trực để chia sẻ số liệu một cách nhanh chóng [25], [32], [36]
Tuy nhiên, một trong những yếu tố làm giới hạn việc sử dụng phương
pháp PFGE là thời gian có liên quan đến hoàn thành quá trình phõn tích. Mặc
dù các bước thực hiện không phức tạp, nhưng thời gian để hoàn thành là 2
đến 3 ngày. Điều này làm giảm khả năng phõn tích một lượng lớn mẫu chủng
vi khuẩn.
1.1.2. Kỹ thuật Southern blotting và RFLP (Kỹ thuật đa hình chiều dài các
đoạn ADN cắt ngẫu nhiên bới các enzym giới hạn)
Southern blotting do Edward Southern phát minh ra năm 1975. Kỹ
thuật này đã được sử dụng nhiều năm để phát hiện và xác định sự có mặt một
gen (một trình tự gen) nào đó trong bộ gen của tế bào sinh vật Eukaryote và
Prokaryote. Để phát hiện gen này, trước hết cần tách chiết ADN bộ gen của tế
bào, toàn bộ phõn tử ADN được phõn cắt bởi enzym giới hạn thành các đoạn
nhỏ, và các đoạn ADN nhỏ này được phõn tách bởi quá trình điện di trên
thạch agarose. Những đoạn ADN sau khi phõn tách sẽ được di chuyển từ
thạch agarose tới màng nitrocellulose hoặc nylon bằng kỹ thuật Southern
blotting (Gây biến tính ADN trên gel bằng dung dịch kiềm, thông thường là
NaOH 0,5N; NaCl 1,5N. Sau đó, chuyển các đoạn ADN từ bản gel lên màng
lai bằng sức mao dẫn). Vị trí của các đoạn ADN trên gel được giữ nguyên khi
chuyển lên màng lai [1], [2], [3]. Acid nucleic gắn trên màng sau đó được lai

với một hoặc nhiều mẫu dò được đánh dấu (labelled probes) có trình tự tương
đồng với đoạn gen được nghiên cứu, tạo nên các phõn tử ADN lai (các mẫu
dò có thể được đánh dấu với một nửa mẫu dò, bao gồm: chất phóng xạ hoặc
cơ chất có màu với hoạt tớnh enzym hoặc cơ chất huỳnh quang với hoạt tớnh
enzym). Sau đó, rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò thừa, thấm khô và thực
hiện ghi hình phóng xạ bằng phim X-quang với chất đánh dấu là phóng xạ
7
hoặc đo huỳnh quang hay phát hiện sự xuất hiện màu trên màng lai tùy theo
phương pháp gắn chất đánh dấu đã được sử dụng. Phương pháp cổ điển trên
hiện nay đã được điều chỉnh phù hợp với khả năng phõn biệt các chủng vi
khuẩn dựa trên cơ sở quan sát tớnh đa dạng của những băng ADN được tạo ra
do sự phõn cắt bởi enzym giới hạn tại những vị trí nhận dạng đặc hiệu trên
gen cụ thể từ chủng này tới chủng khác. Kết quả những băng ADN được tạo
ra trên thạch sẽ khác nhau về kích thước giữa các chủng vi khuẩn khác nhau.
Vì vậy, kỹ thuật với tên RFLP (restriction fragment length polymorphism) ra
đời với bản chất xác định sự đa dạng tự nhiên của các vị trí có trình tự đặc
hiệu nằm trên gen mà enzym giới hạn có khả năng nhận diện và cắt. Kỹ thuật
này tạo nên các đoạn ADN khác nhau được phõn biệt bằng điện di đồ, những
đoạn cắt này cũn được gọi là các “dấu võn tay” đặc trưng cho từng phõn tử
ADN. Xử lý những mẫu ADN bằng cùng một cặp enzym giới hạn, các bộ gen
có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng đoạn cắt có chiều dài khác nhau, cũn
những bộ gen hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau. Bản đồ
di truyền kết quả RFLP có tớnh chớnh xác cao, thường được sử dụng trong
nghiên cứu định loại nguồn gốc và mức độ tiến hóa của các loài sinh vật [1],
[2]. Trong kỹ thuật RFLP, chỉ có những đoạn gen (ADN) được lai hóa với
mẫu dò mới có thể thấy được qua phõn tích bằng RFLP, điều này làm đơn
giản hóa cho quá trình phõn tích các mẫu ADN fingerprinting rất nhiều [25].
Những mẫu dò đặc hiệu với gen đã được sử dụng để phõn loại dưới loài
đối với các vi khuẩn như Brucella, Legionella pneumophila và Pseudomonas
aeruginosa. Hơn thế nữa, ribotyping, một dạng khác của RFLP – Southern

