Báo cáo khoa học : Thử nghiệm tạo phôi chó nhà (canis domesticus) bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hàng nghìn năm trước, chó đã được con người nuôi dưỡng như là vật nuôi. Chó
đã trở thành “người bạn thân nhất” của con người [47]. Chúng đã từng giúp cho con
người trong công việc săn bắn, trang trại, trông nhà, hỗ trợ một số công tác về an
ninh, phòng chống tội phạm và giúp dẫn đường cho người mù… Ngoài ra, chó còn
là mô hình trong các nghiên cứu về sinh lý, về bệnh học ở người. Có hơn 370 bệnh
về rối loạn di truyền ở chó và nhiều trong số đó giống với các rối loạn ở người. Vì
thế, các nghiên cứu về chó là rất cần thiết nhằm phục vụ cho lợi ích của con người.
Hiện nay, trên thế giới, nhu cầu về nhân bản hay mở rộng nguồn gen của những
con chó có đặc tính đặc biệt đang phục vụ trong những lĩnh vực chuyên sâu khác
nhau đang ngày càng nhiều nên những nghiên cứu về sinh sản ở chó càng trở nên
cần thiết. Tuy nhiên, các nghiên cứu về chó ở các nước phương Tây và Mỹ lại bị
hạn chế bởi các luật bảo vệ động vật và tổ chức bảo vệ động vật. Điểm bất lợi của
các nước có ngành khoa học phát triển này lại là lợi thế của Việt Nam khi phong tục
Việt Nam coi thịt chó là một loại thực phẩm. Chính vì thế, nguồn mẫu vật và mô
hình chó cho các nghiên cứu về sinh sản trong điều kiện in vitro khá dồi dào và
không bị cản trở.
Tuy nhiên, các nghiên cứu về nuôi thành thục trứng, thụ tinh và nuôi phôi chó in
vitro ở Việt Nam chưa đạt được các kết quả có ý nghĩa. Hiện chỉ có nhóm tác giả
Quách Tuyết Anh và Trần Thị Dân Năm 2005 đã báo cáo nuôi thành thục được
trứng chó với tỉ lệ 0,75% ngoài ra không còn công bố nào có kết quả cao hơn.
Trên thế giới, nuôi thành thục trứng chó đã được công bố từ năm 1976 [28]
nhưng ứng dụng công nghệ sinh học sinh sản trên đối tượng chó thì mới phát triển
khoảng 10 năm trở lại đây [36] và kết quả còn nhiều hạn chế. Hiện nay, các kết quả
của những nghiên cứu nuôi trưởng thành trứng in vitro trên thế giới còn thấp so với

các loài khác. Tỷ lệ nuôi chín trứng chó chỉ đạt khoảng 20% ngoại trừ nghiên cứu
gần đây của tác giả Songsasen và Wildt đã báo cáo nuôi chín trứng thu nhận từ
những nang trứng có kích thước > 2 mm đạt tỷ lệ 79,5% [14], [46]. Và do đó, tỷ lệ
phôi hình thành từ nguồn trứng nuôi trưởng thành in vitro này cũng rất hạn chế [14].
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
2
Ở Việt Nam, hiện nay chưa có quy trình nào hiệu quả cho việc nuôi thành thục
trứng chó và tạo phôi chó in vitro.
Những hạn chế này có thể do những đặc điểm khác biệt trong sinh lý sinh sản ở
chó so với các loài động vật có vú khác. Thứ nhất là chu kỳ sinh dục của chó kéo
dài khoảng 3 – 10 tháng tùy giống trong khi bò, người, heo là 20 – 28 ngày. Thứ hai
là sự kiện chảy máu âm đạo ở giai đoạn tiền động dục. Sự chảy máu này không
giống ở người là do bong tróc lớp niêm mạc dạ con khi không thụ tinh, ở chó sự
chảy máu này là để bong lớp tế bào ngoài giúp tử cung sẵn sàng cho phôi làm tổ.
Thứ ba là quá trình chín của trứng chó. Ở các loài động vật có vú khác, trứng tiến
hành giảm phân trong nang trứng ở giai đoạn nang tiền rụng. Khi rụng trứng ở giai
đoạn Metaphase II và sẵn sàng cho thụ tinh. Tuy nhiên, ở chó không xảy ra như
vậy, khi rụng, trứng ở giai đoạn túi mầm (germinal versicle –GV) và quá trình giảm
phân hoàn thành sau khoảng 48 giờ trong ống dẫn trứng [36]. Tuy nhiên, chỉ có sự
kiện thứ nhất và thứ ba là có ảnh hưởng nhiều tới những nghiên cứu về sinh sản của
chó in vitro.
Do đó, việc tiến hành nghiên cứu về nuôi thành thục và tạo phôi chó in vitro ở
Việt Nam là rất thiết thực. Các nghiên cứu này không chỉ có tiềm năng phát triển
cao mà còn ẩn chứa nhiều thách thức và khó khăn.
Những nghiên cứu về tạo phôi chó in vitro cần thiết được phát triển trên nền
những nghiên cứu về sinh lý sinh sản ở chó.
1.1. Chu kỳ động dục ở chó

Chó là loài động vật đa rụng trứng, động dục một lần một năm và không theo
mùa [36]. Mỗi chu kỳ động dục kéo dài vài tháng; ngoài ra, biểu hiện về thời gian
động dục ở mỗi con và mỗi giống rất khác nhau, đôi lúc những biểu hiện cũng khác
nhau. Chu kỳ sinh dục bình thường của chó cái có thể phân chia thành 4 giai đoạn,
mỗi giai đoạn có hành vi, sinh lý và kiểu nội tiết riêng biệt.
1.1.1. Kỳ không động dục
Kỳ không động dục ở chó kéo dài 2-10 tháng [47]. Tuyến sinh dục của chó ở kỳ
này không có hoạt động rõ rệt. Chúng không hấp dẫn hoặc không chấp nhận cho
chó đực giao phối. Âm hộ nhỏ và không phồng lên. Phân tích tế bào học ống sinh
dục của chó cái cho thấy các tế bào nhỏ chiếm đa số và một phần nhỏ các tế bào
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
3
bạch cầu và các vi khuẩn. Nội soi âm đạo thấy các nếp gấp phẳng, mỏng và đỏ. Sinh
lý của chó trong giai đoạn này vẫn chưa được hiểu rõ nhưng chắc chắn là có sự
giảm chức năng thể vàng và giảm tiết prolactin.
Ở kỳ này, kết quả đo nồng độ estrogen được báo cáo rất khác nhau nhưng đều
cho rằng hàm lượng đạt mức độ cao hơn mức trung bình một tháng trước kỳ tiền
động dục rồi tăng lên nhanh chóng [30]. Trong khi đó, nồng độ của Luteinizing
hormone (LH) trong huyết thanh đạt ở mức thấp, dưới 1 ng/ml, chỉ bằng 2-20% so
với nồng độ đỉnh. Ở giai đoạn đầu của kỳ không động dục, follicle stimulating
hormone (FSH) luôn ở nồng độ căn bản (khoảng 20 ng/ml) và tăng lên vào giữa và
cuối của kỳ (>30ng/ml) [8], [29].
Chó cái trong giai đoạn không động dục không thấy có sự hoạt động chức năng
của buồng trứng.
1.1.2. Kỳ tiền động dục
Trong suốt kỳ tiền động dục, chó cái bắt đầu hấp dẫn con đực nhưng vẫn không
chấp nhận giao phối. Có sự bong lớp màng niêm mạc giả ở tử cung khiến chảy máu

âm đạo, và âm đạo mở rộng ở mức trung bình. Phân tích tế bào của âm đạo cho thấy
có sự thay đổi phát triển từ những tế bào nhỏ cận gốc thành các tế bào trung gian
nhỏ và lớn, tế bào trung gian và cuối cùng là tế bào biểu mô bề mặt phản ánh tác
dụng của nồng độ estrogen. Nếp gấp âm đạo của chó biểu hiện sự sung phù, có màu
hồng và tròn.
Khi chuyển dần từ kỳ không động dục sang kỳ động dục, nồng độ estrogen tăng
từ mức độ trung bình (26 pg/ml) cho tới đỉnh (50-100 pg/ml) rồi giảm xuống nhanh
chóng sau đó [6], [9]. Trong kỳ tiền động dục, LH đạt đỉnh (4-40ng/ml) khoảng 1-3
ngày sau đỉnh của estrogen [6]. Ngược lại, progesterone lại tăng chậm. Progesterone
tăng từ mức căn bản (0,2-0,4 ng/ml) tới trước đỉnh LH thì đạt 0,6-0,8 ng/ml và sau
đỉnh thì đạt 3,2-5,4 ng/ml [7].
Vào giai đoạn sớm của kỳ tiền động dục, nang trứng trội có kích thước khoảng
2-3 mm. Các nang này phát triển tới kích thước khoảng 9-12 mm trước khi vào cuối
kỳ tiền động dục [7].


Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
4
1.1.3. Kỳ động dục
Trong suốt kỳ động dục, chó có biểu hiện chấp nhận hoặc thụ động trong giao
phối và có thể bị chảy máu. Sự chảy máu âm đạo này là do sự bong màng niêm mạc
giả ở tử cung chó. Giai đoạn này, âm hộ chó phồng hết cỡ. Các tế bào bề mặt âm
đạo chiếm đa phần. Các nếp gấp âm đạo trở nên cuộn nhiều hơn. Nồng độ estrogen
giảm rõ rệt sau đỉnh LH trong khi progesterone tăng dần (khoảng từ 4-10 ng/ml ở
thời điểm rụng trứng) đánh dấu pha thể vàng của buồng trứng. Kỳ động dục kéo dài
3 ngày tới 3 tuần và thường là 9 ngày. Hành vi động dục của chó có thể có trước
hoặc sau đỉnh LH. Nó kéo dài (khác nhau ở mỗi cá thể) và có thể không cùng lúc

với thời kỳ có thể thụ tinh. Trứng tiền trưởng thành rụng ở thời điểm 2 ngày sau
đỉnh LH và thành thục khoảng 2-3 ngày sau. Thời gian tồn tại của trứng sau thành
thục là 2-3 ngày [6], [8], [29].
1.1.4. Kỳ đình dục
Trong kỳ đình dục, những con chó bình thường trở nên khó tính cùng với giảm
các biểu hiện lôi cuốn con đực. Sự chảy máu âm đạo giảm và âm hộ cũng giảm
phồng từ từ. Nồng độ estrogen ở mức thấp còn nồng độ progesterone tăng dần tới
đỉnh là 15-80 ng/ml và duy trì ở mức cao trước khi giảm dần ở cuối kỳ đình dục
(khoảng 30-50 ngày) ở cả cá thể mang thai và không mang thai [6]. Nội mạc tử
cung và cơ tử cung phát triển dưới ảnh hưởng của sự tăng nồng độ progesterone. Kỳ
đình dục thường kéo dài 2-3 tháng ở những con chó mang thai. Cá thể sẽ đẻ khoảng
64-66 ngày sau đỉnh LH. Nồng độ prolactin tăng ngược lại với sự giảm
progesterone ở giai đoạn cuối của kỳ đình dục hoặc mang thai. Progesterone đạt
mức độ cao nhất trong giai đoạn mang thai.
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
5
Hình 1: Hình ảnh tế bào học ống sinh sản chó trong chu kỳ động dục
Giai đoạn đầu kỳ tiền động dục có
sự tập trung của bạch cầu trung tính,
tế bào cận gốc, tế bào biểu mô bề
mặt, hồng cầu, và chất nhầy
Giai đoạn cuối kỳ tiền động dục,
hồng cầu, tế bào biểu mô, và sự
vắng mặt của các bạch cầu trung
tính
Giai đoạn động dục đặc trưng bởi
các tế bào biểu mô được keratin hóa,

phần lớn không có nhân và tế bào có
góc cạnh
Giai đoạn đình dục đặc trưng bởi sự
giảm sút các tế bào biểu mô, sự tăng
các tế bào trung gian, và sự hiện
diện của bạch cầu trung tính.
Nguồn:
Tế bào gốc (basal cell): là những tế bào trẻ nhất của tế bào biểu mô âm đạo
Tế bào cận gốc (parabasal cell): là những tế bào nhỏ nhất trong các tế bào biểu mô âm đạo
Tế bào trung gian (intermediate cell) có kích thước rất khác nhau nhưng thường lớn hơn 2
lần tế bào cận gốc
Tế bào biểu mô (superficial cell): là những tế bào già nhất trong các tế bào biểu mô âm đạo
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
6

1.2. Sự thành thục của trứng chó in vivo
1.2.1. Các giai đoạn phát triển của trứng chó
Ở giai đoạn nang sơ cấp, các trứng chứa một nhân, bao quanh bởi ty thể, mạng
lưới nội chất trơn và thể Golgi. Vào giai đoạn phát triển sớm, liên kết giữa trứng và
nang chưa hoàn thiện đầy đủ [53] [54]. Màng trong suốt của trứng trong nang sơ
cấp bắt đầu hình thành và trở nên rõ ràng cùng với sự tăng trưởng tế bào. Một
nghiên cứu về vi cấu trúc gần đây đã chứng minh rằng màng trong suốt ở trứng chó
được hình thành bởi mạng lưới các sợi fibrin và các lỗ với nhiều kích thước [51].
Độ dày của màng trong suốt của trứng phát triển đầy đủ khoảng 10 µm.
Ty thể hiện diện ngày càng nhiều trong suốt thời kỳ phát triển của trứng,
thể hiện sự gia tăng các hoạt động trao đổi chất trong trứng [53], [54]. Tế bào chất
của trứng giai đoạn nang sơ cấp bao gồm các hạt và sợi hoặc các phiến lưới nội

chất. Thể Golgi cũng tăng về số lượng. Các hạt lipid đầu tiên xuất hiện trong noãn
sơ cấp của nang đang phát triển và gia tăng trong suốt quá trình sinh trứng [53],
[54].
Thành thục
Rụng trứng
Thời kỳ thụ thai
Sự sừng hóa
âm đạo
Kỳ tiền động dục
Kỳ động dục Kỳ đình dục
Chu kỳ động dục với ngày bắt đầu kỳ động dục là ngày thứ nhất

H
ình
2
: Diễn tiến hormone trong chu kỳ động dục chó
(
Ngu
ồn: yourownvet.com
)

Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
7
Trong giai đoạn sớm của nang trội, nhân chiếm gần hết thể tích của noãn bào,
bao xung quanh là các ty thể, và số lượng các hạt lipid tiếp tục tăng. Các vùng tế
bào chất của trứng tiếp giáp với các tế bào hạt có sự hiện diện với số lượng lớn các
thể Golgi và vài ty thể. Trong suốt quá trình phát triển, trứng vẫn tiếp tục gia tăng

