nghiên cứu, phân tích genotype và sự tương đồng kháng nguyên của virus care ở việt nam

i
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI





BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU, PHÂN TÍCH GENOTYPE
VÀ SỰ TƯƠNG ĐỒNG KHÁNG NGUYÊN
CỦA VIRUS CARE Ở VIỆT NAM

CNĐT: LÊ HUỲNH THANH PHƯƠNG










9718

HÀ NỘI – 2013

ii
MỤC LỤC
Phần I 1
MỞ ĐẦU 1
Phần II 6
NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6
I. NỘI DUNG 6
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6
2.1. Phương pháp quan sát, thống kê sinh học 6
2.2. Phương pháp mổ khám 7
2.3. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý 7
2.4. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch 9
2.5. Phương pháp nuôi cấy tế
bào 11
2.6. Phương pháp phân lập virus Care trên tế bào tổ chức 12
2.7. Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID
50
) 13
2.8. Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus 14
2.9. Phương pháp tách chiết RNA 15
2.10. Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR 15
2.11. Phương pháp giải trình tự gene 17
2.12. Phương pháp xử lý số liệu, xây dựng cây sinh học phân tử 18
2.13. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein 18
2.14. Phương pháp chế tạo kháng thể 19
2.15. Phương pháp ELISA 20
2.16. Phương pháp tinh chế kháng thể 21
2.17. Phương pháp thực hiện phản ứng trung hòa virus 23
Phần III 25
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1. Kết quả thu thập mẫu chó mắc bệnh Care và nghiên cứu các đặc điểm
bệnh lý, chẩn đoán bệnh Care bằng phương pháp nhuộm tiêu bản vi thể và
hóa mô miễn dịch 25
3.2. Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào, xác định một số đặ
c tính
sinh học của virus 32
3.2.1. Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST 32


iii
3.2.2 Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) và hiệu giá của các chủng virus
Care phân lập được 35
3.3. Kết quả giải trình tự gene của một số chủng virus Care phân lập tại Việt
Nam và virus vacxin 42
3.3.1 Kết quả phản ứng RT- PCR 42
3.3.2 Kết quả giải trình tự gene của virus Care 46
3.4. Kết quả xác định sự tương đồng gene của các chủng virus Care phân l
ập
tại Việt Nam với các chủng virus trên thế giới và chủng virus vacxin 61
3.4.1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide trong gene của các chủng virus
Care nghiên cứu và chủng virus vacxin 61
3.4.2. Kết quả so sánh trình tự axitamin của đoạn gene P và đoạn gene H của
các chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin 63
3.4.3. Kết quả cây sinh học phân tử 69
3.4.4. Sự tương đồng về nucleotide và axitamin giữa các chủng virus Care
nghiên cứu: 70
3.5. Kết quả chế tạo kháng thể đa dòng tương ứng với các chủng virus Care phân lập
được ở Việt Nam và chủng virus vacxin để dùng cho phản ứng trung hòa 72
3.5.1. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus 72
3.5.2. Kết quả tạo kháng thể qua chuột 74

3.6. Kết quả xác định sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus Care
phân lập và chủng virus vacxin 78
Phần IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 87
4.1. Kết luận: 87
4.2. Đề nghị: 88
Phần V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 94
5.1. Tài liệu tiếng Việt 94
5.2. Tài liệu tiếng Anh 94


iv
DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Hồ sơ của các mẫu thu thập 25
Bảng 3.2. Bệnh tích đại thể của chó nghi mắc Care 26
Bảng 3.3. Bệnh tích vi thể của chó nghi mắc bệnh Care 28
Bảng 3.4. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch để xác định chó bị mắc bệnh Care 30
Bảng 3.5. Nguồn gốc của các chủng virus Care được lựa chọn cho nghiên cứu 34
Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu khả năng gây b
ệnh tích tế bào của các chủng
virus Care 36
Bảng 3.7. Hiệu giá và đặc tính nhân lên của các chủng virus Care phân lập . 39
Bảng 3.8. Các chủng virus Care được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên 40
Bảng 3.9. Hiệu giá virus của chủng CDV1-P trong và ngoài tế bào qua thời gian. 41
Bảng 3.10. Hiệu giá virus của chủng CDV2-H trong và ngoài tế bào qua thời gian . 41
Bảng 3.11. Kết quả phản ứng RT- PCR với gene H 43
Bảng 3.12. Kết quả RT-PCR với gene P 45
Bảng 3.13. So sánh tương
đồng nucleotide và axit amin đoạn gene H 70
Bảng 3.14. So sánh tương đồng nucleotide và axit amin đoạn gene P 71

