ứng dụng kỹ thuật qf - pcr vào chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn số lượng nhiễm sắc thể ở người

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ








BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)



ỨNG DỤNG KỸ THUẬT QF-PCR
VÀO CHẨN ĐOÁN NHANH TRƯỚC SINH
RỐI LOẠN SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ Ở NGƯỜI



CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Ký tên)





NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN PHÙNG NHƯ TOÀN

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ
SỞ KH&CN TP.HCM BỆNH VIỆN TỪ DŨ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)







THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 8/2013


CÁM ƠN


Để thực hiện thành công đề tài này, nhóm nghiên cứu đã nhận
được sự tham gia, hỗ trợ và giúp đỡ quý báu của các bệnh nhân,
đồng nghiệp và các tổ chức.
Nhóm nghiên cứu xin trân trọng cám ơn:
- Sở Khoa học và Công nghệ đã cấp một phần kinh phí để
thực hiện đề tài.
- Ban Giám đốc và các đồng nghiệp ở Đơn vị Chẩn đoán
trước sinh, Khoa Khám bệnh, các khoa chuyên môn và các
phòng chức năng của Bệnh viện Từ Dũ đã tạo điều kiện
mọi mặt để đề tài được triển khai và đạt kết quả tốt.
- Giáo sư Bác sĩ The-Hung Bui và Bệnh viện Karolinska,
Stockholm, Thụy Điển đã giúp đỡ về mặt kỹ thuật và các
tài liệu tham khảo.

- Đặc biệt cám ơn vì sự hiểu biết và tham gia của các gia
đình bệnh nhân, yếu tố quyết định cho sự thành công của
đề tài.


TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Lệch bội là nguyên nhân quan trọng gây ra sẩy thai và dị tật bẩm sinh. QF-
PCR là kỹ thuật mới trong chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện và can thiệp sớm
thai bị các bất thường này.
Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) lựa chọn các locus STR thích hợp cho
phản ứng QF-PCR để phát hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 21, 18, 13,
X, Y; (2) xác định tỉ lệ hiện diện của các alen, độ dài và mức độ dị hợp tử của các
locus STR được lựa chọn; (3) xác định độ tương hợp kết quả QF-PCR với kết quả
karyotype tế bào dịch ối và xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương
và tiên đoán âm của phương pháp QF-PCR.
Đối tượng và phương pháp của nghiên cứu là 400 trường hợp thai có nguy
cơ cao bị rối loạn nhiễm sắc thể đã được tầm soát phát hiện qua tiền căn sinh con
dị tật bẩm sinh, xét nghiệm và siêu âm sẽ được chọc ối và chẩn đoán trước sinh
nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y bằng kỹ thuật QF-PCR và so sánh kết quả với kỹ
thuật tiêu chuẩn vàng là karyotype.
Kết quả nghiên cứu đã xác định được các locus STR thích hợp cho phản ứng
QF-PCR để phát hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể số 13 (D13S252,
D13S305, D13S634, D13S742, D13S800), số 18 (D18S386, D18S535, D18S976,
D18S978, D18S1002, D18S1364, GATA178F11), số 21 (D21S11, D21S1411,
D21S1435, D21S1442, D21S1444, D21S2055) và nhiễm sắc thể giới tính
(DXYS267 DXS1187 DXS981 XHPRT DXS2390). Đây là các locus STR có từ 5
đến 30 loại alen với tỉ lệ dị hợp tử cao trên 70%. Mức độ tương hợp giữa kết quả
bình thường và bất thường của kỹ thuật QF-PCR với kết quả karyotype là 100%.
Kỹ thuật QF-PCR có độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm đều

đạt 100%. Khả năng trả lời kết quả cho các mẫu xét nghiệm bằng QF-PCR là
99,5% với thời gian trung bình từ 36 đến 48 giờ.



SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Aneuploidy is an important issue causing miscarriage and congenital
abnormalities. QF-PCR is a new method in prenatal diagnosis of those disorders.
Objectives of the study were (1) to chose appropriate STR loci for QF-PCR
to detect aneuploidy of chromosome 21, 18, 13, X, Y; (2) to explore the rate and
size of alleles and heterozygosity of chosen STR loci; (3) to evaluate the
concordance between QF-PCR and karyotype of amniocyte and the sensitivity,
specificity, positive predictive value and negative predictive value of QF-PCR.
The study included 400 pregnancies detected at high risk of chromosome
disorders via history of congenital abnormalities or biochemistry and ultrasound
screening were performed amniocentesis and analysed chromosome 13, 18, 21, X
and Y with QF-PCR and compared to gold standard karyotype.
The study has identified appropriate STR loci for QF-PCR to detect
aneuploidy of chromosome 13 (D13S252, D13S305, D13S634, D13S742,
D13S800), 18 (D18S386, D18S535, D18S976, D18S978, D18S1002, D18S1364,
GATA178F11), 21 (D21S11, D21S1411, D21S1435, D21S1442, D21S1444,
D21S2055) and sex chromosomes (DXYS267 DXS1187 DXS981 XHPRT
DXS2390). Those STR loci had 5 to 30 types of allele with heterozygosity higher
than 70%. Either normal or abnormal results were 100% concordant between QF-
PCR and karyotype. The specificity, positive predictive value and negative
predictive value of QF-PCR were 100%. QF-PCR could produce conclusion in
99.5% of cases with average turn around time 36 to 48 hours.
THÔNG TIN TÓM TẮT ĐỀ TÀI

