Bước đầu nghiên cứu việc sử dụng nấm mốc để xử lý sinh khối rơm thành các đường dùng để sản xuất Ethanol

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHẠM THỊ THANH THÚY
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU VIỆC SỬ DỤNG
NẤM MỐC ĐỂ XỬ LÝ SINH KHỐI RƠM THÀNH
CÁC ĐƯỜNG DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT ETHANOL
Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH
LỜI CẢM ƠN
Khi bắt đầu để viết Luận văn, đặt biệt là Lời cảm ơn Em vô cùng xúc động
và xin gửi lòng cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Hoàng Quốc Khánh, trưởng
Phòng Vi Sinh Ứng Dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công
Nghệ Việt Nam. Thầy là người đã đưa ra ý tưởng về đề tài và luôn quan tâm,
hướng dẫn, động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn
thành tốt luận văn này.
Em xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn quý thầy cô Bộ môn Sinh hóa cũng
như quí thầy cô Khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ
Chí Minh, đã tận tâm truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt
khóa học này.
Tôi xin cảm ơn anh Ngô Đức Duy, em Đào Thị Thu Hiền, cán bộ nghiên
cứu Phòng Vi Sinh Ứng Dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, đã quan tâm, giúp đỡ,
động viên tôi trong suốt thời gian làm luận văn.
Cảm ơn tất cả những người bạn thân thiết lớp cao học Hóa Sinh K15,
chúng ta đã cùng nhau vượt qua khó khăn và động viên nhau trong học tập.
Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn, con xin chân thành
cảm ơn ông bà, cha mẹ đã luôn hết lòng yêu thương, chăm sóc, dạy dỗ con. Gia
đình là điểm tựa, là niềm tin để con vươn lên.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 08 năm 2010.

Chân thành cảm ơn
Phạm Thị Thanh Thúy
 Mục lục


./01############################################################################################################## E
23&45,'1671
4#4#889:;<=>?@>A9>B#######################################################C
EEE))AUT;_i N
EEK))O6:7;_i S
4#D#&!?@>A@>&$E@@@$9E########################################################################### F
EKE1&0 J
EKK?&0 \
EKN ^
4#C#3<=;!@############################################################################################# 4G
4#H#I9>J(>E@@@$9E=%K=$@#######################################################44
4#F#/L M>NO8 =*>O9> @PQ%9>R <E Saccharomyces
cerevisiae############################################################################################################ 44
4#S#/LM>NO8=*>O9>@PQ%9>R<EPichia stipitis 4D
4#T#/LM>NO8=*>O9>@PQ%9>R<9U>Trichoderma reesei####4C
4#T#4#V=9(ML=WAEX!EE@@@9EQ%;!@9E=ITrichoderma reesei
13
4#T#D#V=9(!Y=( :2Z&MYJ:&9>EX!EE@@@9EQ%
EX!E;!@9E=I<Trichoderma reesei 16
EZKE7&f( EJ
EZKK7&fH EZ
EZKN1QI#$(_M EZ
EZKS,?;:#$ E\
EZKW+`'9 E\
EZKJA(<RE^

4#[# *!Y=( :2Z&MY\*=]8=^!_`]3]aZ>EX!E
E@@@9EQ%;!@9E=I<(Trichoderma reesei 19
 ! "#$%&'()*
 Mục lục
E\EjOGQ&k&A:&E^
E\KjOG:#$ E^
E\NjOG,? K]
E\SH<lHQ;CK]
E\WjOG<Q'_m K]
4#b#!NR9>B=IE@@@$9E=%E=$@#####################################DG
E^E60;",[GKE
E^KA KE
4#4G#!NR9>B=I;!@$9E=%E=$@Q%*!Y=(:2Z&
MY\*=]8@?EE=$@##########################################################################DD
4#44#)Y=\:&>?c&$%>2d############################################################## DH
4#4D#)Y=\:&>?c=]$&2d############################################################## DT
23&De71fgh,
D#4#=@>A######################################################################################################## Db
KEE7&A;":& K^
KEEEnH K^
KEEK60;" K^
KEK?FQ;  N]
KEKE?FQ N]
KEKK IF;&Q;0;" NE
D#D*_23&_*_9ijk&######################################################################### CD
D#D#4#23&_*_\9*=8=*>Trichoderma reesei 32
KKEEo&0<#I=NK
KKEKo&0<;= NK
D#D#D#23&_*_\9*=8=*>=Ya%$<E Pichia stipitis và
Saccharomyces cerevisae 33