blotting sử dụng những mẫu dò bắt nguồn từ gen rARN 16S và 23S được áp
dụng thành công ở nhiều nghiên cứu để phõn biệt các chủng vi khuẩn [25].
Kết quả phõn tích ribotyping chỉ cho một số lượng nhỏ các băng, do đó đơn
8
giản cho phõn tích. Tuy nhiên, điều này cũng hạn chế khả năng của kỹ thuật
trong việc phõn biệt giữa các chủng có mối liên quan gần.
Tác dụng lên nhiều vị trí gen của kỹ thuật Southern blotting cũng có thể
được áp dụng trong các nghiên cứu phõn loại dưới loài của vi khuẩn.
Grundmann và cộng sự [25] sử dụng phối hợp mẫu dò gen toxA với các mẫu
dò của gen rARN 23S và 16S để phõn loại dưới loài Pseudomonas
aeruginosa. Cả hai bộ mẫu dò sử dụng trong kỹ thuật RFLP – Southern
blotting đều mang lại những thông tin về mối liên quan về tiến hóa của các
chủng vi khuẩn được nghiên cứu. Tuy nhiên, không có kỹ thuật nào có khả
năng tách biệt giữa các chủng vi khuẩn hiệu quả bằng kỹ thuật PFGE. RFLP –
Southern blotting là một kỹ thuật hữu ích cho nghiên cứu giới hạn về phõn
loại dưới loài của các chủng vi khuẩn, các kỹ thuật blotting cồng kềnh đã
được thay thế rộng rói bởi kỹ thuật PCR based locus – specific RFLP [25].
1.1.3. Phương pháp PCR based locus – specific RFLP (Kỹ thuật RFLP dựa
trên khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu)
PCR có khả năng khuếch đại một cách thông thường những đoạn gen
đặc hiệu để nghiên cứu sự khác nhau giữa các chủng vi khuẩn và khả năng đề
kháng kháng sinh. Đoạn gen đặc hiệu nào đó sử dụng trong nghiên cứu sẽ
được khuếch đại bởi các primer đặc hiệu và sau đó được phõn tích bằng kỹ
thuật RFLP. Những đoạn ADN sau khi bị phõn cắt sẽ được tách biệt trên
thạch agarose hoặc gel nhỏ polyacrylamide và các mẫu gen này sẽ được quan
sát, phõn tích sau khi nhuộm bằng ethilium bromide [1], [2].
Kỹ thuật RFLP dựa trên khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu (locus-
specific RFLP) đã được áp dụng ở rất nhiều nghiên cứu khác nhau. Shortrige
và cộng sự đã sử dụng RFLP để phõn tích gen ureC để chứng tỏ sự khác nhau
giữa các chủng Helicobacter pylori ở Mỹ. Vùng gen 16S, 23S và vùng đệm

16S-23S cũng đã được sử dụng là đích tác dụng của kỹ thuật RFLP dựa trên
9
đoạn gen đặc hiệu (locus-specific RFLP) [25]. Trong đó, sự thay đổi này của
ribotyping, đó là ADN ribosom được khuếch đại và bị cắt bởi enzym giới hạn.
Những đoạn ADN bị cắt bởi enzym giới hạn sẽ được quan sát sau khi điện di
trên gel thạch. Vì vậy, làm giảm bớt nhu cầu về kỹ thuật Southern blotting.
Ribotyping được áp dụng rất thành công cho phõn biệt các chủng vi khuẩn và
thể hiện độ tương đồng cao với operon rARN
Một áp dụng mới của kỹ thuật RFLP dựa trên khuếch đại PCR đoạn
gen đặc hiệu (locus-specific RFLP), Cockerill và cộng sự đã xác định được
đột biến điểm xảy ra ở gen katG của Mycobacterium tuberculosis dẫn đến
mức độ đề kháng khác nhau với isoniazid giữa các chủng vi khuẩn này phõn
lập được, thể hiện qua những mẫu RFLP của gen được khuếch đại sử dụng
trong nghiên cứu. Tuy nhiên, khả năng tách biệt (discriminatory power) của
kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu (locus-specific PCR) nhìn chung
không tốt bằng các phương pháp khác, trước hết bởi vì trong nghiên cứu, kỹ
thuật này chỉ phõn tích một vùng giới hạn của hệ gen nó có thể khuếch đại
được. Ví dụ nghiên cứu của Kỹhn và cộng sự cho thấy PCR – ribotyping có
khả năng tách biệt nghèo nàn khi so sánh với kỹ thuật PFGE và các phương
pháp phõn loại theo sinh hóa [25].
Tuy nhiên, kỹ thuật RFLP dựa trên đoạn khuếch đại PCR gen đặc hiệu
cho thấy hiệu quả áp dụng đáng tin cậy ở một số nghiên cứu dịch tễ học của
virus viêm gan C (HCV). Bằng kỹ thuật này, HCV được chia thành 6
genotype chớnh, đánh số từ 1 đến 6. Davison và cộng sự đã phát triển một kỹ
thuật đơn giản để xác định genotype của HCV dựa trên sự khuếch đại PCR và
phõn tích RFLP đoạn ADN không mã hóa nằm trên bộ gen của virus này. Kỹ
thuật sử dụng phương pháp cắt ADN bằng nhiều hoặc một enzym riêng lẻ
HaeIII – RSAI, MvaI - HinfI, BstI và ScrFI cho phép tách biệt các chủng virus
phõn lập được vào các nhúm 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5 và 6. RFLP của các
10