1. Tên đề tài: Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR vào chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn
số lượng nhiễm sắc thể ở người.
2. Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Khắc Hân Hoan và Phùng Như Toàn.
3. Cơ quan chủ trì: Bệnh viện Từ Dũ.
4. Thời gian thực hiện đề tài: 8/2010 – 6/2013.
5. Kinh phí được duyệt: 320.000.000 đồng.
6. Kinh phí đã cấp: 288.000.000 đồng.
- Cấp đợt 1: 200.000.000 đồng theo thông báo số : 128 /TB-SKHCN ngày 16/8/2010.
- Cấp đợt 2: 88.000.000 đồng theo thông báo số: 19 /TB-SKHCN ngày 8/5/2013.
5. Mục tiêu:
- Lựa chọn các locus STR thích hợp cho phản ứng QF-PCR để phát hiện các trường
hợp lệch bội nhiễm sắc thể 21, 18, 13, X, Y.
- Xác định tỉ lệ hiện diện của các alen, độ dài và mức độ dị hợp tử của các locus STR
được lựa chọn.
- Xác định độ tương hợp kết quả QF-PCR với kết quả karyotype tế bào dịch ối và xác
định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm của phương pháp QF-
PCR.
6. Nội dung thực hiện (đối chiếu với hợp đồng đã ký):
TT Công việc yêu cầu thực hiện theo HĐ Ghi chú
1 Lựa chọn các locus STR thích hợp cho phản ứng QF-PCR
để phát hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 21, 18,
13, X, Y.
Đã thực hiện xong
2 Xác lập quy trình và thực hiện kỹ thuật QF-PCR trên tế bào
dịch ối.
Yêu cầu:
- Quy trình kỹ thuật QF-PCR được Hội đồng khoa học
bệnh viện phê duyệt và đưa vào thực hiện thường quy.
- Thực hiện kỹ thuật QF-PCR đủ 400 mẫu có kết quả
karyotype đạt yêu cầu.

Đã thực hiện xong
3 Nuôi cấy tế bào ối và phân tích karyotype để làm cơ sở đối
chứng với QF-PCR.
Yêu cầu: Thực hiện nuôi cấy tế bào ối và phân tích
karyotype đủ 400 mẫu có kết quả đạt yêu cầu.
Đã thực hiện xong
4 Thống kê và cập nhật dữ liệu, viết báo cáo chuyên đề:
- Xác định tỉ lệ hiện diện của các alen và mức độ dị hợp
Đã thực hiện xong
tử của các locus STR được lựa chọn;
- Thống kê tần suất các loại lệch bội nhiễm sắc thể;
- Báo cáo phân tích sự tương quan giữa kỹ thuật QF-PCR
và karyotype.
5 Báo cáo nghiệm thu cấp cơ sở (bệnh viện Từ Dũ) Đang thực hiện
6 Báo cáo tổng kết nghiệm thu cấp quản lý
Yêu cầu: Báo cáo toàn văn, báo cáo tóm tắt, đĩa CD.
Đang thực hiện
7. Sản phẩm của đề tài
TT Tên sản phẩm Ghi chú
1 Báo cáo tổng kết (toàn văn và tóm tắt, tài liệu và CD)
(được trình bày trong báo cáo này)
Theo yêu cầu HĐ
2 Quy trình kỹ thuật QF-PCR trên tế bào dịch ối trong chẩn
đoán trước sinh rối loạn nhiễm sắc thể (1 tập tài liệu hướng
dẫn chi tiết toàn bộ quy trình).
(được trình bày trong phụ lục sản phẩm)
Theo yêu cầu HĐ
3 1 báo cáo chuyên đề “Thống kê tần suất các loại lệch bội
nhiễm sắc thể”.
(được trình bày trong phụ lục sản phẩm)

Theo yêu cầu HĐ
4 1 báo cáo chuyên đề “Xác định tỉ lệ hiện diện của các alen
và mức độ dị hợp tử của các locus STR được lựa chọn”.
(được trình bày trong phụ lục sản phẩm)
Theo yêu cầu HĐ
5 1 báo cáo phân tích sự tương quan giữa kỹ thuật QF-PCR và
karyotype.
(được trình bày trong báo cáo này)
Theo yêu cầu HĐ
6 1 bài báo khoa học (Đăng trên tạp chí khoa học và báo cáo
tại hội nghị khoa học chuyên ngành).
(được trình bày trong phụ lục sản phẩm)
Theo yêu cầu HĐ
7 Đào tạo 2 thạc sĩ sinh học chuyên ngành di truyền từ đề tài
này.
(được trình bày trong phụ lục sản phẩm)
Ngoài yêu cầu HĐ
8 Tổ chức 1 hội thảo chuyên đề: Chẩn đoán trước sinh và kỹ
thuật QF-PCR.
(được trình bày trong phụ lục sản phẩm)
Ngoài yêu cầu HĐ






I
MỤC LỤC

Mục lục I
Danh sách các chữ viết tắt II
Danh sách các bảng III
Danh sách các hình VI
Danh sách các lưu đồ VI

PHẦN MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp 3
1.2. Các phương pháp lấy mẫu chẩn đoán trước sinh 7
1.3. Kỹ thuật di truyền trong chẩn đoán trước sinh 10
1.4. Tình hình nghiên cứu chẩn đoán trước sinh rối loạn nhiễm sắc thể ở
Việt Nam 21
CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Đối tượng nghiên cứu 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu 24
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37
3.1. Đặc điểm của các đối tượng nghiên cúu 37
3.2. Các locus str trong phản ứng QF-PCR 38
3.3. Đặc điểm các locus str 42
3.4. Kết quả QF-PCR so với kết quả Karyotype 51
Cùng hợp tử 57
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

