nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc 2005 và bằng đo quang phổ hấp thụ UV -VIS theo dược điển Việt Nam III

Website: Email : Tel : 0918.775.368
đặt vấn đề
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều
loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau.
Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1].
Berberin đợc biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli, điều
trị bệnh lỵ. Thuốc đợc sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn,
không ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của vi khuẩn có ích ở ruột.
Hiện nay trên thị trờng có các dạng bào chế của Berberin nh: thuốc nhỏ
mắt, viên nén, viên bao . Vì vậy vấn đề kiểm tra chất l ợng nguyên liệu làm
thuốc cũng nh thành phẩm là rất quan trọng.
Dợc điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên
liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ tử
ngoại UV- VIS, dợc điển Trung Quốc (2005) định lợng Berberin bằng HPLC.
Để có cơ sở lựa chọn phơng pháp định lợng Berberin thích hợp, chúng tôi đã
tiến hành thực hiện đề tài : So sánh hai phơng pháp định lợng Berberin
nguyên liệu bằng HPLC theo dợc điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang
phổ hấp thụ UV-VIS theo dợc điển Việt Nam III với những mục tiêu sau:
Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng HPLC
theo dợc điển Trung Quốc (2005)
Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng đo
quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
So sánh hai phơng pháp định lợng trên để tìm phơng pháp thích
hợp cho việc định lợng berberin trong các cơ sở kiểm tra chất lợng
thuốc trong nớc.
PHầN I. TổNG QUAn
1
Website: Email : Tel : 0918.775.368
1.1. vài nét Về BERBERIN:
1.1.1. Cấu trúc:
Beberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có khung

protoberberin[1]. Isoquinolin còn đợc gọi là benzo[c] pyridin hay 2- benzamin
là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic[18]
Cấu trúc của isoquinolin
Công thức cấu tạo:

Công thức phân tử: C
20
H
18
NO
4
+ PTL: 336.36
Tên khoa học : 5,6 dihydro 8,9 dimethoxy 1,3 dioxa 6a
azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6]
1.1.2. Nguồn gốc: Berberin thờng có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây
thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin có nhiều
trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so
với alcaloid toàn phần [9].
Berberin thờng có lẫn các tạp chất alcaloid khác nh: palmatin,
jatrorrhizin. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5
% [6],[13].
2
Website: Email : Tel : 0918.775.368
1.1.3. Tính chất
- Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng. Tan trong nớc nóng,
khó tan trong ethanol và nớc lạnh, rất khó tan trong cloroform, không tan trong
ether.[6]
1.5. Tác dụng dợc lý:
- Berberin có tác dụng kháng vi trùng nh: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu và
liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùng

gây bệnh (kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đờng ruột) [12], [17].
- Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệt khi dùng sẽ không
ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của hệ vi khuẩn có ích ở ruột, khi dùng
phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởi các
thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đờng ruột [17].
- Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co
cơ, giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đờng, ức chế cơn nhịp nhanh thất,
giảm viêm cho ngời bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất huyết, giảm
tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin[17].

Chỉ định: [9],[12],[17]
- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật và
đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt.
- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài( do nắng, gió,
lạnh, bụi, khói ) và điều trị bệnh đau mắt hột.
- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.
1.1.6. Chống chỉ định: [17]
- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin
- Ngời dị ứng với berberin ( rất hiếm gặp)
1.1.7. Dạng thuốc và hàm lợng: [11]
3
Website: Email : Tel : 0918.775.368
- Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lợng 10 mg, hoặc 50-100
mg/ viên
- Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích
bên ngoài (gió, nắng, lạnh, bụi, khói)
1.2. Một số phơng pháp định lợng Berberin:
1.2.1. Phơng pháp thể tích: [5], [13]
Hòa tan 0,3g chế phẩm (chính xác) vào trong cốc với 150ml nớc đang sôi.
Làm nguội, chuyển dung dịch vào bình định mức 250ml. Lấy chính xác 50ml

dung dịch kali dicromat 0,1N rồi thêm nớc tới vạch. Lắc đều trong 5 phút, lọc
qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 100ml dịch lọc cho vào
bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, lắc cho tan, sau đó thêm 10 ml
dung dịch acid hydrochloric 16%, đậy kín, lắc đều, để vào bóng tối trong 10
phút. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1N, gần điểm tơng đơng thêm
2ml dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi màu xanh biến mất
thì dừng.
Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều kiện.
1ml dung dịch kali dicromat 0,1N tơng ứng với 12,39 mg C
20
H
18
NO
4
Cl.
1.2.2. Phơng pháp đo UV-vis
Phơng pháp 1:[6].
* Dung dịch thử: Cân 0.200 g chế phẩm và hòa tan trong 200ml nớc bằng
cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nớc đến 1000ml. Lấy 10ml dung dịch
này pha loãng với nớc đến 100ml.
* Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,200 g Kali dicromat thuốc thử
chuẩn đã sấy khô ở 110
0
C trong 4 giờ, hòa tan trong nớc. Thêm 10ml dung dịch
acid sulfuric 1N và thêm nớc vừa đủ 1000ml.
* Đo độ hấp thụ: Đo At và As của dunh dịch thử và dung dịch chuẩn ở b-
ớc sóng 421 nm.
* Cách tính: Lợng ( mg) của C
20
H