kích thước cùng với đó là sự gia tăng của các hạt lipid khiến cho trứng có màu đen
[12], [54]. Cho tới nay, người ta vẫn chưa biết hạt lipid hiện diện trong trứng chó
với số lượng lớn như thế có ảnh hưởng như thế nào đến sự trưởng thành và phát
triển trứng ở loài này.
Trong sinh lý bình thường, trứng chó được giải phóng khỏi nang trứng ở giai
đoạn prophase I của quá trình phân chia giảm phân [14] lúc này trứng vẫn còn sự
hiện diện của túi mầm (germinal vesicle) ở trong tế bào chất. Túi mầm được tạo
thành từ màng nhân và một nhân chứa vật chất di truyền. Trứng có sự thay đổi quan
trọng về hình thái nhân trong suốt quá trình thành thục bao gồm sự phiên mã của
mRNA và tổng hợp protein ở mức cao. Ở tế bào chất, sự hình thành của các bào
quan, điển hình là ti thể và ribosome và sự hình thành nên màng trong suốt (zona
pellucida) và hạt vỏ cho phép quá trình giảm phân tới giai đoạn metaphase II, thể
hiện ở sự giải xoắn của các nhiễm sắc thể và xuất hiện của thể cực thứ nhất.
Sự rụng trứng xảy ra 2 ngày trước kỳ động dục và ở hầu hết các con chó cái là
khoảng ngày thứ 3 sau khi có biểu hiện chấp nhận giao phối [22], [55]. Trứng được
giải phóng khỏi nang tiền rụng (có đường kính khoảng 4-13 mm) ở giai đoạn túi
mầm có đường kính khoảng 118-135 µm. Quá trình vỡ túi mầm ở trứng chó diễn ra
khoảng 48 giờ trong ống dẫn trứng [22], [55]. Trứng đạt giai đoạn thành thục về
nhân khoảng 48-72 giờ sau rụng trứng. Theo kết quả báo cáo của Reynaud và cs
(2005), khi quan sát trứng từ 17 đến 138 giờ sau rụng trứng cho thấy trứng đầu tiên
đạt giai đoạn metaphase II vào 54 giờ sau rụng [36]. Các trứng thành thục in vivo
cũng cho thấy có sự giãn nở của lớp tế bào hạt tuy nhiên lớp trong cùng bao quanh
sát trứng còn tồn tại quanh trứng tới tận giai đoạn phôi nang [22]. Trứng chó được
thụ tinh di chuyển trong ống dẫn trứng khoảng 9-10 ngày sau đó mới tiến vào tử
cung [22], [55].


Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T

ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
8
1.2.2. Đặc điểm môi trường phát triển của trứng chó in vivo
Môi trường nang trứng
Trong buồng trứng của tất cả các loài động vật có vú, nang trứng là một đơn vị
cấu trúc và chức năng. Nang trứng chứa giữ trứng phát triển và thành thục. Trong
nang trứng đang tăng trưởng, trứng chó phát triển và gia tăng về kích thước [12].
Trứng nhỏ với một lớp tế bào hạt tiền thân hình thành trong nang nguyên sơ
(primordial) (đường kính 25 µm); trong nang tiền xoang (pre-antral follicle), trứng
hiện diện cùng với sự bao quanh của lớp đơn tế bào hạt và ở cuối nang tiền xoang
(advanced preantral follicles) (đường kính khoảng 211,4 ± 1,5 µm) trứng lớn lên
(đường kính khoảng 115 ± 14 µm), có sự tập trung các hạt lipid với số lượng lớn.
Đây cũng là đặc trưng của trứng chó tiền rụng với nhiều lớp tế bào hạt bao quanh. Ở
giai đoạn sớm của nang trưởng thành (đường kính khoảng 360,5 ± 18 µm) có sự
hình thành những xoang [12] và kích thước nang trưởng thành giai đoạn tiền rụng
đạt khoảng từ 2-3 tới 8-10 mm [8]. Do vây, trong suốt giai đoạn phát triển này,
đường kính của trứng tăng từ khoảng gần 20 µm đến 120 µm và trở nên tương đối
hoàn thiện.

H
ình
3
:
Các giai
đoạn phát triển nang
buồng trứng.
(a): Nang nguyên sơ
(b): Nang sơ cấp
(c): Nang thứ cấp
(d): Nang tiền trội

(e) Nang trội
(f): Nang đa noãn
(Nguồn: Blackmore
và cs 2004)
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
9
Đa số các nang chỉ gồm 1 trứng mặc dù nang đa rụng trứng đã được quan sát ở
chó cũng như nhiều loài động vật có vú khác. Tuy nhiên, phần trăm nang đa rụng ở
chó gặp nhiều hơn: 14% ở những con chó 1-2 tuổi và 5% ở những con 7-11 tuổi
[52]. Sự hiện diện của nang đa rụng không được coi như một hiện tượng bệnh lý mà
nó là một hiện tượng tự nhiên bắt nguồn từ sự hiện diện với mật độ cao các mảng
nang sơ cấp trong tủy của buồng trứng chó non. Số phận của các nang rụng nhiều
lần vẫn chưa được biết rõ. Chúng có thể hoặc rụng hoặc trải qua sự thoái lui
(atresia) như ở đa số các nang rụng một lần [1].
Có 2 kiểu thoái hóa được quan sát ở buồng trứng chó: thoái hóa kiểu A, kiểu này
chiếm đa số ở nang tiền xoang, đặc trưng bởi sự hoại tử của trứng và màng trong
suốt. Trái lại, sự thoái hóa kiểu B, là sự hoại tử của tế bào hạt. Quá trình thoái hóa
kiểu B dẫn tới kết quả là nang tăng trưởng giả bởi sự phát triển giả hình thành cấu
trúc giống nang tăng trưởng [49].
Môi trường ống dẫn trứng
Sự thành thục ngoài nang trứng và thời gian sống kéo dài trong ống dẫn trứng là
nét đặc biệt của trứng chó. Ống dẫn trứng của chó giúp trứng tồn tại trong thời gian
dài bao gồm sự thành thục hoàn toàn, sự thụ tinh và sự phát triển tới giai đoạn phôi
nang. Do vậy, tổng thời gian trứng chó trong ống dẫn trứng khoảng 8,5 tới 9 ngày,
nhiều hơn 3-4 ngày so với các loài khác [22]. Bởi thế, hình thái của ống dẫn trứng
phải thích hợp cho sự tồn tại dài ngày của giao tử trong cơ quan này. Trong thực tế,
lòng trong của ống dẫn trứng động vật có vú được hình thành bởi tổ hợp hệ thống

những nếp gấp niêm mạc nhầy đan dọc vào nhau. Những nếp gấp dọc được sắp
thành hàng bởi một lớp biểu mô hình trụ đơn giản. Hình thái và đặc tính sinh học
của mô này được điều khiển bởi hormone buồng trứng [56]. Trong suốt chu kỳ động
dục của chó, các tế bào biểu mô xếp hàng bao gồm các tế bào có lông nhung đã biệt
hóa hoàn toàn và các tế bào tiết, chúng chiếm tới 40-50% các tế bào biểu mô. Do
vậy, ở chó, trứng được đặt trong môi trường các chất tiết và chất nhầy của ống dẫn
trứng trong một thời gian dài, và có thể những chất này có vai trò chủ chốt trong sự
kiện toàn của trứng.


Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
10
Sự tương tác với tinh trùng trong ống dẫn trứng
Trong cơ thể, trứng chó rụng duy trì khả năng thụ tinh ít nhất 4 ngày [55]. Sự
giao phối có thể xảy ra trước 2-3 ngày đến 1 tuần sau khi rụng trứng. Tinh trùng có
thể thực sự hiện diện quanh tổ hợp trứng-tế bào ổ trước cả khi trứng thành thục.
Chúng vẫn có thể còn sống sau khi giao phối 11 ngày trong ống dẫn trứng của con
cái [11]. Thời gian tinh trùng tập trung quanh trứng chó không chắc chắn vì chênh
lệch giữa thời điểm rụng trứng, thụ tinh và thành thục của trứng. Trong một nghiên
cứu in vivo đã báo cáo có sự hiện diện của tinh trùng trong trứng ở giai đoạn túi
mầm, mặc dù không có sự thay đổi trong những đầu tinh trùng được quan sát cho
tới sau khi trứng bài xuất thể cực thứ 2. Trong khi sự tập trung của tinh trùng ở
trứng tiền thành thục có thể xảy ra, hiện nay vẫn không có bằng chứng về phôi phát
triển sau đó của những trứng được báo cáo này. Mặt khác, ở loài cáo xanh sự phát
triển của tiền nhân đực đã được quan sát ở trứng giai đoạn túi mầm thu nhận từ
những con đã giao phối [13].
1.3. Những cố gắng nuôi thành thục trứng chó in vitro