vùng 5’ không mã hóa cũng thuận lợi cho một số nghiên cứu về các genotyp
virus theo phõn bố địa lý, lịch sử tự nhiên của bệnh và mối liên quan của các
genotyp với đáp ứng của interferon [25].
1.1.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA assay): Kỹ
thuật đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên
Đõy là phương pháp cũng dựa theo kỹ thuật PCR với đoạn mồi ngẫu
nhiên (AP-PCR: Arbitrary Primed PCR) lần đầu tiên được Williams cùng
cộng sự và Welsh cùng MacClelland mô tả. Kỹ thuật RAPD được thiết kế dựa
trên việc sử dụng một số đoạn mồi có trình tự ngẫu nhiên ngắn (độ dài khoảng
9 – 10 base) có khả năng lai với trình tự của đoạn ADN trên phõn tử ADN
bằng ái lực vừa đủ ở nhiệt độ gắn mồi thấp. Những đoạn mồi này sẽ được sử
dụng để bắt đầu khuếch đại những vùng ADN của bộ gen vi khuẩn. Nếu hai
mồi của RAPD gắn ở giữa một đoạn ADN có kích thước vài kilobase theo
hướng thích hợp với nhau, sản phẩm PCR thu được với các phõn tử ADN có
độ dài tương ứng với khoảng cách của hai primer. Số lượng và vị trí gắn của
những primer có sự khác nhau giữa các chủng của mỗi loài vi khuẩn. Vì vậy,
sau khi tách biệt các sản phẩm khuếch đại PCR trên thạch điện di agarose,
mỗi mẫu băng “band” điện di sẽ thể hiện kết quả về đặc điểm của mỗi chủng
vi khuẩn cụ thể [25]. Tức là, những sinh vật có bộ gen giống nhau hoàn toàn
khi nhõn gen bằng máy PCR với các mồi ngẫu nhiên, kết quả thu được các
đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc. Điện di kết quả
nhõn gen, thu được điện di đồ gồm những băng (vạch) ADN ở những vị trí
giống nhau trên bản gel. Khi bộ gen của các mẫu được kiểm tra có sự khác
nhau (có đa dạng sinh học) sẽ cho kết quả khác nhau trên điện di đồ [1], [2].
Hầu hết các trường hợp, trình tự của một số primer RAPD được sử
dụng để tạo ra những mẫu băng ADN tốt nhất cho sự phõn biệt giữa các
chủng vi khuẩn phải được xác định theo kinh nghiệm. Gần đõy, một primer
11
có trình tự được thống nhất với tên là M13 đã được sử dụng cho kỹ thuật “dấu
võn tay” RAPD, primer này cho phép tiêu chuẩn hoá quy trình RAPD [25].

Một số nghiên cứu đã cho thấy sự thành công khi sử dụng kỹ thuật
RAPD trong phõn biệt những chủng vi khuẩn ở các loài vi khuẩn khác nhau,
bao gồm: A. baumannii, Candida albicans, H. pylori, Proteus mirabilis,
Histoplasma capsulatum, Haemophilus sommus, các loài Leptospira, S.
aureus, và L. pneumophilia [25].
So sánh với những phương pháp phõn loại khác, Villa và cộng sự cho
thấy kỹ thuật RAPD có độ tách biệt cao hơn phương pháp phõn tích bộ gen vi
khuẩn dựa trên RFLP hoặc 16S rARN hay vùng đệm 16S – 23S, nhưng khả
năng tách biệt thấp hơn kỹ thuật REP-PCR. Tuy nhiên, vẫn cũn nhiều nhược
điểm được đưa ra với kỹ thuật RAPD làm mất đi độ tái lặp và chuẩn hóa của
phương pháp. Bởi vì, các mồi không đối mã trực tiếp với bất kỳ vị trí gen cụ
thể nào, trong đó một số hiện tượng gắn mồi là kết quả của sự lai không hoàn
hảo giữa mồi và vị trí đích. Vì vậy, quá trình khuếch đại vô cùng nhạy cảm
với những thay đổi nhẹ về nhiệt độ ở giai đoạn gắn mồi, do đó có thể dẫn đến
sự khác nhau về những băng ở mỗi mẫu sau nhiều lần phõn tớch. Sử dụng
mồi thiết kế theo kinh nghiệm, mỗi một loại mồi đòi hỏi một dạng hóa chất và
điều kiện tối ưu cho phản ứng, do đó cũng làm cho sự chuẩn hoá của kỹ thuật
này rất khó khăn [25].
1.1.5. Kỹ thuật Rep – PCR (Repetitive extragenic palindromic PCR: REP-
PCR)
Một kỹ thuật trực tiếp cho kết quả “dấu võn tay-fingerprinting” không
cần sử dụng enzym cắt hạn chế là rep - PCR dựa trờn nguyên tắc nhõn cỏc
đoạn gen lặp lại. Thuật ngữ rep - PCR là chỉ phương pháp sử dụng cặp mồi
đặc hiệu để nhân những chuỗi lặp lại phổ biến nằm trên phõn tử ADN của các
vi sinh vật thuộc cơ thể nhân sơ. Versalovic và cộng sự mô tả một kỹ thuật
12
xác định “dấu võn tay” bộ gen của vi khuẩn bằng cách phõn tích các mẫu
ADN đặc hiệu của mỗi chủng vi khuẩn thu được từ quá trình khuếch đại PCR
những đoạn ADN lặp lại nằm trên bộ gen của vi khuẩn. Sản phẩm khuếch đại
PCR được phõn tách bởi quá trình điện di trên thạch agarose và thu được các

