Báo cáo khoa học : Chế tạo bộ kít xác định nhanh peroxit trong dầu ăn và một số thực phẩm chế biến

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH


CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ


BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 24 /06/ 2011)









CHẾ TẠO BỘ KIT XÁC ĐỊNH NHANH
PEROXIT TRONG DẦU ĂN VÀ MỘT SỐ
THỰC PHẨM CHẾ BIẾN







CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: NGUYỄN THỊ THANH MAI
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 10/ 2011

1

BÁO CÁO NGHIỆM THU



Tên đề tài: CHẾ TẠO BỘ KIT XÁC ĐỊNH NHANH PEROXIT TRONG DẦU ĂN VÀ
MỘT SỐ THỰC PHẨM CHẾ BIẾN
Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN THỊ THANH MAI
Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ
Thời gian thực hiện đề tài: 11/2008 – 6/2010
Kinh phí đƣợc duyệt: 80.000.000 đồng
Kinh phí đã cấp: 59.000.000 đồng
Mục tiêu:
Nghiên cứu xây dựng bộ kit xác định nhanh hàm lƣợng peroxit trong dầu ăn và
một số thực phẩm chế biến với mục tiêu giúp các cơ quan quản lý kiểm tra nhanh đƣợc
an toàn vệ sinh thực phẩm tại các cơ sở sản xuất, giúp các đơn vị chế biến thực phẩm,
nhà hàng, quán ăn và cả ngƣời tiêu dùng kiểm tra đƣợc chất lƣợng của các sản phẩm mà
họ cung cấp hay tiêu thụ, nhằm đảm bảo sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.

Nội dung:
 Xây dựng và tối ƣu hóa qui trình xác định hàm lƣợng peroxit với đối tƣợng mẫu
là dầu ăn và các loại thực phẩm trong phòng thí nghiệm.
 Nghiên cứu chế tạo hai bộ kit xác định nhanh hàm lƣợng peroxit: Bộ kit so màu
bằng mắt sử dụng cho đối tƣợng mẫu là dầu ăn; bộ kit đo màu bằng máy sử
dụng cho đối tƣợng mẫu là dầu ăn và một số thực phẩm chế biến.
 Kiểm tra đối chứng kết quả xác định giữa bộ kít với phƣơng pháp trọng tài
AOAC.
2

Tóm tắt
Peroxid là sản phẩm sơ cấp của quá trình oxy hóa lipid, thƣờng đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp chuẩn độ iod của AOCS. Tuy nhiên phƣơng pháp này bị ảnh hƣởng bởi
chất nền, oxy không khí, điểm cuối chuẩn độ khó nhận biết. Đề tài này đã sử dụng
phƣơng pháp chiết-trắc quang để xác định peroxid trong dầu mỡ và thực phẩm chế biến
dựa trên nguyên tắc là dùng Fe
2+
khử peroxid

trong môi trƣờng acid, lƣợng Fe
3+
sinh ra
sẽ tạo phức với SCN
-
, phức Fe(SCN)
6
3-
sẽ ghép cặp với CTMA
(cetyltrimethylammonium bromide) và đƣợc chiết bằng etylacetate. Kết quả cho thấy,
phƣơng pháp này có độ nhạy cao, phản ứng xảy ra nhanh, có độ tƣơng quan cao so với

phƣơng pháp AOCS (r=0,991; SDD=0,34meq/kg). Trên cơ sở phƣơng pháp đề nghị đã
phát triển hai bộ kit: so màu bằng mắt và đo màu bằng máy quang tự chế, trong đó bộ
kit so màu bằng mắt có khả năng bán định lƣợng tốt, có màu thay đổi trong 3 khoảng
giới hạn của chỉ số PV; còn bộ kit đo màu bằng máy tự chế thì có độ tƣơng quan cao so
với phƣơng pháp AOCS.
Từ khóa: Peroxid, AOCS, Bộ kit


Abstract
The primary products of lipid oxidation are peroxides, which are usually determined
using official iodometric method (AOCS), although some interference and difficulty in
determine the titration endpoint can lead to imprecise results. This study was based on
an extraction spectrophotometric method for determination peroxide through ion-pair
formation between cetyltrimethylammonium (CTMA) and iron thiocyanate complex in
ethylacetate. The result showed that this method had LOD and LOQ smaller than that
of method without CTMA and high correlation with AOCS official method (r = 0,991;
SDD = 0.34meq/kg). Basing on the suggested method, we developed 2 test kits: visual
and using colorimeter, in which the colour change of the visual kit in 3 peroxide value
ranges is clearly, while the colorimeter kit has high correlation with AOCS method.

