dược điển Việt Nam 4, Phụ lục 17

13.6 THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN
Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số
lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có khả năng
sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ
điểm y tế có trong thuốc.
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện
vô khuẩn. Trong khi làm thí nghiệm, chú ý
không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử.
Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các
dược phẩm gồm cả nguyên liệu và thành
phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn trong
quá trình sản xuất.
Thử nghiệm sơ bộ
Tìm chất ức chế có trong thuốc
Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn sẽ không
có giá trị nếu chất ức chế có trong thuốc cản
trở đến khả năng phát hiện các vi sinh vật. Vì
vậy cần làm thí nghiệm kiểm tra trước bằng
cách lấy dung dịch chế phẩm đã được pha ở
nồng độ thích hợp vào môi trường chọn lọc
cho Escherichia coli, Salmonella,
Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa,
rồi cấy vào đó 1 ml canh khuẩn 24 h tuổi đã
pha loãng với dung dịch đệm phosphat pH
7,2 ít nhất tới độ pha loãng 10
-3
các vi khuẩn
tương ứng. Nếu vi khuẩn không mọc, thí
nghiệm cần thay đổi bằng cách:
1. Giữ nguyên lượng chất mang thử nhưng
tăng thể tích môi trường.

2. Cho vào dung dịch pha loãng một lượng
vừa đủ chất khử hoạt tính thích hợp.
3. Phối hợp cách làm (1) và (2) để vi khuẩn
mang cấy có thể mọc được.
Tuỳ theo thành phần và nồng độ của mẫu
thử, có thể thêm vào môi trường để trung
hòa chất ức chế các loại sau: lecithin đậu
tương 0,5 %, polysorbat 20: 4,0 %.
Làm lại thí nghiệm với điều kiện chất ức chế
trong lượng mẫu mang kiểm tra đã được
trung hòa.
Môi trường
Môi trường nuôi cấy có thể pha theo cách
dưới đây hoặc có thể dùng môi trường khô
do các hãng sản xuất môi trường vi sinh vật
cung cấp. Các môi trường tự pha chế
thường phải hấp tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở
nhiệt độ 121

°C trong 15 phút trừ khi có
những chỉ dẫn riêng đối với loại môi trường
đặc biệt.
Thạch dùng cho pha chế môi trường có độ
ẩm dưới 15 %. Nước dùng trong các công
thức môi trường phải tinh khiết.
Môi trường lỏng casein lecithin đậu tương
polysorbat
Casein thủy phân bởi pancreatin
Lecithin đậu tương
Polysorbat 20

Nước
20,0 g
5,0 g
40,0 ml
960 ml
Hòa tan casein thủy phân bởi pancreatin và
lecithin đậu tương vào 960 ml nước, đun
cách thuỷ ở 48 °C đến 50 °C khoảng 30
phút cho tan hoàn toàn. Thêm 40 ml
polysorbat 20, trộn đều, phân chia vào các
dụng cụ thích hợp.
Môi trường thạch casein đậu tương
Casein thủy phân bởi pancreatin
Natri clorid
Thạch
Bột đậu tương thủy phân bởi
papain
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 ± 0,2
15,0 g
5,0 g
15,0 g
5,0 g
1000 ml
Môi trường lỏng casein đậu tương
Casein thủy phân bởi pancreatin
Dikali hydrophosphat
Bột đậu tương thuỷ phân bởi
papain
Glucose

Natri clorid
Nước
17,0 g
2,5 g
3,0 g
2,5 g
5,0 g
1000 ml
Hòa tan các chất rắn vào nước đun nóng
nhẹ để tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch ở
nhiệt độ phòng, phân chia vào các bình thích
hợp đã tiệt khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3
± 0,2.
Môi trường thạch muối - manitol
Casein thủy phân bởi pancreatin
Thạch
Pepton
Cao thịt bò
Natri clorid
D-Manitol
Đỏ phenol
Nước
5,0 g
15,0 g
5,0 g
1,0 g
75,0 g
10,0 g
0,025 g
1000 ml

Trộn, đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng
1 phút để tan hoàn toàn, pH sau khi tiệt
khuẩn: 7,4 ± 0,2.
Môi trường thạch Baird - Parker
Casein thủy phân bởi pancreatin
Cao thịt bò
Cao nấm men
Lithi clorid
Thạch
Glycin
Natri pyruvat
Nước
10,0 g
5,0 g
1,0 g
5,0 g
20,0 g
12,0 g
10,0 g
950 ml
Đun nóng, khuấy đều sau đun sôi khoảng 1
phút, tiệt khuẩn, để nguội tới 45 °C đến 50
°C, thêm 10 ml dung dịch kali telurit 1 % vô
khuẩn và 50 ml nhũ dịch lòng đỏ trứng. Trộn
kỹ, nhẹ nhàng rót vào các hộp.
Chế tạo nhũ dịch lòng đỏ trứng bằng cách:
Sát khuẩn toàn bộ bề mặt quả trứng, đập vỡ
quả trứng trong điều kiện vô khuẩn, lấy lòng
đỏ trứng vào ống trụ chia vạch vô khuẩn.
Thêm nước muối sinh lý vô khuẩn để có tỷ lệ

lòng đỏ trứng so với nước muối sinh lý là
3/7. Bỏ vào một cốc khuấy vô khuẩn, trộn với
tốc độ lớn trong 5 phút.
pH sau khi tiệt khuẩn 6,8 ± 0,2.
Môi trường thạch Vogel - Johnson
Casein thủy phân bởi pancreatin
Cao nấm men
Manitol
Natri pyruvat
Thạch
Glycin
Lithi clorid
Dikali hydrophosphat
Đỏ phenol
Nước
10,0 g
5,0 g
10,0 g
10,0 g
16,0 g
10,0 g
5,0 g
5,0 g
25,0 mg
1000 ml
Đun sôi để hòa tan các chất rắn trong
khoảng 1 phút. Tiệt khuẩn, để nguội đến 45
°C đến 50 °C. Thêm 20 ml dung dịch kali
telurit 1 % vô khuẩn.
pH sau khi tiệt khuẩn 7,2 ± 0,2.