Bảng 3.15. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus 73
Bảng 3.16. Biến đổi bệnh lý của chuột gây miễn dịch 74
Bảng 3.17. Kết quả thu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus Care 77
Bảng 3.18. Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng
virus Care 77
Bảng 3.19. Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV1P 79
B
ảng 3.20. Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV6H 80
Bảng 3.21 Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV13R 81
Bảng 3.22. Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV16H 82
Bảng 3.23. Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV19P. 83
Bảng 3.24. Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV VX. 84
Bảng 3.25. Kết quả sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus Ca rê
phân lập và chủng virus vacxin 85


v
DANH MỤC HÌNH
Ảnh 2.1. Hoá miễn dịch dương tính Ảnh 2.2. Hoá miễn dịch âm tính 11
Hình 1. Phổi viêm, gan hóa 27
Hình 2. Phổi viêm dính với thành ngực 27
Hình 3. Đại não sung huyết, xuất huyết 27
Hình 4. Hạch lympho màng treo ruột sưng, tụ máu 27
Hình 5. Ruột xuất huyết, chứa hơi căng phồng 27
Hình 6. Xuất huyết niêm mạc ruột 27
Hình 7. Phế nang đứt nát, lòng phế nang chứa nhiều dịch phù (HE x10) 29
Hình 8. Phế nang thâm nhiễ
m tế bào viêm(HE x40) 29
Hình 9. Lông nhung ruột đứt nát (HE x10) 29
Hình 10. Viêm cầu thận, xuất huyết (HE x40) 29

Hình 11.Hạch lympho xuất huyết, nang lympho teo (HE x10) 29
Hình 12. Hạch lympho xuất huyết, số lượng lymphocytes giảm (HE x40) 29
Hình 13. Hóa miễn dịch dương tính ở phổi (IHCx10) 31
Hình 14. Hóa miễn dịch dương tính tại ruột (IHCx10) 31
Hình 15. Hóa miễn dịch dương tính tại thận (IHCx10) 31
Hình 16. Hóa miễn dịch dương tính tại hạch lympho (IHCx10) 31
Hình 17. CPE do CDV-4H gây ra sau 24 giờ gây nhiễm (10X) 38
Hình 18. CPE do Onderstepoort (virus vacxin) gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X) 38
Hình 19. CPE do CDV-4H gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X) 38
Hình 20. Tế bào Vero –DST bình thường (10X) 38
Hình 21. Kết quả phản ứng RT- PCR 44
Hình 22. Kết quả phản ứng RT-PCR 45
Hình 23. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gene
Haemagglutinin của virus Care 47
Hình 24. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene H của các chủng virus
Care nghiên cứu 57


vi
Hình 25. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gene
Phospho protein của virus Care. 58
Hình 26. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene P của các chủng virus
Care nghiên cứu 60
Hình 27. So sánh trình tự axitamin của đoạn gene H của các chủng virus Care
nghiên cứu 66
Hình 28. So sánh trình tự axitamin của đoạn gene P của các chủng virus Care
nghiên cứu 67
Hình 29. Cây sinh học phân tử của các ch
ủng virus Care nghiên cứu 69
Hình 30. Chuẩn bị kháng nguyên tinh chế 72

Hình 31. Tạo gradient đường saccarose 72
Hình 32. Chuẩn bị mẫu cho siêu ly tâm 72
Hình 33. Máy siêu ly tâm 72
Hình 34. Nuôi động vật thí nghiệm 76
Hình 35. Chuẩn bị kháng nguyên 76
Hình 36. Tiêm động vật thí nghiệm 76
Hình 37. Bệnh tích ngoài da sau khi tiêm 76
Hình 38. Chuẩn bị mổ chuột 76
Hình 39. Lấy máu tim chuột 76


vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BSA : Bovine Serum Albumin
cDNA
: CompleDMEMtary DNA
CDV : Canine distemper virus
CPE : Cytophathogeneic Effect
DAB : 3,3-diaminobenzidine
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA : Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
FBS : Fetal Bovine Serum
HE : Haematoxilin – Eosin
IHC : Immunohistochemistry
MOI : Multiplicity Of Infection
Ond : Onderstepoort
PBS
: Phosphate buffered saline

RNA : Ribonucleic acid
RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
TBP : TATA-binding protein
TCID
50
: 50% Tissue Culture Infective Dose
TMB : 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine



1
Phần I
MỞ ĐẦU


Virus Care ở chó được phát hiện từ thế kỷ XVIII, được tìm thấy ở Peru
thuộc Châu Á, bệnh phân bố khắp thế giới. Năm 1905, căn bệnh được bác sĩ
thú y người Pháp tên là Henri Carré phân lập được từ nước mũi của chó bệnh
lọc qua giấy lọc vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm cho chó, cũng vẫn gây được
bệnh, ông cho rằng nguyên nhân bệnh là virus (Carré, 1905). Vì vậy, bệnh
này được gọi là bệnh Care (theo tên nhà khoa học) (David T. Smith, 1979).
B
ệnh Care được phát hiện trên toàn thế giới. Gần đây, bệnh được công
bố ở các nước châu Á như Nhật Bản (Lan và cs, 2006), Thái Lan
(Keawcharoen và cs, 2005), Hàn Quốc (An và cs, 2008) và Ấn Độ (Latha và
cs, 2007).
Bệnh Care là một bệnh lây nhiễm cao ở chó, gây tổn thương lớn ở hệ
tiêu hóa, dạ dày, ruột, hệ thần kinh trung ương và hệ hô hấp theo Hồ Đình
Chúc (1993), Trần Thanh Phong (1996), Vương Đức Chất và cs, (2004), Lê
Thị Tài (2006), Tô Du và Xuân Giao (2006), Nguyễn Văn Thanh (2007),

