nghiên cứu công nghệ sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng nhằm phát triển một số cây trồng trọng yếu của tỉnh sơn la

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
QUỸ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ ĐỔI MỚI CÔNG NGHỆ
DO DOANH NGHIỆP THỰC HIỆN THEO NGHỊ ĐỊNH SỐ 119/1999/NĐ-CP CỦA CHÍN
H
PHỦ


BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN
Tên đề tài:

Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng nhằm phát
triển một số cây trồng trọng yếu của tỉnh Sơn La
(MÃ SỐ ĐỀ TÀI)


Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài:
(ký tên) (ký tên và đóng dấu)




KS. Phạm Văn Hùng Dương Hồng Hương

Bộ Khoa học và Công nghệ
Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia
(ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Số TT Chữ viết tắt Nghĩa của chữ viết tắt
1 VSV Vi sinh vật
2 HTL Hòa tan lân
3 KB King B
4 ĐK Đối kháng
5 LN1 Lần nhắc 1
6 LN2 Lần nhắc 2
7 Nts Ni tơ tổng số
8 Pts Lân tổng số
9 Kts Kali tổng số
10 ĐC Đối chứng
11 TN Thí nghiệm
12 CT Công thức
13 CTTN Công thức thí nghiệm
14 HCVS Hữu cơ vi sinh
15 HRGMT Bệnh héo rũ gốc mốc trắng





i
DANH MỤC BẢNG

TT Nội dung Trang
Bảng 1 Các chủng vi sinh vật phân giải lân phân lập 17
Bảng 2 Hoạt tính phân giải lân của các chủng vi khuẩn phân lập 18
Bảng 3 Hoạt tính phân giải lân duy trì qua các lần cấy truyền 19

Bảng 4 Khả năng hòa tan lân của các chủng VSV phân lập được 20
Bảng 5 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Azotobacter
mới phân lập
21
Bảng 6 Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter 22
Bảng 7 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV phân lập
được
23
Bảng 8 Hàm lượng IAA thô hình thành của các chủng vi sinh vật
phân lập
25
Bảng 9 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn
đối kháng
27
Bảng 10 Hoạt tính đối kháng nấm F. solani

của các chủng vi
khuẩn đối kháng
29
Bảng 11 Điểm sinh học của các chủng Azotobacter tuyển chọn 31
Bảng 12 Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 32
Bảng 13 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến hoạt tính sinh học
của VSV
32
Bảng 14 Phân loại an toàn sinh học của các chủng vi khuẩn đối
kháng
33
Bảng 15 Đánh giá an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật đến
cây trồng
35

Bảng 16
Ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật đến khả năng sinh
trưởng phát triển của đậu tương, ngô và cà phê
35
Bảng 17 Tình trạng sức khoẻ của chuột trong thời gian thí nghiệm 37
Bảng 18 Trọng lượng của chuột trong thời gian thí nghiệm 37
Bảng 19 Khả năng kìm hãm sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
đối kháng
38
Bảng 20
Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây ngô
39

ii
Bảng 21
Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây đậu tương
39
Bảng 22 Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây cà phê
40
Bảng 23 Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây ngô
40
Bảng 24 Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây đậu tương
40
Bảng 25 Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây cà phê

40
Bảng 26 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật
*
(CNP1, AT4,
KT2, ĐK14) trong điều kiện hỗn hợp chủng
41
Bảng 27 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật
**
(PTP1, AT7,
KT8, ĐK31) trong điều kiện hỗn hợp chủng
41
Bảng 28 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật
***
(TGP2,
AT10, KT9, ĐK37) trong điều kiện hỗn hợp chủng
42
Bảng 29 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật (CNP1, AT4,
KT2, ĐK14) trong than bùn khử trùng
42
Bảng 30 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật PTP1, AT7,
KT8, ĐK31 trong than bùn khử trùng
43
Bảng 31 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật TGP2, AT10,
KT9, ĐK37 trong than bùn khử trùng
43
Bảng 32 Sự thay đổi hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật
trong quá trình bảo quản ở điều kiện hỗn hợp
43
Bảng 33 Ảnh hưởng của các tổ hợp vi sinh vật đến năng suất và
khả năng phòng trừ bệnh thối rễ của cây ngô

44
Bảng 34 Ảnh hưởng của các tổ hợp vi sinh vật hữu ích đến sinh
trưởng của cây đậu tương
45
Bảng 35 Ảnh hưởng của tổ hợp vi sinh vật hữu ích đến sự sinh
trưởng và phát triển của cây cà phê ở giai đoạn vườn ươm
46
Bảng 36 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của
chủng VSV
47
Bảng 37 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến hoạt tính sinh học 48

iii
của VSV
Bảng 38 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới mật độ tế bào các chủng vi
sinh vật hữu ích
49
Bảng 39 Ảnh hưởng của pH tới mật độ tế bào của các chủng Vi
sinh vật hữu ích
50
Bảng 40 Ảnh hưởng của lượng thổi không khí đến mật độ tế bào
của các chủng vi sinh vật hữu ích
50
Bảng 41 Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến mật độ tế bào của
các chủng vi sinh vật hữu ích
51
Bảng 42 Mật độ tế bào của các chủng vi sinh vật hữu ích theo thời
gian nuôi cấy
52
Bảng 43 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp 1 đến mật độ tế bào củacác

chủng vi sinh vật hữu ích
53
Bảng 44 Thành phần lý hoá học của than bùn 54
Bảng 45 Khả năng tồn tại của các chủng VSV trong chế phẩm dạng
bột sau thời gian bảo quản ở 4
0
C
58
Bảng 46 Ảnh hưởng của chế phẩm đến một số chỉ số nông học của
ngô
59

Bảng 47 Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến các yếu tố
cấu thành năng suất và năng suất ngô
59
Bảng 48 Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến khả năng
phòng trừ bệnh thối rễ của cây ngô
60
Bảng 49 Kết quả thử nghiệm chế phẩm vi sinh đến sinh trưởng,
phát triển, năng suất đậu tương
61
Bảng 50 Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến khả năng
phòng trừ bệnh thối rễ của cây đậu tương
61
Bảng 51 Mức độ khô cành và tốc độ phát triển đốt trên cành hữu
hiệu ở các công thức thí nghiệm
62
Bảng 52 Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến khả năng
phòng trừ bệnh thối rễ cây cà phê
62

Bảng 53 Sự biến động nhiệt độ của khối ủ trong quá trình xử lý than bùn 63
Bảng 54 Sự biến động quần thể vi sinh vật trong quá trình xử lý
than bùn
65
Bảng 55. Thành phần hóa học than bùn trước và sau xử lý 66

iv
Bảng 56. Tính chất cảm quan của cơ chất sau khi xử lý 67
Bảng 57. Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng phát triển của cây
cải ngọt
68
Bảng 58. Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng nảy mầm của ngô
CP888
68
Bảng 59. Khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi sinh vật
hữu ích trong cơ chất sau khi phối trộn
69
Bảng 60. Hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng VSV phân lập 71
Bảng 61. Tỷ lệ giảm trọng lượng rơm trong bình ủ bổ sung chế
phẩm vi sinh vật sau 14 ngày
72
Bảng 62. Sự thay đổi nhiệt độ, pH và biến động VSV hiếu khí phân
giải xenlulo trong đống ủ đối chứng (không bổ sung chế
phẩm VSV) sau 30 ngày
73
Bảng 63. Sự thay đổi nhiệt độ, pH và biến động VSV hiếu khí phân
giải xenlulo trong đống ủ bổ sung chế phẩm VSV sau 30
ngày
73
Bảng 64. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa học của rơm rạ sau

ủ 30 ngày
74
Bảng 65.
Một số chỉ tiêu so sánh giữa việc ủ không bổ sung và bổ
sung chế phẩm vi sinh vật
75
Bảng 66. Tỷ lệ nảy mầm của hạt cải trên nền các cơ chất 75
Bảng 67. Đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học của các chủng VSV
lựa chọn.
76
Bảng 68. Sự biến động về mật độ của các chủng VSV trong khối ủ
(CT1, CT2, CT3)
77
Bảng 69. Sự biến động về mật độ của các chủng VSV trong khối ủ
(CT4, CT5, CT6)
77
Bảng 70. Thành phần hóa học của cơ chất trước và sau khi ủ
Bảng 71. Đặc điểm hình thái và hoạt tính sinh học của các chủng vi
sinh vật
79
Bảng 72. Thành phần hóa học của các nguồn phế phụ phẩm trước
và sau xử lý
80
Bảng 73. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng đến sinh trưởng,
phát triển và năng suất của giống đậu tương ĐT84
85

v
Bảng 74. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại đậu
tương ĐT84

87
Bảng 75. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới sinh trưởng,
phát triển và năng suất của ngô lai CP999
88
Bảng 76. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại giống
ngô C999
90
Bảng 77. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới sinh trưởng,
phát triển của giống cà phê Catimor tuổi 4
90
Bảng 78. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới các yếu tố cấu
thành năng suất của giống cà phê Catimor tuổi 4
91
Bảng 79. Mức độ nhiễm bệnh trên cây cà phê chè Catimor tuổi 4
nghiên cứu
92
Bảng 80. Kết quả thử nghiệm phân HCVS đối kháng trên giống đậu
tương ĐT84 tại Yên Châu
95
Bảng 81. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại trên
giống đậu tương ĐT84 tại Yên Châu
95
Bảng 82. Đánh giá hiệu quả kinh tế của phân HCVS đối kháng trên
giống đậu tương ĐT84 tại Yên Châu
96
Bảng 83. Kết quả thử nghiệm phân HCVS đối kháng trên giốngngô
lai CP999 tại Mộc Châu
97
Bảng 84. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại giống
ngô CP999 tại Mộc Châu

97
Bảng 85. Đánh giá hiệu quả kinh tế của phân HCVS đối kháng trên
giống ngô lai C999 tại Mộc Châu
98
Bảng 86. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới các yếu tố cấu
thành năng suất của giống cà phê Catimor tuổi 4 tại Mai
Sơn
98
Bảng 87. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại cây cà
phê chè Catimor tuổi 4 tại Mai Sơn
99
Bảng 88. Đánh giá hiệu quả kinh tế của phân HCVS đối kháng trên
giống cà phê chè Catimor tuổi 4
95



i
DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

TT Nội dung Trang
Hình 1: Khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn phân giải lân phân lập 18
Hình 2: Hoạt tính phân giải lân của một số chủng vi khuẩn phân lập 19
Hình 3: Hình ảnh phản ứng màu của các chủng Azotobacter với
thuốc thử Nessler
21
Biểu đồ 1: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter 22
Hình 4: Hình ảnh khuẩn lạc của một số chủng vi sinh vật phân lập
được
24

Hình 5: Khả năng sinh tổng hợp IAA thô của các chủng vi sinh vật 24
Hình 6: Hình thái khuẩn lạc và bào tử của chủng Fusarium solani
mới phân lập
26
Hình 7. Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn đối kháng 29
Hình 8: Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn đối kháng 30
Hình 9. Một số hình ảnh thí nghiệm xác định đặc điểm sinh lý sinh
hóa các chủng VSV tuyển chọn
31
Hình 10: Minh họa đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật đến
cây ngô
34
Hình 11. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật trên chuột
bạch
36
Hình 12. Nội tạng của chuột bạch sau khi đánh giá độc tính 37
Hình 13: Đồ thị biến động nhiệt độ trong quá trình xử lý than bùn 64
Hình 14. Kết quả xử lý than bùn bằng chế phẩm vi sinh 67
Hình 15: Thí nghiệm trồng cải trên cơ chất than bùn 67
Hình 16. Ảnh hưởng của dịch chiết than bùn đến khả năng nảy mầm
của ngô
68
Hình 17: Vòng phân giải xenlulo của các chủng VSV ( theo phương
pháp CMC-aza)
71
Hình 18. Ảnh minh họa phế thải rơm rạ xử lý sau 30 ngày 74
Biểu đồ 2. Sự biến thiên nhiệt độ của khối ủ 78
Hình 19. Hiệu quả của chế phẩm lên khối ủ 78
Hình 20. Đánh giá chất lượng cơ chất sau xử lý 79

ii
Đồ thị 3: Đồ thị biến động nhiệt độ trong quá trình xử lý thân lá lạc 80
Đồ thị 4: Đồ thị biến động nhiệt độ trong quá trình xử lý thân lá đậu
tương
80
Hình 21: Thân lá lạc trước và sau xử lý 82
Hình 22: Thân lá đậu tương trước và sau xử lý 82


i
MỤC LỤC

Mục Nội dung Trang
I MỞ ĐẦU 1
II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
III
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
7
Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật
sử dụng cho sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
7
Nội dung 2: Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất phân
hữu cơ vi sinh đối kháng
7
Nội dung 3: Xây dựng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh
đối kháng
8
Nội dung 4: Xây dựng mô hình sử dụng phân hữu cơ vi sinh
đối kháng
8

Nội dung 5: Đăng ký sản phẩm phân hữu cơ vi sinh đối
kháng
9
IV. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9
4.1. Vật liệu 9
4.2. Phương pháp nghiên cứu 10
V. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
5.1. Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật sử dụng cho
sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
17
5.1.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân giải lân từ đất
trồng cây cà phê, đậu tương, ngô tại huyện Mộc Châu, Yên
Châu, Mai Sơn, Sông Mã
17
5.1.2. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do từ
đất trồng cây cà phê, đậu tương, ngô tại huyện Mộc Châu, Yên
Châu, Mai Sơn, Sông Mã
20
5.1.3. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn kích thích sinh trưởng
từ đất trồng trồng cây cà phê, đậu tương, ngô tại huyện Mộc
Châu, Yên Châu, Mai Sơn, Sông Mã
23
5.1.4. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn đối kháng vi sinh vật
gây bệnh thối rễ từ đất trồng cây cà phê, đậu tương, ngô tại
25

ii
huyện Mộc Châu, Yên Châu, Mai Sơn, Sông Mã
5.1.5. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh trưởng, phát triển và
hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn

30
5.1.6. Xác định an toàn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn để khẳng
định khả năng sử dụng cho nghiên cứu sản xuất phân bón
33
5.2. Xây dựng qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng 38
5.2.1. Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng qui mô phòng
thí nghiệm
38
SƠ ĐỒ 1 - QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV CHO CÂY
NGÔ
55
SƠ ĐỒ 2 - QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV CHO CÂY
ĐẬU TƯƠNG

56

SƠ ĐỒ 3 - QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV CHO CÂY CÀ
PHÊ
57
5.2.2. Xây dựng qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng từ
than bùn
62
QUI TRÌNH SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH ĐỐI
KHÁNG TỪ THAN BÙN
70
5.2.3. Xây dựng được qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
từ các nguồn phụ phẩm nông nghiệp
71
QUI TRÌNH SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH ĐỐI
KHÁNG TỪ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP

83
5.3. Đánh giá hiệu quả của phân bón HCVSĐK đến sinh trưởng,
phát triển, năng suất và khả năng hạn chế một số bệnh cây đậu
tương, ngô và cà phê tại các huyện Mai Sơn, Mộc Châu, Yên
Châu của tỉnh Sơn La.
84
5.3.1. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng đến sinh trưởng, phát
triển năng suất và khả năng hạn chế một số bệnh của giống đậu
tương ĐT84
84
5.3.2. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng đến sinh trưởng, phát
triển và năng suất của giống ngô lai CP999
88
5.3.3. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng đến sinh trưởng, phát
triển và năng suất của giống cà phê Catimor tuổi 4
90
5.4. Xây dựng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng 93

iii
trên 03 loại cây trồng trọng yếu (cà phê, đậu tương và ngô)
5.5.
Xây dựng mô hình đánh giá khả năng thích ứng của phân
hữu cơ vi sinh đối kháng cho một số đối tượng cây trồng (cà
phê, đậu tương và ngô)
94
5.5.1. Đánh giá hiệu quả của phân bón HCVS đối kháng tới giống đậu
tương ĐT84 tại huyện Yên Châu
94
5.5.2. Đánh giá hiệu quả của phân bón HCVS đối kháng tới giống ngô
lai C999 tại Mộc Châu

96
5.5.3. Đánh giá hiệu quả của phân bón HCVS đối kháng tới giống cà
phê Catimor tuổi 4 tại Mai Sơn
98
V. KẾT LUẬN 100
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 101
VII. PHỤ LỤC 103







1

I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, việc quá lạm dụng phân bón hoá học trong sản
xuất nông nghiệp đã dẫn tới rất nhiều diện tích đất canh tác trở nên bạc màu, chai
cứng và mất dần khả năng canh tác, những diện tích này ngày càng lớn và rất cần
thiết phải trả lại sự mầu mỡ, phì nhiêu của đất bằng cách áp dụng các biện pháp
thâm canh liên hoàn, trong
đó phân bón hữu cơ vi sinh đóng một vai trò hết sức
quan trọng.
Theo các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, cây trồng chỉ hấp thu được
35-40% tổng lượng Nitơ, 50-60 % tổng lượng Photpho và Kali bón trên đồng ruộng.
Lượng phân hoá học còn lại hoặc bị bốc hơi, rửa trôi hoặc ngấm vào trong đất. Theo
tính toán, hàng năm, có khoảng 1,0-1,2 triệu tấn Nitơ bón vào trong đất không có tác
dụng dinh dưỡng đối với cây trồng (bị bốc hơ

i, rửa trôi hoặc ngấm vào trong đất).
Như vậy, hàng năm, có một lượng phân hoá học rất lớn thất thoát, gây ô nhiễm môi
trường đất, nước, không khí và ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ con người và các
sinh vật khác. Mặt khác, việc sử dụng quá mức phân hoá học cũng gây lãng phí rất
lớn cho người nông dân.
Việc sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh bên cạnh chức năng trả lại sự mầ
u mỡ,
phì nhiêu cho đất, cung cấp dinh dưỡng thay thế một phần cho phân hoá học, còn có
tác dụng làm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của cây trồng lên 30-60% tổng
lượng phân hoá học bón cho đất, từ đó làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường, tiết kiệm
được hàng triệu tấn phân hoá học thất thoát hàng năm.
Đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng nhằm
phát triển một số cây trồ
ng trọng yếu của tỉnh Sơn La” được thực hiện nhằm sản xuất
phân hữu cơ vi sinh đối kháng từ các chủng vi sinh vật bản địa tuyển chọn có các
hoạt tính sinh học như cố định ni tơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng, đối kháng
bệnh cây; cung cấp nguồn phân bón hữu cơ cho một số cây trồng trọng yếu của tỉnh
Sơn La, góp phần để tăng năng suấ
t, chất lượng cây trồng, giảm ô nhiễm môi trường.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu
+ Hoàn thiện được công nghệ sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng phục vụ
sản xuất nông nghiệp hữu cơ đặc thù cho tỉnh Sơn La;
+ Xây dựng dây chuyền sản xuất 5.000 tấn sản phẩm/năm.

II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về phân hữu cơ vi sinh
Phân hữu cơ vi sinh là loại phân hỗn hợp của các nguyên liệu có ngu
ồn gốc hữu
cơ và các vi sinh vật có lợi bao gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn được sử dụng để làm

phân bón. Trong số đó quan trọng là các nhóm vi sinh vật cố định đạm, phân giải
2

lân, phân giải chất hữu cơ, kích thích sinh trưởng cây trồng, v.v Việc bổ sung các
loại vi sinh vật có khả năng phân huỷ xenlulo cao (Aspergillus, Trichoderma và
Penicillium), cố định nitơ tự do (Azotobacter), phân giải lân (Aspergillus,
Penicillium, Pseudomonas, Bacillus) và các chủng vi sinh vật đối kháng
(Pseudomonas, Bacillus) với mật độ 10
6
-10
8
cfu/g cùng các nguyên tố dinh dưỡng
như đạm dạng hữu cơ, lân dạng quặng photphorit (liều lượng 5%) đã làm tăng chất
lượng của phân bón lên đáng kể.
Phân hữu cơ vi sinh có chứa các vi sinh vật là nấm đối kháng sẽ giúp phòng trừ
nấm bệnh cho cây trồng. Tiến bộ này đã được nghiên cứu, công nhận từ nhiều năm
qua ở nhiều nước trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Việ
c sử dụng phân bón vi
sinh vật có thể cung cấp cho đất từ 30-60 kg N (đạm)/năm, tăng hiệu lực phân lân,
làm tăng độ phì nhiêu của đất. Các chế phẩm có chứa vi sinh vật còn làm tăng khả
năng trao đổi chất trong cây, nâng cao sức đề kháng và chống bệnh ở cây trồng, làm
tăng chất lượng nông sản, tăng thu nhập cho nông dân.
Xu hướng chung hiện nay trên thế giới là tạo ra các sản phẩm phân hữu cơ giàu
dinh dưỡng có b
ổ sung vi sinh vật hữu ích. Để góp phần phát triển nông nghiệp bền
vững, nhiều quốc gia trên thế giới đã khuyến khích người dân sử dụng phân bón
sinh học bằng cách trợ giúp giá bán cho nông dân đồng thời phát triển mạng lưới
khuyến nông, trong đó đặc biệt chú trọng công tác xây dựng các mô hình trình diễn
trên đồng ruộng về việc sử dụng hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh.
Mặt khác việc sử dụng phân hoá h

ọc, thuốc hóa học bảo vệ thực vật quá nhiều dẫn
đến ô nhiễm môi trường đất, tạo cho đất không còn độ xốp, hấp thụ và giữ nước kém.
Các nhà khoa học đã kết luận: sử dụng phân hữu cơ vi sinh làm tăng năng suất cây
trồng, chất lượng sản phẩm tốt hơn, giảm ô nhiễm của NO
3
. Điều này cũng có nghĩa
phân hữu cơ vi sinh góp phần quan trọng cho một nền nông nghiệp hữu cơ bền vững,
xanh sạch và an toàn.
Các chủng vi sinh vật bổ sung trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh có tác dụng:
- Tạo thành phân hữu cơ có chất lượng cao: tăng độ mùn, tăng hợp chất hữu
cơ dễ tiêu, bổ sung các chất kích thích sinh trưởng thực vật.
- Phân huỷ các hợp chất kali, photpho khó tiêu thành dễ tiêu, tăng hàm l
ượng
Nitơ trong đất.
- Tăng quần thể vi sinh vật có ích trong đất và hạn chế vi sinh vật gây hại, từ
đó có thể làm giảm lượng sử dụng các loại phân bón, thuốc bảo vệ thực vật hoá học
trong sản xuất nông nghiệp.
- Tăng năng suất và chất lượng nông sản, tạo ra các sản phẩm nông nghiệp
sạch, an toàn.

2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân hữu cơ vi sinh
Trong những n
ăm gần đây, ở nhiều nước trên thế giới, người ta đã tổ chức
sản xuất công nghiệp một số loại phân vi sinh vật và đem bán ở thị trường trong
nước. Một số loại phân vi sinh vật được bán rộng rãi trên thị trường thế giới. Tuy
3

nhiên, các loại phân vi sinh vật còn rất ít và chỉ là bộ phận nhỏ so với phân hoá học
trên thị trường phân bón. Trong đó có nhiều loại phân vi sinh vật.
2.2.1. Phân vi sinh vật

* Phân vi sinh vật cố định đạm: gồm nhiều loài vi sinh vật có khả năng cố định
N từ không khí. Đáng chú ý có các loài: tảo lam (Cyanobacterium), vi khuẩn
Azotobacter, Bradyrhizobium, Rhyzobium; xạ khuẩn Actinomyces, Klebsiella.
Phần lớn các loài vi khuẩn cố định đạm thường sống cộng sinh với các cây
họ đậu. Chúng xâm nhập vào rễ cây và sống cộng sinh trong đó, tạo thành các nốt
sần ở rễ cây. Chúng sử dụng chất hữu cơ của cây để sinh trưởng đồng thời hút đạm
từ không khí để cung cấp cho cây, một phần tích luỹ lại trong cơ thể chúng.
Tảo lam cộng sinh với bèo hoa dâu và hút đạm tích luỹ lại làm cho bèo hoa
dâu có hàm lượng đạm cao, trở thành cây phân xanh rất quý.
Thời gian gần đây, cùng với những tiế
n bộ của khoa học và công nghệ, các
nhà khoa học đã sử dụng công nghệ gen để tạo ra các chủng vi sinh vật cố định đạm
có nhiều đặc điểm tốt: khả năng cố định đạm cao, khả năng cộng sinh tốt. Công
nghệ sinh học cũng giúp tạo ra những chủng vi sinh vật có đặc tính cạnh tranh cao
với các loài vi sinh vật trong đất. Mặt khác, công nghệ sinh học đã cho phép các nhà
khoa học tách đượ
c gen quy định đặc tính cố định đạm từ vi khuẩn và đem cấy vào
nhân tế bào cây trồng, làm cho một số loài cây trồng cũng tạo được khả năng cố
định đạm như vi khuẩn.
Hiện nay trên thị trường phân bón nước ta, phân vi sinh vật cố định đạm
được bán dưới các tên thương phẩm sau đây:
Phân nitragin chứa vi khuẩn nốt sần cây đậu tương.
Phân rhidafo chứa vi khuẩn nốt sần cây lạc.
Azotobacterin chứa vi khuẩn cố định đạm tự do.
Azozin chứa vi khuẩn cố định đạm từ không khí sống trong ruộng lúa. Loại
phân này có thể trộn với hạt giống lúa.
* Phân vi sinh vật hoà tan lân: cây chỉ có thể hút được lân từ đất dưới dạng
hoà tan trong dung dịch đất. Vì vậy, cây chỉ có thể hút được lân ở dạng dễ tiêu trong
đất. Lân ở dạng khó tan trong đất cây không hút được. Vì vậy, có nhiều loại đất nh
ư

đất đỏ bazan, đất đen, v.v hàm lượng lân trong đất khá cao, nhưng cây không hút
được vì lân ở dưới dạng khó hoà tan.
Trong đất thường tồn tại một nhóm vi sinh vật có khả năng hoà tan lân.
Nhóm vi sinh vật này được các nhà khoa học đặt tên cho là nhóm HTL (hoà tan lân,
các nước nói tiếng Anh đặt tên cho nhóm này là PSM – phosphate solubilizing
microorganisms).
Nhóm hoà tan lân bao gồm: Aspergillus niger, một số loài thuộc các chi vi
khuẩn Pseudomonas, Bacillus, Micrococens. Nhóm vi sinh vật này dễ dàng nuôi cấy
trên môi trường nhân tạo. Nhiều nơi người ta đã đưa trộn sinh khối hoặc bào t
ử các
loại vi sinh vật hoà tan lân sau khi nuôi cấy và nhân lên trong phòng thí nghiệm, với
4

bột phosphorit hoặc apatit rồi bón cho cây. Sử dụng các chế phẩm vi sinh vật HTL
đem lại hiệu quả cao ở những vùng đất cây bị thiếu lân.
Một số loài vi sinh vật sống cộng sinh trên rễ cây có khả năng hút lân để
cung cấp cho cây. Trong số này, đáng kể là loài VA mycorrhiza. Loài này có thể hoà
tan phosphat sắt trong đất để cung cấp lân cho cây. Ngoài ra loài này còn có khả
năng huy động các nguyên tố Cu, Zn, Fe… cho cây trồng. Nhiều nơi người ta sử
dụng VA mycorrhiza đã làm tăng n
ăng suất cam, chanh, táo, cà phê… Nuôi cấy VA
mycorrhiza trên môi trường nhân tạo rất khó. Vì vậy, hiện nay các chế phẩm có
chưa VA mycorrhiza chỉ có bán rất hạn chế trên thị trường phân bón Mỹ.
Những năm gần đây, trên thị trường phân bón ở một số nước có bán chế
phẩm Phospho – bacterin trong có chứa vi khuẩn giải phóng lân dễ tiêu từ các chất
hữu cơ.
* Phân vi sinh vật kích thích tăng trưởng cây. Gồm một nhóm nhiều loài vi
sinh vật khác nhau, trong
đó có vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, v.v Nhóm này được các
nhà khoa học phân lập ra từ tập đoàn vi sinh vật đất.

Người ta sử dụng những chế phẩm gồm tập đoàn vi sinh vật được chọn lọc
để phun lên cây hoặc bón vào đất làm cho cây sinh trưởng và phát triển tốt, ít sâu
bệnh, tăng năng suất. Chế phẩm này còn làm tăng khả năng nảy mầm của hạt, tăng
trọng lượng hạ
t, thúc đẩy bộ rễ cây phát triển mạnh. Như vậy, chế phẩm này có tác
động tương đối tổng hợp lên cây trồng.
Để sản xuất chế phẩm vi sinh vật kích thích tăng trưởng của cây, người ta sử
dụng công nghệ lên men vi sinh vật. Ở các nước phát triển người ta sử dụng các
thiết bị lên men tự động, công suất lớn. Ở nước ta, đã dùng kỹ thuật lên men trên
môi trường bán rắn
để sản xuất chế phẩm này, bước đầu cho kết quả khá tốt.
Những năm gần đây ở nước ta đang tiến hành khảo nghiệm chế phẩm EM
của giáo sư người Nhật Teruo Higa. Chế phẩm này được đặt tên là vi sinh vật hữu
hiệu (Effective microorganisms – EM). Đây là chế phẩm trộn lẫn một nhóm các loài
vi sinh vật có ích trong đó có vi khuẩn axit lactic, một số nấm men, một số xạ
khu
ẩn, vi khuẩn quang hợp, v.v Tại hội nghị đánh giá kết quả sử dụng EM tại Thái
Lan tháng 11/1989, các nhà khoa học đã đánh giá tác dụng tốt của EM như sau:
- Cải tạo lý hoá tính và đặc tính sinh học của đất.
- Làm giảm mầm mống sâu bệnh trong đất.
- Tăng hiệu quả của phân bón hữu cơ.
- Cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt, cho năng suất cao, phẩm chất nông sản
tốt.
- Hạn ch
ế sâu bệnh hại cây trồng.
- Góp phần làm sạch môi trường.
2.2.2. Phân hữu cơ vi sinh
Phân hữu cơ vi sinh gồm phân vi sinh vật và hợp chất hữu cơ (ít nhất đạt
15%). Ở nước ta, những quan điểm mới trong sản xuất nông nghiệp ngày càng
được nhận thức sâu sắc và đề cao trong giai đoạn hiện nay là hướng tới sản xuất

5

nông nghiệp bền vững, sinh thái, hữu cơ và an toàn, Những quan điểm này là
hoàn toàn đúng đắn và không hề mâu thuẫn với chủ trương phát triển công nghệ
sinh học phục vụ nông nghiệp. Theo ý kiến của một số nhà khoa học, con đường
đảm bảo an ninh lương thực là sản xuất theo hướng thâm canh, trong đó, việc sử
dụng những phân hữu cơ vi sinh đóng vai trò rất quan trọng.
Thời gian qua, các nhà khoa học trong cả nước
đã nghiên cứu và sản xuất
thành công một số loại phân hữu cơ vi sinh bón cho cây trồng. Kết quả thử nghiệm
tại các vùng sản xuất cho thấy các sản phẩm phân bón hữu cơ vi sinh này có tác
dụng tích cực đến việc nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, đồng thời có tác
dụng bảo vệ môi trường sinh thái. Một số sản phẩm như Azogin, Rhizolec,
Vitaragin, Phosphobacterin, v v đều cho hiệu quả tốt trên cây trồng. Kết qu
ả
nghiên cứu trong nước thời gian qua phải kể đến như:
- Đề tài khoa học cấp Nhà nước KC-08-02 (1991-1995): Nghiên cứu công
nghệ sản xuất và ứng dụng phân bón vi sinh vật cố định Nitơ nhằm nâng cao năng
suất lúa và cây trồng cạn.
- Đề tài khoa học cấp Nhà nước KHCN.02.06 (1996-1998): Nghiên cứu áp
dụng các giải pháp công nghệ mới nhằm mở rộng việc sản xuất và ứng dụng phân
bón vi sinh vật cố định Nit
ơ, phân giải lân trong nông lâm nghiệp.
- Đề tài khoa học cấp Nhà nước KHCN.02.06B (1999-2000): Nghiên cứu
công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm phân bón vi sinh vật hỗn hợp phát triển
nông lâm nghiệp bền vững.
- Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: Nghiên cứu công nghệ sản xuất
phân bón vi sinh vật chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh
thái (Mã số KC.04.04) do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam chủ
trì

(2001-2004)

2.2.3. Phân hữu cơ vi sinh đối kháng
Phân hữu cơ vi sinh đối kháng về thành phần cơ bản như phân hữu cơ vi sinh,
trong đó có bổ sung thêm một số loại vi sinh vật (Bacillus, Pseudomonas,
Metarhizium, Beauveria ) có khả năng đối kháng cao với một số bệnh hại cây trồng
như: bệnh héo xanh, bệnh héo vàng, bệnh thối quả, thối thân, thối rễ, Nhờ vậy,
loại phân này có phổ tác dụng rất rộng trên nhiều lo
ại cây trồng, không những góp
phần làm tăng năng suất cây trồng mà còn tăng chất lượng nông sản, đảm bảo cho
sự phát triển một nền nông nghiệp hữu cơ bền vững.
Đây chính là sản phẩm cần được hoàn thiện, phát triển mạnh mẽ trong xu thế hội
nhập hiện nay.

2.3. Nhu cầu sản xuất và tiêu thụ phân hữu cơ vi sinh tại Sơn La
Theo thống kê, với nhu c
ầu sản xuất và tiêu thụ phân hữu cơ vi sinh tại tỉnh
Sơn La từ 2009 đến hiện nay là rất lớn

6

Theo từng loại cây

TT Loại cây Nhu cầu (tấn)
1 Cây chè 7.502
2 Cây cà phê 12.139
3 Cây dâu tằm 2.594
4 Cây mía 6.548
5 Cây ăn quả 27.272
6 Cây lương thực 12.186

Tổng 68.262
(Nguồn: Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Sơn La, 2009)

Theo địa bàn
TT Huyện Nhu cầu (tấn)
1 Huyện Mộc châu 9.931
2 Huyện Phù Yên 4.317
3 Huyện Yên Châu 8.248
4 Huyện Mai Sơn 16.411
5 Huyện Bắc Yên 2.178
6 Huyện Sông Mã 5.464
7 Thị xã Sơn La 9.494
8 Huyện Thuận Châu 8.152
9 Huyện Quỳnh Nhai 599
10 Huyện Mường La 3.468
Tổng 68.262
(Nguồn: Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Sơn La, 2009)


2.4. Trữ lượng than bùn tại Sơn La

Tại Sơn La có nhiều mỏ than bùn với trữ lượng lớn, độ ngập nước cao nhưng
khi phơi khô thì rất nhẹ, thành phần chủ yếu là mùn cây, xác thực vật đã phân hủy
cao hoàn toàn đồng nhất, chất lượng tương đương loại tốt nhất ở Việt Nam.
7

Trữ lượng than bùn ở một số mỏ đại diện tại Sơn La
Trữ lượng
TT Điểm mỏ Đơn vị
tính

Tổng số Cấp I Cấp II
1 Tân Lập - Mộc
Châu
Tấn 107.060 64.660 42.400
2 Chiềng Ve – Mộc
Châu
Tấn 105.503 49.790 55.713
3 Mường Chanh -
Mai Sơn
Tấn 35.979 4.100 31.879
4 Mường Lựm -Yên
Châu
Tấn 1.463 1.463
5 Bản Ban - Huy
Thượng
Tấn 18.220 18.220
Tổng 268.225 118.550 149.675
(Nguồn: Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Sơn La, 2009)

Theo khảo sát những mỏ than bùn này có hàm lượng chất hữu cơ cao, đạt trên
20%, đảm bảo đủ nguyên liệu và chất lượng cho sản xuất với công suất 5.000 tấn
phân hữu cơ vi sinh/năm.

III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1
: Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật sử dụng cho sản
xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Khảo sát và thu thập mẫu đất tại 3 vùng đặc thù chuyên canh cây cà phê, đậu
tương và ngô ở Sơn La.
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật thuộc 3 nhóm: phân giải lân, cố

định Nitơ, đối kháng bệnh chết héo cây do vi khuẩn Ralstonia solanacearum
và thối thân cây do vi khuẩn Erwinia carotovora.
- Đánh giá hoạt tính sinh họ
c các chủng vi sinh vật tuyển chọn.
- Định tên và xác định độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển
chọn.
Nội dung 2:
Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối
kháng
2.1. Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng qui mô phòng thí nghiệm
- Nghiên cứu khả năng tổ hợp của các chủng VSV đối kháng.
8

- Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp VSV tuyển chọn đến sinh trưởng phát triển
cây trồng (cà phê, đậu tương, ngô).
- Nghiên cứu nhân sinh khối VSV đối kháng.
- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng.
- Đánh gía hiệu quả của chế phẩm vi sinh đối kháng trên 03 loại cây trồng
2.2. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng qui
mô bán công nghiệp từ than bùn.
- Nghiên cứu x
ử lý nguyên liệu hữu cơ bằng các chế phẩm vi sinh đối kháng
- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất 03 loại phân hữu cơ vi sinh đối
kháng
- Đánh giá hiệu quả của 03 loại phân hữu cơ vi sinh đối kháng trên cây trồng
(cà phê, đậu tương và ngô) trong điều kiện nhà lưới.
2.3. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng từ
các nguồn phế phụ phẩm khác nhau.
- Nghiên cứ
u xử lý sơ bộ phế phụ phẩm nông nghiệp phù hợp, sẵn có ở Sơn

La.
- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng từ
các nguồn nguyên liệu phế phụ phẩm.
- Đánh giá hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh đối kháng (sản xuất từ các nguồn
phế phụ phẩm nông nghiệp) trên cây trồng (cà phê, đậu tương và ngô).
Nội dung 3:
Xây dựng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Xây dựng, áp dụng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng trên
03 loại cây trồng trọng yếu (cà phê, đậu tương và ngô).
- Hiệu chỉnh, đề xuất quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng trên
03 loại cây trồng trọng yếu (cà phê, đậu tương và ngô).
Nội dung 4
: Xây dựng mô hình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Xây dựng 03 mô hình đánh giá khả năng thích ứng của phân hữu cơ vi sinh
đối kháng cho một số đối tượng cây trồng (cà phê, đậu tương và ngô).
- Tổ chức hội nghị đầu bờ tổng kết mô hình: tổ chức hội nghị và giới thiệu kết
quả sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng tới các hộ nông dân.
9

- Quảng cáo sản phẩm trên các phương tiện thông tin đại chúng.
Nội dung 5
: Đăng ký sản phẩm phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở.
- Khảo nghiệm và đăng ký “Phân hữu cơ vi sinh đối kháng Ngọc Trung”.
IV. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1.1. Vật liệu
- Mẫu đất thu ở các huyện Mộc Châu, Yên Châu, Mai Sơn, Sông Mã, thành
phố Sơn La.
- Giống đậu tương ĐT84
- Giống ngô lai CP999

- Giống cà phê: Catimor 4 năm tuổi
- Phân hữu cơ vi sinh vật đối kháng
- Các thiết b
ị, hóa chất thuộc Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông
hóa.
+ Môi trường AT để phân lập và nhân sinh khối vi khuẩn kích thích sinh
trưởng thực vật: CaCO
3
20g; Gluco 20g; K
2
HPO
4
0,8g; MgSO
4
.7H
2
O 0,5g; KH
2
PO
4

0,2g; FeCl
3
.6H
2
O 0,1g; Na
2
MoO
4
.2H

2
O 0,05g; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường King B: Để phân lập và nhân sinh khối vi sinh vật kích thích
sinh trưởng nhóm Bacillus: Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K
2
HPO
4

(12,5%) 12 ml; MgS0
4
.7H
2
0 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường SPA. Để phân lập và nhân sinh khối vi sinh vật kích thích sinh
trưởng nhóm Pseudomonas: Saccharoza 20g, peptone 5g, K
2
HPO
4
0,5g,
MgS0
4
.7H
2
0 0,25g, nước cất 1000 ml.
+ Môi trường SX1 để nhân sinh khối các chủng VSV: đậu trắng 100 g;
K
2
HPO
4
0,5g; MgSO

4
.7H
2
O 0,5g; KH
2
PO
4
0,5g; (NH
4
)
2
SO
4
1,0g; CaCO
3
1,0g;
Glucoza 5,0g; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường SX2 để nhân sinh khối các chủng VSV: Rỉ đường 10g; đậu 50g;
CaCO
3
1,0g; Bột nấm men 5,0g; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường TTC: Để nghiên cứu hình thái khuẩn lạc R.solanacearum
(Kelman, 1954): pepton 10 g; cazein hydrolyzat 1g; glucoza 5g; thạch 20g; nước cất
1 lần 1000 ml. Khử trùng ở 0,5 at, 121°C, 20 phút, làm lạnh đến 60 °C và thêm 5 ml
2-3-5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1 %.
+ Môi trường 523: Để nuôi cấy R.solanacearum: MgSO
4
.7H
2
O (6,25%) 5 ml;

K
2
HPO
4
12,5%) 16,3 ml; yeast extract 4g; casein hydrolyzat 8g; sucaroza 10g; agar
18g; nước cất 1000 ml.
10

+ Môi trường King B (KB): Để phân lập và thu sinh khối vi khuẩn đối kháng:
Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K
2
HPO
4
(12,5%) 12 ml; MgS0
4
.7H
2
0
(6,25%) 25ml; nước cất 1000ml.
+ Môi trường LB: Để nuôi cấy vi khuẩn đối kháng (Luria Broth: Difco
Bacto): tryptone 10g; difco bacto yeast extract 5g; NaCl 5g; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường PDA: Glucoza 20.0 g; Khoai tây 200.0 g; Thạch 15 g nước cất
1000 ml.
+ Môi trường Czapek- Dox: Sucrose 30.0g; NaNO
3
3.0g; MgSO
4
.7 H
2
O 0.5g;

KCl 0.5g; FeSO
4
x 7 H
2
O 0.01g; K
2
HPO
4
1.0g; Thạch 15g; Nước cất 1000 ml.
+ Môi trường mước chiết Malt: Glucoza 20.0g; Malt extract 20.0g Pepton
1.0g; Thạch 20.0g; Nước cất 1.000 ml ; pH=5.6
+ Môi trường Pikowskia (để phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải lân):
Ca
3
(PO
4
)
2
: 0,5g; Sacarose 10g; (NH
4
)
2
SO
4
: 0,5; NaCl: 0,2g; MgSO
4
.7H
2
O: 0,1g;
KCl: 0,2g; Cao nấm men: 0,5g; MnSO

4
: vết; FeSO
4
: vết; nước cất: 1.000 ml;
pH=7.

4.1.2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Azotobacter theo Erogov (1983)
- Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật (theo phương pháp Koch)
- Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler theo Lê Văn Khoa (1996)
- Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái theo Nguyễn Lân
Dũng (1998).
- Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật: Khả năng cố

định nitơ của các chủng vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đo hoạt tính
khử axetylen trên máy sắc ký khí. Azotobacter được nuôi cấy trên môi trường dịch
bán lỏng (4 ml môi trường trong lọ 10 ml) hoặc cắt toàn bộ phần rễ cây lạc cho và
bình tam giác 250 ml (đối với Rhizobium). Đậy kín lọ/bình bằng nút cao su, dùng
bơm tiêm thay thế 10% thể tích khí trong lọ/bình bằng khí axetylen. Ủ mẫu qua 24 h
rồi tiến hành phân tích mẫu trên máy sắc kí khí.
Kết quả tính toán được th
ực hiện theo công thức:



Trong đó:
M : Hoạt tính cố định nitơ được thể hiện bằng lượng Etylen tạo thành
V
1
: Lượng axetylen dùng để hoà vào bình hoà loãng khí chuẩn

V
2
: Thể tích bình đựng mẫu
V
3
: Thể tích khí Etylen chuẩn đã hoà loãng được bơm vào máy
V
4
: Thể tích lọ dùng để hoà loãng khí chuẩn
V
5
: Thể tích mẫu bơm vào máy
L
1
: Chiều cao píc của vạch mẫu trên băng tự ghi của máy sắc kí khí
V
1
.V
2
.V
3
.L
1
.10
-6

V
4
.V
5

.L
2
.22,4
M =
11

L
2
: Chiều cao píc của vạch mẫu trên vạch Etylen chuẩn trên băng tự ghi của
máy sắc kí khí
t: Thời gian ủ mẫu
22,4. 10
6
: Hệ số chuyển số ml khí Etylen sang số nmol khí Etylen
- Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng R.
solanacearum và F.oxysporum.
+ Thu mẫu: mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây lạc và
vừng khoẻ, đang thời kỳ ra hoa kết quả. Mẫu đất được thu ở độ sâu 15 cm ÷ 20 cm,
mỗi điểm thu 100g đất, mẫu được đựng trong từng túi polyetilen riêng biệt, ghi ngày
tháng n
ăm và địa điểm thu mẫu.
+ Phân lập và tuyển chọn: (theo Geels và Schippers -1983).
10 g đất được khuấy đều trong 90 ml nước cất khử trùng, lắc 30 phút, để lắng
tự nhiên, lấy phần dịch trong để phân lập vi khuẩn đối kháng. Mẫu thu từ các cây
được nghiền trong cối sứ có chứa 1 ml nước cất khử trùng, bỏ cặn, sử dụng phần
dịch để phân lập vi khuẩn đối kháng.
Bướ
c 1: Mỗi mẫu dịch trên được pha loãng đến nồng độ nhất định, sao cho
khi dùng 0,1 ml trải đều trên bề mặt môi trường KB hoặc PDA, ủ ở nhiệt độ 28
0

C ÷
30
0
C trong 24 ÷ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt.
Bước 2: Những khuẩn lạc có sắc tố vàng, nâu hoặc xanh nhạt được hoà loãng
trong các ống eppendorf riêng biệt, dùng 100µl dung dịch trải đều trên bề mặt đĩa
môi trường KB hoặc PDA (mật độ tế bào trong dung dịch sao cho sau khi ủ ở 28
0
C
÷ 30
0
C trong 24 ÷ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt).
Bước 3: Phun dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh phủ lên bề mặt môi trường, ủ
ở nhiệt độ 28
0
C ÷ 30
0
C trong 24 ÷ 48 giờ.
Bước 4: Quan sát các đĩa môi trường, nếu xuất hiện những vùng ức chế (vòng
vô khuẩn), nghĩa là có vi khuẩn đối kháng tại điểm đó.
Bước 5: Những tế bào vi khuẩn đối kháng được làm sạch và giữ trong nước
cất khử trùng hoặc glyxerol 30% ở - 80
0
C để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
+ Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng
++ Chủng vi khuẩn đối kháng cần kiểm tra được cấy bằng tăm vô trùng lên
điểm giữa của bề mặt môi trường KB (môi trường đặc), để vi khuẩn phát triển ở
28
0
C ÷ 30

0
C trong 24 ÷ 48 giờ, các tế bào phát triển thành cụm khuẩn lạc hình tròn.
++ Dùng bông vô trùng loại bỏ các tế bào trong cụm khuẩn lạc.
++ Xử lý những tế bào còn sống sót bằng cách xông hơi chloroform từ 45 đến
60 phút.
++ Phun dung dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh đạt mật độ 10
7
÷10
8

tế bào/ml
kín bề mặt môi trường.
++ Ủ ở nhiệt độ 28
0
C ÷ 30
0
C, sau 48 giờ quan sát khả năng đối kháng của vi
khuẩn được thể hiện qua hiện tượng có hay không có vòng ức chế.
++ Dựa vào kích thước vòng ức chế để đánh giá hiệu lực đối kháng của chúng.
12

- Phương pháp Salkowsky cải tiến (Misra và cs, 1989): sử dụng để xác định
khả năng sinh tổng hợp IAA thô: Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi
trường có bổ sung 0,1% Triptophan. Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm, thu được dịch
trong. Cho 2 ml dịch trong vào ống nghiệm chứa 8 ml thuốc thử Salkowsky cải tiến.
Lắc đều, để yên trong 20 phút, sau đó so màu trên máy với bước sóng 530nm. Hàm
lượng IAA tạo ra trong môi trường được tính toán trên cơ sở đồ thị IAA chuẩn.
Thuốc thử Salkowsky cả
i tiến: FeCl
3

0,5M 15ml; H
2
SO
4
98% 300 ml; Nước
cất 500 ml.
- Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch đĩa để xác định khả năng
phân giải kitin.
- Phương pháp phân lập vi sinh vật phân giải lân: Lấy 10 g mẫu cho vào cối
sứ nghiền nhỏ và đưa vào bình tam giác có chứa 90 ml nước cất vô trùng (độ pha
loãng 10
-1
) lắc bằng máy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong 15 phút. Hút 0,5 ml dịch
cho vào ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước cất vô trùng ta được nồng độ pha loãng
10
-2
. Tiếp tục làm như vậy cho tới khi thu được độ pha loãng thích hợp. Lấy pipet vô
trùng hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các ống nghiệm có độ pha loãng thích hợp cho
vào đĩa Petri có chứa môi trường Pikowskia. Gạt đều và ủ ở 30
0
C trong vài ngày
cho tới khi xuất hiện khuẩn lạc. Với mỗi độ pha loãng cấy ra 3 đĩa. Sau khi xuất
hiện khuẩn lạc trên các đĩa, đếm số khuẩn lạc vi sinh vật có vòng bao quanh. Đây
chính là các vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vô cơ khó tan.
Đồng thời đếm tổng số VSV có trên các môi trường tổng số để tính tần số bắt gặp vi
sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất ph
ốt pho vô cơ khó tan.Các khuẩn lạc
này chưa đảm bảo thuần khiết về mặt di truyền và giữ mức độ ổn định hoạt tính cho
nên cần phải giữ chúng trong các ống nghiệm giữ giống để làm sạch.Để làm sạch
dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy sinh khối của giống cần làm sạch cho

vào ống nghiệm chưa 4,5 ml nước cất vô trùng. Trộn đều và pha loãng tiếp cho đến
khi đạt
được độ pha loãng thích hợp. Hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng
thích hợp nhỏ vào đĩa pettri có chứa môi trường Pikowskia gạt đều và ủ cho đến khi
xuất hiện khuẩn lạc. Giữ các khuẩn lạc riêng rẽ có vòng trong bao quanh trong ống
nghiệm giữ giống và tiếp tục làm sạch cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cấy
truyền những khuẩn lạc có vòng phân hủy sang ống nghiệm thạch nghiêng để giữ
giố
ng.
Môi trường giữ giống thạch nghiêng có thành phần như sau (g/l): Glucose:
10g; Cao nấm men; 6,5g; Ca
3
(PO
4
)
2
: 5g; (NH
4
)
2
SO
4
: 0,5g; Kl: 0,2g;
MgSO
4
.7H
2
O: 0,1g; MnSO
4
: 0,01g; FeSO

4
: 0,01g; Agar: 20g; H
2
O: 1000ml
- Xác định định tính khả năng phân hủy phốtpho vô cơ: lựa chọn sơ bộ dựa
trên độ lớn và độ trong của vòng phân hủy. Cấy các chủng đã phân lập được trên
môi trường dịch thể có thành phần giống như thành phần môi trường phân lập không
có thạch. Mỗi chủng cấy vào 1 ống nghiệm chứa 5ml môi trường với một lượng cấy
tương đối bằng nhau (1 vòng que cấy), nuôi c
ấy trên máy lắc 24h. Dùng micropipet
cấy dịch vi sinh vật trên môi trường thạch bằng có thành phần giống như môi trường
13

phân lập thành những giọt nhũ riêng rẽ. Nuôi cấy trong tủ ấm và quan sát vòng phân
hủy. Lựa chọn những chủng có vòng phân hủy to và rõ.
- Xác định hàm lượng P
2
O
5
hòa tan trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp
so màu “ Xanh molipden”
Nguyên lý của phương pháp: Ion phốtpho trong môi trường axit yếu kết hợp
với amoni molipdat phức dị đa axit – phốtphomolipdat. Khi thêm vào chất khử
mạnh (như SnCl
2
trong HCl hoặc axit ascorbic) thì molipden hóa trị 6 bị khử đến
hóa trị 5 và các hóa trị thấp hơn, đồng thời tạo màu xanh phốtpho molipden. Lúc đó
dung dịch có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng phốtpho trong
dung dịch và có thể xác định bằng cách so màu.
Hóa chất: Dung dịch (NH

4
)
2
MoO
4
trong H
2
SO
4
10 N; Dung dịch axit Ascobic
1%; Dung dịch Chuẩn P
2
O
5
.
Cách làm dung dịch chuẩn P
2
O
5
:
Cân chính xác 0.1917g KH
2
PO
4
vào một lít nước cất hai lần trong bình định
mức. Dung dịch P
2
O
5
tiêu chuẩn có hàm lượng P

2
O
5
là 0,1mg/ml. Từ dung dịch
chuẩn này pha loãng ra 10 lần để tạo dung dịch chuẩn để sử dụng có hàm lượng 0.01
mg P
2
O
5
/ml.
Dựng đường chuẩn P
2
O
5
: từ dung dịch chuẩn sử dụng, hút vào mỗi bình định
mức 100ml với các thể tích khác nhau như sau: 2 ml, 4 ml, 6 ml, 8 ml (tương ứng
với 0.02 mg: 0,04 mg, 0,06 mg, 0,08 mg P
2
O
5
). Thên nước cất 2 lần vào các bình
trên đến thể tích xấp xỉ 50 ml và lắc đều. Một bình định mức làm đối chứng chỉ có
nước cất. Thêm vào các bình định mức trên mỗi bình 2ml dung dịch amoni
molipdat và 3 ml dung dịch axit ascobic 1 % sau đó lắc đều. Đặt tất cả các bình lên
bếp cách thủy đun trong 15 phút. Trong quá trình đun sẽ xuất hiện phức màu xanh
molipden. Để nguội và dẫn nước cất đến vạch định mức. Đo giá trị OD (mậ
t độ
quang học) bằng máy so màu có bước song α = 650 nm. Xử lý kết quả sau khi đo ta
sẽ nhận được đồ thị chuẩn P
2

O
5.
Định lượng phốtpho trong dịch nuôi cấy: Nhiễm các chủng vi sinh vật vào
môi trường dịch thể Pikowskia và nuôi trong 2 ngày. Ly tâm mẫu thí nghiệm và đối
chứng ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 10
0
C sau đó thu dịch trong. Hút
0,5 ml dịch trong để định lượng. Sau khi đo OD của mẫu thí nghiệm và mẫu đối
chứng. Mật độ quang học (OD) thực tế bằng hiệu của hai mật độ quang học trên.
Căn cứ vào đường chuẩn P
2
O
5
tính được định lượng của P
2
O
5
hòa tan.
- Phương pháp đánh giá độc tính của vi khuẩn đối kháng trên cây trồng
Đất được chuẩn bị kỹ, trồng cây, khi cây được 1 tháng tuổi thì bổ sung trực
tiếp dịch lên men các chủng vi khuẩn nghiên cứu vào gốc cây sao cho mật độ đạt
khoảng 10
5
-10
6
tb/g đất, theo dõi tình trạng phát triển của cây và tỷ lệ cây chết sau 2
tuần.
- Phương pháp đánh giá độc tính của vi khuẩn sử dụng trên chuột bạch
Thử nghiệm trên chuột theo phương pháp LD
50

oral (liều gây chết trung bình
50% cá thể chuột khi thuốc xâm nhập qua đường miệng) của NIAST, 2003. Dịch vi