Môi trường thạch cetrimid
Gelatin thủy phân bởi pancreatin
Cetrimid (cetyl trimethylamoni
bromid)
Magnesi clorid
Thạch
Glycerin
20,0 g
0,3 g
1,4 g
13,6 g
10,0
ml
Nước 1000
ml
Hòa tan tất cả các chất rắn vào trong nước,
thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi
1 phút cho tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 ± 0,2
Môi trường thạch Pseudomonas để phát
hiện Fluorescin
Casein thủy phân bởi pancreatin
Pepton
Dikali hydrophosphat khan
Magnesi sulfat (MgSO
4
.7H
2
O)
Thạch

Glycerin
Nước
10,0 g
10,0 g
1,5 g
1,5 g
15,0 g
10,0
ml
1000
ml
Hòa tan tất cả các chất rắn vào nước trước
khi thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun
sôi 1 phút cho tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 ± 0,2.
Môi trường thạch Pseudomonas để phát
hiện Pyocyanin
Gelatin thủy phân bởi pancreatin
Kali sunfat khan
Thạch
Magnesi clorid khan
Glycerin
Nước
20,0 g
10,0 g
15,0 g
1,4 g
10,0
ml
1000

ml
Hòa tan các chất rắn trong nước trước khi
thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi
khoảng 1 phút để tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 ± 0,2.
Môi trường lỏng lactose
Cao thịt bò
Lactose
Gelatin thủy phân bởi
pancreatin
Nước
3,0 g
5,0 g
5,0 g
1000 ml
Làm lạnh rất nhanh môi trường sau khi tiệt
khuẩn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 6,9 ± 0,2
Môi trường lỏng selenit - cystin
Casein thủy phân bởi pancreatin
Natri selenit acid
Natri phosphat
Lactose
5,0 g
4,0 g
10,0 g
4,0 g
L- Cystin
Nước
10,0 mg

1000 ml
Đun nóng để tan hoàn toàn. Đun tiếp 15 phút
nữa. Không cần tiệt khuẩn tiếp theo.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,0 ± 0,2
Môi trường lỏng tetrathionat
Casein thủy phân bởi pancreatin
Calci carbonat
Muối mật
Pepton
Natri thiosulfat
Nước
2,5 g
10,0 g
1,0 g
2,5 g
30,0 g
1000 ml
Đun nóng để hòa tan các chất rắn. Khi sử
dụng thêm vào môi trường dung dịch gồm:
5,0 g kali iodid và 6,0 g iod trong 20 ml
nước. Sau đó thêm 10 ml dung dịch xanh
brilliant 0,1 % và trộn đều. Không đun nóng
môi trường sau khi thêm dung dịch xanh
brilliant.
Môi trường thạch xanh brilliant
Pepton
Đường trắng
Cao nấm men
Casein thủy phân bởi
pancreatin

Lactose
Natri clorid
Thạch
Đỏ phenol
Xanh brilliant
Nước
5,0 g
10,0 g
3,0 g
5,0 g
10,0 g
5,0 g
20,0 g
80,0 mg
12,5 mg
1000 ml
Đun sôi để hòa tan tất cả các chất rắn trong
1 phút. Chỉ tiệt khuẩn trước khi dùng. Rót
vào các hộp Petri và để nguội.
pH sau khi tiệt khuẩn: 6,9 ± 0,2
Môi trường thạch xylose - lysin -
desoxycholat
Xylose
Đỏ phenol
L-Lysin
Thạch
Lactose
Natri desoxycholat
Đường trắng
Natri thiosulfat

Natri clorid
Sắt (III) amoni citrat
Cao nấm men
Nước
3,5 g
0,08 g
5,0 g
13,5 g
7,5 g
2,5 g
7,5 g
6,8 g
5,0 g
0,8 g
3,0 g
1000
ml
Đun nóng, lắc tròn để trộn đều chất rắn với nước. Chú ý không để nóng quá. Chuyển ngay vào
bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 50

°C. Rót vào các đĩa ngay trước khi môi trường nguội hoàn
toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,4 ± 0,2
Môi trường thạch bismuth sulfit
Cao thịt bò
Sắt (II) sulfat
Casein thủy phân bởi pancreatin
Bismuth sulfit
Pepton
Thạch

Glucose
Xanh brilliant
Natri phosphat
Nước
5,0 g
0,3 g
5,0 g
8,0 g
5,0 g
20,0 g
5,0 g
25,0
mg
4,0 g
1000 ml
Đun nóng, lắc tròn để hòa đều các chất rắn với nước, không để nóng quá. Chuyển ngay vào bình
cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 50

°C. Rót vào các đĩa để nguội.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,6 ± 0,2
Môi trường thạch - sắt - ba đường
Casein thủy phân bởi pancreatin
Sắt (II) amoni sulfat
Pepton
Natri clorid
Lactose
Natri thiosulfat
Đường trắng
Thạch
D-Glucose monohydrat