Theo các báo cáo hiện nay, tỷ lệ IVM trên trứng chó chỉ đạt khoảng 20% và do
đó tỉ lệ phát triển thành phôi cũng thấp trong các thử nghiệm IVF [21]. Trong thập
kỷ gần đây, các nhà khoa học đang cố gắng tìm hiểu sự thành thục và thụ tinh in
vitro ở trứng chó. Đó là một thách thức vô cùng hấp dẫn đối với các nhà khoa học.
Đa số ý kiến cho rằng sự phân chia giảm phân của trứng chó in vitro là kết quả ảnh
hưởng một cách gián tiếp bởi gonadotropin, hormone nhóm steroid, nhân tố tăng
trưởng và protein bổ sung trong môi trường nuôi cấy. Ngược lại, một số tác giả
khác lại cho rằng sự trưởng thành nhân của trứng có thể xảy ra in vitro không phụ
thuộc vào nguồn protein bổ sung trong môi trường. Do đó, nhiều thử nghiệm đã
được tiến hành nhằm mô phỏng các đặc tính sinh hóa cũng như sinh lý môi trường
nang trứng hay ống dẫn trứng.
1.3.1. Thử nghiệm mô phỏng điều kiện in vivo
Nuôi cấy nang trứng
Sự duy trì cấu trúc ba chiều của nang trứng cho phép bảo tồn chức năng và hình
thái của đơn vị chứa và nuôi dưỡng trứng phát triển và thành thục một cách toàn
vẹn. Bolamba và cs (1998) ước lượng sự trưởng thành nhân của trứng chó thông
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
11
qua nuôi cấy nang trứng trên đĩa nuôi cấy mô bằng nhựa trong điều kiện in vitro có
phủ 0,6% agar vô trùng để ngăn cản sự mất các tế bào hạt. Kết quả thu được sau
nuôi 48 giờ cho thấy số nang tiền xoang đạt 11,5% hoặc giai đoạn sớm của nang có
xoang đạt 8,7% mặc dù tỉ lệ này thấp. Sự tách nang trứng ra khỏi buồng trứng làm
gián đoạn sự vận chuyển sinh lý của các nhân tố trong buồng trứng, có thể thúc đẩy
trứng hoàn tất giảm phân [3].
Nuôi cấy trên lớp tế bào đơn
Ảnh hưởng có lợi của đồng nuôi cấy tới sự phát triển của phôi đã được chứng
minh trong sản xuất phôi bò in vitro [15]. Otoi và cs (2000) đã nuôi trưởng thành

trứng chó trên lớp đơn tế bào ổ của bò với môi trường nuôi phôi bò [32]. Mặc dù
tăng số trứng đạt giai đoạn metaphase II song không có ảnh hưởng tới sự phát triển
tiếp theo sau thụ tinh.
Việc đồng nuôi cấy với lớp đơn tế bào ống dẫn trứng chó đã được tiến hành lần
đầu tiên bởi Hewitt và England (1999). Kết quả cho thấy các tế bào ống dẫn trứng
không có bất cứ ảnh hưởng có lợi nào lên sự trưởng thành nhân của trứng sau 48
giờ đồng nuôi cấy. Chỉ sau 96 giờ thì có cải thiện về sự hoàn tất giảm phân [20].
Gần đây, Bogliolo (2002) đã chứng minh rằng việc đồng nuôi cấy với các tế bào
ống dẫn trứng thu nhận từ phần loa của ống dẫn trứng chó ở giai đoạn động dục có
ảnh hưởng tốt tới tỉ lệ trưởng thành của trứng, đạt 16,7% sau 48 giờ và 23,2% sau
72 giờ nuôi [2].
Việc đồng nuôi cấy trứng chó trên lớp đơn tế bào ống dẫn trứng là một thử
Hình 2.4:
Trứng chó trước khi nuôi cấy (A) và sau khi nuôi cấy (B)
(Nguồn: Shaikhun và cs, 2008)
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
12
nghiệm nhằm gia tăng điều kiện sinh lý mà ở đó trứng hoàn tất quá trình giảm phân.
Tuy nhiên, mô hình này vẫn khác rất nhiều so với môi trường ống dẫn trứng trong
cơ thể, do đó, ở chó có một số đặc trưng đặc biệt ảnh hưởng có lợi tới sự trưởng
thành và khả năng tồn tại lâu của trứng ở đây.
Nuôi cấy trong ống dẫn trứng
Một đoạn ống dẫn trứng được cô lập có thể cung cấp môi trường in vitro với các
đặc điểm khác với lớp đơn tế bào ống dẫn trứng. Trong thực tế, việc nuôi cấy tế bào
rất khác so với nuôi cấy ống dẫn trứng. Trong nuôi cấy tế bào thì số lượng kiểu tế
bào nuôi cấy được giới hạn trong khi ở ống dẫn trứng còn nguyên có sự hiện diện
của tất cả các loại tế bào và được giữ ở cùng giai đoạn như ở động vật sống. Một lợi

ích khác của kiểu nuôi cấy này là sự điều chỉnh về không gian và những liên kết
sinh lý giữa màng nhầy và trứng. Điều này tạo vi môi trường khác với điều kiện
nuôi cấy trong vi giọt hoặc trên lớp đơn tế bào ống dẫn trứng.
Việc nuôi cấy trứng chó trong đoạn loa của ống dẫn trứng đã được chứng minh
là có ảnh hưởng tốt tới sự tồn tại, phát triển nhân trong 30 giờ nuôi cấy [25] và kết
quả cho thấy nhân ở giai đoạn giữa metaphase I tới metaphase II đạt từ 12,5% đến
31,9%. Tuy nhiên, nghiên cứu này được cho là không phù hợp thực tế và nó không
hẳn là một kiểu nuôi cấy; nhưng với kết quả đó, người ta dự đoán rằng ống dẫn
trứng nguyên vẹn cùng với sự hiện diện của các tế bào ống dẫn trứng có thể tiết các
nhân tố khác (như các chất có dinh dưỡng cao hoặc là các nhân tố) trong sự trưởng
thành và khả năng sống của trứng chó.
Tiến hành tương tác với tinh trùng
Như được quan sát trong in vivo, trong in vitro cũng thấy có sự tập trung tinh
trùng chó ở màng trong suốt và ở khoảng không quanh trứng ngay cả khi trứng ở
giai đoạn chưa thành thục. Tuy nhiên, thông tin liên quan tới mối quan hệ giữa giai
đoạn thành thục của trứng và đầu tinh trùng trong tế bào chất của trứng còn giới hạn
và trái ngược nhau. Mahi và Yanagimachi (1976) đã thấy sự trương phồng của nhân
tinh trùng không khác so với sự giãn nhân của nó trong tế bào chất trứng ở tất cả
các giai đoạn trưởng thành [28]. Yamada và cs (1992 và 1993) đã quan sát tinh
trùng mở rộng trong những trứng ngừng ở giai đoạn túi mầm nhưng nhân nguyên
đực lại chỉ được quan sát ở trứng đã thực sự có nhân nguyên cái. Những ảnh hưởng
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
13
của sự tập trung tinh trùng lên sự khởi động và hoàn tất giảm phân lần thứ I ở trứng
chó vẫn còn đang được tìm hiểu [58], [59]. Trong nghiên cứu khác lại khẳng định
sự tập trung tinh trùng là một phần trong những tác động có lợi tới sự hoàn tất giảm
phân ở trứng chó [42]. Những kết quả đó cho thấy rằng ngoài sự tập trung tinh trùng