Keyword: Peroxide, AOCS, test kit

3

MỤC LỤC

Tóm tắt
2

Mục lục

3

Danh sách các chữ viết tắt
6

Danh sách bảng
7

Danh sách đồ thị
8

Danh sách sơ đồ
9

Danh sách hình
10
I.
TỔNG QUAN
11
I.1.
Giới thiệu chung về dầu mỡ
12
I.1.1.
Về mặt hóa học
12
I.1.2.
Về mặt vật lý
12
I.1.3.
Về mặt sinh học

13
I.1.4.
Chức năng chính của dầu mỡ trong cơ thể
13
I.1.5.
Các chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng dầu, mỡ
14
I.2.
Sự oxi hóa của dầu mỡ
14
I.2.1.
Các chỉ tiêu thông dụng đánh giá mức độ oxy hóa của dầu và mỡ
15
I.2.1.1.
Các chỉ tiêu dự đoán
15
I.2.1.2.
Các chỉ tiêu chỉ thị
16
I.2.2.
Sản phẩm của quá trình oxy hóa dầu mỡ
17
I.2.3.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tự oxy hóa của dầu mỡ
18
I.2.4.
Tác hại của việc sử dụng dầu mỡ đã bị oxi hóa
18
I.3.
Các phƣơng pháp xác định chỉ số peroxid

19
1.3.1
Phƣơng pháp chuẩn độ bằng iod (phƣơng pháp AOCS Cd 8-53,
TCVN 6121:2007)
19
1.3.1.1
Nguyên tắc
19
1.3.1.2
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp
20
1.3.2
Phƣơng pháp tạo phức màu giữa Fe
3+
với SCN
-
(phƣơng pháp
IDF - International Dairy Federation)
20
1.3.2.1
Nguyên tắc
20
1.3.2.2
Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp
20
1.3.3
Phƣơng pháp tạo phức màu Fe
3+
với xylenol cam (XO)
20

1.3.3.1
Nguyên tắc
20
1.3.3.2
Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp
21
1.3.4
Phƣơng pháp đề nghị: Tạo phức màu giữa Fe
3+
với SCN
-
sử dụng
phƣơng pháp ghép cặp ion
21
1.3.4.1
Mục tiêu của đề tài
21
1.3.4.2
Cách lựa chọn thuốc thử
21
4

1.3.4.3
Phƣơng pháp tạo phức màu giữa Fe
3+
với SCN
-
sử dụng phƣơng
pháp ghép cặp ion
22

1.3.4.4
Nguyên tắc
22
II
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
24
II.1
NỘI DUNG 1: TỐI ƢU QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH PEROXID
BẰNG PHƢƠNG PHÁP TRẮC QUANG GHÉP CẶP ION
25
II.1.1
Hóa chất và dụng cụ
26
II.1.1.1
Hóa chất
26
II.1.1.2
Dụng cụ
26
II.1.2
Qui trình thực nghiệm
27
II.1.2.1
Chuẩn bị hóa chất
27
II.1.2.2
Xác định peroxid bằng phƣơng pháp trắc quang cải tiến
27
II.1.2.2.1
Nguyên tắc

27
II.1.2.2.2
Quy trình phân tích
28
II.1.2.3
Khảo sát các điều kiện tối ƣu
28
II.1.2.3.1
Khảo sát dung môi chiết
29
II.1.2.3.2
Khảo sát bƣớc sóng hấp thu cực đại của phức
[Fe(SCN)
6
][CTMA]
3

30
II.1.2.3.3
Khảo sát nồng độ SCN
-

31
II.1.2.3.4
Khảo sát nồng độ CTMA
31
II.1.2.3.5
Khảo sát ảnh hƣởng của pH
32
II.1.2.3.6

Khảo sát thời gian lắc trong quá trình chiết
33
II.1.2.3.7
Khảo sát ảnh hƣởng thời gian ổn định màu
34
II.1.2.4
Khoảng tuyến tính, dựng đƣờng chuẩn
34
II.1.2.5
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng
36
II.1.2.6
Hiệu suất thu hồi
38
II.1.2.7
Cách qui đổi sang chỉ số peroxid
39
II.1.2.7.1
Công thức xác định chỉ số peroxid theo phƣơng pháp trắc quang
39
II.1.2.7.2
Công thức xác định chỉ số peroxid theo phƣơng pháp AOAC
39
II.1.2.8
So sánh kết quả phân tích peroxid trên mẫu thật giữa phƣơng
pháp trắc quang cải tiến và phƣơng pháp AOAC
40
II.1.2.8.1
Mục đích
40

II.1.2.8.2
Qui trình phân tích và xử lý mẫu
40
II.1.2.8.3
Kết quả phân tích mẫu theo hai phƣơng pháp
41
II.2
NỘI DUNG 2: CHẾ TẠO BỘ KIT SO MÀU BẰNG MẮT XÁC
ĐỊNH NHANH PEROXID TRONG DẦU, MỠ
43
II.2.2
Mục đích
44
II.2.3
Nguyên tắc
44
II.2.4
Bộ dụng cụ và hóa chất
46
II.2.5
Cách thực hiện
47
5

II.2.6
Kết quả phân tích trên một số mẫu thật
47
II.2.7
Nhận xét
49

II.2.7.1
Ƣu điểm
49
II.2.7.2
Nhƣợc điểm
50
II.3
NỘI DUNG 3: CHẾ TẠO BỘ KIT KÈM MÁY ĐO XÁC ĐỊNH
NHANH PEROXID TRONG DẦU, MỠ VÀ THỰC PHẨM
CHẾ BIẾN
51
II.3.1
Giới thiệu các bộ kit xác định peroxid hiện có
52
II.3.1.1
Giới thiệu về bộ test kit CDR
52
II.3.1.2
Giới thiệu về bộ test kit Saftest
52
II.3.1.3
Nhận xét
53
II.3.2
Mục đích
53
II.3.3
Nguyên tắc và hoạt động của máy
53
II.3.3.1