Đỏ phenol
Nước
10,0 g
0,2 g
20,0 g
5,0 g
10,0 g
0,3 g
10,0 g
13,0 g
1,0 g
0,025
g
1000 ml
Hòa nóng các chất rắn với nước, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn. Chuyển vào các dụng cụ
thích hợp đã tiệt khuẩn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 ± 0,2
Môi trường Mac - Conkey
Casein thủy phân bởi pancreatin 1,5 g
Natri clorid
Gelatin thủy phân bởi pancreatin
Thạch
Pepton
Lactose
Muối mật
Đỏ trung tính
Tím tinh thể
Nước
5,0 g
17,0 g

13,5 g
1,5 g
10,0
g
1,5 g
30,0
mg
1,0
mg
1000
ml
Hòa nóng các chất rắn với nước, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 ± 0,2
Môi trường thạch Levine - eosin - xanh methylen
Gelatin thủy phân bởi
pancreatin
Dikali hydrophosphat
Thạnh
Lactose
Eosin Y
Xanh methylen
Nước
10,0 g
2,0 g
15,0 g
10,0 g
0,4 g
0,065 g
1000 ml
Hòa tan nóng các thành phần gelatin pancreatic, dikali hydrophosphat và thạch trong nước, để

lạnh. Các thành phần còn lại chỉ thêm vào khi sử dụng bằng cách đun chảy môi trường rồi thêm
vào theo tỷ lệ: Cứ 100 ml môi trường thêm 5 ml dung dịch lactose (1 : 5), 2 ml dung dịch eosin Y (1
: 50) và 2 ml dung dịch xanh methylen (1 : 300). Môi trường sau khi hòa trộn có thể không trong
suốt.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 ± 0,2
Môi trường thạch Sabouraud
Glucose monohydrat
Casein thủy phân bởi
pancreatin
Pepton
Thạch
Nước
40,0 g
5,0 g
5,0 g
15,0 g
1000 ml
Hòa tan, đun sôi cho tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 5,6 ± 0,2
Môi trường Sabouraud lỏng
Glucose 20,0 g
Pepton 5,0 g
Casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g
Nước 1000 ml
pH sau khi tiệt khuẩn: 5,6 ± 0,2
Môi trường thạch - khoai tây - glucose
Nấu 300 g khoai tây đã bóc vỏ và thái nhỏ trong 500 ml nước cất, lọc qua vải, thêm nước cất để
được 1000 ml, rồi thêm vào các thành phần sau: thạch 15,0 g; glucose 20,0 g. Hòa tan nóng. Tiệt
khuẩn. Khi dùng đun nóng chảy, để nguội đến 45

°C. Điều chỉnh môi trường bằng dung dịch acid
tartric (1 : 10) đến pH 3,5 ± 0,1. Rót vào các đĩa.
Chú ý:
Không dùng môi trường đun nóng trở lại lần thứ 2.
Để ức chế vi khuẩn thường gặp mọc trên môi trường phát hiện nấm mốc và nấm men (môi
trường thạch Sabouraud hoặc môi trường thạch - khoai tây - glucose) thêm vào một lít môi
trường 0,1 g tetracyclin hoặc 50 mg cloramphenicol, làm đều ngay trước khi dùng.
Dung dịch đệm phosphat pH 7,2: Hòa 34 g kali dihydrophosphat (TT) vào khoảng 500 ml nước cất
trong bình định mức 1000 ml. Điều chỉnh pH tới 7,2 ± 0,1 bằng cách thêm dung dịch natri hydroxyd
2 %. Thêm nước cất tới vạch. Trộn đều, phân chia vào các bình, tiệt khuẩn, bảo quản ở lạnh. Khi
dùng, hòa loãng với nước cất theo tỷ lệ 1 : 800 và tiệt khuẩn.
Môi trường nước thịt
Cao thịt bò 5,0 g
Nước 1000 ml
Môi trường thạch thường
Pepton
Natri clorid
Thạch
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn
10,0 g
5,0 g
15 đến 20 g
1000 ml
7,4 ± 0,2
Môi trường pepton - natri clorid
Pepton
Natri clorid
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn

10,0 g
5,0 g
1000 ml
7,0 ± 0,2
Môi trường tăng sinh cho Clostridia
Cao thịt bò
Pepton
Cao nấm men
Tinh bột dễ tan
Glucose monohydrat
Cystein hydroclorid
Natri clorid
Natri acetat
Thạch
Nước
10,0 g
10,0 g
3,0 g
1,0 g
5,0 g
0,5 g
5,0 g
3,0 g
0,5 g
1000 ml
Hòa tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Hấp tiệt khuẩn 121

°C trong 15
phút. Nếu cần điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 6,8.
Môi trường thạch Columbia

Casein thủy phân bởi
pancreatin
Cao thịt bò
Tim thủy phân bởi pancreatin
Cao nấm men
Tinh bột ngô
Natri clorid
Thạch bột
Nước cất
10,0 g
5,0 g
3,0 g
5,0 g
1,0 g
5,0 g
15,0 g
1000 ml
Hòa tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Nếu cần điều chỉnh pH sao cho
sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,3 ± 0,2. Hấp tiệt khuẩn 121

°C trong 15 phút. Làm lạnh tới 45

°C đến
50

°C. Khi cần có thể thêm 20 mg gentamycin base và rót vào các hộp Petri.
Môi trường sulfit - lactose
Casein thủy phân bởi
pancreatin
5,0 g