còn có các nhân tố khác tham gia vào sự hoàn tất giảm phân của trứng chó trong
nuôi thành thục trong ống nghiệm.
1.3.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi thành thục trứng có thể được chia ra 2 loại, môi trường đơn
giản hoặc môi trường phức hợp. Môi trường đơn giản được cân bằng bởi các dung
dịch với các nguồn năng lượng như pyruvate, lactate và glucose còn môi trường
phức hợp có thêm các chất như amino acid, vitamin và một số phân tử khác [15].
Môi trường đơn giản được sử dụng rộng rãi cho nuôi thành thục trứng chó in
vitro là môi trường Modified Krebs Ringer Bicarbonate (mKRB), Synthetic
Oviductal Fluid (SOF) và môi trường phức hợp như Tissue Culture Medium 199
(TCM 199). Vẫn chưa có báo cáo nào so sánh hiệu quả giữa môi trường đơn giản và
môi trường phức hợp cho nuôi trưởng thành trứng chó nhưng môi trường TCM199
đã được báo cáo là môi trường tốt hơn cho sự trưởng thành nhân của trứng chó đạt
tới giai đoạn metaphase II so với môi trường Connaught Medical Research Labs
Medium 1066 (CMRL 1066) [27]. Nhằm năng cao tỉ lệ nuôi trưởng thành trứng
chó, các môi trường được bổ sung một số chất:
Protein
Nguồn protein được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới dạng huyết thanh.
Huyết thanh lại là một thành tố quan trọng bảo vệ trứng khỏi các tác động có hại
của độc tố trong môi trường nuôi cấy. Huyết thanh cô lập phản ứng oxy hóa của O
2
và

cung cấp đệm pH đồng thời nó có lợi cho trứng chó thụ tinh in vitro và sự phát
triển của phôi chó sau này. Mặc dù vậy, sự hiện diện của huyết thanh lại khiến
màng trong suốt bị xơ cứng [40].
Huyết thanh bất hoạt nhiệt hoặc là albumin huyết thanh được bổ sung vào môi
trường nuôi cấy làm cải thiện tỉ lệ sống và trứng thành thục ở gia súc [15]. Sự
trưởng thành in vitro của trứng chó đã được chỉ ra trong môi trường có bổ sung
huyết thanh bò hoặc chó với nồng độ 5-20%, và 0,3-4% albumin huyết thanh bò

Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
14
(BSA). Huyết thanh bò chửa chỉ tăng cường sức sống của trứng chó trong điều kiện
in vitro khi thêm với nồng độ ≥ 10% và không cho thấy có lợi đối với sự thành thục
[19]. Khi so sánh giữa huyết thanh chó động dục và bò động dục, huyết thanh chó
có ảnh hưởng tốt hơn ở thời điểm khởi đầu sự trưởng thành tới giai đoạn MI-AI
(10,4% so với 4.2%) mặc dù trong nhóm đối chứng không có trứng nào đạt tới giai
đoạn MII [37]. Tỉ lệ nhân thành thục khi thêm 10% huyết thanh chó động dục
(16,3%) cao hơn so với nhóm thêm 10% huyết thanh chó không động dục (11,1%)
[31]. Như được biết, thành phần huyết thanh trong máu ngoài các protein còn có các
hormone như gonadotropin, steroid và các nhân tố tăng trưởng và do đó rất khó để
biết chính xác thành phần nào có ảnh hưởng tốt tới sự trưởng thành nhân trứng.
Theo báo cáo của Hewitt và England (1999) ảnh hưởng của việc bổ sung BSA
lên sự thành thục trứng cũng có liên quan tới số lượng lớn các nhân tố tăng trưởng
liên kết với protein [20]. So sánh trực tiếp giữa BSA và sự bổ sung huyết thanh vào
môi trường TCM199 cho thấy BSA có tác hỗ trợ hơn đối với sự phát triển của trứng
chó tới giai đoạn metaphase I-anaphase I [19], [38]. Khi bổ sung BSA với nồng độ
4% vào môi trường SOF cho thấy có dấu hiệu cải thiện tỉ lệ vỡ túi mầm sau 96 giờ
nuôi cấy [21]. Gần đây, Bolamba và cs (2002) đã chỉ ra rằng khi trứng chó được
nuôi cấy trong nang trứng được cô lập, việc bổ sung 0,3% BSA hoặc 20% huyết
thanh vào môi trường cơ bản SOF là không cần thiết đối với sự hoàn thiện trưởng
thành nhân, và sự hiện diện của chúng đã làm tăng khả năng hoàn tất giảm phân chỉ
ở giai đoạn vỡ túi mầm giai đoạn hướng cực (germinal vesicle breakdown-
diakinesis – GVBD-DK) [3].
Hormone
Trong in vivo, hormone kích hoạt tại thời điểm tiền rụng trứng là cần thiết cho
trứng chó để bắt đầu tiếp nhận những nhân tố ở ống dẫn trứng kích thích hoàn tất

quá trình giảm phân và thành thục. Tuy nhiên, trứng chó nuôi thành thục in vitro
thường được thu nhận từ những nang trứng chưa trưởng thành hơn là những nang
tiền rụng và chúng cũng không được trải qua ảnh hưởng khởi động của hormone.
Do vây, việc thêm hormone vào môi trường nuôi cấy là nhằm mô phỏng các điều
kiện in vivo. Như đã được chứng minh ở các loài khác, FSH kích thích hoàn tất
giảm phân in vitro thông qua điều hòa nồng độ cAMP trong tổ hợp trứng-tế bào ổ
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
15
[24]. Ngoài ra, FSH được cho là có vai trò trong sự giãn nở của tế bào ổ. Sự giãn nở
này có liên quan tích cực tới sự hoàn tất giảm phân. Trong khi đó, khả năng trưởng
thành nhân của trứng chó lại không có liên quan sự giãn nở của tế bào ổ. Sự hiện
diện của các FSH và/hoặc LH với nồng độ 1µg/ml trong giai đoạn nuôi cấy đã
không cải thiện sự trưởng thành nhân [45], [59]. Sự thiếu vắng FSH giúp trứng vượt
qua giai đoạn dừng giảm phân thông qua việc cải thiện tỉ lệ vỡ túi mầm nhưng nó
không thúc đẩy tiến trình giảm phân tiến xa hơn [38].
Gần đây người ta đã chứng minh trứng được ủ với eCG trong thời gian ngắn
(60-240 phút) đã khởi động quá trình hoàn tất giảm phân và tiến trình trứng chó tiến
tới giai đoạn metaphase I [48]. Ảnh hưởng tốt này được cho rằng do hoạt tính FSH
của eCG và sự trái ngược với kết quả trước, có thể do sự khác nhau giữa thời gian
tác động dài hay ngắn của các chất gonadotropin lên tế bào ổ của chó và sự sinh
tổng hợp steroid của chúng. Ảnh hưởng của sự bổ sung gonadotropin có thể thực sự
bị tác động bởi sự đồng hiện diện của các steroid trong môi trường. Tuy nhiên
Rodrigues (2003) đã không chỉ ra được hiệu quả của estradiol (nồng độ từ 1-20
µg/ml) kết hợp với gonadotropin lên sự trưởng thành nhân của trứng chó [38].
Nồng độ progesterone cao hiện diện trong môi trường nang trứng và sự thay thế
estrogen bằng progestagen có thể giúp cho sự phát triển in vitro. Nồng độ của
progesterone (từ 0 – 800 ng/ml) đã được thêm vào môi trường nuôi thành thục trứng