Nguyên tắc hoạt động của mạch
54
II.3.3.2
Phần mềm điều khiển
55
II.3.4
Cách thực hiện bộ kit
57
II.3.4.1
Hóa chất và dụng cụ
57
II.3.4.2
Quy trình đo mẫu
57
II.3.4.3
Khảo sát và tiến hành đo mẫu
58
II.3.4.4
Kết quả xác định LOQ & LOD
59
II.3.4.5
Kết quả kiểm tra độ lặp lại
59
II.3.4.6
Đƣờng chuẩn
60
II.3.4.7
So sánh với kết quả theo phƣơng pháp AOAC, AOCS
61
III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
63
III.1
NỘI DUNG 1: Tối ƣu qui trình xác định peroxid bằng phƣơng
pháp trắc quang ghép cặp ion
64
III.2
NỘI DUNG 2: Chế tạo bộ kit so màu bằng mắt để xác định nhanh
peroxid trong dầu, mỡ
65
III.3
NỘI DUNG 3: Chế tạo bộ kit kèm máy đo để xác định nhanh
peroxid trong dầu, mỡ và các thực phẩm chế biến
68
IV
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
70

TÀI LIỆU THAM KHẢO
72

6

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PV: Peroxide Value
CTMA: Cetyltrimetylamonium bromur
AOM: Active Oxygen Method
OSI: Oxidative Stability Index
FFA: Free Fatty Acid
TBA: Thiobarbituric Acid

AOAC: Association of Official Analytical Chemists
AOCS: American Oil Chemists' Society
TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam
IDF: International Dairy Federation
XO: Xylenol Orange
LOD: Limit Of Detection
LOQ: Limit Of Quantitation
RSD: Relative Standard Deviation
7

DANH SÁCH BẢNG

SỐ
TÊN BẢNG
TRANG
1
Các sản phẩm của quá trình oxy hóa dầu mỡ
18
2
Kết quả khảo sát các dung môi chiết
29
3
Kết quả đo mật độ quang của các mẫu trắng
37
4
Kết quả xác định hiệu xuất thu hồi trên mẫu thật
38
5
Kết quả so sánh PV theo phƣơng pháp AOAC và trắc quang cải tiến
41

6
Kết quả xác định tỷ trọng một số loại dầu
45
7
So sánh kết quả xác định PV giữa phƣơng pháp đo quang và phƣơng
pháp dùng kit so màu bằng mắt
47
8
Kết quả xác định LOD & LOQ trên máy đo quang tự chế
59
9
Kết quả kiểm tra độ lặp lại trên máy đo quang tự chế
59
10
Số liệu đƣờng chuẩn đo bằng máy tự chế
60
11
Kết quả đo mẫu thật bằng phƣơng pháp dùng bộ kit đo quang bằng
máy và AOAC
61
12
Mức độ đánh giá sự oxi hóa của dầu, mỡ
65

8

DANH SÁCH ĐỒ THỊ

SỐ
TÊN ĐỒ THỊ

TRANG
1
Sự thay đổi nồng độ peroxid theo thời gian
16
2
Phổ hấp thu của phức màu [Fe(SCN)
6
][CTMA]
3

30
3
Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ thuốc thử SCN
-

31
4
Sự phụ thuộc mật độ quang vào lƣợng CTMA thêm vào
32
5
Sự phụ thuộc mật độ quang vào pH của dung dịch
32
6
Sự ảnh hƣởng của thời gian lắc lên mật độ quang
33
7
Độ bền màu của phức theo thời gian
34
8
Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ Fe

3+
( g/mL)
34
9
Đƣờng chuẩn của phức [Fe(SCN)
6
][CTMA]
3
trong dung môi
etylacetat
35
10
Đồ thị phân bố giá trị PV theo AOAC và PP trắc quang
42
11
Đƣờng chuẩn của phức [Fe(SCN)
6
][CTMA]
3
đo bằng máy cầm tay
60
12
Đồ thị phân bố giá trị PV theo AOAC và PP dùng bộ kít đo quang
61


9

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

SỐ
TÊN SƠ ĐỒ
TRANG
1
Quy trình thực nghiệm tóm tắt
28
2
Sơ đồ mạch điện khuếch đại tín hiệu
54
3
Sơ đồ các chân của modun USB1208LS
55
4
Qui trình xác định peroxid theo phƣơng pháp trắc quang ghép cặp ion
64
5
Qui trình xác định peroxid theo bộ kit so màu bằng mắt
67
6
Qui trình xác định peroxid theo bộ kit kèm máy đo cầm tay
69

10

DANH SÁCH HÌNH

SỐ
TÊN HÌNH
TRANG
1

Mô hình bộ dụng cụ và hóa chất của bộ kit so màu bằng mắt
46
2
Dãy màu chuẩn: PV 3, PV 10, PV 18
48
3
Kết quả phân tích mẫu dầu Kiddy
48
4
Kết quả mẫu dầu chợ
49
5
Kết quả mẫu dầu cooking oil (Tƣờng An)
49
6
Bộ kit CDR
52
7
Bộ kit Saftest
53
8
Máy đo quang tự chế