2,5 g
Cao nấm men
Cystein hydroclorid
Natri clorid
Lactose
Nước cất
0,3 g
2,5 g
10,0 g
1000 ml
Hòa tan tất cả các thành phần trong nước và điều chỉnh để có pH 7,1 ± 0,1. Đóng vào các ống
nghiệm 16 mm × 160 mm mỗi ống 8 ml và một ống nhỏ Durham. Hấp tiệt khuẩn 121

°C trong 15
phút. Bảo quản ở 4

°C.
Môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel
Genlatin thủy phân bởi
pancreatin
D-Glucose monohydrat
Mật bò khô
Kali dihydrophosphat
Dinatri hydrophosphat
dihydrat
Xanh brilliant
Nước
10,0 g
5,0 g
20,0 g

2,0 g
8,0 g
15 mg
1000 ml
Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,0 đến 7,4. Đun sôi trong 30 phút và làm lạnh ngay.
Môi trường muối mật violet - red
Cao nấm men
Gelatin thủy phân bởi
pancreatin
Muối mật
Lactose monohydrat
Natri clorid
D-Glucose monohydrat
Đỏ trung tính
Tím tinh thể
Thạch
Nước
3,0 g
7,0 g
1,5 g
10,0 g
5,0 g
10,0 g
30 mg
2 mg
15,0 g
1000 ml
Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,2 đến 7,6. Môi trường được đun sôi để tiệt trùng nhưng
không được hấp tiệt trùng.
Chuẩn bị thí nghiệm

Lấy mẫu
Đối với các thử nghiệm dưới đây, mỗi thử nghiệm lấy 10 ml hoặc 10 g chế phẩm.
Cách thử nghiệm
Một mẫu chế phẩm cần xác định giới hạn vi khuẩn phải thực hiện đầy đủ các thử nghiệm sau:
Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí sống lại được, tính ra số lượng vi khuẩn, nấm có trong 1g hoặc
1 ml chế phẩm.
Thử nghiệm tìm những vi khuẩn gây bệnh sau:
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella
Escherichia coli
Chuẩn bị mẫu
Chế phẩm mang thử nghiệm trong quá trình hòa tan hoặc nhũ hóa phải đảm bảo không làm thay
đổi chủng loại vi khuẩn, nấm có trong thuốc. Để có một dung dịch hoặc nhũ dịch thích hợp cho
thử nghiệm, tiến hành như sau:
Đối với chế phẩm rắn, hòa tan trực tiếp hoặc nghiền mịn chế phẩm trong bình với dung môi hoặc
chất nhũ hóa thích hợp.
Đối với chế phẩm ở dạng lỏng như dung dịch thực, nhũ dịch trong nước, chất rắn hòa tan dễ
dàng và hoàn toàn trong nước , dùng dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc dung dịch natri
clorid 0,9 % để hòa loãng.
Những chế phẩm lỏng không thể hòa lẫn trong nước như dầu, kem hoặc sáp: Chế tạo nhũ dịch
bằng cách thêm một lượng vừa đủ tác nhân nhũ hóa vô khuẩn thích hợp như các loại polysorbat.
Dùng phương pháp khuấy trộn cơ học hoặc đồng thời làm ấm bằng nhiệt nhưng không được
vượt quá 45 °C để có nhũ dịch chế phẩm đồng nhất.
Các chế phẩm ở dạng khí dung - lỏng: Làm lạnh bình để các khí hóa lỏng rồi mở nắp để lấy một
lượng thích hợp mang thử.
Tiến hành
Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí
Đối với chế phẩm hòa tan tốt hoặc tạo thành dung dịch hơi đục, dùng phương pháp đĩa thạch.
Còn các chế phẩm khác dùng phương pháp hòa loãng trong ống nghiệm.

Hòa tan hoặc làm nhũ hóa 10 g hoặc 10 ml chế phẩm vừa đủ trong 100 ml dung dịch đệm
phosphat pH 7,2 hoặc trong 100 ml dung môi thích hợp với từng loại chế phẩm, để được dung
dịch chế phẩm có độ pha loãng ở tỷ lệ 1/10. Đối với những chế phẩm dạng nhầy không thể lấy
chính xác bằng pipet ở tỷ lệ 1/10, có thể pha loãng tiếp để lấy được chính xác, nghĩa là có thể
pha loãng đến tỷ lệ 1/50 hoặc 1/100 v.v
Thực hiện thử nghiệm phát hiện chất ức chế trước khi xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí. Chế
phẩm đã pha loãng phải cho ngay vào môi trường nuôi cấy mà không được để quá 1 giờ.
a) Phương pháp đĩa thạch
Hòa loãng chế phẩm sao cho khi cấy 1 ml dịch chế phẩm vào môi trường trong một hộp Petri, số
khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc. Lấy dung dịch có độ pha loãng cuối cùng cho vào 2
hộp Petri, mỗi hộp 1ml. Thêm vào mỗi hộp 15 ml đến 20 ml môi trường thạch casein đậu tương
hoặc môi trường thạch thường đã đun chảy và để nguội đến 45 °C. Đậy hộp, trộn đều bằng cách
xoay qua, xoay lại. Sau đó để yên cho thạch đông cứng ở nhiệt độ phòng. Lật ngược hộp, mang
ủ ở 30 - 35 °C từ 48 giờ đến 72 giờ. Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số lượng
khuẩn lạc. Lấy giá trị của đĩa có số lượng khuẩn lạc lớn nhất mà số khuẩn lạc trong đĩa không
lớn hơn 300 và tính ra số lượng vi khuẩn trong 1 g hoặc 1 ml chế phẩm. Nếu thấy không có
khuẩn lạc mọc ở đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10 vi khuẩn trong 1 g
hoặc 1 ml.
b) Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm
Cho vào 14 ống nghiệm cỡ thông thường, mỗi ống 9,0 ml môi trường lỏng casein đậu tương. Lấy
một dãy 12 ống chia thành 4 lô, mỗi lô 3 ống. Dùng một lô 3 ống để kiểm tra.
Thêm vào lô 1 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống A) 1 g (hoặc 1 ml) chế phẩm và trộn đều.
Thêm vào lô 2 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống B) 1 ml dung dịch lấy từ ống A và trộn đều.
Thêm vào lô 3 gồm 3 ống, mỗi ống 1 ml dung dịch lấy từ ống B và trộn đều.
Bỏ lượng (hoặc phần) không sử dụng của ống A và ống B.
Theo cách pha trên có lô 1, lô 2, lô 3, tương ứng với lượng chế phẩm là: 100; 10; và 1 mg hoặc
µl trong mỗi ống. Đậy kín các ống mang ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 48 đến 72 giờ, quan sát vi
khuẩn mọc ở các ống chứa chế phẩm, mang đối chiếu với Bảng 13.6.1 để biết số lượng vi khuẩn
có trong 1 g hoặc 1 ml chế phẩm.
Bảng 13.6.1 Số lượng vi khuẩn lớn nhất có thể có trong chế phẩm