chó nhưng không có hiệu quả lên sự hoàn tất giảm phân hay sự thành thục toàn diện
của nhân [57]; hơn thế nữa, không có khác biệt trong tỉ lệ thành thục của trứng chó
ở nhóm thêm progesterone (1 µg/ml) và/hoặc estrogen (1 µg/ml) so với nhóm không
được thêm. Điều này cho thấy cần phải có thêm nhiều nghiên cứu in vivo về nồng
độ của các hormone trong môi trường nang trứng và ống dẫn trứng để có sự bổ sung
chính xác các chất này vào môi trường nuôi cấy in vitro.
Theo Kim và cs (2007) việc bổ sung 1 IU/ml hCG và 1 IU/ml FSH đã thúc đẩy
sự trưởng thành nhân ở trứng chó thu nhận giai đoạn nang trứng [23].
Dựa trên những kết quả thu được từ những loài khác, các hormone khác nhau
như somatotropin người và bò (hST, bST) đã được thử trong môi trường nuôi chín
trứng chó. Hormone tăng trưởng ở người dường như thúc đẩy sự trưởng thành tế
bào chất trên trứng mèo và bò, còn bST (1 µg/ml) có vẻ kích thích hoàn tất giảm
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
16
phân và làm tăng số lượng trứng cáo xanh đạt tới giai đoạn metaphase II [50]. Ở
trứng chó, bST (1-10 µg/ml) không có tác dụng lên sự trưởng thành nhân nhưng
hST (1 µg/ml) lại có dấu hiệu làm tăng tỉ lệ trứng chó đạt tới giai đoạn metaphase II
[38]. Điều này cho thấy rằng trứng của chó và các loài động vật khác và cả giữa
những giống chó khác nhau có đáp ứng khác nhau với hormone.
Các chất cung cấp năng lượng và chống oxy hóa
Sự tồn tại của các tế bào trong nuôi cấy in vitro đòi hỏi bổ sung đầy đủ các chất
mang năng lượng. Tuy nhiên, tổ hợp các chất mang năng lượng phù hợp nhất, hỗ
trợ nhất cho quá trình trưởng thành nhân ở trứng chó còn ít được biết.
Nồng độ pyruvate trong môi trường thường là 0,25 mM nhưng khi được kiểm
tra với nồng độ cao hơn (2,5 mM) trong môi trường không có protein cho thấy có 7-
33% trứng chó hoàn tất sự trưởng thành nhân sau 48 giờ nuôi cấy [45].
Bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy cũng đã được nghiên cứu. Songsasen

và cs (2002) báo cáo rằng thêm 11 mM glucose vào môi trường nuôi cấy không
thúc đẩy sự thành thục trứng chó. Tác giả cho rằng có thể do trong thực nghiệm,
glucose độc lập là nguồn năng lượng không đầy đủ cho trứng chó như đối với trứng
chuột hay nồng độ cao của glucose có ảnh hưởng bất lợi lên sự thành thục của
trứng chó nuôi trong điều kiện nồng độ oxy cao (20%) [45].
Để giảm những tổn hại do hoạt tính oxy hóa gây ra bởi nồng độ oxy cao trong
điều kiện nuôi cấy in vitro mà tế bào phải tiếp xúc, các nhà nghiên cứu đã thêm các
hợp chất có tính chống oxy hóa vào môi trường nuôi. Beta-mercaptoethanol (bME),
có gốc glutathione là một hợp chất chống oxy hóa được sinh tổng hợp bởi các tế bào
sống đã được thêm vào môi trường nuôi cấy. Sự hiện diện của chất này thúc đẩy
quá trình sinh tổng hợp glutathione và kích thích sự trưởng thành tế bào chất của
trứng heo và bò [27]. Tuy nhiên trong báo cáo duy nhất về việc thêm chất chống
oxy hóa này vào môi trường nuôi chín trứng chó với nồng độ 0,25 mM đã không cải
thiện sự hoàn tất giảm phân của trứng chó [45].
1.3.3. Các điều kiện nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy trong vi giọt, mật độ nuôi trong vi giọt
Nuôi cấy trong vi giọt là lựa chọn phổ biến để nuôi thành thục trứng ở các loài
động vật khác nhau bao gồm cả đối tượng chó. Với cách nuôi cấy này, yếu tố sinh
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
17
lý chính được tính bởi tỉ lệ thể tích của vi giọt so với số trứng nuôi trên vi giọt. Số
lượng lớn các tổ hợp trứng-tế bào ổ được nuôi trong vi giọt nhỏ có thể dẫn tới khả
năng ức chế sự hoàn tất giảm phân vì những nhân tố này có thể được tiết bởi các tế
bào hạt vào môi trường nuôi. Những nhân tố này có thể ức chế sự tách ra của các
nếp gấp; do đó, ngăn cản trứng trải qua giai đoạn vỡ túi mầm. Trên thực tế, sự gián
đoạn thông tin giữa trứng và các tế bào hạt được cho là đáp ứng để hoàn tất quá
trình giảm phân ở trứng [24]. Trứng chó được nuôi trong thể tích môi trường rất

khác nhau và mật độ (số lượng trứng / thể tích môi trường) trứng cũng khác nhau.
Otoi và cs (2001) đã nghiên cứu về hiệu quả của mật độ trứng lên sự hoàn tất giảm
phân. Kết quả cho thấy ảnh hưởng của mật độ trứng tùy theo các giai đoạn của chu
kỳ sinh dục của chó. Trứng chó thu từ buồng trứng ở giai đoạn không động dục
được nuôi với mật độ 10 tổ hợp trứng-tế bào ổ/100 µl vi giọt cho thấy tỉ lệ đạt giai
đoạn metaphase II cao hơn (16,2%) so với nhóm 5 tổ hợp trứng-tế bào ổ (4,6%)
nhưng không có sự khác biệt ở nhóm trứng thu từ buồng trứng của chó ở giai đoạn
đình dục. Mật độ phù hợp của trứng liên quan tới chu kỳ sinh sản của chó được
khuyến cáo là 1:10 ở thời kỳ không động dục và 1:7 ở thời kỳ đình dục [33].
Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy trứng chó in vitro được báo cáo rất khác nhau (lên tới 120
giờ) nhưng tỉ lệ thành thục hoàn toàn còn thấp và còn nhiều ý kiến trái ngược. Do
đó, ở trứng chó, người ta thừa nhận sự đánh giá hoàn tất giảm phân trong giai đoạn
trung gian của sự cô đặc nhiễm sắc thể (vỡ túi mầm tới metaphase I) sau thời gian
nuôi cấy [5]. Việc kéo dài thời gian nuôi cấy có khả năng làm tăng tỉ lệ trứng đạt
giai đoạn vỡ túi mầm-metaphase II hơn giai đoạn túi mầm. Tuy nhiên, thời gian
nuôi kéo dài lại cho thấy tỉ lệ trứng chó thoái hóa cao [26]. Để vừa có được ích lợi
của việc nuôi cấy trong ống dẫn trứng và giới hạn tỉ lệ thoái hóa cao của cả trứng và
ống dẫn trứng sau thời gian nuôi cấy dài, hệ thống nuôi cấy hai bước (nuôi trong
ống dẫn trứng cô lập trong 24 giờ và nuôi trong vi giọt trong 48 và 72 giờ) đã được
báo cáo bởi Luvoni và cs (2003). Kết quả cho thấy sau 72 giờ nuôi cấy, tỉ lệ trứng
chó hoàn tất giảm phân ở nhóm được nuôi cấy bước đầu trong ống dẫn trứng cao
hơn so với nhóm nuôi trong vi giọt (74% so với 12,2%). Trứng thoái hóa có vẻ tăng
khi tăng tổng thời gian nuôi cấy nhưng trứng được nuôi bước đầu trong ống dẫn
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
18
trứng cho tỉ lệ thoái hóa sau 72 giờ và 96 giờ (24,4 và 54,8%) thấp hơn tương ứng

khi nuôi trong vi giọt (74,3 và 94,8%) [26].
Nhiệt độ nuôi cấy
Về nhiệt độ, trứng chó được nuôi cấy ở nhiệt độ từ 37 đến 39
o
C tùy theo các tác
giả nhưng chưa có thông tin chính thức về việc so sánh ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi
cấy tới kết quả thành thục nhân ở trứng chó.
Nồng độ O
2
Đã có những nghiên cứu khẳng định nồng độ O
2
của điều kiện nuôi cấy in vitro có
ảnh hưởng tới kết quả nuôi thành thục trứng chuột và trứng bò. Kết quả cho thấy mức
oxy ở 5% phù hợp hơn mức 20% trong không khí [15]. Hiện nay, mới chỉ có một báo
cáo duy nhất về ảnh hưởng của nồng độ oxy khi nuôi cấy trứng chó cho rằng 5% hay
20% oxy trong suốt quá trình nuôi trưởng thành với môi trường TCM199 và môi
trường CMRL 1066 không có dấu hiệu ảnh hưởng tới sự trưởng thành nhân [45].
1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện sinh lý chó
Tuổi chó
Theo nghiên cứu của Haenisch và cs (2003) cho thấy trứng thu nhận từ buồng
trứng của những con chó chưa thành thục về tính (4-6 tháng) thì không có khả năng
nuôi trưởng thành trong điều kiện in vitro. Trứng từ những chó đã động dục (đã trải
qua thành thục về tính) mới có khả năng phát triển hoàn tất tới giai đoạn metaphase
II [19], [45]. Tuy nhiên, khả năng phát triển này của trứng giảm đáng kể ở chó cái
lớn hơn 7 tuổi [19].
Giai đoạn động dục của chó
Các thông tin báo cáo về mối liên quan giữa các giai đoạn của chu kỳ động dục
chó và khả năng phát triển hoàn thiện của trứng chó tới metaphase II vẫn còn nhiều
quan điểm trái ngược. Một số nghiên cứu cho rằng không có sự liên quan [18], [34],
[39], [46], trong khi một số khác đã chứng minh rằng giai đoạn chu kỳ sinh sản ảnh

