ứng dụng kỹ thuật multiplex – pcr để phát hiện một số gen độc lực của nhóm escherichia caoli sản sinh độc tố shiga (stec) phân lập được từ phân bò, heo và thịt bò

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn đến:
Gia đình đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi cả về vật chất lẫn tinh
thần, là chỗ dựa vững chắc để tôi học tập tốt.
Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban
chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến
thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
Thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và truyền đạt những
kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
BSTY Bùi Thị Thu Trang đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi
trong thời gian thực hiện đề tài.
BSTY Lê Hữu Ngọc, phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi
Trường, Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa
sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn
trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.
Chân thành cảm ơn
Đàm Thị Minh Thơ
TÓM TẮT
iii
ĐÀM THỊ MINH THƠ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 9/2005.
“ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN
ĐỘC LỰC CỦA NHÓM E. COLI SẢN SINH ĐỘC TỐ SHIGA (STEC) PHÂN
LẬP ĐƯỢC TỪ PHÂN BÒ, HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”.
Hội đồng hướng dẫn:
PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân
BSTY Bùi Thị Thu Trang

Đề tài được thực hiện nhằm phát hiện các gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA,
và gen uid của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò,

heo, bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Quan sát và ghi
nhận trên môi trường MAC chỉ có một loại khuẩn lạc hồng, trên môi trường
SMAC có hai loại khuẩn lạc hồng và trắng, trên môi trường CT-SMAC cũng có
hai loại khuẩn lạc hồng và trắng. Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng
lẻ. Ly trích DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương
pháp nhiệt. Kết quả multiplex - PCR được ghi nhận như sau:
(1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc
riêng lẻ có mang gen độc lực đó.
(2) 100% mẫu phân tiêu chảy đều có E. coli mang gen gây dung huyết
ehxA. Tần số phát hiện gen stx của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy
lần lượt là: 50% ở bò, 44,4% ở heo cai sữa và 100% trên bê.
Ở phân bò tiêu chảy: có 5/10 mẫu (50%) phát hiện E. coli mang gen
độc lực thuộc nhóm Stx; 10/10 mẫu (100%) phát hiện E. coli mang gen
ehxA; 4/10 mẫu (40%) E. coli mang gen stx2, 1/10 mẫu (10%) E. coli mang
gen stx1; và không phát hiện được gen uid và eae.
Ở phân heo cai sữa tiêu chảy: có 4/9 mẫu (44,4%) phát hiện E. coli
mang gen stx, trong đó có ¼ mẫu mang gen stx1 (25%) và ¾ mẫu mang
gen stx2 (75%), không có mẫu nào mang gen uid và eae, 9/9 mẫu (100%)
mang gen ehxA.
Ở phân bê tiêu chảy: có 8/8 mẫu (100%) phát hiện được ít nhất 1 gen
độc lực, có mẫu phát hiện 2 -3 gen độc lực; 8/8 mẫu (100%) phát hiện
được gen ehxA; 7/8 mẫu (87,5%) phát hiện được gen stx1; 1/8 mẫu
(12,5%) phát hiện được gen stx2. Trong khi đó, không phát hiện được gen
uid trong bất kì mẫu nào, 7/8 (87,5%) mẫu đều hiện diện cả gen ehxA và
stx.
(3) 9 mẫu bề mặt thịt bò khảo sát hoàn toàn chưa phát hiện được gen độc
lực của E. coli.
(4) Chưa phát hiện được gen uid và eae trong 27 mẫu phân tiêu chảy của
bò, bê và heo cai sữa; và 9 mẫu bề mặt thịt.
SUMMARY