Số mg (µl) chế phẩm cho mỗi
ống
Số lượng vi khuẩn lớn
nhất có thể có trong 1 g
hoặc 1 ml
100 10 1
Số ống
có vi
0
0
0
1
0
0
< 3
3
khuẩn
mọc
1
1
0
0
0
1
3
7
1
1
2
2

1
2
0
0
0
0
0
1
7
11
9
14
2
2
2
3
1
1
2
0
0
1
0
0
15
20
21
23
3
3

3
3
0
1
1
2
1
0
1
0
38
43
75
93
3
3
3
3
2
2
3
3
1
2
0
1
150
210
240
460

3
3
3
3
2
3
1100
> 1100
c) Phương pháp màng lọc:
Dùng các màng lọc có kích thước lỗ lọc không lớn hơn 0,45 µm, có khả năng giữ lại các vi khuẩn
cần kiểm tra. Chọn loại màng lọc làm bằng nguyên liệu giữ lại vi khuẩn nhưng không ảnh hưởng
đến mẫu thử. Thí dụ có thể dùng màng celulose nitrat để lọc các dung dịch nước, dầu và cồn
thấp độ. Dùng màng celulose acetat để lọc dung dịch cồn cao độ. Dùng hệ thống lọc có thiết kế
cho phép chuyển được màng lọc vào môi trường nuôi cấy.
Chuyển một lượng thích hợp dung dịch mẫu thử đó pha theo mục “Chuẩn bị mẫu” (tốt nhất là lấy
một lượng dung dịch mẫu tương đương với 1 g hoặc 1 ml mẫu cần thử; nếu lượng vi khuẩn có
nhiều trong mẫu thử, có thể lấy lượng dung dịch mẫu ít hơn). Mỗi mẫu thử cần 2 màng lọc, dung
dịch mẫu thử sau khi chuẩn bị phải được lọc ngay qua màng lọc. Rửa màng lọc 3 lần, mỗi lần
khoảng 100 ml dung dịch thích hợp như dung dịch đệm phosphat pH 7,2. Khi cần có thể thêm
chất hoạt động bề mặt như polysorbat 80 hoặc các chất khử hoạt tính của các chất kháng khuẩn
vào dung dịch dùng để rửa. Cũng có thể rửa màng lọc với số lần ít hơn, nếu thấy đủ loại hết
thuốc và tác nhân ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm khỏi màng lọc. Chuyển một màng lọc lên
môi trường thạch dùng phát hiện vi khuẩn. Ủ ở 30 °C đến 35 °C, theo dõi trong 48 đến 72 giờ,
đếm số khuẩn lạc mọc trên màng lọc. Chuyển màng lọc còn lại lên mặt môi trường phát hiện
nấm. Ủ ở 20 °C đến 25 °C, theo dõi trong 5 ngày, đếm số khuẩn lạc mọc trên màng lọc. Nếu
chắc chắn về thời gian mọc của nấm cần phát hiện thì có thể theo dõi, đếm trong khoảng thời
gian ngắn hơn. Chọn đếm các đĩa có số khuẩn lạc cao nhất ít hơn 100 khuẩn lạc trên màng. Tính
số vi khuẩn hoặc nấm có trong 1 gam hoặc 1 ml mẫu thử.
Mẫu thử là thuốc dạng miếng đắp thấm qua da: Chuyển vô trùng 10 miếng dán vào bình đã có
sẵn 500 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,2, Lắc đều trong 30 phút. Lọc qua 2 màng lọc để tìm vi