Nguyễn Thị Lan và Tr
ần Trung Kiên (2010), Nguyễn Hữu Nam (2011).
Năm 1923, Putoni lần đầu tiên chế vacxin nhược độc tuy nhiên độc lực
của virus vẫn còn cao. Sau năm 1948 với sự phát triển mạnh mẽ của virus học
nhiều vacxin phòng bệnh Care có hiệu quả ra đời.
Virus Care giống như virus sởi về hình thái và cấu trúc. Một số công
trình nghiên cứu khác cho rằng có sự liên quan về kháng nguyên giữa virus
Care, virus sởi và dịch tả trâu bò (Sidery và cs, 1996), virus gây bệnh trên
động vật nhai lại nhỏ, virus gây bệnh trên
động vật có vú dưới nước (cá heo,
hải cẩu) (Griffin, 2001; Murphy, 1999). Virus Care (Canine distemper virus)
thuộc họ paramyxoviridae và có mối liên quan gần gũi về tính kháng nguyên,
sinh lý với virus sởi của người và virus dịch tả trâu bò của loài nhai lại. Ba


2
virus này cùng một nhóm với nhau trong giống Morbillivirus. Morbillivirus là
một virus tương đối lớn (đường kính 150 – 250 nm) với sự đối xứng hình
xoắn ốc, chúng có một lớp vỏ lipoprotein (Kennedy và cs, 1989). Cấu trúc của
hạt virus bao gồm: Nucleocapside chứa ARN một sợi không phân đoạn gần
1600 nucleotide mã hóa thành 6 protein cấu trúc và 1 protein không cấu trúc
(Diallo, 1990).
N: Nucleocapsid, khối lượng phân tử 60 – 62 Kda bao quanh và phòng
vệ cho hệ gene của virus, nhạy cảm với những chất phân giải protein.
P: Phosphoprotein, khối lượng phân tử 73 – 80 Kda, nhạy c
ảm với
những yếu tố phân giải protein, đóng vai trò quan trọng trong sự sao chép của
RNA (Sidhu và cs, 1993)
M: Matrix, khối lượng phân tử 34 – 39 Kda, đóng vai trò quan trọng trong
sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc.

F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59
– 62 Kda, đóng vai trò trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến
kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (h
ợp bào).
H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là
glycoprotein thứ hai của vỏ bọc, khối lượng phân tử 76 – 80 kda, thể hiện tính
chuyên biệt của loài virus. Ở virus Care, protein này không hấp phụ hồng cầu
cũng không ngưng kết hồng cầu.
L: Large protein có khối lượng phân tử lớn 200 kda, chưa rõ chức năng
(Nguyễn Vĩnh Phước và cs; Bell và cs, 1992).
Protein không cấu trúc (C) được mã hóa từ một khu đọc mở khác ở
gene P (Lamb và Kolakofsky, 2001). Ch
ức năng thực tế của protein C trong
sinh học của virus là không rõ ràng.
Mặc dù có những sự khác biệt nhỏ về kháng nguyên giữa các chủng
CDV khác nhau nhưng nó thường được chấp nhận là chỉ có một serotype. Tuy
nhiên, có sự khác biệt đáng kể trong khả năng gây bệnh của các chủng virus


3
phân lập và các type ở các khu vực địa lý khác nhau đã được nói tới. Các type
của CDV bao gồm: Asia 1 (Nhật Bản, Trung Quốc), Asia 2 (chỉ có ở Nhật
Bản), Bắc Cực, động vật hoang dã châu Âu, USA 1 và 2, CDV cổ điển
(Onderstepoort, Convac, Rockborne và Snyder Hill) (Haas và cs, 1997; 1999;
Harder và Osterhaus, 1997; Martella và cs, 2006; 2007; Yoshida và cs,
1998). Bên cạnh đó, dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gene mã hóa
cho protein H, Lan NT và cs, (2008) đã chia ra thành 5 type virus lớn
được phân lập từ những vùng địa lý khác nhau: type Châu Âu, cổ điển
(Classic type), Asia 1, Asia 2 và USA.
Mặc dù các nước trên thế giớ