55
9
Giao diện chính
56
10
Giao diện lập đƣờng chuẩn
56

11
Mô hình bộ dụng cụ và hóa chất của bộ kit kèm máy đo cầm tay
57



11






I. TỔNG QUAN
12

I.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ DẦU MỠ
Mỡ và dầu là những triester của acid triglyceric ở dạng lỏng hoặc rắn, luôn luôn
tồn tại trong thức ăn của ngƣời và gia súc, gọi chung là các chất béo. Không những
đóng vai trò là một phần của thực phẩm mà chất béo còn ảnh hƣởng sâu sắc đến sức
khỏe con ngƣời và vật nuôi. Các chất béo này rất dễ bị oxi hóa dẫn đến bị ôi, hƣ. Ở
nhiệt độ không quá 102
o
C, các chất béo này không có biến đổi đáng kể ngoài việc hóa
lỏng. Các loại dầu, mỡ có giá trị dinh dƣỡng rất cao đối với cơ thể, tuy nhiên việc sử
dụng dầu, mỡ không đúng cách lại trở thành có hại cho cơ thể [1].
I.1.1. Về mặt hóa học
- Chất béo là triester của acid béo với Glycerol

Trong đó R, R’, R’’ là các nhóm thế no hay không no, có số carbon từ 12-20
- Các mỡ tự nhiên là hỗn hợp của các Triacylglycerol
- Triacylglycerol là dạng đơn giản của lipid - một trong ba nguồn cung cấp năng
lƣợng cho cơ thể (bên cạnh hai nguồn khác là carbohydrate và protein) - Với 9
cal/gram (38kJ/g), lipid là thực phẩm giàu năng lƣợng nhất trong cả 3 loại kể
trên (hai loại còn lại có 4 cal/gram).
- Dầu mỡ có thể chia ra thành bão hòa và không bão hòa dựa theo bản chất của
acid béo hiện diện. Bản thân các acid béo cũng đƣợc chia thành bão hòa, đơn
bão hòa, đa bão hòa dựa vào sự hiện diện của liên kết đôi C=C.
I.1.2. Về mặt vật lý
Dầu no có điểm sôi cao hơn dầu không no. Điều đó có thể đƣợc giải thích do sự
‘cô đặc’ của phân tử. Mạch hydrocarbon dài trong phân tử gần nhau làm tăng lực Van
13

der Waals, dầu mỡ không no có chứa một hoặc nhiều liên kết C=C, hầu nhƣ lúc nào
cũng vậy liên kết C=C có cấu hình cis. Sự hiện diện của ‘nút thắt’ trong cấu hình cis
làm hạn chế sự quay làm cho các phân tử khó gần nhau hơn dẫn đến lực liên kết liên
phân tử giảm, do đó có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn dầu mỡ bảo hòa. Cấu hình Trans
của các acid béo không no dể dàng tiến gần đến nhau hơn do đó có nhiệt độ nóng chảy
cao hơn cấu hình cis.
I.1.3. Về mặt sinh học
Lipid bao gồm: mỡ, dầu, phospholipids, và steroid. Sự khác biệt cơ bản giữa dầu
và mỡ là trạng nhiệt độ sôi. Mỡ thƣờng dạng rắn trong khi dầu thƣờng là dạng lỏng ở
nhiệt độ thƣờng (dầu cọ và dầu dừa nằm ngoài quy luật trên).
Ngoài lƣợng triacylglycerol có sẵn trong thức ăn, cơ thể cũng có khả năng tự tổng
hợp triacylglycerol từ đƣờng và tinh bột. Phần lớn lƣợng triacylglycerol này tích tụ
trong mô mỡ, nếu chúng ta ăn quá nhiều dầu và đƣờng có thể gây béo phì. Các
triacylglycerol này sẽ phân hủy tạo thành acid béo khi cơ thể cần: sửa chữa tế bào,
màng tế bào… thiếu những acid béo này làm màng tế bào trở nên cứng và dính thay vì
mềm dẻo và trơn trƣợt. Các triacylglycerol bão hòa tuần hoàn trong cơ thể cho đến khi

tìm đƣợc ‘nhà’ thƣờng đó là các mô mỡ. Việc tích tụ này gây nguy cơ nhồi máu cơ tim
và sơ vữa động mạch đồng thời làm lƣợng triacylglycerol trong máu cao dẫn đến độ
nhớt của máu tăng, làm các tiểu cầu có khuynh hƣớng dính lại với nhau, việc tích tụ
tricylglycerol là một bƣớc trong chuỗi gây béo phì.
I.1.4. Chức năng chính của dầu mỡ trong cơ thể
- Tích trữ năng lƣợng: dầu mỡ có thể bị đốt cháy để giải phóng năng lƣợng khi
lƣợng carbohydrat trong khẩu phần ăn không cung cấp đủ.
- Là dung môi hòa tan của các vitamin thiết yếu nhƣ vitamin A, D, E và K là
những vitamin không tan trong nƣớc.
- Là lớp bảo vệ và cách nhiệt: Mô mỡ bao bọc xung quanh các cơ quan bên
trong cơ thể bảo vệ chúng khỏi những tổn thƣơng và sự thay đổi nhiệt độ bằng cách
14