khuẩn và nấm mỗi màng 50 ml dung dịch. Tiếp tục ủ, theo dõi, đếm vi khuẩn và nấm như ở trên.
Thử nghiệm tìm các vi khuẩn gây bệnh
a) Tìm Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa
Cho một lượng chế phẩm đã pha loãng tương ứng với 1 g hoặc 1 ml chế phẩm vào 100 ml môi
trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 đến 72 giờ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở
môi trường. Nếu thấy mọc, dùng que cấy lấy môi trường, cấy lên đĩa thạch Vogel - Johnson
(hoặc thạch Baird - Parker hoặc thạch manitol - muối) và môi trường thạch cetrimid. Đậy đĩa, lật
ngược hộp Petri, mang ủ 30 °C đến 35 °C trong 18 đến 72 giờ. Sau khi ủ kiểm tra nếu không
thấy có những khuẩn lạc với đặc tính như ghi trong Bảng 13.6.2 và Bảng 13.6.3 (nêu ở phần
sau) đối với từng môi trường đã sử dụng thì chế phẩm không có Staphylococcus aureus và
Pseudomonas aeruginosa. Nếu thấy có khuẩn lạc nghi ngờ thì tiếp tục làm các phản ứng sinh
hóa của Staphylococcus aureus hoặc Pseudomonas aeruginosa như sau:
*Phản ứng coagulase (đối với Staphylococcus aureus):
Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt thạch Vogel-Johnson (hoặc thạch
Baird - Parker, hoặc thạch manitol - muối) thêm vào từng ống nghiệm, mỗi ống 0,5 ml huyết
tương thỏ hoặc ngựa. Đem ủ 37 °C, kiểm tra các ống sau 3 giờ ủ rồi tiếp tục ủ thêm 24 giờ. Nếu
thấy có đông huyết tương (ở bất kỳ mức độ nào), chế phẩm có Staphylococcus aureus.
Bảng 13.6.2 - Đặc điểm hình thái của Staphylococcus aureus trên các môi trường lựa chọn
Môi
trườn
g
Thạch
Vogel -
Johnson
Thạch
manitol -
muối
Thạch
Baird -
Parker

Đặc
điểm
hình
thái
khuẩn
lạc
Màu đen
được
bao bọc
bằng
một vùng
vàng
Khuẩn
lạc màu
vàng
cùng với
một vùng
vàng
xung
quanh
Khuẩn lạc
màu đen
bóng,
viền
quanh
bằng một
vùng
sáng rõ
2 mm đến
5 mm

*Phản ứng oxydase và sinh sắc tố (đối với Pseudomonas aeruginosa):
Lấy những khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt môi trường thạch cetrimid cấy ria trên mặt môi
trường thạch Pseudomonas phát hiện Fluorescin và môi trường Pseudomonas phát hiện
Pyocyanin trong hộp Petri. Nếu nhiều khuẩn lạc cần được cấy truyền, có thể chia bề mặt hộp
thành bốn phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc lựa chọn. Đậy và lật ngược hộp môi trường đã
cấy truyền và ủ ở (35 + 2)

°C ít nhất 3 ngày kiểm tra đường cấy dưới ánh sáng đèn tử ngoại.
Kiểm tra các đĩa để xác định có khuẩn lạc đặc trưng theo Bảng 13.6.3 hay không. Xác nhận bất
kỳ khuẩn lạc nghi ngờ nào mọc trên một hoặc nhiều môi trường. Phát hiện Pseudomonas
aeruginosa bằng phản ứng oxydase: Nhỏ ngay lên khuẩn lạc hoặc chuyển khuẩn lạc lên một
mẩu (hoặc một khoanh) giấy đã tẩm trước dung dịch N,N-dimethyl-phenylen diamin
dihydroclorid 1 %. Nếu thấy hiện màu đỏ hồng chuyển sang màu tím, chế phẩm có
Pseudomonas aeruginosa. Có thể xác định Pseudomonas aeruginosa bằng các phép thử sinh
hóa và nuôi cấy thích hợp khác.
Bảng 13.6.3 - Đặc điểm hình thái của Pseudomonas aeruginosa trên các môi trường lựa chọn

Môi
trường

Thạch
cetrimid
Thạch
Pseudomonas
để phát hiện
Fluorescin
Thạch
Pseudomonas
để phát hiện
Pyocyanin

Đặc
điểm
hình thái
khuẩn
lạc
Màu lục
nhạt
thông
thường
Không màu
đến màu vàng
nhạt
Màu vàng nhạt
Huỳnh
quang ở
ánh
sáng tia
cực tím
Màu lục Màu hơi vàng
Màu xanh
nước biển
Phản
ứng
oxydase
Dương
tính
Dương tính Dương tính
Nhuộm
Gram
Trực

khuẩn
Gram
âm
Trực khuẩn
Gram âm
Trực khuẩn
Gram âm
b) Tìm Salmonella và Escherichia coli
Cho một lượng chế phẩm đã pha loãng tương ứng với 1 g hoặc 1 ml chế phẩm vào khoảng 100
ml môi trường lỏng lactose, ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra nếu có vi khuẩn
mọc, lắc nhẹ nhàng. Lấy 1 ml cho vào một ống chứa sẵn 10 ml hỗn hợp môi trường lỏng selenit -
cystin và môi trường lỏng tetrathionat, trộn đều, ủ trong 18 giờ đến 24 giờ. Phần còn lại của môi
trường lactose sẽ dùng để tìm Escherichia coli.
Tìm Salmonella: Lấy một quai cấy từ canh thang selenit cystin và tetrathionat ria lên mặt môi
trường thạch xanh brilliant, môi trường thạch xylose-lysin-deoxycholat, môi trường thạch bismuth
sulfit trong các đĩa Petri. Đậy đĩa, lật ngược, ủ ở 35 °C đến 37 °C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra,
nếu không thấy khuẩn lạc có dạng như mô tả ở Bảng 13.6.4, chế phẩm không chứa Salmonella.
Bảng 13.6.4 - Đặc điểm hình thái của Salmonella trên môi trường lựa chọn
Môi trường
Mô tả
khuẩn lạc
Thạch xanh brilliant
Khuẩn lạc không
màu hoặc màu
hồng nhạt tới trắng
đục, nhỏ, rõ nét
(thường bao quanh
bằng một vùng màu
hồng tới đỏ)
Thạch xylose - lysin -

