Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus Flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
®ỔV
LÊ THỊ THU HẰNG
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN
NẤM BỆNH Aspergillus flavus SINH Độc TỐ AFLATOXIN
BẰNG KỸ THUÂT PCR
LUẬN VĂN THẠC sĩ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành: BẢO VỆ THựC VẬT Mã
số: 60.62.10
Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM XUÂN HỘI
HÀ NỘI - 2009
- Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là trung thực và chưa hề sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
- Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này
đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ
rõ nguồn gốc.
Tác giả

LỜI CAM ĐOAN
Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Xuân Hội, người đã tận tình dạy bảo,
trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm việc cũng như thực hiện nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn
này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và các cán bộ trong Bộ môn Bệnh Cây đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập tại Bộ môn. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các
thầy cô trong Khoa Nông học, Viện đào tạo Sau đại học - Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã dạy dỗ và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật - Viện Di truyền
Nông nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Bộ môn trong thời gian
vừa qua.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã nhiệt tình động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học

tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2009
Lê Thị Thu Hằng
LỜI CẢM ƠN
3
MỤC LỤC
5
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang
2.1Sự có mặt của Ả. flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc (từ 1967-1983
So sánh kết quả phương pháp Multiplex PCR và phương pháp dựa vào
Ả. Candidas Aspergillus Candidas
A. glacus Aspergillus glacus
A. flavus Aspergillus flavus
A. paracỉtỉcus Aspergillus paraciticus
A. nomius Aspergillus nomius
A. fumigatus Aspergillus fumigatus
A. ochraceus Aspergillus ochraceus
A. oryzae Aspergillus oryzae
cDNA Complementary DNA
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
cs Cộng sự
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates
DC Đối chứng
EDTA Ethylenediaminetetra acetic acid
HPLC High - performance liquid chromatography
HPTLC

High performance thin layer
chromatography
KAc Kalipotassium acetate
PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp
SDS Sodium lauryl sulfate
TLC Thin - layer chromatography
TE Tris- EDTA
7
màu sắc chủng nấm trên môi trường CAM để phát hiện chủng nấm A.
flavus sinh độc tố Aflatoxin 53
 !"#$%
&'()*+,-.'/0*A. flavus,1'2
345  67
8
4.9
DANH MỤC HÌNH
STT Tên hình Trang
2.1Chu kỳ của nấm A. flavus trên ngô vàng Error! Bookmark not defined.
2.2Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link - Cơ quan sinh
sản gồm: bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi) 11
2.3Mối quan hệ di truyền của một số loài nấm Aspergillus spp.Error!
Bookmark n
2.4Hình thái cuống sinh bào tử của nấm A.flavus và nấm A. oryzaeError!
Bookmark
2.5Màu sắc khuẩn lạc của các loài nấm Aspergillus spp. trên môi
trường nuôi cấy (PDA) Error! Bookmark not defined.
2.6
2.7
2.8 4.1B Thu nhận mẫu nấm A. flavus từ các mẫu, A: Ngô; B: Đậu tương
2.9 trên môi trường PDA đặcError!

Bookmark not defined.
4.2Hình ảnh thể bình và cuống sinh bào tử của nấm A. flavus quan
2.10 sát dưới kính hiển vi (x 1600) Error!
Bookmark not defined.
4.3Hình ảnh nấm A. flams được phân lập từ các mẫu gạo tại Hà Nội
2.11 phát triển trên môi trường PDA (trái) và môi trường Czapek
(phải)Error! Bookmar
4.4Các chủng nấm được bảo quản trong dung dịch glycerol 50%,
2.12 4°c Error! Bookmark not defined.
4.5Tốc độ phát triển của nấm A. flavus tại các ngưỡng nhiệt độ
2.13 20°c, 28°c,
30°c trên các nông sản sau, A: 4 ngày; B: 6 ngày nuôi cấy 39
2.14 Hình ảnh phát triển của nấm A. flavus được phân lập từ các mẫu
2.15 Ngô tại Thanh Hóa; A: sau 2 ngày ; B: sau 4 ngày nuôi cấy; C:
4.6
4.7
4.8
4.9
4.10
4.11
4.12
4.13
4.14
2.16 sau 6 ngày nuôi cấy trên môi trường PDAError! Bookmark not defined.
2.17 Nuôi cấy nấm A.flavus trong môi trường PDA
lỏngError! Bookmark not defi Sợi nấm A. flavus đã làm khô dùng làm nguyên liệu
cho quá trình tách chiết ADN tổng số Error! Bookmark not defined.
2.18 Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel Agarose 1% của các mẫu nấm A.
flavus phân lập từ các mẫu nông sản A: Đậu tương; B:
2.19 Gạo Error! Bookmark not defined.