bao bọc có tác dụng nhƣ một lớp đệm và cách ly. Não bộ của mỗi ngƣời đƣợc bao bọc
bởi một lớp giàu lipid gọi là vỏ myelin
- Chức năng thông tin: có vai trò quan trọng nhƣ là chất thông tin nội phân tử
hoặc điều chỉnh hormone nội bộ. Tất cả sinh vật đều sử dụng chất chuyển thông tin để
gửi thông tin đến các tế bào khác, các chất chuyển thông tin này thƣờng là phân tử kỵ
nƣớc kích thƣớc nhỏ, triacylglycerol đƣợc xem ứng viên xuất sắc. Ở dạng ester hóa,
chúng dễ dàng xâm nhập qua màng tế bào. Trong quá trình vận chuyển chúng thƣờng
gắn kết với protein vì vậy hàm lƣợng biểu kiến của chúng rất thấp và đƣợc xem nhƣ
thụ động đến khi chạm đến tế bào nhận phù hợp
I.1.5. Các chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng dầu, mỡ
Để đánh giá chất lƣợng dầu mỡ, ngƣời ta dựa trên các chỉ số sau:
Chỉ số acid: là số miligam KOH dùng để trung hòa acid béo tự do có trong 1g chất
béo. Chỉ số acid cao chứng tỏ chất béo không tƣơi, đã bị thủy phân một phần.
Chỉ số xà phòng: là số miligam KOH dùng để xà phòng hóa 1g chất béo và trung
hòa acid béo tự do có trong 1g chất béo này.
Chỉ số Ester: là số miligam KOH cần dùng để trung hòa chất béo liên kết với
glycerin, đƣợc giải phóng khi xà phòng hóa 1g chất béo. Do đó chỉ số ester bằng hiệu

số giữa chỉ số xà phòng và chỉ số acid.
Chỉ số Iod: là số gam iod kết hợp với 100g chất béo. Chỉ số này dùng để xác định
mức độ chƣa bảo hòa của acid béo vì iod sẽ kết hợp vào các nối đôi trong phân tử acid.
Và một số chỉ số khác nhƣ chỉ số peroxid (PV), TBA, FFA…
I.2. SỰ OXI HÓA CỦA DẦU MỠ
Dầu mỡ bị oxy hóa trong suốt quá trình sản xuất, vận chuyển, lƣu trữ và trong quá
trình chế biến thức ăn qua quá trình tự oxy hóa cũng nhƣ oxy hóa cảm quang.
Hydroperoxid là sản phẩm đầu tiên của quá trình oxy hóa chất béo và đƣợc coi là dạng
tổng quát của các peroxid. Sau đó peroxid bị phân giải để tạo thành aldehyd và ceton.
Các aldehyd và ceton này là những chất có mùi và vị khó chịu [2].
15

Quá trình ôi thiu tăng nhanh ở điều kiện ẩm, nhiệt độ cao và có ánh sáng. Một số
ion kim loại nhƣ đồng, sắt cũng xúc tác cho quá trình này.
Điều kiện thích hợp cho quá trình peroxid hóa là phân tử acid béo chƣa bão hòa,
đƣợc cung cấp nhiều oxygen, có ion kim loại chuyển tiếp làm xúc tác.
I.2.1. Các chỉ tiêu thông dụng đánh giá mức độ oxy hóa của dầu và mỡ [3]
Có 2 loại chỉ tiêu để đáng giá mức độ oxy hóa của dầu và mỡ: các chỉ tiêu dự
đoán và các chỉ tiêu chỉ thị.
- Các chỉ tiêu dự đoán: sử dụng những điều kiện để thúc đẩy quá trình oxy hóa
của dầu mỡ và mỡ hoặc các sản phẩm chế biến (sử dụng dầu mỡ hoặc có chứa dầu mỡ)
qua đó đánh giá chất lƣợng của nguyên liệu, hiệu quả của chất bảo quản hoặc dự đoán
hạn sử dụng của sản phẩm.
- Các chỉ tiêu chỉ thị: sử dụng để đánh giá chất lƣợng của dầu mỡ hoặc sản phẩm
chế biến tại thời điểm đánh giá.
I.2.1.1. Các chỉ tiêu dự đoán
 Phƣơng pháp oxy hoạt tính - AOM (Active Oxygen Method)
Phƣơng pháp này dự đoán mức độ ổn định của dầu mỡ bằng cách thổi không khí
qua dung dịch dầu mỡ tại tốc độ thổi, nhiệt độ và nồng độ nhất định. Sau đó, peroxid
và hydroperoxid sinh ra trong quá trình trên đƣợc chuẩn độ bằng iod. AOM đƣợc định

nghĩa là khoảng thời gian cần thiết để hàm lƣợng peroxide trong mẫu đạt 100meq/kg.
Dầu càng tốt, thời gian đạt đƣợc giá trị trên càng lâu (AOM càng lớn). Đối với các loại
mẫu khác cần phải tiến hành bƣớc chiết dầu mỡ ra rồi tiến hành thổi khí.
Phƣơng pháp này tốn thời gian vì cần một khoảng thời gian dài để thổi khí, có thể
lên đến 48 giờ hoặc hơn để lƣợng peroxid đạt 100meq/kg. Phƣơng pháp này nằm trong
bảng tóm tắt đƣợc ban hành bởi AOAC, AACC và AOCS.
 Chỉ số ổn định oxy hóa - OSI (Oxidative Stability Index)
Về nguyên tắc phƣơng pháp này tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp AOM, nhƣng nhanh
hơn và mang tính tự động hơn. Không khí đƣợc thổi qua buồng chứa mẫu tại nhiệt độ
16