18
NO
4
Cl đợc tính bằng công thức sau:
4
Website: Email : Tel : 0918.775.368

a
As
At
P
ìì=
006,1
1
a: khối lợng ( mg) kali dichromat.
Phơng pháp 2 [6]
Xác định hàm lợng berberin clorid trong viên nén.
* Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lợng trung bình và nghiền thành bột
mịn. Cân chính xác một lợng bột viên tơng đơng với khoảng 80 mg berberin
clorid, thêm 10ml nớc để thấm đều bột viên, sau đó thêm khoảng 200ml nớc sôi,
khuấy kĩ 5 phút, để nguội rồi chuyển vào bình định mức 500ml, thêm nớc tới
vạch, lắc đều. Để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm. Lấy chính xác 5ml dung dịch
trong ở trên đem pha loãng với nớc cất vừa đủ 100ml.
* Dung dịch chuẩn : pha tơng tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu
berberin clorid.
* Mẫu trắng: nớc cất.
* Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn trong cùng điều
kiện tại bớc sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy 1 cm.
1.2.3. Phơng pháp cân [5]
áp dụng để định lợng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo tủa

của berberin với acid picric.
Cân 20 viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lợng bột viên t-
ơng ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml, thêm
khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, rồi thêm methanol
đến ngấn. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu. Lấy đúng
100ml dịch lọc. Làm bay hơi cho đến khô trên cách thủy, thêm 150ml dung
dịch NaOH 0,1N và 90ml nớc, đun nóng. Lắc kỹ để hòa tan. Để nguội rồi lọc
qua giấy lọc đã thấm ớt. Rửa phễu và giấy lọc 3 lần, mỗi lần 10ml nớc.
Gộp dịch lọc và nớc rửa, thêm 10ml dung dịch acid hydroclorid 0,1N rồi
tiếp tục cho ngay và từ từ 30ml dung dịch bão hòa acid picric ( TT). Lắc đều.
5
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Để yên qua một đêm, lọc qua phễu thủy tinh xốp có đờng kính lỗ xốp 10
16 àm ( đã cân bì) để lấy tủa. Rửa tủa 3 lần với nớc cất ở khoảng 15
0
C, mỗi
lần 15ml nớc, hút kiệt nớc rồi sấy khô phễu và tủa ở 100
0
C đến khối lợng không
đổi. Khối lợng tủa xác định là P (g).
1 g tủa tơng ứng với 0,6586 g C
20
H
18
NO
4
Cl.
1.2.4. Phơng pháp HPLC
Phơng pháp 1:[14], [15].
* Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Cột thép không gỉ ( 25cm x 4 mm) đợc nhồi bởi hạt silicagel đã đ-
ợc octadecylsilan hóa có đờng kính 5 àm.
- Nhiệt độ cột: 40
0
C.
- Pha động: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat và 1,7g natri laurylsulfat trong
1000 ml hỗn hợp dung môi nớc và acetonitril (1:1).
- Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lu của berberin khoảng
10 phút.
- Detector UV ở bớc sóng 345 nm.
- Thể tích tiêm: 10 àl.
- Nồng độ dung dịch thử và chuẩn: 0,1mg/ml và cách tiến hành pha 2 dung dịch
này giống nhau.
* Tiến hành:
Lần lợt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin
trong các dung dịch thử , chuẩn và hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng
berberin trong chế phẩm.
* Cách tính: Lợng W
t
(mg) của berberin clorid (C
20
H
18
ClNO
4
).
W
t
= W
s

x (A
t
/ A
s
)
W
s
= Lợng (mg) của berberin chuẩn, tính theo lợng khan.
6
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Phơng pháp 2: [13]
* Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Cột đợc nhồi bởi các hạt silicagel đã đợc octadecylsilan hóa.
- Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kali
dihydrophosphat với 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chứa 0,2%
triethylamin, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric] và acetonitril (60:40).
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút.
- Detector UV ở bớc sóng 263 nm.
- Thể tích tiêm: 20 àl
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 32 àg/ml
* Tiến hành:
Lần lợt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin
trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng berberin có
trong chế phẩm.
Phơng pháp 3: [16]
* Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Cột Hypersil C18 ( 5 àm, 25 cm x 4,6 mm)
- Pha động: Acid phosphoric 0,04 mol/l acetonitril ( 58: 42).
- Tốc độ dòng: 1ml/phút.
- Detector UV ở bớc sóng 349 nm.