mẫu phõn tích ADN đặc hiệu. Mẫu ADN đặc trưng cho mỗi chủng vi khuẩn
có thể được phõn tích dựa trên các phần mềm chuyên dụng như:
BioNumerics. Những chủng cho các mẫu phõn tích giống nhau (nghĩa là cùng
một loài) sẽ được xếp vào cùng một nhúm.
Đối với ADN của các loài Eukaryote hay Prokaryote đều có chứa các
đoạn ADN được gọi là lặp lại, phõn bố nhiều hoặc ít trong bộ gen một cách
ngẫu nhiên. Có hai dạng của đoạn gen lặp lại được sử dụng với mục đích
phõn loại. Những đoạn ADN ngược xuôi giống nhau nằm ngoài gen có tớnh
lặp lại (Repetitive extragenic palindromic: REP) là trình tự gồm 38 base với 6
13
Hình 1.1: Phương pháp Rep – PCR. Dưới điều kiện của PCR, primer
khuếch đại vùng giới hạn nằm giữa hai yếu tố lặp lại bằng sự kéo dài của ADN
Taq polymerase. Sản phẩm PCR được điện di và hình ảnh các band thu được
tạo ra mẫu fingerprinting. Sự khác biệt về kích thước các band thể hiện đa dạng
về khoảng cách giữa các yếu tố lặp lại.
Điện di mẫu Rep-PCR
vị trí thoái hóa và một cấu trúc thòng lọng gồm có 5 base khác nhau giữa mỗi
đầu của vùng ngược xuôi bảo tồn. Trình tự REP là dạng đoạn gen lặp lại thứ
nhất được mô tả phần lớn đối với những nghiên cứu về vi khuẩn đường ruột.
Tớnh tự nhiên ngược xuôi của các đoạn REP và khả năng chúng tạo ra cấu
trúc thòng lọng (stem-loop structure) dẫn đến có nhiều chức năng của các yếu
tố với tớnh bảo tồn, phõn tán cao này. Trình tự ERIC (Enterobacterial
repetitive intergeneic concensus sequence) là dạng đoạn gen lặp lại thứ hai đã
sử dụng thành công để phõn loại vi khuẩn dựa vào ADN. Trình tự ERIC là
đoạn có kích thước 126 bp có chứa đoạn lặp lại ngược chiều có tớnh bảo tồn
cao và được xác định nằm ở những vùng ngoài của hệ gen của vi khuẩn.
Chúng lần đầu tiên được xác định rừ dựa trên số liệu trình tự thu được từ E.
coli, Salmonella typhimurium [25].
Trong khi các trình tự Rep và ERIC thường được sử dụng nhất với mục
đích để phõn loại vi khuẩn theo ADN, một đoạn ADN lặp lại khác, trình tự

BOX đã được sử dụng để phõn biệt các chủng Streptococcus pneumoniae.
Trình tự BOX nằm trong các vùng gen và cũng có thể tạo ra cấu trúc thòng
lọng (stem-loop structure) bởi vì sự cặp đôi đối xứng của chúng. Chúng là các
“đoạn lặp lại khảm” bao gồm sự gắn kết khác nhau của 3 đơn vị nhỏ trình tự
được cho là boxA, boxB và boxC. Ba đơn vị nhỏ trình tự có độ dài lần lượt là
59, 45 và 50 nucleotide. Yếu tố BOX không có mối liên quan về trình tự đối
với cả hai yếu tố Rep và ERIC. Yếu tố BOX ban đầu được xem là duy nhất sử
dụng đối với Streptococcus pneumoniae, nhưng sau này được sử dụng ở nhiều
loài vi khuẩn khác [25].
Rep – PCR có thể được thực hiện với các mẫu ADN tách chiết từ
những khuẩn lạc vi khuẩn hoặc bằng một số phương pháp cải tiến sử dụng
toàn bộ tế bào chưa qua xử lý. Phản ứng khuếch đại Rep và ERIC có thể thực
hiện với một mồi đơn, một hệ thống mồi đơn hoặc đa hệ thống mồi. Các mẫu
14
ERIC nhìn chung ít phức tạp hơn so với những mẫu Rep, nhưng cả hai đều
cho khả năng độ tách biệt cao trong phõn loại ở mức độ chủng vi khuẩn. Áp
dụng cả hai phương pháp Rep và ERIC PCR để định typ các chủng vi khuẩn
sẽ làm tăng khả năng tách biệt so với sử dụng riêng lẻ từng kỹ thuật.
Rep – PCR nhanh chóng trở thành một trong các phương pháp được sử
dụng rộng rói nhất trong phõn loại dựa trên cấu trúc ADN. Rep – PCR với các
đoạn mồi dựa trên cơ sở trình tự Rep và ERIC đã rất thành công sử dụng để
phõn biệt các chủng Bartonella, Bacillus subtilis, Citrobacter diversus, S.
aureus kháng methicillin, S. pneumoniae, A. baumanii, Burkholderia cepacia,
L. pneumophilia, H. pylori, Neisseria gonorrhoeae và Neisseria meningitidis.
Kỹ thuật này dễ dàng thực hiện và áp dụng với một số lượng lớn hoặc nhỏ
chủng vi khuẩn phõn lập được [25].
Rep – PCR cho thấy có thể áp dụng rộng rói và có khả năng tách biệt
cao hơn so với cả phương pháp phõn tích plasmid và một số kỹ thuật “dấu
võn tay” khác. Rep – PCR được xem là có khả năng phõn biệt mạnh hơn so
với phương pháp phõn tích bằng enzym giới hạn những gen rARN 16S và