nhất định, sau đó đƣợc dẫn qua bể chứa nƣớc DI. Acid bay hơi tạo thành trong quá
trình oxi hoá lipid làm tăng độ dẫn diện của nƣớc, độ dẫn đƣợc theo dõi liên tục. OSI
đƣợc định nghĩa là thời gian cần thiết để đạt đến một giá trị độ dẫn định trƣớc.
 Chỉ số iod
Chỉ số iod dùng để đo lƣờng số nối đôi của acid béo không bão hòa. Dầu mỡ có
chỉ số iod cao sẽ dễ bị oxi hóa. Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến chỉ số iod, do đó chỉ số
này một mình nó không phản ánh hết độ bền của dầu mỡ
I.2.1.2. Các chỉ tiêu chỉ thị
 Chỉ số peroxid - Peroxide Value (PV: Peroxide Value)
Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để đánh giá mức độ ôi thiu, PV
là hàm lƣợng của peroxid và hydroperoxid có trong mẫu và đƣợc định nghĩa là số meq
O
2
/kg mẫu. Giá trị PV thay đổi không cố định do đó phải thận trọng trong quá trình lƣu
trữ và kiểm tra mẫu. Thật khó đễ đƣa ra chỉ dẫn cụ thể nào về mối liên quan giữa giá trị
PV với sự oxy hóa của dầu mỡ. Giá trị PV cao chắc chắn chỉ ra rằng dầu mỡ đã bị oxy
hóa, nhƣng giá trị trung bình của PV có thể là kết quả của sự suy kiệt sau khi đạt đến
giá trị cực đại. Một cách tƣơng đối, theo Warner [4] có thể phân chia sự oxy hóa theo
các khoảng PV nhƣ sau: 3-5 mới bị oxy hóa, 10-12 bị oxy hóa trung bình, 16-18 bị oxy

hóa nhiều, việc phân chia này dựa trên việc gây mùi khó chịu do sự oxy hóa dầu mỡ tại
các mức oxy hóa hơn là ý nghĩa nhƣ là định nghĩa khoảng chấp nhận giá trị PV của dầu
mỡ.

Đồ thị 1: Sự thay đổi nồng độ peroxid theo thời gian

17

 Chỉ tiêu TBA - TBA test
Aldehyd bão hòa, 2-enal và 2-dienanl là những sản phẩm sinh ra trong giai đoạn
dập tắt của phản ứng oxy hóa dầu mỡ có thể phát hiện đƣợc bằng acid 2-thiobarbituric.
Phản ứng tạo thành có màu đỏ có thể đo màu đƣợc. Phản ứng này phát triển đầu tiên để
xác định malonaldehyd, ngoài ra TBA cũng phản ứng với các aldehyd khác, cũng nhƣ
bị ảnh hƣởng nhiễu nền ví dụ nhƣ Phenol trong khói. Cũng nhƣ PV, giá trị TBA không
hoàn toàn phản ánh chất lƣợng của dầu mỡ. Có thể do aldehyd không đƣợc sinh ra
trong giai đoạn dập tắt hoặc những aldehyd bay hơi trong quá trình chế biến cũng nhƣ
trong quá trình lƣu trữ.
 Acid béo tự do (FFA: Free fatty acid)
Acid béo tự do có trong dầu mỡ (hoặc phần chiết dầu mỡ) có thể xác định bằng
phƣơng pháp chuẩn độ. FFA đƣợc biểu diễn là % của lƣợng acid có trong mẫu thử (%
acid oleic cho mẫu mỡ động vật hoặc dầu nành, % acid lauric cho dầu dừa hoặc dầu
chứa acid béo mạch ngắn). FFA biểu thị cho sự thủy phân của dầu, mỡ. Trong giai
đoạn oxy hóa dầu mỡ cũng sinh ra acid. Phƣơng pháp này cũng dùng để xác định thành
phần, nguồn gốc của dầu mỡ sử dụng
I.2.2. Sản phẩm của quá trình oxy hóa dầu mỡ [2]
Sản phẩm sơ cấp của quá trình oxy hóa dầu mỡ là lipid hydroperoxid, tƣơng đối
bền tại nhiệt độ phòng và không có sự hiện diện của ion kim loại chuyển tiếp nhƣ sắt,
đồng. Khi có sự hiện diện của ion kim loại cũng nhƣ nhiệt độ cao chúng lặp tức bị phân
hủy tạo thành gốc alkoxy sau đó tạo thành aldehyd, ceton, acid, ester, rƣợu và các
hydrocacbon mạch ngắn. Các sản phẩm tiếp theo của quá trình oxy hóa đƣợc trình bày

trong bảng 1.
18


Bảng 1: Các sản phẩm của quá trình oxy hóa dầu mỡ
I.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tự oxy hóa của dầu mỡ [2]
Sự tự oxy hóa của dầu mỡ bị ảnh hƣởng bởi thành phần acid béo của dầu mỡ, quá
trình sản xuất, năng lƣợng nhiệt hoặc ánh sáng, nồng độ và loại oxy, acid béo tự do,
mono và diacylglycerol, ion kim loại chuyển tiếp, peroxit, các hợp chất đã bị oxy hóa
nhiệt, bột màu và chất chống oxy hóa. Các hợp chất này tác động qua lại lên sự oxy
hóa của dầu mỡ và không dễ định lƣợng đƣợc sự ảnh hƣởng của từng yếu tố.
I.2.4. Tác hại của việc sử dụng dầu mỡ đã bị oxi hóa [5]
Trong cơ thể, quá trình oxy hóa lipid là một quá trình chuyển hóa bình thƣờng,
tham gia điều hòa hoạt động của các enzyme liên kết với màng tế bào và lƣới nội bào.
Tuy nhiên, khi quá trình này xảy ra mạnh và kéo dài, ở màng tế bào xuất hiện những
đám phân tử lipoperoxid, đó chính là những đƣờng dẫn nƣớc qua màng, làm thay đổi
tính thấm của màng. Các lipoperoxid phản ứng với các nhóm – SH của enzym làm ức
chế các hoạt động của enzym, làm thay đổi quá trình phosphoryl hóa. Hậu quả là các
bơm canxi, natri, kali không hoạt động và dẫn đến sự tích tụ canxi ở bào tƣơng.
Hiện nay ngƣời ta thấy quá trình oxy hóa lipid là nguyên nhân của nhiều bệnh:
nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch, stress, thiểu năng động mạch vành…
19