desoxycholat
Khuẩn lạc màu đỏ,
có thể chấm đen ở
trung tâm
Thạch bismuth sulfit
Khuẩn lạc màu đen
hoặc màu xanh
Nếu thấy khuẩn lạc có dạng như mô tả ở Bảng 13.6.4, đem nhuộm soi thấy gồm những trực
khuẩn hình gậy, Gram âm, thực hiện tiếp bằng cách chuyển khuẩn lạc nghi ngờ riêng biệt sang
ống môi trường thạch - sắt - ba đường (nghiêng). Trước tiên cấy ria trên mặt thạch nghiêng, sau
cấy sâu xuống phần đứng của thạch, ủ ở 35 °C đến 37 °C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra nếu
không thấy môi trường bị kiềm hóa (màu đỏ) ở phần nghiêng và acid hóa (màu vàng) phần dựng
đứng, có hoặc không có kèm theo màu đen ở phần dựng đứng do sinh H
2
S, chế phẩm không
chứa Salmonella.
Tìm Escherichia coli:
Cấy ria một quai cấy từ môi trường lactose đã có vi khuẩn mọc lên trên bề mặt môi trường thạch
Mac - Conkey. Đậy nắp, lật ngược hộp, ủ ở 35 °C đến 37 °C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra nếu
không có khuẩn lạc phù hợp với mô tả ở Bảng 13.6.5 thì chế phẩm không có Escherichia coli.
Nếu có khuẩn lạc phù hợp với mô tả ở bảng 13.6.5 thì chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt thạch
Levine - eosin - xanh methylen trong các đĩa Petri. Nếu có nhiều khuẩn lạc nghi ngờ, chia đĩa
thành 4 phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc đã lựa chọn. Đậy đĩa, lật ngược, ủ ở 35 °C đến
37 °C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra nếu không có những khuẩn lạc thể hiện cả hai đặc tính ánh
kim dưới ánh sáng phản chiếu, và màu đen xuất hiện ở ánh sáng truyền qua, chế phẩm không
có Escherichia coli. Kết hợp các phản ứng thử nghiệm sinh hóa và đặc điểm nuôi cấy để kết luận
sự có mặt của Escherichia coli trong chế phẩm.
Bảng 13.6.5 - Đặc điểm hình thái của Escherichia coli trên môi trường thạch Mac - Conkey
Đặc điểm hình thái
khuẩn lạc

Khuẩn lạc màu đỏ
gạch, có thể có vùng
mật kết tủa bao
quanh
Nhuộm Gram Trực khuẩn Gram âm
c) Enterobacteria và các vi khuẩn Gram âm khác
Phát hiện vi khuẩn: Làm đồng nhất chế phẩm đem kiểm tra bằng cách xử lý một lượng thích hợp
như đã mô tả ở phần chuẩn bị mẫu và ủ ở 35 °C đến 37 °C trong một thời gian thích hợp (th-
ường từ 2 giờ đến không quá 5 giờ) trong môi trường canh thang lactose để phục hồi lại vi khuẩn
mà không làm tăng số lượng vi khuẩn. Lắc bình chứa và chuyển một lượng đã đồng nhất của
chế phẩm tương đương khoảng 1 g hoặc 1 ml chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng
Enterobacteria- Mossel và ủ ở 35 °C đến 37 °C trong 18 giờ đến 24 giờ. Cấy lên đĩa thạch muối
mật violet-red ủ ở 35 °C đến 37 °C trong 18 giờ đến 48 giờ. Chế phẩm không có Enterobacteria
nếu không thấy mọc những khuẩn lạc vi khuẩn Gram âm trên đĩa.
Đánh giá số lượng: Ủ một lượng thích hợp môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel với những l-
ượng chế phẩm đem kiểm tra đã được làm đồng nhất chứa 0,2 g; 0,02 g và 2 mg hoặc 0,2 ml;
0,02 ml và 2 µl. Nếu cần có thể pha loãng chế phẩm, ủ ở 35 °C đến 37 °C trong 24 giờ đến 48
giờ. Các khuẩn lạc đã phát triển tốt thường đỏ hoặc hơi đỏ, nhuộm vi khuẩn bắt màu Gram âm,
chứng tỏ kết quả dương tính. Ghi lượng nhỏ nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả dương tính
và lượng lớn nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả âm tính. Xác định số lượng vi khuẩn theo
Bảng 13.6.6.
Bảng 13.6.6- Tính lượng vi khuẩn trong chế phẩm
Kết quả đối với mỗi lượng
sản phẩm
Số vi
khuẩn
có trong 1
0,2 g
hoặc
0,2 ml