iv
“The application of multiplex - PCR in detecting some virulent genes of
E. coli isolated from diarrhea faeces of bovine and swine, swabs of beef
surface”
The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, ehxA and uid genes of
isolated E. coli from 27 diarrhea stools samples of bovines, calves, piglets, and 9
swabs of the beef surface by multiplex - PCR. There was the observing on each
the isolating medium: one kind of pink colony on MAC (HM), white colony on
SMAC (TS), pink colony on SMAC (HS), white colony on CT-SMAC (TCT), and
pink colony on CT-SMAC (HCT). Each colony group was chosen about 6 – 10
separate colonies. DNA of the colony groups and each separate colonies were
extracted by the heat method. The results of multiplex - PCR were showed that:
(1) The colony group had virulent genes, the separate colony
belonging to that group did or did not have those genes.
(2) Frequency of ehxA gene of isolated E. coli from diarrhea stools samples
was 100%; stx gene was 50% from bovine; 100% from calves; 44.4% from
piglets.
In diarrhea bovine stools samples: 5 of 10 samples (50%) detected E.
coli carrying stx gene, all of 10 samples (100%) were detected E. coli
carrying ehxA gene, 4 of 10 samples (40%) were detected E. coli carrying
stx2, 1 of 10 samples (10%) were detected E. coli carrying stx1, none of
those samples were detected E. coli carrying uid and eae.
In diarrhea piglet stools samples: 4 of 9 samples (44.4%) were
detected E. coli carrying stx, including of 1 of 4 samples were detected E.
coli carrying stx1 (25%) and 3 of 4 samples were detected E. coli carrying
stx2 (75%); all of 9 samples (100%) were detected E. coli carrying ehxA,
and no sample was detected E. coli carrying uid and eae.
In diarrhea calf stools samples: all of 8 samples (100%) were detected
no less than one virulent gene, some samples were detected 2-3 virulent
genes; 7 of 8 samples (87.5%) were detected stx1 gene; 1 of 8 samples

(12.5%) was detected stx1 gene; all of 8 samples (100%) were detected
ehxA gene. Meanwhile, no sample was detected uid and eae genes; 7 of 8
samples (87.5%) were detected E. coli carrying both ehxA and stx genes.
(3) 9 swabs samples were investigated but no sample contained the E. coli
carrying the virulent genes .
(4) In the 27 diarrhea bovine, calf, piglet stools samples, uid and eae genes
have not been detected yet.
v
MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm tạ ...........................................................................................................iii
Tóm tắt............................................................................................................... iv
Summary ..............................................................................................................v
Mục lục ...............................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................ix
Danh sách các bảng ..............................................................................................x
Danh sách các sơ đồ, biểu đồ, hình ......................................................................xi
1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề..............................................................................................1
1.2. Mục tiêu – yêu cầu................................................................................2
1.2.1. Mục tiêu ...................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu.....................................................................................2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................3
2.1. Vi khuẩn E. coli .....................................................................................3
2.1.1 Đặc điểm sinh học .....................................................................3
2.1.2. Yếu tố kháng nguyên ................................................................3
2.1.3. Phân loại E. coli ........................................................................4
2.2. Shiga toxigenic E. coli (STEC)...............................................................5
2.2.1.Thuật ngữ ..................................................................................5
2.2.2. Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC...............6

2.2.2.1. Độc tố Shiga (Stx) ......................................................... 6
2.2.2.2. Enterohemolysin............................................................ 8
2.2.2.3. Yếu tố bám dính............................................................. 8
2.2.3. Cách sinh bệnh......................................................................... 9
2.2.4. Khía cạnh lâm sàng .................................................................10
2.2.5. Dịch tễ học .............................................................................11
2.2.6. Chẩn đoán............................................................................... 12
2.2.7. Phòng ngừa............................................................................. 12
vi
2.3. Serotype O157:H7 ...............................................................................12
2.4. Kỹ thuật PCR..................................................................................... 14
2.4.1. Khái niệm ...............................................................................14
2.4.2. Nguyên tắc.............................................................................. 14
2.4.3. Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR ...........................15
2.4.4. Phân tích kết quả PCR............................................................ 16
2.4.5 Multiplex – PCR...................................................................... 16
2.4.6. Ứng dụng................................................................................ 16
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN........................................18
3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện...........................................................18
3.1.1. Thời gian.................................................................................18
3.1.2. Địa điểm..................................................................................18
3.2. Nội dung thực hiện...............................................................................18
3.3. Phương pháp thực hiện.........................................................................18
3.3.1 Vật liệu thí nghiệm cơ bản .......................................................18
3.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu................................................19
3.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli ...................................................19
3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy......................................................19
3.3.2.2. Qui trình phân lập, định tính.........................................19
(1) Nuôi cấy và phân lập....................................................19
(2) Chọn khuẩn lạc E. coli ................................................20

(3) Thử sinh hóa................................................................20
3.3.3. Ly trích DNA...........................................................................20
3.3.4. Qui trình multiplex – PCR.......................................................22
3.3.5. Điện di, đọc kết quả ................................................................23
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................24
4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò
tiêu chảy..............................................................................................................24
4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo con
cai sữa tiêu chảy..................................................................................................26
vii