Tài liệu tham khảo




II

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT
bp base pair: cặp base
CĐTS chẩn đoán trước sinh
CGH Comparative Genomic Hybridization: lai bộ gen so sánh
CMV Cytomegalovirus
DHT dị hợp tử
DNA Deoxyribonucleic Acid
DTBS dị tật bẩm sinh
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid
FBS Fetal Bovine Serum: huyết thanh thai bò
FISH Fluorescence in situ Hybridization: lai tại chỗ phát huỳnh quang
Hc hội chứng
ISCN International System for Human Cytogenetic Nomenclature: Hệ
thống quốc tế định danh di truyền tế bào người
MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
NC nguy cơ
NCBI National Center for Biotechnology Information: Trung tâm
Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia
NST Nhiễm sắc thể
PCR Polymerase Chain Reaction
QF–PCR Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction
rfu relative fluorescent unit: đơn vị huỳnh quang tương đối
STR short tandem repeat
VNTR variable number tandem repeat
XN xét nghiệm

III
DANH SÁCH CÁC BẢNG

SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG

1.1 So sánh một số ưu điểm và nhược điểm chính của các kỹ thuật 17
1.2 Kết quả các nghiên cứu chẩn đoán lệch bội trước sinh bằng QF-PCR 18
1.3 Đặc điểm các các bộ kit QF-PCR chẩn đoán lệch bội phổ biến 20
2.1 Các locus đặc hiệu nhiễm sắc thể được khảo sát trong các phản ứng 31
2.2 Các locus đặc hiệu nhiễm sắc thể được khảo sát thêm khi cần thiết 32
2.3 Đánh giá tỉ số giữa các alen trong cùng một locus 35
3.1 Đặc điểm của các đối tượng nghiên cứu. 37
3.2 Các locus bị loại ra và các locus STR được thêm vào ở phiên bản 2 40
3.3 Độ dài của các locus str so với công bố trên NCBI 43
3.4 Độ dị hợp tử của các locus STR 44
3.5 Tần suất alen của các locus NST 13 46
3.6 Tần suất các loại alen của các locus NST 18 49
3.7 Tần suất alen của các locus NST 21 50
3.8 Tần suất alen của các locus NST giới tính 51
3.9 Kết quả chẩn đoán bằng QF-PCR theo tuổi thai phụ 52
3.10 Kết quả QF-PCR theo chỉ định chọc ối 52
3.11 Sự tương hợp giữa kết quả QF-PCR với kết quả karyotype 54
3.12 So sánh kết quả QF-PCR với kết quả karyotype, 2 mẫu không kết luận
được xem là bình thường
57
3.13 So sánh kết quả QF-PCR với kết quả karyotype kết hợp, 2 mẫu không
kết luận được xem là bất thường
57

IV
DANH SÁCH CÁC HÌNH

SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG

1.1. Karyotype của cá thể nữ bị hội chứng Down 47,XX,+21 4
1.2. Karyotype của cá thể nữ bị hội chứng Edwards 47,XX,+18. 5
1.3 Kỹ thuật chọc hút dịch ối dưới sự hướng dẫn của siêu âm 8
1.4 Biểu diễn kết quả phân tích số lượng NST bằng QF-PCR 14
1.5 Alen 9 của locus STR có tên TH01 có trình tự lõi 4 nucleotide 14
2.1 Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 27
2.2 Vị trí các locus STR trên các NST 13, 18, 21, X, Y và các NST khác 33
3.1 Các locus ở dạng dị hợp tử với tỉ số tín hiệu không kết luận được 39
3.2 Kết quả điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất với IV 2,5 kV, IT 20”

41
3.3 Kết quả điện di theo sau khi tối ưu với IV 2,3 kV, IT 20” 41
3.4 Nhân vi đoạn của locus 13B (D13S634) ở thai và người cha 47
3.5 Kết quả QF-PCR khảo sát đột biến vi nhân đoạt locus 13A (D13S742)
ở thai phụ, người cha và thai
48
3.6 Kết quả QF-PCR và karyotype của mẫu 46,XX,dup(18) 55
3.7 Kết quả QF-PCR và FISH trường hợp monosomy X thể khảm 56
3.8 Kết quả QF-PCR mẫu ối nhiễm DNA mẹ trước (a) và sau (b) nuôi cấy 58



V

DANH SÁCH CÁC LƯU ĐỒ

SỐ TÊN LƯU ĐỒ TRANG

1.1 Quy trình thực hiện nuôi cấy và lập bộ karyotype 10
2.1 Quy trình chọn mẫu và thực hiện nghiên cứu 25
2.2 Tiến trình thực hiện kỹ thuật QF-PCR 30



1
PHẦN MỞ ĐẦU

Rối loạn nhiễm sắc thể về số lượng và cấu trúc là nguyên nhân của gần
50% các trường hợp sẩy thai và chiếm 0,5 – 1% số trẻ được sinh ra. Hầu hết
những thai bị lệch bội kiểu tam thể (trisomy) chết lưu trong tử cung hoặc nếu
sống sót sau sinh thì sẽ bị đa dị tật bẩm sinh, chậm phát triển thể chất, đần
độn, tử vong sớm. Khoảng 85% các bất thường này là do trisomy 13, 18, 21
hoặc lệch bội nhiễm sắc thể giới tính.
Với tỉ lệ trẻ sinh sống trisomy 21 là 1/750 [16], mỗi năm Việt Nam có
khoảng 2.129 trẻ sinh ra mắc hội chứng Down và cùng với các rối loạn nhiễm
sắc thể khác gây gánh nặng lớn cho gia đình và xã hội. Vì thế chẩn đoán trước
sinh phát hiện sớm các trường hợp thai bị rối loạn nhiễm sắc thể để can thiệp
kịp thời là biện pháp dự phòng tích cực, hiệu quả cao.
Từ đầu những năm 1970 đến nay, đã có nhiều phương pháp xét nghiệm
di truyền áp dụng vào khảo sát nhiễm sắc thể như karyotype, FISH, MLPA.
Các phương pháp này cho kết quả nhanh nhưng đòi hỏi nhiều công lao động,
khó thực hiện với số lượng mẫu lớn và không loại trừ được trường hợp bị
ngoại nhiễm DNA của mẹ. Gần đây, kỹ thuật array-CGH đã được phát triển
để khảo sát nhiễm sắc thể, tuy nhiên giá thành còn khá cao.