* Tiến hành: Tơng tự nh 2 phơng pháp HPLC đã trình bày ở trên.
1.3. Tổng quan Phơng pháp hplc
1.3.1. Nguyên tắc
Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và
định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất
với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu
năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất
7
Website: Email : Tel : 0918.775.368
cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy
thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha
động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha,
chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là
detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đợc hiển thị
trên màn hình hoặc đa ra máy in. [8]
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một
tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ ra khỏi cột.
Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách đợc
các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc
đồ. [8], [11]
1.3.3. Các thông số đặc trng của quá trình sắc ký:
Kết quả của quá trình sắc kí đợc detector phát hiện, phóng đại và ghi
thành sắc ký đồ( hình 1):


t
t

W
b2
0.5-2
W
0.5-1
W
b1
W
R2
R2
t'
t'
R1
R1
t
o
Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trng
8
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Trong đó :
t
o
(thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách
t
R
(thời gian lu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích đợc bơm vào cột
cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích.
t
R
(thời gian lu thực ) = t

R
- t
o.
W
0,5
: Độ rộng pic ở nửa chiều cao
W
b
: Độ rộng đáy pic.
1.3.2.1. Hệ số dung lợng k

[8]
Nếu k' nhỏ thì
t
R
cũng nhỏ và sự
tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ đợc
tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau.
1.3.2.2 Độ chọn lọc

(selectivity - factor)
=
tt
tt
'k
'k
01R
02R
1
2

=
(k
2
'
> k
1
'
) [4], [8]
khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối u từ 1,5 đến 2.
1.3.2.3. Độ phân giải (resolution)
Đặc trng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc
ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau đợc tính theo công thức:
=
R
( ) ( )

=
+

=
+

+
'k1
'k
ww
tt
ww
tt
B
B
A2/1B2/1
A,RB,R
AB
A,RB,R
1
4
N
18,12
[4], [8]
Độ phân giải cơ bản đạt đợc khi R = 1,5
1.3.2.4. Hệ số bất đối AF
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó đợc tính theo công thức:

9
1
t
t
t
tt
t
't
'k
0
R
0
0R
0
R
=

==
Website: Email : Tel : 0918.775.368
a2
AF
w
20/1
=
[4], [8]
Trong đó:
W
1/20
: là chiều rộng của pic đợc đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đờng

cong phía trớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lợng đợc chấp
nhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tợng kéo đuôi càng rõ. Hiện tợng đỉnh kéo
đuôi (tailing peak) có thể là do tơng tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh hoặc
cột sắc ký bẩn. Đỉnh kéo tuyến trớc (fronting peak) có thể do lợng mẫu đa vào
quá lớn so với năng lực cột [7].
1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N
Đặc trng cho hiệu lực cột.
N = 16






w
t
B
R
2
hay N=5,54






w
t
B2/1

R
2
[4], [8]
Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H đợc
tính bằng công thức:
=
H
N
L
1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8]
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm
6 bộ phận chính sau:
a/Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh đợc áp suất (0 -
400 bar)
a/ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
10
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Bình chứa dung môi thờng bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi
chạy sắc ký đợc lọc qua màng lọc (thờng màng lọc cỡ lỗ 0,45 àm ) và đuổi khí
hòa tan.
c/ Hệ tiêm mẫu
Để đa mẫu phân tích vào cột.
Có nhiều phơng pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một
van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.
Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể đợc tiêm ngay sau khi lọc loại tạp
qua màng lọc 0,45 àm, còn mẫu rắn cần hòa tan trong 1 dung môi
thích hợp.
d/ Cột sắc ký lỏng HPLC
Cột đợc chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu đợc với áp suất

cao đến vài trăm bar.
- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh
có đờng kính rất nhỏ (3, 5, 10 àm).
- Đờng kính cột: 4 hoặc 4,6 mm.
e/ Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ
UV - VIS. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa.
f/ Thiết bị hiển thị kết quả
Có nhiều loại nhng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín hiệu
đo dới dạng pic.
Sơ đồ khối hệ thống HPLC đợc tổng quát ở hình 2
11
Cột
Binh
chứa
pha
động
BơmVan tiêm
mẫu
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC
1.3.5. Cách đánh giá pic[7]
* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tơng ứng với tổng lợng
chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay ngời ta thờng dùng máy tích phân điện
tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số
1,3 %). Phơng pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đờng nền và cả
pic có đờng nền bị trôi. Phơng pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic đợc
nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao.
* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic

(khoảng cách giữa đờng nền và đỉnh pic) là một đại lợng tỷ lệ với diện tích pic
và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ. Phơng pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số
k
'
là hằng định.
* Với pic có đờng nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao
pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.
1.4.Tổng quan PHƯƠNG PHáP QUANG PHổ HấP THụ UV-VIS
1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6]
1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bớc sóng và cờng độ I
o
qua dung
dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l. Khi đi qua dung
dịch ,một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì đi
qua dung dịch .
Mối quan hệ giữa I và I
o
đợc thể hiện bằng định luật Lambert-Beer.
12
Detector Bộ phận tự ghi
Website: Email : Tel : 0918.775.368
I = I
o

ì

10
-

Cl
Với là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc vào
nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bớc sóng của ánh sáng chiếu
vào dung dịch.
1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert beer
+ Chùm tia sáng phải đơn sắc
+ Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp)
+ Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang).
+ Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền duới tác dụng của ánh
sáng (UV-VIS).
1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer
+ Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) nh do
tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém.
+ Sai lệch do hoá học:
- Do sự phân ly (ion hoá): thờng gặp khi pha loãng dung dịch, phân tử chất
tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly không nh
nhau.
- Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác dạng
đơn phân tử.
+ Do phản ứng các chất lạ:
- Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện t-
ợng này xảy ra, ngời ta dùng mẫu trắng có thành phần nh dung dịch, chỉ thiếu
chất cần định lợng.
- Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hởng tới kết quả định l-
ợng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng tạo màu, phải chú ý tới điều kiện
phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng.
1.4.1.4. Một số đại lợng thông dụng[
a/ Độ truyền qua (T-Transmittance):
13
Website: Email : Tel : 0918.775.368

Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang) đặc trng cho độ trong suốt
(về mặt quang học) của dung dịch, đợc định nghĩa:
T =
0
t
I
I
= 10
-

Cl
Thờng T tính ra phần trăm (%). Một chất có T=1(hay100%), nghĩa là hoàn
toàn không có hấp thụ ánh sáng, ngời ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt.
b/ Độ hấp thụ (A-Absorbance):
Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) đợc định nghĩa :
A = lg
1
T
= .C.l
Đối với một chất xác định (có xác định), thờng đo trên một loại cốc đo
(có bề dày thông thờng là l=1 cm), nh vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ
dung dịch:
A=K.C (K=.l)
c/ Hệ số hâp thụ phần trăm (
1
1%
cm
E
):
Theo công thức A =.C.l, nếu l=1 cm, C=1% thì :

A = =
1
1%
cm
E
Vậy
1
1%
cm
E
chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo
có bề dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một xác định,
1
1%
cm
E
là một hằng
số.
d/ Hệ số hấp thụ phân tử (

):
Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của dung
dịch có nồng độ 1M/l, dùng cốc đo có bề dày1cm.
Cũng nh
1
1%
cm
E
, với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác định
(, dung môi, nhiệt độ,...)

là một hằng số.
Giữa
1
1%
cm
E
và

có mối liên hệ

=
1
1%
10
cm
E
ì

M
14
Website: Email : Tel : 0918.775.368
ở đây M là phân tử gam của chất tan.
1.4.2. Một số kỹ thuật định lợng bằng phơng pháp quang phổ UV-VIS.[2],
[4],[8]
1.4.2.1. Phơng pháp đo phổ trực tiếp:
Đo độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ C của dung dịch dựa vào giá trị
1
1%
cm

E
biết trớc (tra cứu).
A =
1
1%
cm
E
.C.l C =
1
1%
cm
A
E
(với l =1 cm)
Trong phơng pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bớc sóng () và mật
độ quang A bằng cách:
Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D
2
(cho một vạch sáng có bớc sóng xác định).
Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.
Dùng một kính lọc Holmium (có các giá trị
max
xác định cho trong tài
liệu )để kiểm tra lại máy.
Dùng dung dịch K
2
CrO
4
, K
2

Cr
2
O
7
tinh khiết quang phổ pha thành dung
dịch có nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị
max
và tìm A
max .
1.4.2.2. Phơng

pháp so sánh
Đo độ hấp thụ A
x
, A
c
của dung dịch thử có nồng độ C
x
(cha biết) và của
dung dịch chuẩn có nồng độ A
c
(đã biết).
Ta có:
x
c
A
A
=
x
C

c
C
C
x
=


x
c
A
A
x C
c
Chú ý: nồng độ của dung dịch thử C
x
và của dung dịch chuẩn C
c
không đợc
chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết quả
càng chính xác.
15