vùng đệm 16S-23S. Hơn thế nữa các phương pháp nghiên cứu đã so sánh Rep
– PCR với các phương pháp phõn loại khác như “Multilocus enzym
electrophoresis”, đặc điểm sinh hóa, ribotyping cho thấy đõy là phương pháp
này tốt hơn so với các phương pháp trên. Cuối cùng, một số nghiên cứu cho
rằng Rep–PCR có sự tương quan rất tốt với kết quả của PFGE, nhưng khả
năng tách biệt thì thấp hơn PFGE một chút [25].
1.1.6. Kỹ thuật AFLP (Amplified fragment length polymorphism): Kỹ thuật
đa hình chiều dài các đoạn ADN được khuếch đại chọn lọc.
Kỹ thuật AFLP do Vos và cộng sự phát minh năm 1975. Đõy là
phương pháp sinh học phõn tử “dấu võn tay” dựa trên sự khuếch đại chọn lọc
một tập hợp con những đoạn ADN được tạo ra bởi enzym giới hạn [1], [3].
15
Khởi đầu phương pháp này được sử dụng để xác định đặc điểm bộ gen của
thực vật, nhưng gần đõy AFLP được áp dụng cho phõn loại vi khuẩn [25]. Có
hai dạng khác nhau của AFLP đã được mô tả. Một là sử dụng hai enzym giới
hạn và hai primer cho sự khuếch đại; thứ hai là sử dụng một primer đơn và
một enzym giới hạn [25], [32]. Trong một dạng chung nhất của kỹ thuật này,
ADN vi khuẩn được tách chiết, làm sạch và phõn cắt bằng hai enzym giới hạn
khác nhau, như EcoRI và MseI. Những đoạn ADN giới hạn thu được, sau đó
được gắn với đoạn ADN có trình tự tương đồng (adaptor) với PCR primer
bằng một cầu nối tại các đầu mút. PCR primer sử dụng cho quá trình khuếch
đại có chứa trình tự tương đồng với trình tự của đoạn adaptor được nối và có
chứa một đến hai base chọn lọc ở điểm kết thúc 3’ của chúng. Ví dụ, một
primer chọn lọc đối mã trực tiếp với một vị trí EcoRI có thể có trình tự 5’-
GAATTCAA-3’, tại đõy 6 base đầu tiên được bổ sung với vị trí của EcoRI
trong khi hai nucleotid A cũn lại ở vị trí kết thúc 3’ được chọn lọc và chỉ cho
phép khuếch đại khi các vị trí EcoRI đó có trình tự 3’-CTTAATT-5’. Không
cho phép khuếch đại vị trí EcoRI với trình tự 3’-CTTAATC-5’. Vì vậy, các
nucleotid chọn lọc cho phép khuếch đại chỉ tập hợp nhỏ của các đoạn gen giới
hạn. Để quan sát các mẫu phõn tích, một trong các PCR primer có gắn chất

đánh dấu phóng xạ hoặc chất huỳnh quang, hoặc có thể chọn cách nhuộm
bằng ethidium bromide, các mẫu ADN có thể được quan sát trên gel thạch
dưới ánh sáng tia cực tớm (UV) [1], [3], [25].
Một số nghiên cứu chứng minh cho thấy AFLP là phương pháp có độ
lặp lại [22], [36], [39] và khả năng tách biệt tốt đối với chủng bắt nguồn từ
các dòng khác nhau. Khả năng phõn biệt của AFLP giữa các chủng vi khuẩn
lớn hơn so với phương pháp PCR-based ribotyping; tuy nhiên vẫn chưa thể
được so sánh với Rep-PCR và PFGE. Quy trình thực hiện AFLP là xét
16
nghiệm chuyên sõu hơn Rep-PCR, nhưng kết quả thu được nhanh hơn PFGE
[25], [32].
1.1.7. Kỹ thuật giải trình tự gen (ADN Sequencing)
Nền tảng cơ bản của các phương pháp sinh học phõn tử được sử dụng
để phõn biệt những phõn nhúm nhỏ vi sinh vật đều dựa trên sự khác biệt về
cấu trúc của phõn tử ADN. Do đó, giải trình tự gen được xem là phương pháp
tốt nhất về khả năng phõn biệt trong những phõn loại nhỏ hơn ở mỗi loài vi
sinh vật. Phương pháp giải trình tự ADN được thực hiện dựa nguyên tắc tạo
ra những mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Những mảnh ADN
chứa những base đã đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid. Trong đó,
mỗi mảnh ADN này được phân biệt với nhau bằng vị trí khác nhau trên gel
với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu, đọc kết quả tùy theo các
kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Tuy nhiên, ban đầu quy trình giải trình tự
gen có sử dụng chất đánh dấu phóng xạ để phát hiện sản phẩm của phản ứng,
một kỹ thuật không phù hợp với việc sử dụng trên lõm sàng hiện nay. Vì vậy,
quy trình giải trình tự gen hiện nay sử dụng các nucleotid có gắn chất huỳnh
quang để đánh dấu ADN. Trình tự ADN sẽ được đọc bởi một thiết bị tự động.
Quá trình tạo ra những mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình
bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter
Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Frederick
Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả [2],

[3], [25].
Quá trình giải trình tự gen nhìn chung bắt đầu từ sự khuếch đại PCR
trực tiếp của đoạn gen được quan tõm nằm trên phõn tử ADN, tiếp sau là các
phản ứng giải trình tự của sản phẩm PCR vừa khuếch đại. Cải tiến của quy
trình này có thể được áp dụng được đối với cả giải trình tự ARN. Trong đó,
những thiết bị được sử dụng để phõn tích tự động trình tự ADN trên gel dựa
17
vào sự phát hiện chất huỳnh quang được đánh dấu trình tự của các sản phẩm
thu được từ phản ứng.
Nguyên lý cơ bản của phương pháp giải trình tự ADN dựa vào hoạt
động của enzym ADN polymerase (dideoxy) trong quá trình tổng hợp ADN,
đó là: ADN polymerase xúc tác gắn những nucleotide vào mạch đơn ADN
đang tổng hợp ở vị trí 3' có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotide không
có nhóm 3'-OH thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương
pháp này là sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng phản ứng tổng hợp
ADN một cách ngẫu nhiên. Trong phản ứng giải trình tự, sử dụng đoạn ADN
mồi là đoạn ADN mạch đơn có kích thước 20 nucleotide, bốn loại
dideoxynucleotide (ddNTP) được gắn với bốn loại thuốc nhuộm huỳnh quang
khác nhau.
Phương pháp được chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ, thành phần
bao gồm: ADN khuôn, ADN mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide),
enzym ADN Taq polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện phản ứng thích
hợp, đồng thời có bổ sung thêm khoảng 1% một loại ddNTP
(dideoxynucleotide) cho mỗi phản ứng khác nhau. Dideoxynucleotide là loại
nucleotide bị mất 2 nguyên tử oxy ở carbon thứ 3 và carbon thứ 4. Do đó khi
mạch ADN đang tổng hợp bị gắn 1 ddNTP không có nhóm 3'-OH ở
nucleotide cuối cùng nên quá trình tổng hợp không được kéo dài tiếp tục và
phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại [2], [3].
Trong phản ứng, ddNTP được đưa vào với một lượng nhỏ so với lượng
dNTP nên thỉnh thoảng mới có một ddNTP được sử dụng ngẫu nhiên làm