i đã dùng vacxin nhược độc để phòng
bệnh nhưng gần đây tỷ lệ chó mắc Care đã tăng một cách đáng kể ở một số
nước như Nhật, các nước châu Âu (Appel và cs, 1987; Blixenkrone và cs,
1993; Shin và cs, 1995; Lan và cs, 2005). Rất nhiều chó đã được tiêm phòng
vacxin phòng mà vẫn mắc bệnh (Blixenkrone và cs, 1993; Lan và cs, 2006).
Yoon SH, Park JY, (2008) đã xác định trình tự gene quy định kháng
nguyên hemagglutinin (H) từ bốn chó mắc virus Care phân lập được tại Hàn
Quốc. Những trình tự này được đưa vào phân tích cây phát sinh loài c
ủa các
chủng virus Care (là EU1, EU2, EU3, NA1, NA2, 1 Châu Á, Châu Á 2 và
vacxin). Phân tích này cho thấy ba trong số các phân lập Hàn Quốc nằm trong
nhóm 2 Châu Á chủng còn lại nằm trong nhóm 1 của Châu Á. Như vậy ngay
trong một quốc gia đã lưu hành hai chủng virus Care khác nhau.
Roger và cs, (2003) nghiên cứu một trường hợp mà trong đó hàng trăm con
chó trong một thị trấn Alaska (Mỹ) đã chết trong một ổ dịch Care. Virus Care đã
được tìm thấy trong bàng quang, lá lách, phổi, và tuyến nước bọt của các chó bị
bệnh. Kháng thể huỳnh quang trự
c tiếp kiểm tra cho kết quả dương tính (Mô
miễn dịch cho thấy sự hiện diện của virus trong lá lách, phổi, và tuyến nước bọt).
Trong nghiên cứu này kỹ thuật RT-PCR cũng đã được sử dụng để xác nhận sự
hiện diện của virus Care. RNA virus được phát hiện bằng RT-PCR trong não, lá


4
lách, gan, phổi và thận. Xác định trình tự nucleotide và phân tích phát sinh loài
của một đoạn gene P 540-bp của chủng Alaska với trình tự tương ứng của 2
vacxin và 7 chủngvirus Care phân lập tự nhiên cho thấy virus Care gây nên
các ổ dịch đã liên quan chặt chẽ đến một chủng virus Care độc lực cao ở
Siberia. Như vậy có sự sai khác rất lớn về tính gây bệnh của các chủng virus
Care tự nhiên cũng như sự khác nhau về tính kháng nguyên của chủng virus

Care tự
nhiên và chủng được sử dụng làm vacxin.
Benetka, (2009) nghiên cứu phát sinh loài thông qua phân tích trình tự
genee haemagglutinin (H) trên 14 chó khác nhau ở Áo (từ năm 2003 đến
2007) cho thấy có dòng lưu thông virus Care khác nhau ở Áo. Đa số các
chủng phát hiện thuộc dòng châu Âu. Một virus Care ở Áo phát hiện vào năm
2003 có mối quan hệ mật thiết với chủng virus Care ở Hungary 2005-2006.
Hai chủng virus Care phân lập từ chó từ năm 2007 thành lập một nhóm khác
biệt rõ rệt phát hiện trước đây chúng thuộc 2 nhóm khác nhau là Trung Quốc
(châu Á-1) và Mỹ. Các chủng virus Care ở
Áo trước đây có thể được gán cho
nhóm châu Âu nhưng rõ ràng khác khi năm 2007 các mẫu chó phân lập được
có cả chủng virus Care châu Á. Để làm sáng tỏ vai trò dịch tễ học của sự lưu
hành này, Kháng nguyên H được phân tích. Tất cả các mẫu cho thấy các axit
amin có cùng nguồn gốc Châu Âu ngoại trừ một chuỗi phân lập từ chó nhiễm
virus Care năm 2007. Như vậy ở Áo có thể có một sự đa dạng cao về nguồn
gốc các chủng virus Care gây bệnh khác nhau trên chó.
Thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về virus Care kể từ khi
nó xuất hiện trên thế giới đến nay và các vacxin mới không ngừng được sản
xuất để tăng hiệu quả phòng bệnh. Tuy nhiên dịch bệnh vẫn xảy ra điều này
cho thấy virus không ngừng biến đổi và cần nghiên cứu đầy đủ về đặc điểm di
truyền cũng như tính kháng nguyên của các chủng virus Care lưu hành
ở từng
quốc gia để có chiến lược phòng bệnh hiệu quả.