Năm 1993, kỹ thuật QF-PCR khảo sát các locus STR đã được phát triển
với khả năng áp dụng vào khảo sát nhanh số lượng nhiễm sắc thể. QF-PCR có
nhiều ưu điểm như thời gian ra kết quả nhanh, độ chính xác và độ nhạy cao, ít
công lao động, giá thành thấp, năng suất cao, có thể phát hiện ngoại nhiễm
DNA mẹ. Vì vậy, QF-PCR đã được áp dụng vào chẩn đoán trước sinh hội
chứng Down ở một số nước trên thế giới như Anh, Ý, Thụy Điển, Úc, Hồng
Kông, Trung Quốc.

2
Từ năm 1999, bệnh viện Từ Dũ đã sử dụng kỹ thuật karyotype vào
chẩn đoán trước sinh. Đến năm 2006 đã triển khai thêm kỹ thuật FISH và
MLPA. Hiện nay nhu cầu chẩn đoán trước sinh của xã hội ngày càng cao, số
lượng chẩn đoán ngày càng nhiều, phải có kết quả chẩn đoán càng sớm càng
tốt đã đặt ra nhu cầu thay đổi kỹ thuật mới, hiện đại để phù hợp.
Tại Việt Nam, hiện nay chỉ mới có một số nơi như bệnh viện Từ Dũ,
Đại học Y Dược TPHCM, Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện Phụ Sản Trung
Ương và bệnh viện Hùng Vương có thể thực hiện chẩn đoán trước sinh nhiễm
sắc thể thai. Tuy nhiên các trung tâm này chỉ dừng lại ở việc sử dụng kỹ thuật
karyotype, FISH hoặc MLPA.
Với những ưu điểm của mình, QF-PCR hoàn toàn có thể thay thế vai
trò của kỹ thuật FISH và karyotype trong phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể.
Tuy nhiên, các bộ chẩn đoán QF-PCR thương mại hiện nay đều dựa trên các
locus STR của người da trắng, chưa có báo cáo nào về kỹ thuật này được triển
khai ở nước ta, tính đa hình và mức độ dị hợp tử của các locus STR sử dụng
trong khảo sát nhiễm sắc thể của người Việt Nam vẫn chưa được xác lập. Vì
thế, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR vào chẩn
đoán nhanh trước sinh rối loạn số lượng nhiễm sắc thể ở người” với các mục
tiêu như sau:
1. Lựa chọn các locus STR thích hợp cho phản ứng QF-PCR để phát
hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 21, 18, 13, X, Y.

2. Xác định tỉ lệ hiện diện của các alen, độ dài và mức độ dị hợp tử của
các locus STR được lựa chọn.
3. Xác định độ tương hợp kết quả QF-PCR với kết quả karyotype tế bào
dịch ối và xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và tiên đoán
âm của phương pháp QF-PCR.

3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÁC RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG GẶP
Các nhiễm sắc thể (NST) có thể bị đột biến về số lượng hoặc cấu trúc.
Bất thường có thể xảy ra trên một hay nhiều NST. Các bất thường được gọi là
thể đồng nhất hoặc thể thuần khi tất cả các tế bào đều mang nó và được xem
là thể khảm khi chỉ một số tế bào có bất thường này.
Nguyên nhân bất thường số lượng NST có thể là do sai lỗi khi phân ly
trong quá trình phân bào. Sự sai lỗi thường ngẫu nhiên, thường gặp khi tuổi
làm mẹ cao hoặc khi 1 trong 2 bố mẹ có mang rối loạn cấu trúc NST.
Bất thường NST là nguyên nhân của hơn 50% các trường hợp sẩy thai
tự nhiên trong 3 tháng đầu thai kỳ và chiếm gần 7% các trường hợp tử vong
sơ sinh. Khoảng 0,6% trẻ lúc sinh phát hiện có bất thường NST. Trong đó,
lệch bội NST 13, 18, 21, X và Y vẫn có thể sống đến khi sinh và chiếm đến
85% các trường hợp rối loạn NST [12],[64].
1.1.1. Trisomy 21 – hội chứng Down
Hội chứng (Hc) Down là rối loạn NST có tần suất 1/700 – 1/800 trẻ sơ
sinh. Nguy cơ sinh con Hc Down tăng theo tuổi mẹ khi sinh: nguy cơ 1/2.000
ở thai phụ 20 tuổi và tăng lên 1/100 ở thai phụ 40 tuổi [55].
Bệnh nhân Hc Down thường có vẻ mặt đặc trưng: mặt tròn, dẹt, mũi
tẹt, khe mắt xếch, có nếp quạt che góc trong mắt, tai nhỏ, đóng thấp, vành tai
kém uốn cong, miệng nhỏ, lưỡi to, dày, không có đường rãnh trung tâm và
thường thè ra ngoài, cổ to, ngắn, gáy phẳng rộng, lòng bàn tay có rãnh khỉ…

kèm theo các bất thường về hình thái khác như dị tật tim, dị tật ống tiêu hóa,
lùn và chậm phát triển tâm thần. Khoảng 15 – 20% trẻ bị Hc Down chết sớm

4
do bệnh tim bẩm sinh, những người không kèm dị tật khác có thể sống đến 50
– 60 tuổi [68].
Về di truyền, có khoảng 95% là trisomy 21 thuần 47,XX,+21 (hình 1.1)
hoặc 47,XY,+21 và 2,5% là thể khảm. Một số ít do chuyển đoạn hòa nhập
tâm với 1 NST tâm đầu khác như NST 14 hoặc NST 22 [1].

Hình 1.1. Karyotype của cá thể nữ bị hội chứng Down 47,XX,+21.
1.1.2. Trisomy 18 – hội chứng Edwards
Năm 1960, bác sĩ John Hilton Edwards là người đầu tiên mô tả hội
chứng này. Hc Edwards có tần suất 1/3.000 – 1/4.000 trẻ sinh sống. Trẻ mắc
Hc Edwards thường nhẹ cân, sinh non, cằm nhọn, lẹm, trán hẹp, tai đóng
thấp, ngón tay co quắp, chân khoèo, rốn lồi…và 90% trẻ có dị tật tim đi kèm.
Hầu hết các bệnh nhi sống không quá 6 tháng tuổi [1],[13].
Về di truyền, có khoảng 80% là trisomy 18 thuần 47,XX,+18 (hình 1.2)
hoặc 47,XY,+18. Khoảng 10% ở thể khảm 46,XX/47,XX,+18 hoặc
46,XY/47,XY,+18 và 10% là thể chuyển đoạn [1],[55].

5

Hình 1.2. Karyotype của cá thể nữ bị hội chứng Edwards 47,XX,+18.
1.2.3. Trisomy 13 – hội chứng Patau
Đây là bất thường NST nặng, được bác sĩ Klaus Patau mô tả bản chất di
truyền đầu tiên vào năm 1960. Hc Patau xuất hiện với tần suất 1/5.000 trẻ với
các biểu hiện như đầu nhỏ, độc nhãn cầu hoặc không nhãn cầu, nhãn cầu nhỏ,
khuyết mống mắt, khoảng cách 2 mắt xa; tai đóng thấp và biến dạng; sứt môi,
chẻ vòm; não thất duy nhất, đa ngón, các dị tật tim. Trẻ thường chết ngay

hoặc vài tháng sau sinh [12],[13].
Về nguyên nhân di truyền, 80% các trường hợp là trisomy 13 thuần
47,XX,+13 hoặc 47,XY,+13. Khoảng 20% trường hợp có bộ NST thể khảm
46,XX/47,XX,+13 hoặc 46,XY/47,XY,+13 hoặc chuyển đoạn do bố mẹ
truyền cho hoặc mới phát sinh [55].
1.2.4. Monosomy X và Triplo X
Monosomy X còn được gọi là Hc Turner. Monosomy X có tỉ lệ chết
cao ở giai đoạn phôi thai (98 – 99%), chỉ một số nhỏ sống đến khi sinh và tần
suất gặp 1/3.000 bé gái sơ sinh. Dấu hiệu của Hc Turner rất đa dạng, một số
có thể phát hiện được từ giai đoạn sơ sinh và trẻ nhỏ, thậm chí từ giai đoạn

6
phôi thai với da gáy dày, nang bạch huyết vùng cổ. Bệnh nhân Hc Turner
trưởng thành thường có các biểu hiện như lùn (cao 1,26 – 1,41m), rối loạn
phát triển xương, khuôn mặt Turner hình trái tim, 35% trẻ thiểu sản xương
hàm, cổ ngắn và dày, không dậy thì, vô kinh nguyên phát, tử cung kém phát
triển, teo buồng trứng, vô sinh. Phát triển tâm thần thường giảm nhẹ [27].
90% người bị Hc Turner có karyotype dạng 45,XO. Trong đó 50 – 65%
ở trạng thái thuần; khoảng 10% có đột biến cấu trúc gây thiếu hụt các gen cần
thiết trên NST X hoặc Y như: IsoXq, IsoXp, mất đoạn NST X, NST X hình
vòng, mất đoạn NST Y [1].
Hc Triplo X được Jacobs mô tả đầu tiên vào năm 1959 với tần suất gặp
1/1.000 bé gái. Ở hội chứng này, người bệnh thường có thể dậy thì và sinh sản
bình thường, một số trường hợp vô kinh nguyên phát và thường mãn kinh
sớm, chỉ số thông minh có thể thấp hơn bình thường. Kiểu gen thường là
47,XXX nhưng đôi khi xuất hiện ở dạng khảm 46,XX/47,XXX [1].
1.2.5. Hội chứng Klinefelter và Hội chứng 47, XYY
Hc Klinefelter có tần 1/1.000 bé trai. Khoảng 80 – 85% các trường hợp
Klinefelter có karyotype 47,XXY. Các trường hợp còn lại có thể ở dạng khảm
46,XY/47,XXY hoặc 46,XX/47,XXY hoặc 45,X/46,XY/47,XXY. Nguồn gốc

của NST bất thường: 53% NST thêm có nguồn gốc từ bố, 34% rối loạn giảm
phân lần I và 9% rối loạn giảm phân lần II ở mẹ, 3% rối loạn trong phân chia
hợp tử. Tuổi mẹ cao làm tăng bất thường khi giảm phân lần I [1],[12],[55].
Người bị Hc Klinefelter có thể có trí tuệ bình thường nhưng có thể có
các đặc điểm như: cao bất thường, chân tay dài, dương vật kém phát triển,
tinh hoàn nhỏ. Bệnh hiếm khi chẩn đoán được từ lúc sơ sinh hoặc ở tuổi thiếu
niên trừ khi có bất thường rõ ở cơ quan sinh dục ngoài. Người nam trưởng

7
thành thường được phát hiện vì vô sinh, không có tinh trùng, testosteron giảm
đột ngột lúc khoảng 30 tuổi [66].
Hội chứng 47,XYY có tần suất gặp 1/1000 bé trai với kiểu hình ít đặc
trưng và thường được phát hiện khi trưởng thành vì nguyên nhân vô sinh. Tuy
nhiên, người bệnh có thể có rối loạn hành vi, hay gây hấn và phạm tội
[1],[12],[55].
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH
Để thực hiện các xét nghiệm (XN) di truyền trong chẩn đoán trước sinh
(CĐTS) cần phải lấy tế bào hoặc vật chất di truyền có nguồn gốc từ thai. Hiện
nay, trên thế giới có nhiều phương pháp khác nhau để lấy tế bào thai.
1.2.1. Chọc hút dịch ối
Chọc hút dịch ối là phương pháp lấy tế bào thai bằng cách đưa kim vào
buồng ối để hút dịch ối. Thời gian chọc hút dịch ối lý tưởng là ở tuần thai 16
– 18 khi tỉ lệ thể tích dịch ối/thai là lớn nhất. Chọc hút dịch ối là một trong
những thủ thuật trước sinh xâm lấn vì thế có thể gây một số tai biến như: sẩy
thai (khoảng 0,5%), bất đồng nhóm máu Rh, nhiễm trùng mẹ (rất hiếm gặp),
rỉ ối (2 – 3%) và thường tự cầm vài giờ sau thủ thuật.
Dưới sự dẫn đường của siêu âm, ngày nay kỹ thuật chọc hút dịch ối trở
nên dễ dàng và an toàn, hạn chế tối đa các tai biến đã nêu. Vì vậy, chọc hút
dịch ối là thủ thuật được lựa chọn nhiều nhất.

8

Hình 1.3. Kỹ thuật chọc hút dịch ối dưới sự hướng dẫn của siêu âm.
“Nguồn: ” [68].
Tế bào thu được từ dịch ối có nguồn gốc từ các mô của thai như màng
ối, da, đường tiết niệu, đường hô hấp, đường tiêu hoá, tế bào máu thai. CĐTS
bằng tế bào ối có độ chính xác cao vì tế bào ối thu được ít có nguy cơ ngoại
nhiễm tế bào từ mẹ [30].
1.2.2. Sinh thiết gai nhau
Sinh thiết gai nhau được biết đến từ cuối những năm 1960. Từ năm
1983 nhờ có siêu âm dẫn đường mà kỹ thuật sinh thiết gai nhau đã trở nên
phổ biến trong CĐTS sớm ở ba tháng đầu của thai kỳ.
Gai nhau sau sinh thiết có thể nuôi cấy hoặc phân tích trực tiếp. Phương
pháp phân tích NST trực tiếp hoặc nuôi cấy ngắn hạn qua đêm, cho kết quả
trong vài giờ hoặc 1 ngày, tuy nhiên kỹ thuật thực hiện khó, chất lượng kém
nên phương pháp này ít được sử dụng.
Hạn chế của sinh thiết gai nhau là tỉ lệ sẩy thai cao, tăng 0,8% so với
chọc hút ối kinh điển, khoảng 1,9 – 2,1% [30].
1.2.3. Chọc hút máu cuống rốn
Chọc hút máu cuống rốn được thực hiện từ tuần thai 18, đây là kỹ thuật
có tai biến cao như sẩy thai (1,4%), chết trước sinh (1,4%), chảy máu kéo dài,

9
chảy máu từ thai sang mẹ, bất thường cấu trúc thai, thai chậm phát triển, nang
nước. Vì vậy, chọc hút máu cuống rốn chỉ áp dụng trong chẩn đoán các bệnh
về máu hoặc để phân tích các yếu tố sinh hóa, miễn dịch trong máu thai
[30],[34],[35].
1.2.4. Sinh thiết mô thai và nội soi thai
Quan sát thai bằng nội soi được tiến hành lần đầu tiên vào những năm
1950. Cho đến nay, tỉ lệ tai biến của kỹ thuật nội soi thai vẫn ở mức cao. Tỉ lệ

sẩy thai là 5 – 7%, sinh non khoảng 10%, rỉ ối, nhiễm trùng ối, chảy máu, tổn
thương bàng quang, ruột… vì vậy chỉ áp dụng kỹ thuật này khi cần sinh thiết
thai lấy mẫu cho những xét nghiệm đặc biệt như bệnh về da [30],[34],[35].
1.2.5. Phân lập tế bào và DNA của thai trong máu mẹ
Phân lập tế bào và DNA có nguồn gốc từ thai trong máu mẹ hiện là
phương pháp không xâm lấn và hiện đang được quan tâm nghiên cứu tại
nhiều quốc gia. Hầu hết các nghiên cứu tập trung vào phát hiện và phân lập
nguyên hồng cầu có nguồn gốc từ thai trong máu mẹ. Đây là loại tế bào có
nhân và có đời sống ngắn nên thích hợp nhất trong CĐTS.
Tỉ lệ các tế bào thai và DNA nguồn gốc từ thai rất ít, mặc dù đã có
nhiều tiến bộ trong các kỹ thuật nhằm làm giàu tế bào con trong máu mẹ
nhưng hiệu quả của các phương pháp này vẫn còn nhiều hạn chế. Với sự phát
triển của khoa học công nghệ, các kỹ thuật xác định tế bào con và làm tăng số
lượng tế bào con sẽ tốt hơn, hứa hẹn vai trò to lớn của phương pháp này trong
CĐTS ở tương lai [20],[69],[70].

10
1.3. KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH
Các tế bào thai sau khi thu thập được sẽ tiếp tục được dùng để chẩn
đoán xác định bằng các kỹ thuật di truyền khác nhau. Mỗi kỹ thuật đều có
những ưu điểm và nhược điểm riêng.
1.3.1. Lập bộ karyotype
Nuôi cấy tế bào và phân tích karyotype là kỹ thuật truyền thống được
nghiên cứu và ứng dụng vào CĐTS năm 1966 khi Steele và cộng sự báo cáo
kết quả nuôi cấy tế bào ối để xác định bộ NST của thai [62],[65]. Tế bào ối,
máu cuống rốn hoặc gai nhau được nuôi cấy trong 3 – 14 ngày. Sau đó chu kỳ
tế bào của chúng sẽ được dừng ở kỳ giữa (metaphase) dưới tác động của
colchicin. Các cụm phân bào kỳ giữa này sẽ được thu hoạch, trải lên tiêu bản
kính, nhuộm G-band (giemsa trypsin G-banding) và phân tích, lập bộ NST
(lưu đồ 1.1).

Lưu đồ 1.1. Quy trình thực hiện nuôi cấy và lập bộ karyotype.
Kỹ thuật này có thể xác định bất thường về số lượng lẫn cấu trúc các
NST với độ chính xác lên đến 99,4 – 99,8 % và được xem là tiêu chuẩn vàng
trong khảo sát số lượng NST [29],[53]. Tuy nhiên, nhược điểm của karyotype
là không thể phát hiện các bất thường có kích thước 5 – 10Mb ở độ phân giải
500 – 700 band. Kỹ thuật karyotype đòi hỏi rất nhiều công lao động và thời
gian. Thời gian trả kết quả dài từ 14 – 21 ngày, tạo ra tâm lý bất an kéo dài
Mẫu phân tích
(dịch ối, gai
nhau, máu )
Nuôi cấy
3 – 15 ngày
Dừng phân bào
ở kỳ giữa
Thu
hoạch
Chuẩn bị
tiêu bản
Lập bộ NST
Ra kết quả

11
đối với thai phụ, làm cho việc can thiệp - chấm dứt thai kỳ trở nên khó khăn
trong trường hợp thai bị bất thường. Chất lượng của tế bào nuôi cấy, số lượng
tế bào kỳ giữa và chất lượng nhuộm nhiễm sắc thể bị nhiều yếu tố chi phối,
khó kiểm soát. Người thực hiện kỹ thuật cần có hiểu biết và kỹ thuật thành
thạo. Mẫu phân tích cần phải đủ nhiều và phải được nuôi cấy ngay sau khi thủ
thuật để tránh làm cho tế bào bị giảm khả năng sống [65].
1.3.2. Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang - FISH

Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang - FISH (Fluorescence in situ
Hybridization) được nghiên cứu áp dụng vào CĐTS đầu những năm 1990.
Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng các đoạn dò phân tử được gắn màu
huỳnh quang để bắt cặp đặc hiệu với các vùng NST đích và được khảo sát
phát hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang. Dựa vào số lượng tín hiệu huỳnh
quang để xác định số lượng các NST. Nếu có 2 tín hiệu là bình thường. Bất
thường khi chỉ có 1 tín hiệu là monosomy hoặc 3 tín hiệu là trisomy [35],[45].
Kỹ thuật FISH cho kết quả xét nghiệm nhanh trong 2 – 3 ngày. Tuy
nhiên giá thành xét nghiệm khá cao. Ngoài ra, FISH tốn nhiều công thao tác
nên chỉ thực hiện được số lượng mẫu nhất định trong một lần xét nghiệm.
Một người chỉ có thể đọc kính hiển vi và phân tích không hơn 7 mẫu liên tục
trong 8 giờ. Thêm nữa, vấn đề phân tích mẫu trong phòng tối thời gian dài
cũng ảnh hưởng đến tinh thần của người làm xét nghiệm [3],[17],[31],[45].
1.3.3. Kỹ thuật MLPA
MLPA được ứng dụng để chẩn đoán lệch bội các NST 13, 18, 21 và
NST giới tính vào năm 2002. Kỹ thuật này có ưu điểm là có kết quả từ 2 – 4
ngày, chỉ cần 2 mL dịch ối và cần ít nhân lực và thích hợp cho việc chẩn đoán
một số lượng lớn bệnh phẩm.

12
Về nguyên lý của kỹ thuật: Đối với mỗi gen mục tiêu, 2 đoạn dò được
thiết kế để lai với đoạn liền. Đoạn dò chứa một trình tự đích đặc hiệu ngắn và
một đoạn gắn mồi. Một trong những đoạn dò chứa một trình tự đệm. Đối với
mỗi đoạn dò cho phản ứng multiplex, phần đệm có một trình tự dài đặc hiệu.
Sau khi lai qua đêm với đoạn DNA mục tiêu, mỗi cặp đoạn dò liền kề được
nối lại nhờ phản ứng nối. Sau đó PCR được thiết lập với cặp mồi có gắn
huỳnh quang, đảm bảo rằng mỗi sản phẩm PCR tỉ lệ thuận với DNA mục tiêu
ban đầu. Sản phẩm PCR sau đó được phân tách bằng hệ thống điện di mao
quản theo chiều dài [6], [19].
MLPA có thể cùng 1 lúc xác định trên 40 locus khác nhau trong một

lần phân tích. MLPA có thể chẩn đoán với số lượng lớn hơn và giá thành rẻ
hơn khi so sánh với FISH và karyotype. Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi người
thực hiện phải thuần thục, và không phát hiện được ngoại nhiễm DNA. Các
trường hợp tam bội nữ không thể phát hiện được bằng kỹ thuật này [31],[35].
1.3.4. Kỹ thuật CGH
CGH cho phép phân tích toàn thể bộ gen với kết quả chính xác hơn
karyotype. Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên mạch đơn DNA lai đặc hiệu với
nhau. Trong kỹ thuật CGH, các DNA bộ gen mẫu và DNA bộ gen chứng
được đánh dấu bởi các màu huỳnh quang khác nhau, ví dụ xanh và đỏ, sau đó
trộn lẫn chúng và tiến hành lai với NST ở giai đoạn metaphase rồi phân tích tỉ
lệ màu huỳnh quang. Kết quả xét nghiệm cho màu vàng (kết hợp của đỏ và
xanh) khi số lượng DNA bằng nhau ở mẫu chứng và mẫu bệnh, nếu có 3 NST
thì DNA đặc hiệu của NST đó sẽ chuyển sang màu đỏ. Kỹ thuật này có thể
phát hiện sự mất cân bằng NST trong CĐTS. Tuy nhiên hạn chế của nó là
phải đảm bảo NST ở giai đoạn metaphase và độ phân giải đạt được chỉ là 3
Mb [39].

13
1.3.5. Kỹ thuật Array-CGH
Kỹ thuật array CGH có thể phát hiện bất thường toàn bộ bộ gen với
thời gian nhanh chóng hiện nay đang được nghiên cứu để đưa vào ứng dụng
tại nhiều nước trên thế giới. Array-CGH cũng có nguyên tắc giống như kỹ
thuật CGH truyền thống nhưng chúng sử dụng các trình tự DNA thay vì NST
ở giai đoạn metaphase làm mục tiêu lai. Kỹ thuật này có thể phát hiện được
lệch bội NST, các vi mất đoạn và các vi lặp đoạn [39], [41].
Array-CGH có nhiều thuận lợi trong CĐTS, có độ nhạy và hiệu quả
cao, có thể tự động hóa do đó giảm nhân công và thời gian thực hiện xét
nghiệm. Tuy nhiên, khả năng ứng dụng của kỹ thuật này còn nhiều hạn chế do
cần một hệ thống máy đắt tiền, không thể phát hiện ngoại nhiễm DNA từ mẹ,
dễ gây dương tính giả và giá thành còn khá cao.

1.3.6. Kỹ thuật QF-PCR
1.3.6.1. Nguyên tắc kỹ thuật QF-PCR
Từ năm 1993, kỹ thuật QF-PCR đã được Mansfield chứng minh có thể
sử dụng để chẩn đoán nhanh và chính xác tình trisomy 21 và các lệch bội
NST khác [49]. QF-PCR sử dụng các cặp mồi gắn huỳnh quang để khuếch đại
các chuỗi DNA có trình tự lặp lại ngắn – STR (short tandem repeat). Các STR
này đặc hiệu cho các NST và có tính đa hình rất cao. Sản phẩm sau khi
khuếch đại được điện di phân tách đoạn và định lượng bằng hệ thống giải
trình tự DNA.
QF-PCR dựa trên nguyên lý ở giai đoạn sớm của PCR, khối lượng
DNA tạo ra từ 2 alen của một locus STR tỉ lệ thuận với khối lượng DNA đích
trong mẫu ban đầu. Do đó ở trường hợp dị hợp tử, sản phẩm từ 2 alen của
locus STR khi điện di tách đoạn sẽ có 2 đỉnh tín hiệu huỳnh quang với tỉ số
giữa 2 đỉnh là 1:1. Nếu đồng hợp tử, sản phẩm sẽ cho 1 đỉnh tín hiệu huỳnh

14
quang duy nhất. Ở trường hợp monosomy chỉ có 1 NST nên kết quả chỉ cho 1
đỉnh tín hiệu huỳnh quang duy nhất. Ở các trường hợp trisomy, 3 NST sẽ biểu
hiện 3 đỉnh huỳnh quang với tỉ số là 1:1:1 (trisomy 3 alen) hoặc chỉ có 2 đỉnh
với tỉ số là 2:1 hoặc 1:2 (trisomy 2 alen) [49]. Kết quả khảo sát được biểu thị
như hình 1.4.

Hình 1.4. Biểu diễn kết quả phân tích số lượng NST bằng QF-PCR.
1.4.6.2. Khái niệm về STR
STR là các trình tự lặp ngắn có kích thước dưới 1.000 bp với các trình
tự lõi từ 2 đến 6 nucleotide (hình 1.5). Số lần lặp lại khác nhau giữa các cá thể
nên STR có tính đa hình cao. Trên các NST khác nhau chứa các trình tự đa
hình STR khác nhau và đặc hiệu cho từng loại NST. Ở người, các trình tự
STR được phân bố đều trên toàn bộ gen, trung bình cứ 10.000 nucleotide thì
gặp một trình tự STR. Vai trò của các trình tự STR vẫn chưa được hiểu rõ

mặc dù chúng tồn tại giữa các exon và có liên quan các bệnh di truyền [50].

Hình 1.5. Alen 9 của locus STR có tên TH01 có trình tự lõi 4 nucleotide.
(Nguồn: John Buckleton, 2005) [36]