phản ứng tổng hợp ADN dừng lại. Khi phản ứng giải trình tự gen hoàn tất,
bốn hệ thống của sản phẩm phản ứng được kết hợp lại, tập trung và cho vào
một giếng (well) trên thạch polyacrylamide. Trong suốt quá trình điện di, sản
phẩm gồm các đoạn nucleotide với kích thước dài ngắn khác nhau có gắn chất
18
huỳnh quang này được phát hiện tự động. Kết quả dữ liệu được lưu ở dạng kỹ
thuật số để tiếp tục quá trình phân tích sau đó mới cho kết quả về trình tự
ADN với sự trợ giúp của các phần mềm chuyên dụng. Tổng hợp kết quả sẽ
thu được trình tự sắp xếp các nucleotide của đoạn gen [1], [3], [25].
Trên thực tế, cần thiết phải cân nhắc và đỏnh giá trước khi quyết định
sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen cho quá trình phân loại nhỏ các loài vi sinh
vật. Trước hết, đối với mục đích thực tế trong phòng xét nghiệm, giải trình tự
ADN phải được hướng vào một vùng giới hạn (rất nhỏ) của chromosome vi
khuẩn. Một điều không thực tế, đó là thực hiện giải trình tự nhiều vùng hoặc
một vùng lớn ADN trên chromosome của vi khuẩn. Vì vậy, trái ngược lại với
phương pháp phân tích ADN dựa vào các kỹ thuật như PFGE, Rep PCR hoặc
RAPD có thể nghiên cứu toàn bộ chromosome, giải trình tự ADN chỉ nghiên
cứu một phần rất nhỏ của những đoạn ADN có thể khác nhau giữa các chủng
vi khuẩn hoặc nấm. Đõy cũng là hạn chế của kỹ thuật này khi sử dụng trong
phân loại vi khuẩn [25], [32], [36].
Hơn nữa, một đoạn ngắn ADN được sử dụng phải thỏa mãn một số tiêu
chuẩn trước khi được sử dụng để phân biệt các chủng vi sinh vật. Cấu trúc của
vùng ADN được lựa chọn phải bao gồm một chuỗi với trình tự có thể thay đổi
cấu trúc nhưng kế bên là những vựng cú độ bảo tồn cao. Vùng ADN này cho
phép quá trình khuếch đại PCR và phân loại được tất cả các thành viên của
một loài. Sự khác nhau về trình tự ở trong chuỗi ADN được lựa chọn phải đủ
khả năng phân biệt giữa các chủng khác nhau của một loài cụ thể. Cuối cùng,
chuỗi ADN được lựa chọn không thể truyền ngang cho các chủng khác của
một loài [25].
Đáng tiếc, đối với vi khuẩn hoặc nấm, có rất ít những chuỗi ADN thoả

mãn những tiêu chuẩn này. Trong khi gen 16S rARN đã được sử dụng để xác
định những loài mới của vi khuẩn, cho thấy sự khác biệt rất ít giữa các chủng
19
của cùng một loài vi khuẩn. Vùng gen nằm giữa hai gen 16S và 23S rARN
cũng được sử dụng với các kết quả khác nhau. Về cơ bản các locus gen đặc
hiệu loài phải được xác định và kiểm tra một cách có kinh nghiệm để xem xét
một locus gen có khả năng đưa ra được sự khác biệt giữa các chủng. Hạn chế
chính của phương pháp giải trình tự ADN đối được sử dụng để phân loại nhỏ
các loài vi khuẩn hoặc nấm là kích thước của đoạn ADN dùng trong nghiên
cứu bắt buộc phải có thể giải trình tự được trên thực tế [25].
Ngược lại, giải trình tự ADN được xem là “tiờu chuẩn vàng” trong
phân loại virus. Giải trình tự acid nucleic có khả năng tách biệt rất lớn đối với
xác định các genotype của HCV và là kỹ thuật sinh học phân tử duy nhất có
thể dễ dàng xác định được mỗi đột biến có liên quan đến sự kháng thuốc của
HIV. Vùng acid nucleic được sử dụng để phân loại virus theo genotype và
phát hiện các đột biến kháng thuốc cú kích thước ngắn, các chuỗi acid nucleic
rõ ràng, có thể đáp ứng được các tiêu chuẩn cần thiết cho áp dụng phương
pháp giải trình tự acid nucleic.
1.2. So sánh ưu điểm, nhược điểm của các kỹ thuật sinh học phân tử sử
dụng trong phân loại vi khuẩn và hướng lựa chọn kỹ thuật sử dụng trong
nghiên cứu [25], [36]
Tonover và cộng sự đó xác định tiêu chuẩn giúp cho việc lựa chọn và
giải thích các phương pháp phân loại sinh học phân tử dùng trong các nghiên
cứu dịch tễ học [36]. Cho dù một phương pháp phân loại cụ thể có độ tách
biệt cao, độ lặp lại tốt, nhưng sự phức tạp của phương pháp và cách giải thích
kết quả cũng như giá cả đều liên quan đến việc cú xõy dựng hay sử dụng
phương pháp đó hay không tùy theo khả năng của mỗi phòng xét nghiệm. Vì
vậy, lựa chọn phương pháp phân loại sinh học phân tử phụ thuộc vào mức độ
cần thiết, khả năng – trình độ kỹ thuật và nguồn tài chính của mỗi phòng xét
nghiệm [25].

20
Bảng 1.2: So sánh ưu điểm, nhược điểm của các kỹ thuật sinh học phân
tử sử dụng trong phân loại vi khuẩn
Phương pháp
Đặc điểm
PFGE
PCR based
locus – specific
RFLP
RAPD Rep- PCR AFLP
ADN
Sequencing
Tiện lợi sử dụng Vừa Dễ Dễ Dễ Vừa Khó
Giải thích
kết quả
Dễ Dễ Dễ Dễ Dễ Vừa
Khả năng
tách biệt
Cao Trung bình Cao Cao Cao Cao
Thời gian thực
hiện (ngày)
3 1 1 1 2 2
Mức độ lặp lại
trong phòng xét
nghiệm
Cao Cao Vừa Cao Cao Cao
Mức độ tái lặp
giữa các phòng
xét nghiệm
Cao Cao Kém

Trung
bình
Cao Cao
Giá
trang thiết bị
Trung
bình
Trung bình
Trung
bình
Trung
bình
Cao Cao
Giá mỗi mẫu
Xét nghiệm
Trung
bình
Thấp Thấp Thấp
Trung
bình
Cao
Qua tổng kết so sánh, cho thấy các phương pháp PCR based locus –
specific RFLP, RAPD và Rep PCR có quy trình tương tự nhau và dễ dàng
thực hiện. Trong khi đó, kỹ thuật PFGE cần nhiều thời gian, những kỹ thuật
này lại khụng khú khăn trong thực hiện quy trình. Ngược lại, quy trình giải
trình tự gen đòi hỏi nhiều về trình độ, khả năng sử dụng thiết bị, phương pháp
và các rủi ro có khả năng xảy ra dẫn đến không thể giải thích được kết quả. Vì
vậy có thể dẫn đến những khó khăn để thực hiện kết quả một cách đáng tin
cậy và đòi hỏi người làm phải cú trỡnh độ kỹ thuật cao.
21

Những phương pháp này cũng khác nhau bởi sự quan tâm đến sự cần
thiết của thiết bị, giá cả của thiết bị và giá thành của mỗi mẫu xét nghiệm. Ví
dụ, kỹ thuật giải trình tự gen có thể đảm bảo là những thay đổi tinh vi nhất có
thể được phát hiện, nhưng rào cản lớn nhất là giá thành của máy giải trình tự
gen tự động rất cao. Hơn thế nữa, phõn loại dưới loài ở các chủng vi khuẩn
hoặc nấm, trên thực tế phòng xét nghiệm phải cõn nhắc đến các kỹ thuật khác
hơn như PFGE và Rep - PCR. Bởi vì, những kỹ thuật này có khả năng tách
biệt đủ lớn để tạo ra các kết quả phõn loại dưới loài có độ tin cậy và phần xõy
dựng hệ thống thiết bị cũng như giá cả thấp hơn cho mỗi mẫu xét nghiệm.
Trong khi, kỹ thuật giải trình tự gen có giá thành thực hiện cho mỗi mẫu rất
cao. Điều này dẫn đến những phòng xét nghiệm phải cõn nhắc đến yêu cầu về
kết quả của mẫu nghiên cứu, cụ thể yêu cầu về sự phõn biệt giữa các chủng vi
khuẩn được đưa ra để phõn loại. Kỹ thuật giải trình tự gen chắc chắn sẽ có độ
chớnh xác nhất chỉ khi cả hai chuỗi ADN được xác định trình tự.
Những đặc điểm chớnh của các phương pháp phõn loại sinh học phõn
tử đã được đưa ra ở (bảng 1.2). Điều này rất quan trọng để đưa ra một phương
pháp phõn loại sinh học phõn tử phù hợp với thực tế của mỗi phòng xét
nghiệm. Ngoài ra, một tiêu chuẩn khác không được xem xét ở đõy, đó là số
lượng mẫu mỗi phương pháp có khả năng phõn tích. Tiêu chuẩn này có thể
được cho là quan trọng đối với một số phòng xét nghiệm lõm sàng khi có liên
qua đến các nghiên cứu dịch tễ lớn, khả năng phõn tích được một số lượng
lớn có thể quyết định việc lựa chọn phương pháp. Đối với những mẫu nghiên
cứu có số lượng lớn, các kỹ thuật đơn giản với độ tách biệt cao và giá thấp
như Rep - PCR, có thể thích hợp nhất. Tuy nhiên, nếu mong muốn giữ kết quả
phõn tích ADN của vi sinh vật để làm cơ sở dữ liệu tham khảo thì kỹ thuật
PFGE và AFLP có thể được lựa chọn ngang nhau đối với phõn loại dưới loài
của vi khuẩn hoặc nấm.
22
Hiện nay, những nhà nghiên cứu vi sinh hiện đại rất may mắn do đã có
rất nhiều kỹ thuật khác nhau với khả năng phõn biệt tốt ở mức độ phõn tử