5
Nghiên cứu và phân tích sự biến đổi về gene và sự tương đồng gene,
cũng như sự tương đồng kháng nguyên của các chủng virus Care đang lưu
hành ở Việt Nam là vô cùng cần thiết. Nó không những cung cấp những thông

tin khoa học cụ thể và chính xác về các nhóm virus Care đang lưu hành tại
Việt Nam, thấy được sự tương đồng kháng nguyên giữa các nhóm virus này
mà còn là cơ sở khoa học để lựa chọn chủng virus Care thích hợp phục v
ụ
việc chế vacxin phòng bệnh, là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo như tái tổ
hợp virus, chế tạo KIT chẩn đoán hay vacxin phòng bệnh Care.
Phạm vi nghiên cứu:
Một số chủng virus gây bệnh Care trên chó ở Việt Nam.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:
Ý nghĩa khoa học:
Đề tài được thực hiện góp phần quan trọng trong việc nâng cao trình độ của
các cán bộ nghiên cứu, các thông tin khoa học thu được trong quá trình
nghiên cứu có ý nghĩa vô cùng to lớn trong tìm hiể
u, nghiên cứu, phát triển
sâu hơn về trong lĩnh vực virus học và tiến tới chế tạo vacxin. Kết quả của đề
tài còn là tài liệu khoa học quý cho các học viên cao học, bác sỹ thú y và
những người quan tâm đến lĩnh vực công nghệ sinh học trong thú y.
Ý nghĩa thực tiễn:
Đề tài được thực hiện không những cung cấp những thông tin khoa học
cụ thể và chính xác về các nhóm virus Care đang lưu hành tại Việt Nam, thấy
được sự
tương đồng kháng nguyên giữa các nhóm virus này mà còn là cơ sở
khoa học để lựa chọn chủng virus Care thích hợp phục vụ cho các nghiên cứu
tiếp theo như tái tổ hợp virus, chế tạo KIT chẩn đoán hay chế tạo vacxin
phòng bệnh Care. Đề tài được thực hiện sẽ giúp nâng cao năng lực nghiên cứu
cho các cán bộ trẻ, sinh viên đại học, học viên cao học, nghiên cứu sinh của khoa
Thú y, tạo ra nhóm nghiên cứu trẻ có tiềm năng, là hạt nhân nghiên cứ
u khoa
học cho khoa, cho trường, giúp cho khoa Thú y có thể tiếp cận và hội nhập với
nền khoa học tiên tiến của các nước trong khu vực cũng như trên thế giới.

6
Phần II
NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I. NỘI DUNG
- Thu thập mẫu chó mắc bệnh Care và nghiên cứu các đặc điểm bệnh lý,
Chẩn đoán bệnh Care bằng phương pháp nhuộm tiêu bản vi thể và hóa mô
miễn dịch.
- Phân lập virus trên môi trường tế bào, xác định một số đặc tính sinh học
của virus.
- Giải trình tự gene của một số chủng virus Care phân lập tại Việt Nam
và virus vacxin.
- Xác định sự tương đồng gene của các chủng virus Care phân lập tại
Việt Nam với các chủng virus trên thế giới và chủng virus vacxin.
- Chế tạo kháng thể đa dòng tương ứng với các chủng virus Care phân lập được
ở Việt Nam và chủng virus vacxin để dùng cho phản ứng trung hòa.
- Nghiên cứu khả năng phản ứng chéo giữa chủng virus vacxin với một
số chủng virus Care phân lập được ở Việt Nam.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được các nội dung đã đề ra c
ủa đề
tài, chúng tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy
và hiện đại trong lĩnh vực thú y. Trong đó các phương pháp sử dụng cho việc
thu thập mẫu chó mắc bệnh Care và nghiên cứu các đặc điểm bệnh lý, Chẩn
đoán bệnh Care bằng phương pháp nhuộm tiêu bản vi thể và hóa mô miễn
dịch bao gồm.
2.1. Phương pháp quan sát, thống kê sinh học
Để xác định được các triệu chứng lâm sàng ch

ủ yếu của chó mắc Care,
chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của chó từ khi
xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên. Đồng thời dựa vào các đặc điểm


7
dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập
các thông tin liên quan. Tiến hành phân tích, thống kê để đưa ra những kết
quả chính xác. Xác định chính xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý
nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
2.2. Phương pháp mổ khám
Mổ khám ca bệnh nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ
quan, tổ chức của chó mắc bệnh Care, cầ
n tiến hành mổ khám những chó có
biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh. Chó bệnh được cố định cẩn thận,
thu dịch swab (các dịch tự nhiên của cơ thể như nhử mắt, nước mũi, dịch
ngoáy hầu họng). Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan
nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan
như: phổi, hạ
ch, tim, gan, lách, thận theo các mục đích nghiên cứu khác nhau.
2.3. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Mẫu bệnh phẩm được lấy từ các cơ quan, tổ chức của chó nghi mắc bệnh
Care được ngâm trong formol 10% làm tiêu bản vi thể. Phương pháp làm tiêu
bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin
(HE). Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Cố định bệnh phẩm
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%.
Vùi bệnh phẩm
Tiến hành lầ
n lượt các bước sau:

- Rửa focmol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h.
- Đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động.
Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình






8
Bình Hóa chất Thời gian (giờ)
1
Cồn 60
0
C 1:00
2
Cồn 60
0
C 1:00
3
Cồn 70
0
C 1:30
4
Cồn 80
0
C 1:30
5
Cồn 96
0

C 1:30
6
Cồn 100
0
C 1:30
7
Cồn 100
0
C 1:30
8
Cồn 100
0
C 1:30
9
Xylen 1:30
10
Xylen 1:30
11
Parafin 2:00
12
Parafin 2:00
Đúc block
Đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Cắt mảnh: bằng máy microtom.
Tãi mảnh: Dàn lát cắt bằng phẳng trên phiến kính trong nước ấm 48
0
C.
Sau đó để tủ ấm 37
0

C đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm được.
Nhuộm tiêu bản
Các bước tiến hành
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Xylen I: 6h
Xylen II: 6h
Xylen III: 12h
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ:
Cồn 100
0
: 2 lần (mỗi lần 1 phút)
` Cồn 95
0
: 1 lần


9
Cồn 70
0
: 1 lần
Cồn 50
0
: 1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút.
+ Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước.
Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 50
0
: 1 lần

Cồn 70
0
: 1 lần
Cồn 95
0
: 1 lần
Cồn 100
0
: 2 lần
Rửa tiêu bản bằng nước cất
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút, rửa nước.
Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 100
0
mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản đi qua xylen .
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn
còn xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học.
2.4. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
Để phát hiện chính xác sự có mặt của virus Care trong tổ chức, mức độ
tập trung của virus trong các cơ quan để phục vụ cho bước phân lập virus, chúng
tôi tiến hành nhuộm hóa mô miễn dịch hay hóa miễn dị
ch tổ chức (IHC).
Phương pháp nhuộm hóa miễn dịch tổ chức là phương pháp mới, có độ
chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức. Phương
pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên
với kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu (Carpenter,
1998, Lan và cs, 2006; 2008). Trong mỗi lô nhuộm IHC, chúng tôi bố trí đối
chứng dương (lát cắt tổ chức của chó bị mắc b

ệnhCare) và đối chứng âm (lát


10
cắt tổ chức của chó không bị mắc bệnh Care). Kết quả được đánh giá ở các
mức độ nặng nhẹ khác nhau tùy thuộc và việc xuất hiện các điểm, các đám
màu nâu vàng trên tiêu bản. Khi có sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể
đơn dòng đặc hiệu thì xuất hiện các đám nâu vàng trên tiêu bản, phản ứng
dương tính hay tổ chức có virus khu trú. Các đám màu này càng nhiều, màu
càng đậm thì chứng tỏ mức độ
kháng nguyên tập trung tại đây càng nhiều.
Phương pháp nhuộm hoá miễn dịch tổ chức có quy trình tẩm đúc bằng
parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Các bước thực hiện:
Bước 1: Làm sạch tiêu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi
thể. Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
Bước 2: Hoạt hoá enzym
Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp
ướt ở 121
0
C/5 phút.
Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
Dùng H
2
O
2
trong dung môi Methanol (1H
2
O
2

30% : 9 Methanol), ngâm
tiêu bản trong 10 phút.
Bước 4: Gắn kháng thể
Nhỏ 80 µl kháng thể kháng virus Care lên tiêu bản.
Để tủ ấm 37
0
C/1giờ hoặc 4
0
C/qua đêm.
Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần)
Bước 5: Gắn kháng kháng thể
Nhỏ 80 µl kháng kháng thể lên tiêu bản.
Để tủ ấm 37
0
C/1 giờ.
Rửa PBS 3 lần (5phút/lần)






11
Bước 6: Cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 3-5 phút, đến khi thấy
xuất hiện màu vàng nâu trên lát cắt ở đối chứng dương thì dừng phản ứng
bằng nước sạch.
Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Hematoxilin, làm sạch, gắn và quan sát
bằng kính hiển vi quang học.
Minh họa hình ảnh dương tính, âm tính

Ảnh 2.1. Hoá miễn dịch dương tính Ảnh 2.2. Hoá miễn dịch âm tính
Các phương pháp sử dụng cho việc phân lập virus trên môi trường tế bào, xác
định một số đặc tính sinh học của virus bao gồm:
2.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào
- Khôi phục tế bào
Chuẩn bị môi trường đầy đủ (DMEM, 10% FBS làm ấm trong tủ ấm 37
o
C
trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy)
Bước 1: Giải đông nhanh tế bào.
Bước 2: Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường đầy đủ.
Bước 4: Đưa vào nuôi cấy và theo dõi sự phát triển của tế bào. Giữ tế bào
ở 37
0
C, 5% CO
2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
- Cấy chuyển tế bào


12
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS (không chứa
Ca
2+
hoặc Mg
2+
).
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin – EDTA, ủ trong 5 đến