hưởng lớn đến năng lực phát triển của các trứng [23], [33], [41], [57], [59]. Tuy
nhiên, tất cả các báo cáo đều có chung quan điểm là các trứng thu nhận từ các nang
thuộc pha nang noãn hoặc nang tiền rụng (giai đoạn tiền động dục hoặc động dục)
có năng lực phát triển tới metaphase II cao nhất. Đặc biệt, trong nghiên cứu của
Willingham-Rocky và cs (2003) cho thấy trứng thu nhận từ buồng trứng của chó
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
19
giai đoạn đình dục có khả năng phát triển tới MII giống như chó giai đoạn động dục
[57].
Kích thước nang trứng
Theo nghiên cứu của Otoi và cs (2001) có sự khác biệt đáng kể giữa đường kính
của nang noãn giai đoạn động dục, đình dục và không động dục (119,2 ± 0,7, 107,7
± 0,7 và 103,6 ± 0,8 µm, tương ứng) [33]. Còn nghiên cứu khác của Songsasen và
Wildt (2005) cho thấy có tới 80% trứng thu nhận từ các nang có kích thước > 2 mm
đạt giai đoạn metaphase II trong khi chỉ có 16-38% trứng đạt giai đoạn này khi thu
những nang có kích thước nhỏ hơn (0,5 đến < 2 mm) [46]. Điều này cho thấy kích
thước nang trứng có ảnh hưởng tới khả năng phát triển của trứng chó tới giai đoạn
metaphase II.
Kích thước trứng
Kích thước trứng phù hợp cho nuôi thành thục cũng đã được nghiên cứu bởi
Otoi và cs. Nghiên cứu năm 2001 của Otoi chỉ ra rằng trứng có đường kính ≥ 120
µm được thu nhận nhiều hơn từ buồng trứng giai đoạn động dục so với các giai
đoạn khác. Ngoài ra tác giả còn chứng minh trứng phải có đường kính 100-120 µm
[32], [33] mới có khả năng hoàn tất giảm phân, và sự trưởng thành nhân ở các trứng
có đường kính 120 µm cao hơn so với các trứng nhỏ hơn [33].
1.4.

Kết quả tạo phôi chó
in vitro

Do những kết quả hạn chế trong nuôi thành thục trứng chó in vitro nên kết quả
thụ tinh, và nuôi phôi chó cũng rất hạn chế. Mahi và Yanagimachi (1976) là nhóm
đầu tiên báo cáo về thử nghiệm thụ tinh ống nghiệm ở loài này và thu được khoảng
20-30% trứng thụ tinh được đánh giá thông qua sự hiện diện của tiền nhân đực
trong các noãn bào [28]. Songsasen và cs (2002) đã thụ tinh trong ống nghiệm đối
với trứng nuôi cấy in vitro và thấy rằng 34% trứng có sự xâm nhập của tinh trùng
(sự thụ tinh được đánh giá bởi sự hiện diện của hai nhân nguyên và một đuôi tinh
trùng duy nhất trong tế bào chất trứng). Thông thường, sự thụ tinh được ghi nhận
chỉ khoảng 4% tổng số trứng. Trong nghiên cứu khác cũng của Songsasen và cs, tác
giả thu được bảy phôi giai đoạn 2-12 tế bào sau khi thụ tinh 85 trứng [45]. Một
nghiên cứu gần đây của Rodrigues và cs (2004) đạt được tỉ lệ thụ tinh 30%, một nửa
trong số đó là thụ tinh đa tinh trùng. Các tác giả này cũng cho biết tỷ lệ thụ tinh của
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

T
ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương
20
trứng thu nhận từ chó giai đoạn động dục là 42,5%, giai đoạn không động dục là
34,3% và giai đoạn hoàng thể hóa là 18,6%. Tổng số các phôi phát triển sau giai
đoạn 8 tế bào trong các nghiên cứu khoảng 10% [41]. Trong nghiên cứu khác của
Saikhun và cs (2008), tỉ lệ phôi 2 tế bào thu được khi nuôi phôi trong môi trường
SOF là 33,6% [43].
Cho tới nay, chỉ có Otoi và cs (2001) đã nuôi thành công 1 phôi chó tới giai
đoạn phôi nang từ 217 trứng nuôi thành thục trong ống nghiệm. Các báo cáo về
chuyển phôi cũng rất hạn chế [33]. England và cs (2001) đã thu nhận trứng từ
những chó được kích thích động dục sau đó nuôi cấy trong 24-72 giờ và thụ tinh.
Các tác giả đã chuyển 88 phôi giai đoạn 1 và 2 tế bào vào con nhận. Kết quả là có

một phôi được ghi nhận nhờ siêu âm vào ngày thứ 20 sau khi chuyển . Tuy nhiên,
phôi này đã bị hỏng 2 ngày sau đó [36].

Hiện nay, các nghiên cứu in vitro về sinh sản của chó ở Việt Nam còn hạn chế
cả về số lượng nghiên cứu và kết quả đạt được. Hiện chỉ có nhóm của tác giả Quách
Tuyết Anh, Trần Thị Dân trường Đại học Nông lâm Tp. HCM đã báo cáo kết quả
nuôi thành thục trứng chó in vitro đạt 0,75% [35]. Nghiên cứu này sẽ giúp tìm hiểu
thêm về các đặc điểm nuôi thành thục trứng chó và thụ tinh cho trứng chó in vitro.

Hình 5: Phôi chó
thu nhận in vitro ở
các giai đoạn 2 tế
bào (A); 4 tế bào
(B); 8 tế bào (C);
16 tế bào (D).
(Nguồn: Shaikhun
và cs (2008)
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm


Nội dung nghiên cứu
21
Ngô Thị Mai Hương


PHẦN 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

NỘI DUNG 1: Nuôi thành thục trứng chó in vitro
2.1.1. Nguyên liệu
Buồng trứng chó giống nội đang ở độ tuổi sinh

sản (1,5 – 4,5 tuổi). Buồng trứng được thu nhận tại
lò mổ của gia đình anh Hải, số nhà 15/8 Bùi Thị
Xuân, P3, Q. Tân Bình, Tp.HCM.



2.1.2. Môi trường – Hóa chất
Dung dịch nước muối sinh lý 0,9% + 100 IU/ml kháng sinh, 35-39
0
C cho quá
trình rửa và giữ buồng trứng từ lò mổ về phòng thí nghiệm.
Môi trường thu nhận trứng: TCM-199 + 100IU/ml gentamycin; pH = 7,4; nhiệt
độ 38,5
0
C. Môi trường này được sử dụng để thu nhận trứng từ buồng trứng.
Môi trường ủ trứng (Theo Sonya Wesselowski, 2004): TCM 199 + 25µM β-
mercaptoethanol + 10 ng/ml EGF + 0,25 mM pyruvate + 2,0 mM glutamine + 0,1%
polyvinyl alcohol + 100 IU/ml gentamycin + 5IU/ml hCG. Đây là môi trường
dùng để tạo đỉnh hormone cho trứng trước khi nuôi
Môi trường nuôi thành thục trứng (Theo Sonya Wesselowski, 2004): TCM 199
+ 25µM β-mercaptoethanol + 10 ng/ml EGF + 0,25 mM pyruvate + 2,0 mM
glutamine + 0,1% polyvinyl alcohol + 100 IU/ml gentamycin. Thành phần môi
trường nuôi thành thục trứng giống với môi trường ủ trứng song không có hormone.
Dầu khoáng: dùng để phủ các vi giọt trong quy trình nuôi thành thục trứng chó
tránh sự bay hơi nước của các vi giọt đồng thời giữ nhiệt cho vi giọt lâu hơn trong
điều kiện thao tác ngoài tủ nuôi ủ.