2.20 Sản phẩm PCR được nhân lên từ ADN tổng số các chủng A.
flavus được phân lập từ các mẫu Gạo, phân tích trên gel Agarose 1%
với các cặp mồi: A: mồi ver-1; B: mồi omt-1; C: mồi nor-l\ D: mồi
apa-2 nhân các đoạn genError! Bookmark not defined.
2.21 Mật độ xuất
hiện của ba, hai và một gen trong phản ứng PCR đặc hiệu với các cặp mồi riêng rẽ,
sử dụng khuôn là các mẫu ADN nấm A. Jlavus 48
2.22 H
ình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu
nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Đậu tương trên gel agarose 1%:
M: marker; 1-4: A.flavus Hà Nội; 4 - 8: A.jlavus Thanh Hoá; 9: đối
chứng A. niger chuẩn
54
2.23 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A.
flavus phân lập từ các mẫu Ngô trên gel agarose 1%:
2.24 M: marker; 1 -
11: A. flavus Thanh Hoá ; 12 - 15: A. jlavus Hà Nội; 16: đối chứng A. nỉger chuẩn 54
2.25 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A.
flavus phân lập từ các mẫu Gạo trên gel agarose 1%:
2.26 M: marker; 1 - 5: A. flavus Sơn La ; 6 - 11 : A. jlavus Hà Nội ;
2.27 12: đối chứng
A. niger chuẩn 54
4.15 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR
của các mẫu nấm Ả. flavus phân lập từ các mẫu Lạc trên gel
agarose 1%:
2.28 M: marker; 1 - 5: A. flavus Nghệ An ; 6 - 10: A. flavus Hà Nội;
2.29 11-14:A.
flavus Hải Dương; 16: đối chứng A. niger chuẩn 54
4.16 Tần số xuất hiện các tổ họp gen được nhân lên trong phản ứng
2.30 Multiplex

PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu nor-1, ver-1, omt-1 và apa-2 51
4.17 Mầu sắc biểu hiện của nấm Aspergillus flavus trên môi trường
2.31 CAM (nước dừa) theo thứ tự: vàng sậm, vàng nhạt và trắngError!
Bookmark IK
4.18 Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin được sinh ra bởi các chủng
2.32 nấm Aspergillus Jlavus dưới ánh sáng đèn UVError! Bookmark not
defined.
4.19 Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin trên bản sắc ký lớp mỏng
899 ":),;$ <===>?*5=:@:
1. MỞ ĐẦU
2.34 Nấm bệnh là một trong những tác nhân gây bệnh chính làm giảm
năng suất và chất lượng sản phẩm nông sản. Ngoài ra, nhiều loại nấm còn sinh
ra độc tố mycotoxin làm ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người và vật nuôi.
Nhóm nấm sinh độc tố phổ biến nhất là Aspergillus (A. Jlavus, A. parasiticus
và A. nomius) sản sinh ra Aflatoxin, là độc tố nguy hiểm nhất trong nhóm độc
tố mycotoxin và là hợp chất có tiềm năng gây ung thư cao nhất [29, 52].
2.35 Nam Aspergillus sinh độc to Aflatoxin có phổ hoạt động rất rộng,
lây nhiễm trên nhiều loại nông sản đặc biệt là ngô, lạc, bông, đậu tương, ở
hầu hết các nước trên thế giới đặc biệt là các nước có khí hậu nhiệt đới [52].
2.36 Phương pháp truyền thống phát hiện nấm Aspergillus sinh độc tố
Aflatoxin chủ yếu dựa vào đặc điểm sinh học, hình thái sợi nấm và vết loang
để lại trên môi trường đã được công bố từ thập kỷ 80 [26]. Tuy vậy, phương
pháp này có nhược điểm là tốn công sức độ chính xác và độ nhạy không cao.
Tiếp theo, phương pháp sắc ký được sử dụng để phát hiện mức độ nhiễm
Aflatoxin như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) [43].
Ưu điểm của phương pháp này là có thể định lượng chính xác hàm lượng
Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm. Tuy nhiên, phương pháp này lại có
nhược điểm là cần phòng thí nghiệm được trang bị các máy chuyên dụng đắt
tiền. Gần đây, các phương pháp dựa vào kỹ thuật PCR và kỹ thuật kháng thể
đơn dòng đang được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi do có ưu điểm là phát