10 phút. Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly
tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5’ để loại bỏ phần
dung dịch và giữ lại cặn tế bào.
Bước 4: Hòa tan tế bào trong 6ml môi trường DMEM. Đếm tế bào bằng
cách pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy
đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi. Tính số tế bào trong
1ml.
Bướ
c 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2*10
5
tế bào/ml môi
trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi cấy ( 6ml/bình T25,
15ml/ bìnhT75).
Bước 6: Nuôi tế ở 37
0
C với 5%CO
2
, hàng ngày theo dõi sự phát triển của
tế bào.
- Thu tế bào
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào chỉ khác ở
bước 5 và bước 6.
Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5*10
6
tế bào/ml trong môi
trường đầy đủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống
bảo quản 1ml/ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20
o

C trong 2-
3 giờ, chuyển sang -80
o
C qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.
2.6. Phương pháp phân lập virus Care trên tế bào tổ chức
Bước 1: chuẩn bị tế bào phân lập: Tế bào được đưa vào nuôi cấy trong môi
trường và điều kiện thích hợp, môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle
Medium) có bổ sung 5% FCS (Fetal calf serum) làm ấm trong tủ 37
o
C trong 30


13
phút trước khi gây nhiễm virus và mật độ tế bào đạt 70% đến 80% diện tích
đáy bình.
Bước 2: chuẩn bị mẫu phân lập theo quy trình xử lý mẫu phù hợp và hiệu
quả cho quá trình phân lập virus Ca rê. Tùy từng loại mẫu khác nhau mà có
phương pháp xử lý phù hợp với mục đích nghiên cứu. Để tiến hành phân lập
vius từ mẫu bệnh phẩm của các cơ quan, tổ chức của chó mắc ca rê, cần
nghiền nát mẫu bằng chày và c
ối vô trùng sau đó được đồng nhất trong dung
dịch DMEM (thể tích 600ul có bổ sung 10% kháng sinh, bảo quản ở -80
o
C
cho đến khi sử dụng). Với các mẫu là dịch swab (nhử mắt, nhử mũi, dịch
họng) cần bảo quản trong môi trường và điều kiện thích hợp ngay khi lấy,
thông thường bảo quản trong môi trường VTM và ở điều kiện càng lạnh càng
tốt, mẫu sau khi mang về cân loại bỏ tăm bông và bảo quản ở -80
0
C phục vụ

cho phân lập virus. Với mẫu là huyết thanh hay máu chống đông cần bảo quan
ngay trong điều kiện lạnh để đảm bảo virus vẫn còn sống khi đem phân lập.
Bước 3: gây nhiễm virus và quan sát kết quả: Từ các bình tế bào đã chuẩn
bị ở bước 1 hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100 µl mẫu đã chuẩn bị ở
bước 2. Tế bào gây nhiễm virus được ủ ở 37
0
C với 5% CO
2
trong 30 phút. Bổ
sung 5 ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB (Tryptose Phosphate Broth)
vào bình và để ở 37
0
C với 5% CO
2
. Hàng ngày theo dõi sự phá hủy tế bào bằng
kính hiển vi soi nổi và thu virus khi tế bào bị phá hủy đạt 80% - 90% diện tích
đáy của bình nuôi cấy.
2.7. Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID
50
)
Tế bào Vero-DST được chuẩn bị trên khay 96 giếng (2,0 x 10
4
tế
bào/giếng). Huyễn dịch chứa bệnh phẩm được ly tâm bỏ cặn và lấy phần nước
trong và được pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp
các giếng theo thứa tự đánh dấu trước (25µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 5
lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM (10% TBP) được bổ sung vào (100


14

µl/giếng). CPE được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây
nhiễm. TCID
50
được xác định theo phương pháp của Reed Muench.

Trong đó:
A: là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm sát trên 50%, tính bằng phần trăm (%)
B: là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm sát dưới 50%, tính bằng phần trăm (%)
a: là nồng độ pha loãng tại A
b: là nồng độ pha loãng tại B
2.8. Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus
Tế bào Vero-DST được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5×10
4
tế
bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên.
Virus Care phân lập được và chủng virus vacxin được gây nhiễm lên tế
bào ở MOI = 0.01. Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa
virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch bằng 0.5 ml PBS.
Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi trường nuôi
cấy 100µl/giếng.
Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong tế bào được thu riêng từ
dịch nổi và ph
ần tế bào còn lại ở các bình gây nhiễm tại các thời điểm 12, 24,
36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm virus.
Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng
virus. Đường biểu biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log
10

của TCID
50

tại mỗi thời điểm thu virus.
Các phương pháp sử dụng cho việc giải trình tự gene của một số chủng virus
Care phân lập tại Việt Nam và virus vacxin bao gồm:





15
2.9. Phương pháp tách chiết RNA
Từ các mẫu bệnh phẩm thu thập được của các chó nghi mắc bệnh Care
được chúng tôi bảo quản trong điều kiện -80
0
C, tiến hành tách chiết RNA của
virus để chẩn đoán các chó mắc bệnh.
- Quy trình tách chiết ARN virus dùng KIT của hãng Qiagene các bước
thực hiện theo hướng dẫn sau:
Bước 1: Cho 560µl Buffer AVL vào ống eppendoft
Bước 2: Cho 140µl mẫu vào ống trên. Votex trong 15 giây, để nhiệt độ
phòng trong 10 phút, ly tâm thời gian ngắn.
Bước 3: Cho 560µl Ethanol (96% - 100%) vào ống và votex trong 15 giây.
Bước 4: Hút 630µl mẫu trong ống vào cột QIA đậy nắp và ly tâm 8.000
vòng/phút/1 phút, loại bỏ dung dịch phía dưới ống, lặp lại bước 4 một lần nữa
vớ
i phần mẫu còn lại.
Bước 5: Cho 500µl AW1 vào cột QIA, ly tâm 8.000 vòng/phút/1 phút,
loại bỏ dịch phía dưới cột.
Bước 6: Cho 500µl AW2 vào cột QIA, ly tâm 14.000 vòng/phút/3 phút,
loại bỏ dịch phía dưới cột, ly tâm lại lần nữa với tốc độ tối đa trong 1 phút.
Bước 7: Đặt cột QIA vào ống eppendoft 1.5 ml mới, thêm 60µl AVE để ở

nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm tốc độ 8.000 vòng trong 1 phút. Thu dịch
qua cột và bảo quản ở -20
0
C hoặc -80
0
C.
2.10. Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR
- Tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được
trình bày ở bảng sau:





16
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl)
2X Reaction Mix 12.5
Mẫu RNA 5
Primer Forwad 0.5
Primer Reverse 0.5
RT/Platium Taq Mix 0.5
Nước cất 6
Tổng thể tích 25

Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ
nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (
o
C) Thời gian Chu kỳ

Tổng hợp cADN 50 30 phút
1
Duỗi mạch 95 5 phút
1
Duỗi mạch 95 15 giây
Gắn mồi 50 30 giây
2
Tổng hợp sợi mới 72 1 phút
35
3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung
dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40
o
C bổ sung
thêm 10 ul Syber green, đổ thạch vào khay đã cắm lược tạo các giếng để sau
này cho mẫu cần điện di.
- Chuẩn bị mẫu: Trộn 2 µl loading dye với 8 µl sản phẩm RT-PCR trên
giấy parafin.


17
- Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE
1X đến ngập thạch.
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR cần điện di với loading dye vào các giếng
với thể tích 6µl maker 100bp và 10 µl sản phẩm PCR mỗi giếng.
- Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
- Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp
ảnh.

2.11. Phương pháp giải trình tự gene
Kỹ thuật giải trình tự: Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá
trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần
nghiên cứu. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gene tự
động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm được tiến hành tại Phòng
thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y. Nguyên tắc chung của máy giải trình tự
gene tự động là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger. Khi sợi DNA được
tổng hợp s
ẽ sử dụng các nucleotide có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang, các
nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc
bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng trong đó Adenin cho màu đỏ,
Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu đen.
Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau:
Phản ứng PCR sequencing: Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml
theo bảng sau:
Thành phần Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
DTCS Quick Start Master Mix 8,0
DNA 7,0
Primer 0,2
dH
2
O 4,8
Tổng thể tích 20



18
Với chương trình chạy PCR giải trình tự sau
Bước tổng hợp Nhiệt độ (
0

C) Thời gian Số chu kỳ
Biến tính chuỗi DNA 96
0
C 20 giây
Gắn mồi 50
0
C 20 giây
Kéo dài chuỗi DNA 60
0
C 4 phút

30 chu kỳ
Giữ sản phẩm ở 4
0
C
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol
kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter-Mỹ)
Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành
giải trình tự.
2.12. Phương pháp xử lý số liệu, xây dựng cây sinh học phân tử
Phương pháp này cho phép xác định sự tương đồ
ng gene của các chủng
virus đã giải trình tự
Phân tích xác nhận chuỗi gene thu được thông qua chương trình Blast
trên Ngân hàng gene (GeneBank) ( />). Truy cập
ngân hàng gene thu nhận và xác định sự tương đồng về nucleotide của các
chuỗi gene tương ứng của virus với các phân đoạn gene thu được trong
nghiên cứu. Thành phần aminoaxit của kháng nguyên virus được thu nhận
bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (Bộ mã vi khuẩn – bacterial

code) có trong ngân hàng gene và so sánh thông qua chương trình Geneetyx.
Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gene của
chủng virus thu nhận được b
ằng phần mềm Mega5.
Các phương pháp sử dụng trong việc nghiên cứu chế tạo kháng thể đa dòng
bao gồm:
2.13. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein
Các chủng virus được chúng tôi lựa chọn làm nguyên liệu cho các bước
nghiên cứu tiếp theo được chúng tôi nhân lên với số lượng lớn để tiến hành