2.1.3. Dụng cụ - Thiết bị
Xem phụ lục 1: Dụng cụ - Thiết bị
Hình 6:

Chó giống nội
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm


Nội dung nghiên cứu
22
Ngô Thị Mai Hương


Hình 7
: Xác định tuổi chó
thông qua hình thái răng
2.1.4. Phương pháp
Xác định tuổi chó
Chó tại lò mổ được xác định tuổi trước khi tiến hành mổ thu nhận buồng trứng.
tuổi của chó được xác định thông qua hình thái răng (bảng 1)
Bảng 1: Thời gian mọc răng của chó
Răng Thời gian
Tất cả răng sữa 8 tuần
Răng cửa một, 1 số răng tiền hàm, hàm 4-5 tháng
Răng vĩnh viễn mọc đủ 6-7 tháng
Răng trắng sạch 1 năm
Đỉnh răng cửa dưới một mòn 1 năm rưỡi
Dơ và vàng ở các răng phía sau do cao răng 2 năm
Đỉnh răng cửa dưới 2 mòn 2 năm rưỡi
Đỉnh răng cửa trên một mòn 3 năm rưỡi
Đỉnh răng cửa trên hai mòn 4 năm rưỡi
(Nguồn: The Merck Veterinary manual, 2006)

Những chó cái ở độ tuổi sinh sản
(1,5-4,5tuổi) được tiến hành mổ và
thu nhận buồng trứng.



Thu nhận buồng trứng
Sau khi chó được xác định tuổi, được loại sạch lông (bởi các nhân viên lò mổ),
những chó đạt yêu cầu được phân loại để thu buồng trứng. Một đường mổ dài
khoảng 3 cm bắt đầu từ rốn kéo xuống bụng được thực hiện với dao mổ số 11 và
cán dao số 3. Buồng trứng được lấy ra khỏi ổ bụng qua đường mổ này và rửa bằng
nước muối sinh lý ấm bổ sung kháng sinh.
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm


Nội dung nghiên cứu
23
Ngô Thị Mai Hương



Những buồng trứng được lựa chọn cho thí nghiệm là những buồng trứng có
nang nổi từ 0,5-2 mm. Những buồng trứng không có nang nổi hay nang nổi to (>4
mm) hay có thể vàng đều không được lựa chọn cho thí nghiệm. Các buồng trứng
được giữ trong dung dịch sinh lý 35-38
0
C và vận chuyển về phòng thí nghiệm.

Thu nhận trứng
Tại phòng thí nghiệm, buồng trứng được rửa lại 2 lần bằng dung dịch nước muối

sinh lý nói trên. Trứng được thu nhận bằng phương pháp rạch buồng trứng buồng
trứng với dao mổ số 21, cán dao số 4 trong môi trường TCM199. Dung dịch sau khi
rạch được soi tìm dưới kính hiển vi soi nổi. Các trứng có tế bào chất đen đều, có
đường kính ≥ 100 µm và có nhiều hơn 2 lớp tế bào hạt bám đều xung quanh được
thu nhận cho thí nghiệm.


Hình 8
: Mổ và thu nhận buồng trứng (đầu mũi tên)

c

b

a

Hình
9
:
Các hình thái buồng trứng. (a) buồng trứng không có nang nổ
i;
(b) buồng trứng với nang nổi từ 0,5-2 mm; (c) buồng trứng có thể vàng
Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm


Nội dung nghiên cứu
24
Ngô Thị Mai Hương

Nuôi thành thục trứng
Thí nghiệm nuôi thành thục trứng trong đề tài được mô phỏng theo các diễn tiến
sinh lý sinh sản của chó. Như đã đề cập trong phần tổng quan tài liệu, quá trình
thành thục của trứng chó không diễn ra trong điều kiện nồng độ hormone cao như
các loài khác. Trứng chó chịu một ảnh hưởng của nồng độ hormone cao trong nang
buồng trứng sau đó được giải phóng khỏi nang và tiến hành giảm phân lần thứ nhất
trong ống dẫn trứng trong môi trường có nồng độ hormone thấp hơn.
Thí nghiệm được thiết kế như sau: trứng sau khi chọn lọc được ủ trong môi
trường có hormone hCG với nồng độ 5 IU/ml trong 2 giờ (nhằm tạo đỉnh hormone
giống trong nang buồng trứng) sau đó được nuôi thành thục trong môi trường không
có hormone (nhằm tạo điều kiện giống ống dẫn trứng).
Tỉ lệ trứng chó thành thục sau nuôi được đánh giá sau 3 khoảng thời gian nuôi ủ:
48 giờ, 60 giờ và 72 giờ. Trứng chó thành thục được xác định thông qua hình thái
nhân trứng đã được nhuộm với thuốc nhuộm PI 200µg/ml.
Quy trình nhuộm PI
Trứng/phôi được nhuộm với thuốc nhuộm PI (propidium iodide) theo quy trình
của Reyes và cs (2006). Quy trình nhuộm được tiến hành như sau: trứng/phôi được
loại bỏ hoàn toàn các tế bào cumulus bám xung quanh sau đó được cố định trong
paraformadehyde 5% trong 30 phút. Các trứng/phôi này được rửa lại bằng dung
dịch rửa PBS-1% paravinyl alcohol 2 lần và được ủ trong Triton-X100 0,1% trong 2
giờ ở nhiệt độ phòng để tạo các lỗ thủng trên màng trong suốt và màng sinh chất
của trứng/phôi. Các phân tử propidium iodide đi vào tế bào chất và vào nhân qua
các lỗ này, bắt cặp với DNA trong nhân. Sau 2 giờ ủ, trứng/phôi được rửa lại 2 lần
Hình 10:
Các giai đoạn thu nhận trứng
(a) Rửa buồng trứng; (b) Buồng trứng đã được rạch; (c) Dịch nang sau khi
rạch buồng trứng; (d) Các trứng đủ tiêu chuẩn cho quy trình nuôi thành thục

X 20

X 20

d

b

a

c

Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm


Nội dung nghiên cứu
25
Ngô Thị Mai Hương


bằng PBS-1% paravinyl alcohol trước khi chuyển vào thuốc nhuộm PI 200µg/ml
trong 30 phút. Cuối cùng, trứng/phôi được rửa lại 2 lần cũng với dung dịch rửa trên
sau đó được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng 480 nm [37]. Các
hình ảnh về trứng và nhân trứng được ghi lại cho bước đánh giá hình thái nhân sau
này.
Đánh giá trứng
Đánh giá hình thái tế bào: các trứng sau thời gian nuôi thành thục được đánh giá
tỉ lệ sống/thoái hóa thông qua hình thái tế bào chất. Những trứng có hình thái tế bào
chất đen đều, màng tế bào chất căng, trứng có hình khối cầu tròn được đánh giá là
trứng sống. Trứng có tế bào chất bị co lại, phân mảnh, có sự xuất hiện các không
bào hay hình dạng của trứng bị biến đổi (không còn dạng khối cầu) được đánh giá là
thoái hóa.

Việc đánh giá hình thái nhân của trứng chó ở các giai đoạn phát triển được nhận
định dựa theo hình ảnh của Saikhun và cs, 2008 (Hình 11) [48].
Hình 11
:

Trứng chó sau nuôi thành thục nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst
33342. (A) Trứng giai đoạn túi mầm; (B) trứng giai đoạn vỡ túi mầm;