I.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ PEROXID .
Nhƣ đã trình bày ở trên, dầu mỡ và thực phẩm bị oxy hóa gây nên tác hại nghiêm
trọng đối với cơ thể con ngƣời. Do đó để đánh giá chất lƣợng của dầu mỡ, ngƣời ta dựa
vào nhiều chỉ tiêu khác nhau – trong đó để đánh giá độ oxy hóa của dầu mỡ ta dựa vào
chỉ số PV.
Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp xác định hàm lƣợng peroxid trong dầu mỡ,
dầu sau chế biến, và các loại thực phẩm. Phƣơng pháp cổ điển cũng là phƣơng pháp

trọng tài theo AOAC, AOCS là xác định peroxid bằng phƣơng pháp chuẩn độ thể tích
dựa trên lƣợng I
3
-
sinh ra bằng Na
2
S
2
O
3
khi cho lƣợng dƣ KI vào mẫu với chỉ thị hồ
tinh bột. Ngoài ra còn có các phƣơng pháp so màu, trong đó các peroxid là các chất oxi
hóa, khi có mặt một ion kim loại có tính khử sẽ oxi hóa ion kim loại về số oxi hóa cao
hơn. Lƣợng ion kim loại mới sinh ra sẽ tạo phức màu với một thuốc thử hữu cơ. Dựa
trên màu sắc của hợp chất màu tạo thành ta sẽ xác định đƣợc hàm lƣợng peroxid có
trong mẫu.
I.3.1. Phƣơng pháp chuẩn độ bằng iod (phƣơng pháp AOCS Cd 8-53, TCVN
6121:2007) [6], [7]
I.3.1.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp này là dựa trên khả năng peroxid oxi hóa I
-

thành I
2
trong môi trƣờng dƣ I
-
.
Quá trình oxi hóa xảy ra theo phƣơng trình sau:
22
2ROOH KI ROH I K O

I
2
+ I
-
→ I
3
-

Lƣợng I
-
3
sinh ra đƣợc xác định bằng cách chuẩn độ với natri thiosulfat
(Na
2
S
2
O
3
) với chỉ thị hồ tinh bột
2S
2
O
4
2-
+ I
3
-
→ 3I
-

+ S
4
O
6
2-

20

I.3.1.2. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp
Phƣơng pháp này không thích hợp khi cần đo nhiều mẫu, yêu cầu lƣợng mẫu
phân tích nhiều, sử dụng dung môi độc hại (dung môi halogen – cloroform, hiện nay
một số phòng lab đã hạn chế sử dụng dung môi chứa halogen trong đó có chloroform).
Ngoài ra còn bị ảnh hƣởng bởi chất nền: I
-
tự do bị oxy hóa bởi không khí tạo ra I
2
và
phản ứng của I
2
với các thành phần lipid khác, nhất là phản ứng cộng vào nối đôi, làm
sai lệch kết quả.
I.3.2. Phƣơng pháp tạo phức màu giữa Fe
3+
với SCN
-
(phƣơng pháp IDF -
International Dairy Federation) [8], [9], [10]
I.3.2.1. Nguyên tắc
Fe
2+

sẽ bị oxi hóa thành Fe
3+
bởi peroxid. Lƣợng Fe
3+
sinh ra sẽ cho phản ứng
tạo phức màu với SCN
-
.
Thiocyanat (SCN
-
) là thuốc thử nhạy với ion Fe
3+
, nó đƣợc sử dụng rộng rãi
trong phân tích định tính và định lƣợng sắt theo phƣơng trình sau:
33
6
6 ( )Fe SCN Fe SCN

Phức thu đƣợc có màu đỏ và hấp thu cực đại tại bƣớc sóng 500nm. Thông qua
mối quan hệ về tỉ lệ phản ứng giữa Fe
2+
và peroxid, ta xác định đƣợc chỉ số peroxid.
I.3.2.2. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp
Phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm so với phƣơng pháp chuẩn độ: lƣợng mẫu
phân tích nhỏ, nhanh và đang đƣợc ứng dụng rất rộng rãi. Tuy nhiên, phức giữa Fe
3+
và
SCN
-
trong nƣớc không đƣợc bền.