ADN trong phõn loại vi sinh vật. Những kỹ thuật này có thể phù hợp với sự
cần thiết của cả nghiên cứu phòng xét nghiệm và nghiên cứu lõm sàng. Ngoài
ra, một số kỹ thuật sinh học phõn tử có khả năng tạo ra thư viện tham khảo
lớn (cơ sở dữ liệu) về những vi sinh vật được phõn loại. Vì vậy, các chủng vi
sinh vật bùng nổ mới phát hiện được có thể được so sánh chéo giữa các phòng
xét nghiệm để kiểm soát những thay đổi trong quần thể vi sinh vật.
Chương II
ỨNG DỤNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP
23
PHÂN LOẠI VI KHUẨN DỰA TRÊN CẤU TRÚC
ADN TRONG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN
HAEMOPHILUS INFLUENZAE
2.1. Kỹ thuật PFGE
2.1.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của Haemophilus influenzae
Đối với phõn loại vi khuẩn Haemophilus influenzae từ trước đến nay
chủ yếu dựa vào 2 phương pháp phõn loại chớnh, đó là phõn loại theo typ
sinh học (biotype) và phõn loại theo typ huyết thanh (serotype). Tuy nhiên,
hiện nay với sự phát triển của công nghệ sinh học thì ứng dụng các phương
pháp sinh học phõn tử trong phõn loại vi khuẩn này cho độ phõn biệt rất cao,
đặc biệt là kỹ thuật PFGE [8], [12], [22], [23], [26], [33], [38]. Những nghiên
cứu về đặc điểm sinh học phõn tử của Haemophilus influenzae có sử dụng kỹ
thuật PFGE đều với mục đích phõn loại theo genotype. Enzym giới hạn SmaI
thường được dùng để phõn tích toàn bộ hệ gen của vi khuẩn này. Với khả
năng nhận diện trình tự 5’-CCCGGG- 3’ có ở trên toàn bộ phõn tử ADN và
cắt ở vị trí giữa nucleotid C và G (hình dưới) cho các mẫu phõn tích PFGE
với 10-12 đoạn ADN cú kớch thước từ 10-500 kilobases (kb) trên điện di đồ
[36]. Qua phõn tích các mẫu PFGE thu được sẽ cho phõn loại genotype các
chủng Haemophilus influenzae theo đặc thù của kỹ thuật PFGE [1], [3], [35].
Hình 2.1: Vị trí cắt của enzym SmaI
- Tại Việt Nam, nghiên cứu về Haemophilus influenzae typ b gõy viêm

màng nóo mủ cũng đã đánh giá đặc sinh học phõn tử của vi khuẩn này dựa
trên phõn loại genotype theo kỹ thuật PFGE. Qua phõn tích cho thấy, hầu hết
các chủng Haemophilus influenzae typ b này tập trung ở một số nhúm
24
genotype chớnh. Ngoài ra cũn có nghiên cứu đánh giá, so sánh đặc điểm sinh
học phõn tử giữa các chủng Haemophilus influenzae typ b gõy viêm màng
nóo mủ và những chủng gõy nhiễm trùng đường hô hấp dưới [4], [26], [35].
- Trên thế giới, hiện nay có nhiều nghiên cứu về đặc điểm sinh học
phõn tử của những chủng Haemophilus influenzae gõy bệnh cũng như được
phõn lập từ người lành được thực hiện ở nhiều quốc gia khác nhau. Điển hình
là một nghiên cứu của Anna Skoczyn’ska và cộng sự về đặc điểm sinh học
phõn tử của những chủng Haemophilus influenzae typ b gõy viêm màng nóo
mủ từ năm 1997 đến 2004 tại Phần Lan bằng kỹ thuật PFGE, cho thấy 233
chủng Hib gõy bệnh được xếp vào 5 genotype và tất cả các chủng này đều
được đánh giá là có thể có sự liên quan với nhau (Possibly related). Một
nghiên cứu khác cũng tại Phần Lan, Agnieszka Sulikowska cũng đã sử dụng
kỹ thuật PFGE để đánh giá đặc điểm sinh học phõn tử của những chủng
Haemophilus influenzae phõn lập từ họng mũi (nasopharynge) những đứa trẻ
theo các mùa khác nhau [33]. Ngoài ra, cũn nhiều nghiên cứu khác về Hi nói
chung và Hib nói riêng có sử dụng kỹ thuật PFGE, đặc biệt trong lĩnh vực
dịch tễ học [8], [12], [22], [23].
2.1.2. Đánh giá mối liên quan về ADN của các chủng Haemophilus
influenzae phân lập được và xác định nguồn gốc gõy nhiễm trùng
Hiện nay, trong nước cũng như trên thế giới, những nghiên cứu so sánh
sự tương đồng về các mẫu phõn tích ADN trên điện di đồ của những chủng
Haemophilus influenzae phõn lập được từ nghiên cứu. Sau khi đánh giá sự
tương đồng của các mẫu ADN của mỗi chủng vi khuẩn dựa trên những băng
(band) ADN ở điện di đồ sẽ đưa ra được mối liên quan giữa các chủng vi
khuẩn Haemophilus influenzae phõn lập được ở các mức độ khác nhau:
Không thể phân biệt được (Indistinguishable) hay có thể xếp vào cùng một

nguồn gốc, có mối liên quan gần (Closely related), có thể có liên quan
25