D#D#C23&_*_;*M=MVa%$=i<9U>Q%=Ya%$<Eal&
am&MYm&n######################################################################################### CC
D#D#H#23&_*_M@2U&M2o&Ji################################################## CH
 ! "#$%&'()*
 Mục lục
KKSE7&AR NS
KKSKp[3# &P NS
KKSN.H,<,#V&9: NS
KKSS9'U%&D NS
D#D#F#23&_*_;*M$==WEX!EE@@@9EQ%EX!E;!@9E
############################################################################################################################ CF
KKWE7&AR NW
KKWKp[3# &P/&0Xp05<#YI9CNW
KKWN.H,<,#V&9: NJ
KKWS9'U%&DI9C&0;50NZ
D#C#23&_*_&>?c#########################################################################C[
KNED0<DOGU& #U# '
%&<)G,[HNZ
KNKD0<DOG"#$(#U# '
%&<)G,[HNZ
KNND0<DOGU&,?(#8&#U# '
%&<)G,[HN\
KNSD0<# 'I'0`;'0`
&Y#:7-%&<)G,[HN\
KNWD0<DOGQI#$(_MA%&<)G,[
H N^
KNJG,[HI()A;T<#_&': d"#$
d,?;QI#$(_M#mBO<9:N^
KNZA#_&':&Q,5;T2#$'<&
;TGSaccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis S]

23&C)'1+f"71e
C#4#):$9*=:2Z&^!Y=(=o>&>MY%@2U&M2o&Ji
=$]=]$&\*=]8=^!_`]3###########################################################HD
NEEq03#a,?%&<)G,[SK
 ! "#$%&'()*
 Mục lục
NEK?# '  SN
NEN?I9C&0 SW
NES?I9C50 SJ
NEW?:&0&QG%&<)G,[HS\
C#D#):$9*=:2Z&^=MVa%$=i(MY%@2U&M2o&
Ji=]$&\*=]8=^!_`]3##############################################################FG
NKE?# '<'=&"#$(W]
NKK?I9C&0;50WE
NKN?:&0&QG%&<)G,[HWK
C#C#):$9*=:2Z&^!Y=(_aMnMY%@2U&M2o&
Ji=]$&\*=]8=^!_`]3##############################################################FD
NNE?# 'WK
NNK?I9C&0 WK
NNN?I9C50WS
NNS?:&0&QG%&<)G,[HWW
C#H#):$9*=%@2U&M2o&Ji=$]J>9ijk&Q%Jp&9ijk&
j&jMAE==E=]$&\*=]8=^!_`]3########################FS
NSE?# 'WJ
NSK?I9C&0;50WZ
NSN?:&0&Q,D2G,[H W\
C#F#):$9*=:2Z&^<=$=MV&aqL=@?\*=]8=^!
_`]3########################################################################################################## F[
NWE?# 'W\
NWK?I9C&0;50W^

NWN?:&0&Q,D2G,[H JE
C#S#^!_`]3]=]$&a8@?EQd>*M>qJ>A=o>&>O=
MVa%$=i(O_Q%<=$=MV&aqL=MrBZ*=W&>A
=]?#################################################################################################################### S4
NJE?# 'JK
NJK?I9&0;50JK
 ! "#$%&'()*
 Mục lục
C#T#?EE=$@=]$&M>qJ>A&<_$;>Qd>>cMVJ*
Qd>^&Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis 63
23&H)1e6/s,t
SEU&" JJ
SKL_Y JJ
671)+u

.``E`U(Y;``
.``K.H,<,,[9
.``NU%&D5g'A
 ! "#$%&'()*
Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

-  
-  
-  
-   
- ! "#$%&
- ! "#$%&"
- ! "#$%&'
- ! &()"*&()'

- ++ +&+&,
- ++ / +&+&, 
,00
- 1 
-  23
- 4. 405.,00
- .67 ",#8&'96:7
- 77;.777:,;,<=
- 10 1(-(&0
- . (->> 0
- +?@ +,?00@
- 1 (1;0
- ++@ +&&0+>@
- ?.1 ?-,>%&,
- . .50
- 11 1(5&0
- 7? 7&
- 7+? 7A:&0B
- . >.C
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
DANH MỤC CÁC BẢNG

DEE,8FBGHIJ
DEKLM90FGC500*Trichoderma reesei EJ
DEN1# ;"&=50O$;;'&P;QKK
DKEFR%&<)3# &P&0NS
DKK1<(TU#V&9: NW
DKNFR%&<)3# &P&0X50NJ
DKS1<(TG%&<)5<#YI9&0;50NJ

DKW99:ASE
DNE?# ' SN
DNK?I9C&0 SW
DNN?I9C50 SZ
DNS?:&0&QG%&<)G,[HIS\
DNW?# '#I"#$(W]
DNJ?I9C&0;50 WE
DNZ?:&0&QG%&<)G,[HIWK
DN\?# 'IH2;T<<Y,?(#8&
'<&%&<)G,[HWN
DN^?I9C&0WN
DNE]?I9C50 WW
DNEE?:&0&QG,[HO<#_&':,?'<&WW
DNEK?# 'I'0`;'0`&
Y#:7- WJ
DNEN?I9C&0;50I'0`;'
0`&Y#:7- WZ
DNES?:&0&QG%&<)G,[HIW\
DNEW?# ' I'(a0&;'(a0&
b-\]c]dEe W^
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
DNEJ?I9C&0;50I'(a0&;'
(a0&b\]c]dEeW^
DNEZ?:&0&QG%&<)G,[HJE
DNE\?# ' JK
DNE^?I9C&0;50JN
DNK]U%&Df#$ JS
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục

DANH MỤC CÁC HÌNH

?)EE12FBG&0J
?)EK=&@>(;'=&@Z
?)EN12FBG&0\
?)ES1<#H;YH(DG^
?)EW12FBGE]
?)EJ6Y9,[RG:C,[D&0EW
?)EZ6Y9RG:C,[D5EJ
?)E\12Q&Ib\] EZ
?)E^A*50 KN
?)KE7&A:&H#5g0H($K^
?)KK7QTrichoderma reesei 6--\]ENN]
?)NELfY(=&h03#a,?O< 9:SK
?)NKLfY(=&h# 'I SS
?)NN+3(U#aI9&0 SJ
?)NS+3(U#aI950  SZ
?)NWLfY(=&h:&0&Q%&<)G,[HS^
?)NJ=&#f(=&hI9&0d50"#$(
 WE
?)NZ=&#f(=&hI9C&0;50I'0
`;'0`&Y#:7-WZ
?)N\=&#f(=&hC&0;50I'(a0&;
'(a0&b\]c]dEe J]
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ Mở đầu
MỞ ĐẦU
Sự thay đổi khí hậu, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên có giới hạn và
nhu cầu sử dụng năng lượng toàn cầu tăng là một vấn đề cần quan tâm cấp thiết.
Nhu cầu năng lượng toàn cầu tăng 50% vào năm 2025 và sự tăng trưởng kinh tế

một cách nhanh chóng của các quốc gia thuộc Châu Á như Ấn độ, Trung Quốc.
Để đáp ứng lại sự tăng trưởng kinh tế vào thế kỷ 21, chúng ta cần cố gắng hơn
nữa việc nghiên cứu và sản xuất năng lượng sinh học từ nguồn nguyên liệu tái
tạo, chi phí thấp và nguyên liệu có sẵn tại địa phương như chất thải sinh học và
các phần còn lại từ nông nghiệp. Sự nỗ lực này không những làm giảm sự ô
nhiễm môi trường, mà còn giảm việc khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên
đang dần cạn kiệt. Phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học hiện nay có giá
thành rất cao, tuy nhiên, vì mục đích bảo vệ môi trường và phát triển bền vững
nên sử dụng nhiên liệu sinh học. Công nghệ sinh học về lên men là một trong
những kỹ thuật mà có thể ứng dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối
lignocellulosic, sẽ giúp chúng ta đạt được mục tiêu giữ được môi trường và
nguồn năng lượng sử dụng.
Đứng trước những nguy cơ thiếu hụt về nguồn nhiên liệu hóa thạch như
dầu mỏ, than đá và cũng là mối quan tâm hàng đầu hiện nay, vì vậy nội dung và
phạm vi của đề tài là “Bước đầu nghiên cứu việc sử dụng nấm mốc để xử lý
sinh khối rơm thành các đường để sản xuất ethanol” sẽ góp phần vào việc
nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu tái tạo được để sản xuất ethanol sinh học
phục vụ cuộc sống bền vững
Đề tài được thực hiện qua những nội dung như sau:
A. Giai đoạn 1: Sử dụng nấm mốc để thủy phân rơm rạ thành đường.
1. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hàm lượng đường khử
tạo ra trong quá trình thủy phân rơm.
2. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ bào tử mốc đến hàm lượng đường
khử tạo ra trong quá trình thủy phân rơm.
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
1
Luận Văn Thạc Sĩ Mở đầu
3. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH ban đầu đến hàm lượng đường khử
tạo ra trong quá trình thủy phân rơm.
4. Khảo sát hàm lượng đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng

dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm.
5. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên quá trình thủy
phân rơm.
6. Sử dụng bình lên men với các điều kiện thời gian, mật độ bào tử mốc,
pH và chất hoạt động bề mặt đã chọn ở các thí nghiệm trên.
B. Giai đoạn 2: Lên men ethanol từ các đường được tạo ra
7. Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức độ khác
nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis
Nội dung và kết quả nghiên cứu của đề tài làm cơ sở cho việc ứng dụng
công nghệ lên men trong quá trình lên men sinh khối lignocellulosic. Từ những
kết quả nghiên cứu của đề tài với qui mô phòng thí nghiệm sẽ phát triển thành kỹ
thuật ứng dụng cho các mô hình sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulosic qui
mô lớn hơn, đáp ứng việc sản xuất nguồn nhiên liệu sinh học từ nguồn nguyên
liệu tái tạo để phục vụ đời sống.
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
2
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình sản xuất nhiên liệu sinh học
1.1.1. Tình hình trên thế giới và tiềm năng
Ngày nay, một số quốc gia sản xuất nhiên liệu sinh học (NLSH) như khí
sinh học, ethanol sinh học và dầu diesel sinh học từ nguồn nguyên liệu tái tạo
ngày càng gia tăng. Toàn cầu sản xuất ethanol sinh học tăng từ 17,25 tỷ lít trong
năm 2000 đến hơn 46 tỷ lít trong năm 2007, chiếm khoảng 4% của 1.300 tỷ lít
xăng tiêu thụ trên toàn cầu. Các chương trình ở Mỹ, châu Á và châu Âu dự kiến
tổng nhu cầu nhiên liệu ethanol sinh học có thể phát triển hơn 125 tỷ lít vào năm
2020 [45]
Hoa Kỳ là nước sản xuất lớn nhất thế giới về nhiên liệu ethanol sinh học,
chiếm gần 47% ethanol sinh học toàn cầu trong năm 2005 và 2006. EU cũng gia
tăng sự phát triển năng lượng từ sinh khối gỗ, chất thải và cây trồng nông nghiệp,

sản xuất ethanol sinh học tăng 71% và tiêu thụ đạt 2,44 tỷ lít trong năm 2007.
Nhu cầu tiềm năng về ethanol sinh học dùng cho nhiên liệu phục vụ giao thông
vận tải ở EU ước tính là khoảng 12,6 tỷ lít vào năm 2010 [45].
Brazil là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới về ethanol sinh học và sản xuất
lớn thứ hai sau Hoa Kỳ, dự kiến sẽ tăng từ 15,4 tỷ lít trong năm 2004 và 26,0 tỷ
lít vào năm 2010. Ethanol từ mía cung cấp 40% nhiên liệu cho xe hơi tại Brazil
và khoảng 20% được xuất khẩu sang Mỹ, EU và các thị trường khác [19].
Hơn 10 nhà máy nhiên liệu sinh học, đang hoạt động hoặc đang được xây
dựng ở Canada, 130 nhà máy ở Hoa Kỳ năm 2006 và tại miền đông Canada và
Hoa Kỳ, ngô được sử dụng làm nguyên liệu, ở phía tây Canada sử dụng lúa mì
làm nguyên liệu. Brazil sản xuất một lượng lớn ethanol từ mía, và nhiều xe trong
nước đã được thiết kế để chạy trực tiếp bằng nhiên liệu ethanol. Ở Châu Âu,
ethanol được sản xuất tại Thụy Điển, Đan Mạch, Đức, Anh, Pháp, Ý và Tây Ban
Nha. Nhiều quốc gia châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, và Indonesia
cũng đang phát triển năng lực sản xuất ethanol [43].
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
3
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
1.1.2 Tình hình ở Việt Nam và tiềm năng
Việt Nam có nhiều tiềm năng về NLSH có thể làm nhiên liệu thay thế cho
xăng dầu nguồn gốc dầu mỏ. Nhiều loại cây như sắn, ngô, mía, có thể sản xuất
cồn sinh học mà ở Việt Nam lại có nhiều vùng đất rất thích hợp với các loại cây
trồng này. Sản lượng sắn cả nước năm 2007 là hơn 7 triệu tấn, mía đường hơn 14
triệu tấn và ngô gần 4 triệu tấn. Với sản lượng này có thể đáp ứng được cho nhu
cầu sản xuất cồn sinh học ở quy mô vừa và nhỏ. Ước tính Việt Nam có thể sản
xuất khoảng 500 triệu lít ethanol sinh học mỗi năm nếu như tổ chức quy hoạch và
thực hiện vùng nguyên liệu theo hướng sử dụng đất triệt để, tạo ra nhiều loại
giống có sản lượng cao và sở hữu các công nghệ tách dầu từ nguyên liệu.
Theo đánh giá của Bộ Công Thương, ngành công nghiệp Nhiên liệu sinh
học Việt Nam đang tăng tốc nhanh. Theo kế hoạch, đến năm 2011, cả nước sẽ có

5 nhà máy sản xuất ethanol nhiên liệu đi vào hoạt động với tổng công suất
365.000 tấn/năm đủ để pha chế 7,3 triệu tấn xăng E5 [47].
Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam đã giao cho các công ty thành viên
Tổng Cty Dầu Việt Nam, Tổng công ty Dịch Vụ Tổng hợp dầu khí xây dựng
chiến lược phát triển vùng nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất của các nhà
máy Nhiên liệu sinh học. Công ty NLSH Phương Đông (OBF), đã ký văn bản
hợp tác với Sở NN và PTNN của tỉnh Bình Phước về hợp tác trồng cây sắn trên
địa bàn của tỉnh. Công ty còn làm việc với một số tổ chức tài chính như Tổng
công ty Tài Chính dầu khí, Ngân hàng BIDV, Ngân hàng Hàng Hải, Ngân hàng
Thương Mại cổ phần Việt Nam (Vietcombank), về khả năng cung cấp những
khoản vay tín dụng cho nông dân trồng sắn, cho những doanh nghiệp sản xuất và
kinh doanh, cung cấp sắn lát cho nhà máy ethanol Bình Phước [48].
Song song với việc phát triển vùng nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất
ethanol, Tổng công ty Dầu Việt Nam đang tiến hành hợp tác với Công ty
Idemitsu và Công ty NBF của Nhật Bản nghiên cứu triển khai việc nhập các
giống cây Jatropha có năng suất cao trên thế giới về trồng thử nghiệm tại Bình
Thuận, Việt Nam để làm cơ sở phát nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất dầu
diesel tương lai. Trên cơ sở chọn lọc và thuần hóa các giống quốc tế tại Bình
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
4
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
Thuận, giống Jatropha có năng suất cao sẽ được trồng đại trà tại các nơi đất khô
cằn, đất hoang hóa tại Bình Thuận, Ninh Thuận, Quảng Trị, Quảng Ngãi để thu
dầu Jatropha. PV OIL sẽ tiến hành nghiên cứu việc xây dựng nhà máy diesel sinh
học khi sản lượng dầu từ cây Jatropha và việc trồng cây Jatropha có hiệu quả
kinh tế đối với nông dân [48].
Tập đoàn Dầu khí Việt Nam cho biết, từ tháng 8 năm 2010 sẽ đưa sản
phẩm xăng sinh học E5 bán tại hơn 20 điểm ở TP Hồ Chí Minh, Hà Nội, Vũng
Tàu, Hải Phòng và Hải Dương. Sau đó, xăng sinh học E5 sẽ được mở rộng ra 3
cửa hàng ở Đà Nẵng, 3 cửa hàng ở Huế và 5 cửa hàng ở Cần Thơ. Và bắt đầu

năm 2012, PVN sẽ cung ứng khối lượng lớn sản phẩm xăng sinh học E5 cho thị
trường cả nước [49].
1.2. Nguyên liệu lignocellulosic
Lignocellulosic gồm các thành phần chính như: cellulose, hemicellulose,
lignin. Cellulose, là thành phần chính, đã được nghiên cứu nhiều nhất. Cellulose
là polymer mạch thẳng được liên kết bởi β (1 → 4) glucosid. Không giống như
cellulose, hemicellulose là một heterosaccharide bao gồm các monome
carbohydrate khác nhau như galactose, mannose, xylose, glucose, và arabinose.
Hemicelluloses thường được phân loại theo sự hiện diện của đường khử như D-
galactan, D-Mannan, D-xylan, L-arabinan, vv. Các đường pentose chính trong
hemicellulose (tức là, β-D-xylopyranose như được tìm thấy trong xylan) là đại
diện chung nhất của một hemicellulose. Các đường pentose khác là arabinose,
thường liên kết với xylose và galactose trong arabinoxylan và arabinogalactan,
tương ứng. D-xylan bao gồm 15 - 30% của cây nhiều năm, 20 - 25% gỗ cứng, và
7 - 12% của gỗ mềm. Các thành phần của các loại đường khác nhau hiện diện
trong polysaccharides cùng với lignin và tro trong vật liệu lignocellulosic khác
nhau được thể hiện trong bảng 1.1
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
5
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
Bảng 1.1: Thành phần hóa học của rơm rạ [11]
Lignocellulosic
Hydrate cacbon
(% )
Không phải
hydrate cacbon
(%)
Glucose Mannose Galactose Xylose Arabinose Lignin Tro
Rơm rạ 41,0 1,8 0,4 14,8 4,5 9,9 12,4
Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản, các sợi này được gắn lại với

nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm.
Các vi sợi được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi
sự tấn công của enzyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân.
1.2.1. Cellulose
Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose được tìm thấy ở
thành tế bào thực vật. D-glucose được liên kết với nhau bằng liên kết β (1 - 4)
glucosid với mức độ trùng hợp không nhỏ hơn 15.000 DP. Thành phần cellulose
của gỗ khác nhau giữa các loài từ khoảng 40-50%. Mức độ trùng hợp (DP) của
cellulose là trong khoảng 10.000-15.000 DP. [8]
Hình 1.1: Công thức hóa học của cellulose
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và lực Van
Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình. Trong
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
6
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị
tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình,
cellulose liên kết không chặt nên dễ bị tấn công. Có hai kiểu cấu trúc của
cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình.
Hình 1.2: Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) và kiểu chuỗi gấp
khúc (Folding chain) [8]
1. Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed Fibrillar): phân tử cellulose kéo
thẳng và định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500Å, xếp xen kẽ
với vùng vô định hình.
2. Kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo
chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm
a và b như trên hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các
mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại,
hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong
vùng vô định hình, các liên kết β - glucosid giữa các monomer bị thay đổi góc

HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
7
Sợi đơn,
b
Sợi đơn, a
Gấp
khúc
Đường
thẳng
Kiểu
Nhiều sợi nhỏ
hợp thành
Kiểu
Chuỗi gấp
khúc
Vô định hình
Vùng kết
tinh
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi
180
o
cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi tác nhân thủy phân
hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β -
glucosid) sẽ làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này không
tạo được liên kết hydro.
Cellulose được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, điều này làm cho
cellulose khá bền vững với tác động của enzyme cũng như hóa chất.
1.2.2. Hemicellulose
Hemicellulose là một loại polymer phức tạp, phân nhánh và độ trùng hợp

khoảng 70 - 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường 6 (galactose-D, L-galactose,
D-mannose, L-rhamnose, L-fructose) và đường 5 (D-xylose, L-arabinose), acid
uronic (D-glucuronic acid) và chứa một lượng nhỏ nhóm acetyl. Thành phần của
hemicellulose phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu. Hemicellulose trong gỗ cứng
chứa chủ yếu là xylan (15-30%) trong khi ở gỗ mềm chứa galactoglucomannan
(15-20%) và xylan (70-10%) chiếm ưu thế. Thành phần cơ bản của hemicellulose
là β - D - xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β - (1,4).
Hình 1.3: Công thức hóa học của hemicellulose
Cấu tạo của hemicellulose đa dạng tùy vào từng loại nguyên liệu và có
một vài điểm chung gồm:
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
8
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
- Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1,4). Xylose là
thành phần quan trọng nhất. Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết
với vị trí 2 hoặc 3.
- Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide
hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và
với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại
ở dạng vô định hình và dễ bị thủy phân hơn so với cellulose.
1.2.3 Lignin
Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào
thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể
tách lignin ra hoàn toàn. Lignin là polymer, được cấu từ các đơn vị
phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), chất gốc là rượu
trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rượu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl
(H), chất gốc là rượu trans-p-coumary [9].
Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của lignin
Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả với
cellulose (không nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào

bản chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia
liên kết. Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
9
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
liên kết cao nhất với khối hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch
nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm
thường liên kết với lignin. Các liên kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan
qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoxit (phản ứng giữa nhóm khử của
hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin)
Hình 1.5: Công thức hóa học của lignin
1.3. Cơ chất xylan
Xylan là một hemicellulose phổ biến nhất trong tự nhiên, có thể chiếm từ
30% khối lượng trong rơm rạ (cây một vụ), 15 – 30% cây gỗ lá rộng, 7 – 10%
cây gỗ lá kim [9]. Xylan là một polymer có liên kết 1,4 của xylose. Xylan khu
trú trong thành tế bào thực vật bậc cao, đặc biệt trong gỗ mộc và cỏ. Xylan có
nhiều tên dạng: xylan, xyloglucan (phức hợp của D-xylose and D-glucose),
glucomannan (phức hợp của D-glucose và D-mantose), galactoglucomannan
(phức hợp của D-galactose, D-glucose và D-mannose) và arabinogalactan (phức
hợp của D-galactose và arabinose). Tất cả xylan đều có mạch chính do các đơn
phân xylopyranose (C
5
H
10
O
5
) nối với nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside. Bộ
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
10
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu

khung xylan là các chuỗi ngắn của O-acetyl, α-L arabinofuranosyl, D-α
glucuronic và các acid phenolic cố định. Các chuỗi này được xem như các gốc R
phân nhánh tại vị trí gắn kết với các nguyên tử C của khung protein. Trong cấu
tạo của xylan, các xylose tồn tại trong liên kết β-1,4. Mức độ polymer ở xylan
cũng khác nhau, chẳng hạn, trong gỗ lá rộng và gỗ lá kim lần lượt là 150–200 và
70–130 đơn vị glucose/phân tử.
Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử. Nó khác nhau ở các loài
thực vật, ở các mô và tế bào. Do đó, sự thủy phân hoàn toàn của xylan đòi hỏi
một sự kết hợp mạnh của nhiều enzym hoạt động. Nó được thủy phân tốt bởi tổ
hợp endoxylanase (1,4-D-xylan xylanohydrolase, EC 3.2.1.8) và 3-xylosidase
(EC 3.2.1.37) do nhiều chủng vi khuẩn và nấm sinh tổng hợp.
1.4. Từ sinh khối cellulose thành Ethanol
Việc chuyển đổi cellulose thành nhiên liệu sinh học ethanol có ba bước cụ
thể là tiền xử lý, thủy phân và lên men. Các nguyên liệu trở nên dễ tiếp cận hơn
với các enzym sau khi tiền xử lý. Cellulose phân cắt tạo thành đường khử mà đó
là cơ chất cho quá trình lên men.
Cellulose là thành phần quan tâm chính và có thể xử lý bằng phương pháp
hóa học hoặc thủy phân bằng enzyme để tạo thành glucose làm chất nền chính
trong quá trình lên men ethanol. Hemicellulose có cấu trúc nhỏ gọn hơn so với
cellulose và có thể bị phân hủy đáng kể hoặc hòa tan trong tiền xử lý.
1.5. Đặc điểm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm men Saccharomyces
cerevisiae
* Phân loại
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Lớp: Saccharomycetes
Bộ: Saccharomycetales
Họ: Saccharomycetaceae
Giống: Saccharomyces
Loài: Saccharomyces cerevisiae

HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
11
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
* Đặc điểm hình thái: Nấm men Saccharomyces cerevisiae thuộc cơ thể
đơn bào, tế bào dạng hình oval, chiều dài khoảng 10 micromet và chiều rộng
khoảng 5 micromet.
* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Nấm men Saccharomyces cerevisiae sinh
sản bằng phương pháp mọc chồi, sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu 28 – 32
0
C. Nấm
men có khả năng lên men đường glucose để tạo thành ethanol. Nhiệt độ lên men
tối ưu của Saccharomyces cerevisiae từ 28-32
0
C.
Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ưu để tạo ethanol là 4,5 – 5,0.
Nếu pH thấp khoảng 3,0 – 4,0 nấm men cũng hoạt động được và vi khuẩn bị ức
chế. pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị
nhiễm khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên
men có hiệu suất thấp.Thông thường nồng độ dung dịch đường dùng cho lên men
bởi nấm men Saccharomyces cerevisiae từ khoảng 22 % khối lượng hoặc ít hơn.
* Đặc điểm sinh thái: Saccharomyces cerevisiae được phân bố vùng núi
và vùng nhiệt đới
1.6. Đặc điểm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm men Pichia stipitis
* Phân loại
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Lớp: Saccharomycetes
Bộ: Saccharomycetales
Họ: Saccharomycetaceae
Giống: Pichia

Loài: Pichia stipitis (Pignal 1967)
* Đặc điểm hình thái: Nấm men Pichia stipitis thuộc cơ thể đơn bào, tế
bào dạng hình oval.
* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Nấm men Pichia stipitis, nhiệt độ tăng
trưởng tối ưu là 28
0
C – 32
0
C, nhiệt độ lên men là 32
0
– 34
0
C, pH cho tăng trưởng
là 3 – 7, pH lên men là 3 - 8 [24].
* Đặc điểm sinh thái: Nấm men Pichia stipitis được phân bố vùng núi và
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
12
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
vùng nhiệt đới
1.7. Đặc điểm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm sợi Trichoderma reesei
* Phân loại
Trichoderma reesei là một loại nấm sợi sinh sản vô tính được phân lập từ
vải bông ở quần đảo Solomon vào thời Chiến tranh thế chiến thứ II, loài duy nhất
được phân lập là Trichoderma reesei QM6a, và được phân loại như sau [25]:
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Lớp: Deuteromycetes
Bộ: Moniliales
Họ: Moniliaceae
Giống: Trichoderma

Loài: Trichoderma reesei
* Đặc điểm hình thái: Sợi nấm màu trắng, sau đó có màu xanh do bào tử
được hình thành. Cuống bào tử có dạng chùm, phân nhánh liên tục, sinh ra các
thể bình có dạng hình tam giác, mỗi nhánh kết thúc bởi một thể bình. Đính bào tử
hình cầu, đường kính 3,6 – 4,5 µm, có màu xanh lục, có vách xù xì.
* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Trichoderma reesei sinh trưởng ở nhiệt độ
tối thiểu 0
0
C, tối ưu 20 – 28
0
C, tối đa 30 – 37
0
C. Sự tăng trưởng của sợi nấm sinh
sắc tố màu vàng cam trên môi trường PDA.
* Đặc điểm sinh thái: Trichoderma reesei được phân bố ở vùng cực Bắc,
vùng núi, vùng nhiệt đới
1.7. 1. Một số đặc tính hệ enzyme cellulase và xylanase từ Trichoderma reesei
* Enzym Cellulase: là một phức hợp gồm nhiều enzym, các loại phức
hợp này sẽ lần lượt thủy phân cellulose thông qua thủy phân liên kết 1,4-ß-
glucosid tạo sản phẩm cuối cùng là glucose.
* Phân loại: Hệ enzym cellulosic được phân thành ba nhóm chủ yếu:
Endo-ß-glucanase (EC 3.2.1.4), exo-ß-glucanase (EC 3.2.1.91) và ß-glucosidase
(EC 3.2.1.21)
- Endo-ß-glucanase hay còn gọi là 1,4-ß-D-glucan glucanohydrolase,
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
13
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
CMCase, Cx: Enzym này tham gia phân giải liên kết β-1,4-glucosid trong mạng
cellulose, trong lichenin và β-D-glucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là
cellodextrin, cellobiose và glucose. Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose

dạng vô định hình, tác động yếu đến cellulose dạng kết tinh.
- Exo-ß-glucanase hay còn gọi là 1,4-ß-D-glucan cellobiohydrolase,
Avicelase, C1: Enzyme cắt đặc hiệu liên kết β-1,4 glucosid ở đầu tự do của
cellulose để tạo thành cellobiose. Không có khả năng phân giải cellulose dạng kết
tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng giúp cho enzym
endocellulase phân giải chúng. Cellobiohydrolase có hai loại khác nhau như
Trichoderma reesei CBH I và CBH II, trong đó, CBH I cắt chuỗi celluolose ở đầu
khử và CBH II cắt chuỗi cellulose ở đầu không khử [8].
- β-glucosidase hay còn gọi là cellobiase (EC.3.2.1.21): enzym này tham
gia thủy phân cellobiose, tạo thành glucose [44].
* Tính chất của enzyme cellulase
Thuộc tính của enzyme cellulase thay đổi tùy theo nguồn gốc của chúng.
Cellulases là một protein có tính axit. Enzyme cellullase có thể hoạt động ở dãy
pH từ 3 – 7, nhưng pH tối ưu là 4 – 5 và nhiệt độ tối ưu là 40 – 50°C. Cellulase
bị ức chế bởi các sản phẩm như glucose và cellobiose được tạo ra trong phản ứng
thủy phân. Glucose ức chế β-glucosidase và cellobiose ức chế Endo-ß-glucanase
và Exo-ß-glucanase [44].
* Vị trí phân cắt của enzyme cellulase
Trong tự nhiên, thủy phân cellulose cần có sự tham gia của tất cả 3 loại
enzyme endoglucanase, exolglucanase và β- glucosidase. Mỗi loại enzym chỉ
tham gia thủy phân một phần trong cellulose. Các loại enzyme này thay phiên
nhau thủy phân cellulose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose.
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
14