0,02 g
hoặc
0,02 ml
0,002 g
hoặc
0,002 ml
+ + + Lớn hơn
500
+ + - Ít hơn 500
nhưng lớn
hơn 50
+ - - Ít hơn 50
nhưng lớn
hơn 5
- - - Ít hơn 5
Đếm tổng số nấm mốc, và nấm men
Dùng phương pháp đĩa thạch tương tự như đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, nhưng sử dụng môi
trường thạch Sabouraud hoặc môi trường thạch - khoai tây- glucose, ủ các đĩa ở nhiệt độ ở 20
°C đến 25 °C, theo dõi trong 5 ngày.
Tìm Clostridia
Thử nghiệm thứ nhất dùng cho những sản phẩm qui định không có Clostridia. Thử nghiệm thứ
hai là bán định lượng đối với Clostridium perfringens áp dụng với những sản phẩm có tiêu chuẩn
về số lượng Clostridium perfringens.
Thử nghiệm tìm Clostridia
Chuẩn bị mẫu thử như trong mục “chuẩn bị thí nghiệm”. Chuẩn bị hai mẫu, mỗi mẫu khoảng 1 g
(ml). Một mẫu đem đun nóng tới 80 °C trong 10 phút rồi làm lạnh ngay. Thêm vào mỗi mẫu 100
ml môi trường tăng sinh cho Clostridia. Ủ cả hai mẫu ở điều kiện kỵ khí, ở 35 °C đến 37 °C trong
48 giờ. Sau khi ủ từ mỗi bình cấy chuyển sang một ống môi trường thạch Columbia đã thêm
gentamycin và tiếp tục ủ ở điều kiện kỵ khí ở 35 °C đến 37 °C trong 48 giờ. Nếu không thấy có vi
khuẩn mọc, mẫu thử đạt yêu cầu.

Khi thấy vi khuẩn mọc, chọn một khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trường thạch
Columbia không có gentamycin và ủ ở hai điều kiện kỵ khí và hiếu khí. Khi chỉ thấy vi khuẩn mọc
ở điều kiện kỵ khí, trực khuẩn Gram dương (có hoặc không có nội bào tử); phản ứng catalase âm
tính tức là chế phẩm có Clostridium spp. Nếu cần, có thể so sánh hình thái của khuẩn lạc trên hai
đĩa và dùng thử nghiệm catalase để loại trừ loài Bacillus spp. hiếu khí và kỵ khí tùy tiện có phản
ứng catalase dương tính. Thử nghiệm này có thể thực hiện ngay trên những khuẩn lạc riêng biệt
trên môi trường hoặc bằng cách chuyển vi khuẩn lên trên phiến kính và nhỏ dung dịch nước oxy
già loãng, nếu thấy có sủi bọt nghĩa là phản ứng catalase dương tính.
Đếm Clostridium perfringens
Tạo mẫu thử như mô tả ở mục “chuẩn bị thí nghiệm”. Pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat
pH 7,2 đến các dung dịch chế phẩm có nồng độ 10
-2
, 10
-3
. Tiến hành xác định tổng số vi khuẩn
giống như xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được mục “Tiến hành”. Mỗi lần chuyển 1
ml đã làm đồng nhất sang một ống chứa sẵn 9 ml môi trường sulfit - lactose và một ống nhỏ
Durham. Lắc nhẹ nhàng và đem ủ ở (46 ± 0,5) °C trong khoảng 24 giờ đến 48 giờ.
Các ống có màu đen (sắt sulfid) và sinh hơi trong ống Durham (ít nhất 1/10 thể tích) là có
Clostridium perfringens. Tính lượng Clostridium perfringens theo Bảng 13.6.1.
Những loài vi khuẩn dùng để kiểm tra đối chứng:
Thử nghiệm thứ 1: Clostridium sporogenes ATCC 19404 và NCTC 532
Thử nghiệm thứ 2: Clostridium perfringens ATCC 13124 và NCTC 8237
Nếu cần, kết hợp với dùng Clostridium sporogenes để kiểm tra điều kiện nhạy cảm và điều kiện
kỵ khí.
Lặp lại thí nghiệm
Khi nghi ngờ, cần được thử nghiệm lại như hướng dẫn ở trên với một lượng chế phẩm tăng gấp
đôi.
Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn
Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng thì giới hạn nhiễm khuẩn cho các loại thuốc có

quá trình sản xuất không tiệt khuẩn như sau:
Bảng 13.6.7 - Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn
Mức Loại chế phẩm Yêu cầu
1 Các chế phẩm dùng
cho bỏng và các vết
loét sâu
Không có các vi sinh vật có thể sống lại trong 1 g (ml) mẫu thử
2 Các chế phẩm dùng tại
chỗ như chữa sưng
tấy, tổn thương, và các
Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đuợc không quá 100 trong 1
g (ml)
Mẫu thử phải không có Enterobacteria, Pseudomonas
màng nhầy (mũi, họng,
tai, âm đạo )
aeruginosa, Staphylococcus aureus, nấm trong 1 g (ml)
3 Các chế phẩm dùng tại
chỗ cho da như kem
bôi, nước thơm, dầu,
dung dịch, bột
Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 500 trong 1
g (ml)
Mẫu thử phải không có Enterobacteria, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, nấm trong 1 g (ml)
4 Các chế phẩm dùng
uống; qua trực tràng;
thấm qua da.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 10
4
trong 1

g (ml)
Tổng số Enterobacteria không quá 500 trong 1 g (ml)
Nấm không quá 100 trong
1 g (ml)
Mẫu thử phải không có Escherichia coli, Salmonella,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus trong 1 g
(ml)
5 Các chế phẩm có chứa
các nguyên liệu có
nguồn gốc thực vật,
động vật không thể xử
lí theo qui trình làm
giảm lượng vi khuẩn.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 5.10
4
trong
1 g (ml)
Nấm không quá 500 trong
1 g (ml)
Tổng số Enterobacteria không quá 500 trong 1 g (ml)
Mẫu thử phải không có Escherichia coli, Salmonella,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus trong 1 g
(ml)