hiện nhanh, nhậy, chính xác nấm Aspergillus sinh độc to Aflatoxin. Ngoài ra,
phương pháp PCR còn có thể phát hiện được chủng nấm Aspergillus lây nhiễm
[40].
2.37 Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết
quả nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus sinh độc to Aflatoxin và con đường
sinh tổng hợp Aflatoxin. Các nghiên cứu cho thấy, ít nhất có 20 gen tham gia
1
3
vào con đường sinh tổng hợp Aflatoxin, bốn gen quan trọng là ver-1, omt-1,
nor-1 và apa-2 đã được công bố trình tự nucleotide và chức năng gen. Trình tự
nucleotide của các gen này là cơ sở để sinh tổng hợp các cặp mồi đặc hiệu cho
phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là ADN tổng số tách chiết từ sợi nấm hoặc
các mẫu xét nghiệm.
2.38 Điều kiện thời tiết Việt nam được xem là môi trường lý tưởng cho
sự sinh trưởng và phát triển của nấm Aspergillus. Điều này dẫn đến hàm lượng
và tỷ lệ nhiễm Aflatoxin ữên nông sản Việt Nam là ở mức cao trong khu vực
và đây là một trong những nguyên nhân quan ữọng dẫn đến giá trị nông sản
xuất khẩu của Việt nam rất thấp. Thực tế thì đã có nhiều lô hàng nông sản xuất
khẩu của nước ta như: lạc, đậu tương đã bị trả lại do phát hiện độ nhiễm
Aflatoxin cao quá mức cho phép. Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các
phương pháp chẩn đoán sớm nấm Aspergillus sinh độc to Aflatoxin có ý nghĩa
cực kỳ quan trọng trong việc hạn chế lây lan và giảm thiểu tác hại của nấm.
Phương pháp phát hiện mầm bệnh nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin bằng
kỹ thuật PCR chưa được nghiên cứu ở Việt nam. Với mục tiêu xây dựng
phương pháp chẩn đoán sớm, nhanh và nhạy góp phần làm giảm thiểu tác hại
của nấm Aspergillus trong sản xuất nông nghiệp và tăng giá trị nông sản xuất
khẩu của Việt nam ừên thị trường thế giới, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: "Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh
độc tố Aílatoxin bằng kỹ thuật PCR" với các mục tiêu chính như sau:
- Thu thập và phân lập các chủng nấm A. flavus trên một số nông sản (lạc,

ngô, đậu tương, gạo).
- Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh A. flavus sinh độc tố
Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR để phát hiện tình trạng nhiễm Aflatoxin trên
nông sản.
1
4
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1Tính nguy hại của việc nhiễm nấm Aspergillus spp. và độc tổ
2.39 Aílatoxỉn trên lương thực, thực phẩm
2.40 Trong lịch sử đã từng xảy ra nhiều vụ ngộ độc thức ăn gây tử vong
cho hàng loạt người và gia súc mà nguyên nhân chính là do độc tố của một số
chủng vi nấm mà chúng ta gọi là nấm mốc. Năm 1924 Shoíĩeld và cộng tác đã
phát hiện một loại độc tố được sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc.
Cũng trong thời gian này, Liên Xô tìm ra bệnh không tăng bạch cầu
(Aleusemic) ở một số người ăn phải ngũ cốc bị mốc [61].
2.41 Đến năm 1960 có một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại
một quần đảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học phương
Tây tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra nguyên nhân gà chết là do sưng to
gan, sau xét nghiệm và phân tích đã xác định tác nhân gây chết là độc to
Aflatoxin do nấm A. flavus tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên
thức ăn [61,62],
2.42 Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng
lOmg), độc tố Aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư.
Người ta đã biết Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất
tác động qua đường miệng - nếu hấp thu một tổng lượng 2,5mg Aflatoxin
trong thời gian 89 ngày có thể dẫn đến ung thư gan hơn 1 năm sau. Năm 1961,
ở Anh người ta đã tiến hành thực nghiệm trên chuột cống, cho ăn thức ăn đã
nhiễm mốc trong đó 20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư
gan. Robinson nghiên cứu trên trẻ em Ân Độ bị xơ gan, bằng phương pháp sắc
ký lớp mỏng, ông đã tìm thấy Aflatoxin trong nước tiểu của những trẻ bị xơ

gan và trong sữa của những bà mẹ có con bị xơ gan. Như vậy, theo ông giữa
xơ gan và Aflatoxin có một mối quan hệ khá chặt chẽ với nhau [3].
2.43 Ở Thái lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các
1
5
mẫu lương thực thực phẩm bị mốc thì 50 - 60% số mẫu đó có Aflatoxin. Đồng
thời nhóm tác giả này tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực
phẩm tại các gia đình) cũng thấy có 30 - 50% số mẫu có độc tố Aflatoxin.
Payet và cs (1966) cho biết ở Xênêgan nhiều trẻ em dưới 1 năm tuổi được ăn
70-140 g lạc/ngày trong 10 tháng liền để điều trị bệnh Kwashuovkov. Những
mẫu lạc này sau đó phát hiện có chứa 500 - 1000 ppb Aflatoxin BI. Như vậy
trung bình một ngày một trẻ em đã phải ăn từ 35 - 140 ppb. Hai đứa trẻ trong
số này mắc bệnh gan sau 4-6 năm. Những người công nhân làm việc trong dây
chuyền chế biến lạc có thể nhiễm Aflatoxin qua hô hấp. Một kỹ sư hóa chất
phụ trách khâu hấp tiệt trùng bột lạc bị chết và đã phát hiện được Aflatoxin BI
trong tế bào phổi [22].
2.44 Ở Hà Lan, những công nhân làm việc ở nhà máy ép dầu lạc có thể
tiếp nhận từ 0,039 ppb tới 2,5 ppb Aflatoxin trong một tuần lễ làm việc (Van
Nieweenhuize, 1973). Theo Baxter và cs (1981) có sự nguy hiểm khi tiếp xúc
với bụi lạc hay các sản phẩm nông nghiệp khác có chứa Aflatoxin, tuy mức độ
nguy hiểm chưa được xác nhận [1].
2.45 Theo thống báo của tổ chức nông lương thế giới (FAO), tổn thất
hàng năm ước tính khoảng 12 - 15 % ữên toàn thế giới, trong đó 25% nông sản
của toàn thế giới bị nhiễm các độc tố nấm mốc. Vì vậy, phòng chống độc tố
nấm mốc là vấn đề hết sức quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và được các
nước trên thế giới đặc biệt quan tâm [3,4],
2.46 Ở Philippin các sản phẩm công nghiệp dùng làm thức ăn như lạc,
gạo, đậu tương và cà phê cũng được xác định là nhiễm Ẩ. ýlavus và độc tố
Aflatoxin ở các mức độ khác nhau và được thể hiện ở Bảng 2.1 [1],
2.47 Bảng 2.1 Sự có mặt của A. flavus và Aflatoxin ờ các mẫu lạc (từ 1967-

2.48 1983 ỞPhilippin)
1
6
8A
2.50 Có nhiều chủng nấm mốc tiết ra độc tố này (nấm A. flavus, A.
parasiticus, A. nomius), nhưng A. flaws là loài nấm mốc cung cấp những lượng
Aflatoxin lớn nhất, nguy hiểm nhất. Ở khắp các vùng Nam Phi, nơi người ta ăn
nhiều lạc có mốc A. flavus, tỷ lệ bệnh nhân bị ung thư gan rất cao. A. flaws gặp
nhiều ở các lương thực, thực phẩm khác nhau, nhung các loại hạt có dầu (đặc
biệt là lạc) thích hợp nhất cho sự phát triển [29, 51]. Tác giả (Hiscocks) đã
nghiên cứu hơn 1000 mẫu lạc thí nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất
độc - lkg chứa trên 0,25mg Aflatoxin BI (độc tố chủ yếu của A. flavus) và
21,7% số củ độc vừa, 75% số củ không độc. Còn trên lạc khô: 42% số mẫu là
rất độc; 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc [3,4],
2.51 Loài nấm sản sinh Aflatoxin là A. flaws được phân lập từ 13-21%
trong các mẫu gạo. Những nghiên cứu ở Thái Lan cũng cho thấy A. flaws có
mặt trong nhiều loại thực phẩm bán trên thị trường. Các chủng sinh Aflatoxin
cũng có trong đất trồng trọt. A. flaws được phân lập từ 15 trong 50 mẫu đất ở
Malaysia và 29 trong 106 mẫu đất ở Thái lan, 16 chủng ữong số 44 chủng
phân lập sản sinh Aflatoxin [1, 60]. Các trường hợp nhiễm độc ở người do ăn
2.1Loai mẫu lac
• •
2.2 Tỷ lệ nhiễm
A.
flavus (%)
2.3 Hàm lượng
Aflatoxin BI (ppb)
2.4 Lạc còn tươi
mới đào
2.5 5 2.6 14

2.7 Lạc ở trại, bảo
quản
2.8 1
2.9 257
2.10 trong các chum,
kho
8 88
2.13 Lạc đã bóc vỏ
từ các
2.14 45 2.15 964
2.16 kho nông trại
8B 8C
2.19 Lạc còn trong
vỏ
2.20 25 2.21 0
2.22 Nhân lạc bóc vỏ
lụa
2.23 90 2.24 114
886
1
7
phải Aflatoxin có trong thực phẩm, đặc biệt là ngô nhiễm hàm lượng cao đáng
được quan tâm hơn lạc. Mặc dù lạc nhiễm Aflatoxin nhiều hơn ngô, nhưng
người ta chỉ ăn lạc với lượng nhỏ, trừ một số nước ăn lạc khá phổ biến như
Môdambic, Xênêgan, Xuđăng [1,3]
2.52 Những nghiên cứu của Ablas K. và cộng sự (2004) cho thấy sự
nhiễm Aflatoxin trên ngô do nấm A. jlavus gây nên là một vấn đề quan trọng ở
các vùng ữồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. Trong 3 năm nghiên cứu
từ 2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A. flaws trong đất và
đã xác định rằng mức nhiễm A. Jlavus trong đất trồng ngô bị ảnh hưởng bởi

các vụ canh tác trước. Mật độ A. flaws cao nhất là 794 CFU/g, trong đất trồng
ngô vụ 2001 so với 251 CFƯ/g trong đất trồng bông gối vụ năm 2000 và 457
CFƯ/g đất trồng lúa mì gối vụ năm 2002. Sự nhiễm A. flavus trên ngô hạt năm
2000 dao động từ 0% đến 100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm
lượng Aflatoxin trong ngô dao động từ 0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb).
Mức nhiễm Aflatoxin phân bố ngẫu nhiên trong ngô ở ngoài đồng không tương
quan tới sự nhiễm A. flavus: 43 đến 59% có khả năng tạo các chủng A. flavus
phân lập trong đất Aflatoxin. Với sự nhiễm cao nhất ở quần thể đất của ngô gối
vụ năm 2001. Kết quả cũng cho thấy 84% A. flaws phân lập từ các hạt ngô có
khả năng tạo Aflatoxin [24].
2.53 Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm Aflatoxin Bi (mức trung bình
400pg/kg), trong khi 40% nhiễm Aflatoxin Bi (mức trung bình 133pg/kg) đã
được tìm thấy ở Uganda và 97% ở đảo Cebu, Philippin trung bình là 213
pg/kg. Hàm lượng Aflatoxin ở các mẫu ngô ở gia đình đã liên quan tới sự bùng
nổ của bệnh gan độc tố cấp tính ở tây bắc Ấn Độ. Theo Goto và cộng sự 80 -
85% số mẫu ngô thu thập từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 - 1985 ở
Thái lan đã nhiễm Aflatoxin Bi với lượng 6,30 - 1310 ppb và 0,6 - 767 ppb
theo thứ tự. Trong năm 1973, nghiên cứu về lạc bóc vỏ ở Mỹ cho thấy 15%
1
8
của 361 mẫu có Aflatoxin giới hạn từ vết đến 50 pg/kg. Stoloff, Krof và Hald
đã tìm thấy Aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của các sản phẩm lạc nhập vào Đan
Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465 ịig/kg. Các Aflatoxin đã tìm thấy
ở 41% của 173 số mẫu lạc ở Sudan, 16 mẫu có trên 250 pg/kg và 9% số mẫu
có trên 1000 pg/kg. Ở Philippin, tất cả các mẫu lạc đuợc kiểm ữa năm 1967 -
1969, có Aflatoxin với giá trị 155 ịig/kg và giá trị trung bình 500 pg/kg [3, 4].
2.54 Điều kiện thời tiết ở Việt Nam đuợc xem là môi truờng lý tuởng
cho sinh truởng và phát triển của nấm mốc nói chung và nấm Aspergillus spp.
nói riêng. Nấm mốc có mặt khắp mọi nơi và thuờng phát sinh, phát triển trên
các sản phẩm luơng thục, thục phẩm và cả trên hoa quả. Bên cạnh việc nấm

mốc gây hu hỏng, thối rữa, làm hỏng, giảm chất luợng và giá trị sử dụng còn
có rất nhiều loài nấm mốc tiết ra độc tố gây bệnh cho con nguời. Chính vì tác
hại của độc tố này gây nên với con nguời nên nhiều nuớc phát triển trên thế
giới nhu: Mỹ, Nhật Bản, các nuớc Eư, khi nhập luơng thục, thục phẩm nhu:
ngô, lạc, cà phê, chè, đã đua ra khung giới hạn về hàm luợng về Aflatoxin
phải ở duới mức cho phép. Thục tế thì đã có nhiều lô hàng nông sản xuất khẩu
của nuớc ta nhu: lạc, đậu tuơng đã bị trả lại do phát hiện độ nhiễm Aflatoxin
cao quá mức cho phép. Vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện sớm và nhanh nấm
Aspergillus spp. sinh độc to Aflatoxin đang đuợc đặc biệt quan tâm nghiên
cứu. Mức độ nhiễm Aflatoxin trên ngô và một số tỉnh miền Nam và Bắc Việt
nam cho thấy tần xuất nhiễm Aflatoxin giao động từ 73,3% đến 95,8% trong
đó hàm luợng Aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8 ppb và hàm luợng
Aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25 ppb đối với các tỉnh khác nhau [3, 4 ].
2.55 Ở Việt Nam, Đậu Ngọc Hào và các cộng sự đã nghiên cứu mức độ
2.56 nhiễm nấm mốc và Aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh
Hóa. Kết quả phân tích của 24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các
mẫu này đã bị nhiễm Ả. flavus với tần số cao, từ 50 - 80 %. Các loài khác như
1
9
Ả. gỉacus, Ả. fumigatus và A. Candidas cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao. Loài A.
ochraceus đã được phát hiện thấy ở tỷ lệ thấp. Các loài thuộc chi Fusarium đã
nhiễm với tần suất 15%. Kết quả nghiên cứu mức nhiễm Aflatoxin những mẫu
ngô trên đã cho thấy 33% số mẫu ngô hạt đã bị nhiễm Aflatoxin Bi từ 10 - 40
ppb, 83 % số mẫu bị nhiễm Aflatoxin B
2
từ 10 - 20 ppb, 72% mẫu ngô bột đã
bị nhiễm Aflatoxin Bi từ 25 - 250 ppb ; 9,5% số mẫu ngô bị nhiễm Aflatoxin
B
2
từ 10-20 ppb [1,3].

2.2Sơ lược về các loài nấm Aspergillus spp.
2.57 Ả. flavus, A.parasỉtỉcus, A. nomỉus là ba loài nấm trong quá trình
xâm nhiễm, sinh trưởng phát ữiển tiết ra độc to Aflatoxin cả trên môi trường tự
nhiên và môi trường nuôi cấy nhân tạo, ba loài nấm này thuộc họ nấm cúc.
Đây là các loài nấm khá phổ biến, có thể tìm thấy trên khắp địa cầu, đặc biệt là
các nước nhiệt đới. Bào tử của nấm A. jlavus có khả năng phát tán trong không
khí, trong nước, trong đất. Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát
sinh phát triển trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại
một số loài cây hồng. Vì phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên
phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn. Nam A jlavus có thể ký sinh, gây
hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn. Trên một số loại hạt làm thực phẩm
như: lạc, đậu, vừng, w Trên thực phẩm như: các sản phẩm chế biến từ ngũ
cốc, lạc, vừng, đậu đỗ, và thậm chí cả ữên hoa quả tươi bị bầm dập như:
thanh long, nhãn, xoài, vải, [12, 57].
2.58 Hình 2.1 cho thấy chu kỳ của nấm A. ýĩavus trên ngô vàng. Các
loài nấm sống qua mùa đông thường hoặc là hệ sợi nấm hoặc là có cấu trúc
kháng như hạch nấm (sclerotia). Hạch nấm hoặc là sinh thêm các bào tử sợi
nấm (hyphae) hoặc sinh ra bào tử đính (conidia) hay bào tử thể vô tính, chính
điều này sẽ phát tán ra ngoài môi trường, ra đất và không khí. Các bào tử mang
đến các cây ngô nhờ côn trùng hoặc nhờ gió, rồi từ đó nhiễm nấm trên ngô và
2
0
gây hại [63].
2.2.1 Hình thái học nấm A.flavus và nấm A. paraciticus.
2.59 Trong tự nhiên, có thể dễ dàng phân biệt được loài nấm này do
chúng có màu sắc dễ nhận. Màu vàng lục hay màu xanh lục của đám bào tử
khi chín bám ữên các mầm của hạt hoặc phát triển trên các kẽ giữa hai phiến
của hạt, khi tách ra có thể nhìn thấy rất rõ. Ở các khe giữa hạt lạc hay lớp mầm
của hạt ngô bị mốc có thể quan sát thấy bào tử. Trên môi trường nuôi cấy nhân
tạo, trên thạch Sabouraud hay Czapek Doc hình thành khuẩn lạc sau 24 giờ,

khu vực trung tâm có màu vàng nhạt, rìa mép màu trắng mịn. Sau 48 giờ hình
thành nhiều bào tử miền trung tâm, xuất hiện các khối bào tử chin, màu vàng
nhạt đã chuyển sang màu vàng lục. Từ 72 - 96 giờ, khuẩn lạc phát triển mạnh
và đạt cực đại ở ngày thứ 6-7 khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Khuẩn lạc có kích
thước tới 4 - 5 cm, hình thành nhiều vòng tròn đồng tâm đều đặn, thường có 5
- 6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc, rất dễ phân biệt với nhiều
loại nấm mốc khác. Quan sát đặc điểm vi thể dưới kính hiển vi ở bội số thấp
(XI6) cũng có thể phân biệt được do cơ quan sinh sản của loại nấm này rất
phong phú. Cơ quan sinh sản có hình hoa cúc. Bọng tròn có kích thước từ 25 -
45 pm, giá conidi (conidiophores) (cuống sinh bào tử) mọc thẳng từ sợi xù xì
có kích thước từ 400 - 1000 pm; rộng 5-15 pm. Bào tử trần (conidi) hình tròn
hoặc hình ovan, có đường kính từ 2 - 4 pm. Thể bình có hai lớp, kích thước từ
10 - 15 pm và 3 - 5 pm, đôi khi chỉ có 1 lớp [1, 12].
2.2.2 Phân biệt A. Jlavus trong nhóm A.flavus oryzae.
2.60 Trong nhóm A. flavus oryzae có 5 loài gồm A. oryzae Cohn, A. flavus
2.61 Link, A. parasiticus Speare, A. micro virido citrinus Constantin Lucet, và
A. effuses Tiraboschi. Cả 5 loài này rất dễ nhầm lẫn với nhau về hình thái học,
về màu sắc điển hình trên môi trường nuôi cấy: loài A. oryzae Cohn được sử
2
1
dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men đậu tương, trong công nghiệp sản
xuất các men (enzym) phục vụ cho công nghiệp lên men rượu bia, sản xuất
thức ăn chăn nuôi, do vậy cần phải được phân biệt để tránh nhầm lẫn với hai
loài A. flavus và A. parasiticus sản sinh độc tố Aflatoxin. Cả 5 loài này rất phổ
biến trên phạm vi toàn thế giới và chiếm phần đông trong họ Aspergillus.
Chúng được biết đến do sự có mặt ở nhiều loại cơ chất khác nhau. Trong công
nghiệp lên men của các nước phương Đông: ngũ cốc, sản phẩm chế biến từ
lương thực như bánh mì, mì sợi, hàng hoá làm bằng da, thịt, sản phẩm từ
trứng, sữa, đậu tương, nước hoa quả, rau quả, hàng dệt, giấy, từ côn trùng,
phân rác, từ phổi của chim, từ ruột của bệnh nhân Chúng còn có thể tìm thấy

trong đất, đặc biệt vùng đất ẩm, nóng ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Các
loài này rất khác nhau về hình thái, màu sắc, trên môi trường nuôi cấy và quan
sát trên kính hiển vi về cơ quan sinh bào tử. Sự khác nhau liên quan tới nguồn
gốc thu thập mẫu phân lập chúng. Mẩu phân lập từ đất cho thấy các bọng bào
tử có màu xanh vàng và có cuống bào tử ngắn. Các chủng phân lập từ gạo ở
vùng phương Đông thấy bọng có màu vàng nhạt, giá bào tử dài (cuống sinh
bào tử), vách mỏng [1, 12]. Tuy nhiên, nhóm này cũng có những đặc điểm
chung là:
- Màu sắc khuẩn lạc khác nhau từ màu xanh lục tới màu xanh vàng đậm.
- Cuống bào tử thô ráp không màu sắc.
- Đầu hình bán cầu, hình cột hay gần hình cầu.
- Thể bình một lớp hay hai lớp, thường khác nhau ngay trên một bọng.
- Bọng khác nhau về hình dạng từ bán cầu tới hình vòm trên các đầu nhỏ và
hình cầu trên các đầu lớn.
2
2
- Bào tử thô khác nhau về màu sắc.
- Hạch nấm có ữong nhiều chủng, màu nâu xám tới màu đen.
2.62 Nấm Ả. flavus, A. parasiticus thường nhầm lẫn với loài A. oryzae ừong
sử dụng (chúng cố hình thái, cấu tạo và mối quan hệ di truyền rất gần nhau), như có
mầu khuẩn lạc xanh nhạt, cuống sinh bào tử không mầu, lớn như nhau, đầu thể bình
lưỡng tính hoặc đơn tính, bào tử hình cầu nhỏ Vì vậy, chủng ta cần phải kết hợp cả
vỉệc quan sát mầu sắc khuẩn lạc ưong quá trình phân lập, nuôi cấy và hình ảnh cuống
sinh bào tử khi soi kính hiển vi để tránh nhầm lẫn khi phát hiện các loạỉ nấm này (Ả.
flaws có kích thước cuống sinh bào tử (0,4 - lmm) ừong khi đổ A. oryzae là (1 - 2
mm)).
2.63 2.3 Những đặc tính của độc tố Aílatoxỉn
2,3.1 Tinh chất vật lý, hoá học của Aflatoxin
2.64 Aflatoxin là độc tố chính được tiết ra chủ yếu bởi một số loài nấm
Aspergillus spp. Các Aflatoxin được cấu tạo gồm bốn hợp chất của nhóm bis-

furanocouramin, là sản phẩm ừao đổi chất tạo bởi nấm Á. flaws và A.
Hình 2.2 Cấu tao vi thể của nấm
Aspergillus flavus Link - Cơ quan
sinh sản gồm: bọng (vesicular); thể
bình (metular); và bào tử (conidỉ).
2
3
2.65 parasiticus. Hiện có khoảng trên 16 loại độc tố Aflatoxin đã được tìm thấy, có
kí hiệu Bi, B
2
, GI, G
2
, MI, M
2
, PI, Qi, được phân biệt trên đặc tính lý hóa và độc
tính của chúng [1],
2.66 Các Aflatoxin Bi, B
2
và Gi, G
2
đã được nhiều phòng nghiên cứu xác
định cấu trúc hoá học. Thoạt đầu các nhà hoá học đã xác định có hai Aflatoxin có
công thức CI
7
HI
2
0
6
và CI
7

HI
2
0
7
với trọng lượng phân tử tương ứng là 312 và 328.
Hiện nay hai độc tố được biết là Aflatoxin Bi và Gi. Trong cấu trúc phân tử có các
nhóm lacton và metoxyl, không có nhóm hydroxyl tự do. Các hợp chất trên được
phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là viết tắt của chữ Blue (xanh lam)
và G là viết tắt của chữ Green (xanh lá cây). Aflatoxin Gi có chứa 2 vòng lacton,
Aflatoxin Bi - 1 vòng lacton. Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử Aflatoxin làm
chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm, đặc tính này giữ vai trò
quan trọng trong mọi quá trình chế biến thực phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm
hàm lượng Aflatoxin của các sản phẩm, mặc dầu sự có mặt của protein, pH, và thời
gian xử lý có thể làm thay đổi các kết quả. Tuy nhiên, nếu chỉ xử lý kiềm nhẹ thì việc
axit hóa sẽ làm phản ứng diễn ra theo chiều ngược lại để tạo Aflatoxin ban đầu [1,2].
2
4
2.67 Sau đó, hai Aflatoxin B
2
và G
2
cũng được phát hiện. Chúng có công
thức hoá học hoàn toàn giống với Aflatoxin Bi và Gi chỉ khác là nối đôi trong vòng
hydrofuran đã bị khử. Sự khác biệt về cấu trúc hóa học giữa các độc tố này là không
lớn nhưng độc tính của chúng thì khác nhau rất lớn. Ví dụ như độc tố BI và GI có độc
tính cao nhất và cao hơn nhiều lần so với B2 và G2. Trong các loại Aflatoxin thì
Aflatoxin Bi thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp theo là Gi, trong khi đó
B
2
và G

2
tồn tại ở nồng độ thấp hơn.
Hình 2.6 Cấu trúc hoá học của Aílatoxỉn (Jones, 1977).
2
5