I.3.3. Phƣơng pháp tạo phức màu Fe
3+
với xylenol cam (XO) [11], [12]
I.3.3.1. Nguyên tắc
Trong môi trƣờng acid, Fe
2+
bị peroxid oxi hóa thành Fe
3+
, Fe
3+
vừa đƣợc sinh
ra kết hợp với thuốc thử xylenol da cam tạo thành phức màu đỏ chàm.
Phƣơng trình phản ứng:
21

2 3 *
()
complex
LOOH Fe Fe OH LO alkoxyl

33
( ) ( )Fe OX xylenol orange Fe OX

Thực nghiệm cho thấy phản ứng tạo màu Fe
3+
với XO theo tỉ lệ 1:1 trong
khoảng pH tối ƣu 1.5‚3.0 và phức hấp thu ở bƣớc sóng cực đại λ= 560 nm cách xa cực
đại hấp thu của XO λ= 430 nm.
I.3.3.2. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp
Phƣơng pháp này có độ nhạy cao, phức giữa Fe

3+
và XO bền. Tuy nhiên, do bản
thân thuốc thử xylenol cam đã có màu (λ
max
= 430 nm). Do đó màu thuốc thử dƣ sẽ ảnh
hƣởng phép xác định.
I.3.4. Phƣơng pháp đề nghị: Tạo phức màu giữa Fe
3+
với SCN
-
sử dụng
phƣơng pháp ghép cặp ion
I. 3.4.1. Mục tiêu của đề tài
Trên cơ sở các phƣơng pháp đƣợc sử dụng để xác định peroxid, chúng tôi nhận
thấy phƣơng pháp so màu tiện lợi hơn các phƣơng pháp khác vì có thể phân tích đồng
thời nhiều mẫu và lƣợng mẫu tiêu tốn nhỏ. Chính vì vậy trong đề tài này, chúng tôi
mong muốn cải tiến quy trình phân tích peroxid trong dầu mỡ và thực phẩm bằng
phƣơng pháp trắc quang với nhiều ƣu điểm hơn các phƣơng pháp hiện có, từ đó chế tạo
bộ kit xác định nhanh peroxid trong các đối tƣợng dầu mỡ và các thực phẩm chế biến.
I. 3.4.2. Cách lựa chọn thuốc thử
Vì xylenol cam là thuốc thử có màu (λ= 430 nm), do đó lƣợng thuốc thử dƣ sẽ
ảnh hƣởng đến phƣơng pháp xác định. Ngoài ra, khi khảo sát các loại thuốc thử XO
của Trung Quốc và Merck cho thấy thuốc thử xylenol cam mới bị nhiễm bẩn, khi tiến
hành quét sóng thuốc thử không chỉ thấy bƣớc sóng cực đại của thuốc thử mà còn có
bƣớc sóng cực đại của phức Fe
3+
với XO.


22

I.3.4.3. Phƣơng pháp tạo phức màu giữa Fe
3+
với SCN
-
sử dụng phƣơng
pháp ghép cặp ion
Vì phức [Fe(SCN)
6
]
3-
trong nƣớc kém bền (β = 10
3.23
), chỉ tan tốt trong nƣớc,
mà peroxid nằm trong pha dầu do đó để tăng sự tiếp xúc giữa Fe
2+
trong nƣớc và
peroxid trong dầu ta phải sử dụng một dung môi để chiết phức [Fe(SCN)
6
]
3-
. Ngoài ra,
để tăng độ bền phức cũng nhƣ có thể chiết đƣợc hết lƣợng phức hình thành thì chúng
tôi sử dụng một muối amin bậc 4 để ghép cặp ion với phức [Fe(SCN)
6
]
3-
và sử dụng
một dung môi hữu cơ để chiết [8].

I.3.4.4. Nguyên tắc
Peroxid oxi hóa Fe
2+
về Fe
3+
. Lƣợng Fe
3+
sinh ra sẽ tham gia phản ứng tạo phức
màu với SCN
-
. Tiến hành ghép cặp với cetyltrimethylammonium bromide (CTMA -
muối ammoni tứ cấp) và chiết bằng dung môi hữu cơ. Sau đó đo quang phức màu thu
đƣợc và xác định hàm lƣợng peroxid có trong mẫu.
Công thức của CTMA:

Phản ứng giữa Fe
2+
và peroxid là phản ứng oxi hóa khử. Gồm hai bán phản ứng:
H
2
O
2
+ 2H
+
+ 2e  2H
2
O Eº = +1.77 V
Fe
3+
+ 1e  Fe

2+
Eº = + 0.77V
Theo Branka Mihaljević [10], cơ chế của quá trình này đƣợc đề nghị nhƣ sau:
2 * 3
LOOH Fe LO OH Fe
(1)
Gốc tự do alkoxyl rất hoạt động, nó có khả năng phản ứng với ion Fe
2+
khác,
dung môi RH và LOOH.
* 2 3
LO Fe H LOH Fe
(2)
23

**
LO RH LOH R
(3)
**
LO LOOH LOH LOO
(4)
Phản ứng (4) hầu nhƣ không xảy ra vì lƣợng LOOH thấp đo đó trong phản ứng
(1) đã phản ứng hoàn toàn. Bản chất của phản ứng (3) còn phụ thuộc vào dung môi sử
dụng.
Nếu dung môi sử dụng là CHCl
3
:
**
33
LO CHCl LOH CCl

2 * 3
33
Fe CCl H Fe CHCl
(5)
Nếu dung môi sử dụng là MeOH:
**
22
LO CH OH LOH CH OH

3 * 2
2
Fe CH OH Fe HCHO H
(6)
Nhận thấy lƣợng Fe
3+
xác định không chỉ từ phản ứng (1), mà còn phụ thuộc
vào sự cạnh tranh giữa các phản ứng (2), (3), (5) ,(6). Chính vì vậy các yếu tố nhƣ pH,
dung môi chiết,….cần phải đƣợc khảo sát để tối ƣu quy trình phân tích.
24

II. NỘI DUNG & PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU