xác định nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được khi sử dụng phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để phân tích clenbuterol trong thức ăn gia súc

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ðOÀN
TP. HỒ CHÍ MINH TP. HỒ CHÍ MINH


CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM
SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ
 * 









B
B
Á
Á
O
O


C
C
Á
Á
O
O

N
N
G
G
H
H
I
I
Ệ
Ệ
M
M


T
T
H
H
U
U


(ðã ñược chỉnh sửa theo góp ý của Hội ñồng nghiệm thu ngày 29/01/2010)



XÁC ðỊNH NỒNG ðỘ THẤP NHẤT CÓ THỂ PHÁT HIỆN KHI SỬ DỤNG
PHƯƠNG PHÁP SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM

ðỂ PHÂN TÍCH CLENBUTEROL TRONG THỨC ĂN GIA SÚC









Chủ nhiệm ñề tài: CN. NGUYỄN THỊ VÂN
CNCð. NGÔ HỮU THẮNG
Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ










TP. Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2010


I

TÓM TẮT ðỀ TÀI

Clenbuterol là một chất thuộc nhóm β - agonist ñược sử dụng bất hợp pháp
trong các sản phẩm thịt ñộng vật. Clenbuterol ñược bổ sung vào thức ăn gia súc
nhằm tạo ra những con thú có tỷ lệ nạc hơn, tăng trọng nhanh hơn. Ngoài ra
clenbuterol có tác dụng làm giãn phế quản, ñây là một dược phẩm ñược ñiều chế ñể
ñiều trị giãn phế quản trên người. Vì vậy, clenbuterol có trong sản phẩm thịt ñộng
vật có thể gây ngộ ñộc cho người sử dụng. Clenbuterol bị cấm sử dụng trong thực
phẩm, theo tổ chức FDA và WHO hàm lượng Clenbuterol tối ña cho phép là 0,2
ppb có trong bắp thịt và béo, 0,6 ppb trong gan và cật. Clenbuterol ñược xác ñịnh
hàm lượng bằng các phương pháp HPLC, GC – MS, ELISA, . . . Các phương pháp
phân tích truyền thống thường chi phí phân tích mẫu cao. Phương pháp sóng vuông
quét nhanh trên cực giọt chậm bước ñầu nghiên cứu cho thấy có khả năng phân tích
nhanh, ñơn giản, giá thành thấp, thiết bị do Việt Nam sản xuất. Trong ñiều kiện
phân tích tốt nhất với dung dịch nền là Natri Borat 0.1M, pH 9,5. ðường chuẩn xây
dựng trên mẫu có giới hạn phát hiện từ 28,2 ppb – 32,6 ppb.

II

SUMMARY

Clenbuterol is one of major β - agonist illegally used in livestock production.
It can improve the meat/fat ratio in fattened animals and accelarate livestock
growth. It also has relaxing effect on non – striated musculature and can be used as
an antiasthmatic and a tocolytic agent in human beings. Therefore, excess
clenbuterol residues in livestock products may lead to health risks for consumers.
This has led to a prohibition of clenbuterol use in food production. According to the
US FDA and WHO, a maximum residue limit clenbuterol is 0.2 ppb (ppb) in
muscle and fat, and 0.6 ppb (ppb) in liver and kidney. The amount of clenbuterol
can be determined by methods such as HPLC or GC – MS, ELISA, etc. However,

these traditional methods usually require very expensive preparation procedures.
Alternatively, a square wave fast scanning polarography method (SQF) was
primarily developed and validated to quantify these clenbuterol, which is simple,
rapid, low – cost reagent, equipment made in Vietnam. Under optimum conditions,
Clenbuterol could be baseline separated within a running natri borat buffer 0.1M,
pH 9.5. Highly linear response was obtained for above compound over three oders
of magnitude with detection limits ranging from 28.2 ppb to 32.6 ppb.

III

MỤC LỤC
Trang
TÓM TẮT ðỀ TÀI I
SUMMARY II
MỤC LỤC III
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT V
DANH SÁCH BẢNG VI
DANH SÁCH ðỒ THỊ VII
DANH SÁCH HÌNH VIII
PHẦN MỞ ðẦU 1
ðẶT VẤN ðỀ 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. Tổng quan về CLENBUTEROL 5
1.1.1. Cấu trúc khung của các β
2
– agonist: 5
1.1.2 Công thức cấu tạo Clenbuterol: 6
1.1.3. Tính chất lý hoá: 6
1.1.4. Công dụng: 6
1.1.5. Dược ñộng học: 7

1.1.6. Ảnh hưởng của sự tồn dư Clenbuterol trong thịt gia súc, gia cầm lên người sử dụng 10
1.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 10
1.3. Các phương pháp xác ñịnh Clenbuterol 11
1.3.1. Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) 11
1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS) 12
1.3.3. Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC – MS) 13
1.3.4. Phương pháp cực phổ sóng vuông 13
1.4. Tính cấp thiết của ñề tài 14
1.5. Giới thiệu máy phân tích Analyzer SQF – 505 16
1.5.1. Giới thiệu máy phân tích Analyzer SQF – 505 16
1.5.2. Cấu tạo máy 16
1.5.3. Nguyên tắc hoạt ñộng 17
1.5.4. Cách cài ñặt các thông số chạy máy 17
CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 19
2.1. Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 19
2.2. Vật liệu, hoá chất thí nghiệm 19
2.2.1. ðối tượng nghiên cứu 19
2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ 19
2.2.3. Hóa chất và thuốc thử 20
2.2.4. Chuẩn bị các dung dịch và mẫu giả ñịnh 20
2.3. Phương pháp nghiên cứu ñịnh lượng Clenbuterol 21
2.3.1 Nguyên tắc 21
2.3.2. Khảo sát ñiều kiện ñịnh lượng Clenbuterol bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét
nhanh 21
2.4. Xây dựng quy trình xử lý mẫu thức ăn chăn nuôi 23
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30
3.1. Kết quả thực nghiệm 30
3.1.1. ðịnh lượng CLEN bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh 30
3.1.2. Xây dựng quy trình ñịnh lượng CLEN trong mẫu thức ăn gia súc 43
3.1.3 Khảo sát hiệu suất thu hồi CLEN trong 3 mẫu thức ăn gia súc 54

IV

3.2. Nghiên cứu phân tích CLEN trên máy ANALYZER SQF – 505 với Mode PSA – F: 56
3.2.1. Khảo sát trên Mode PSA – F: 56
3.2.2. Kết quả khảo sát trên Mode PSA – F: 56
3.3. Bàn luận 56
CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 58
4.1. KẾT LUẬN 58
4.2. ðỀ NGHỊ 59
PHỤ LỤC 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO 83



V
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

CLEN: Clenbuterol
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high perfomance liquid chromatography)
LC/MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ
LOD: Giới hạn phát hiện (limit of detection )
LOQ: Giới hạn ñịnh lượng (limit of quantization)
SQW – F: Sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm
Tdrop: Thời ñiểm bắt ñầu quét thế trong ñời sống một giọt
Vstar: Thế bắt ñầu ghi phổ
Vstep: Bước thế quét một chiều
Vpulse: Biên ñộ xung
Vstop: Thế kết thúc quá trình ghi phổ

VI

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Họ β
2
– agonist
5
Bảng 1.2: Thời gian ñào thải CLEN trong nước tiểu và phân ñộng vật
9
Bảng 1.3: ðộ phản ứng chéo của các chất trong họ β
2
– agonist
12
Bảng 3.1: Khảo sát dung dịch nền Na
2
B
4
O
7
– H
3
BO
3
0,2M
30

Bảng 3.2: Khảo sát dung dịch nền Natriacetat 0,2 M
30
Bảng 3.3: Khảo sát dung dịch nền Amoni acetat 0,2 M
30
Bảng 3.4: Khảo sát dung dịch nền Natrihydrophosphat 0,2 M
31
Bảng 3.5: Sự phụ thuộc cường ñộ dòng vào nồng ñộ ñệm Natriborat của CLEN 300 ppb
32
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát chế ñộ quét xuôi và quét ngược
32
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát V star
34
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát Vstep:
34
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát Vpulse
35
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát Time drop
35
Bảng 3.11: Cường ñộ dòng I (nA) của CLEN ñể xây dựng ñường chuẩn trong dung dich
nước
41
Bảng 3.12 : Kết quả khảo sát ñộ lặp lại của phép ño
42
Bảng 3.13 : Hiệu suất chiết của các quy trình
48
Bảng 3.14: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) ño ñược khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 1
48
Bảng 3.15: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 2
50
Bảng 3.16: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) ño ñược khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 3

51
Bảng 3.17: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 4
53
Bảng 3.18: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi 3 mẫu thức ăn gia súc bằng kỹ thuật sóng
vuông quét nhanh trên cực giọt chậm
55












VII

DANH SÁCH ðỒ THỊ

Trang
ðồ thị 3.1: So sánh cường ñộ dòng CLEN của 4 dung dịch nền khác nhau
31
ðồ thị 3.2: Cực phổ ñồ của CLEN 300 ppb khi tiến hành quét xuôi trong dung dịch nền
Natriborat 0,1 M; pH = 9,5
33
ðồ thị 3.3: Phổ sóng Cl
-

trong dung dịch nền KNO
3
0.1M
37
ðồ thị 3.4: Phổ sóng Fe
3+
4ppb trong dung dịch nền Pyrophosphat
38
ðồ thị 3.5: Phổ sóng Cu
2+
nồng ñộ 4ppb trong dung dịch nền Natri borat
39
ðồ thị 3.6: Phổ sóng Vitamin C nồng ñộ 4ppb trong dung dịch nền Amoni acetat
40
ðồ thị 3.7: Xây dựng ñường chuẩn CLEN trong dung dịch nước
41
ðồ thị 3.8: Cực phổ ñồ sóng vuông của CLEN xây dựng trên mẫu 1
49
ðồ thị 3.9: ðường chuẩn của CLEN xây dựng trên mẫu 1
49
ðồ thị 3.10: Cực phổ ñồ sóng vuông của CLEN xây dựng trên mẫu 2
50
ðồ thị 3.11: ðường chuẩn của CLEN xây dựng trên mẫu 2
51
ðồ thị 3.12: Cực phổ ñồ sóng vuông của CLEN xây dựng trên mẫu 3
52
ðồ thị 3.13: ðường chuẩn của CLEN xây dựng trên mẫu 3
52
ðồ thị 3.14: Cực phổ ñồ sóng vuông của CLEN xây dựng trên mẫu 4
53

ðồ thị 3.15: ðường chuẩn của CLEN xây dựng trên mẫu 4
54








VIII

DANH SÁCH HÌNH
Trang

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của CLENBUTEROL
6
Hình 1.2: Quá trình chuyển hóa CLEN trong cơ thể
7
Hình 1.3: Quá trình chuyển hóa Clenbuterol trong nước tiểu chó
8

IX

DANH SÁCH PHỤ LỤC HÌNH

Hình 1.1: Phổ khảo sát dung dịch nền amoni acetat pH 9.5 60
Hình 1.2: Phổ khảo sát dung dịch nền amoni acetat pH 10.5 60
Hình 1.3: Phổ khảo sát dung dịch nền amoni acetat pH 8.5 61
Hình 1.4: Phổ khảo sát dung dịch nền amoni acetat pH 7.5 61
Hình 1.5: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri hydrophosphat pH 10.5 62
Hình 1.6: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri hydrophosphat pH 9.5 62
Hình 1.7: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri hydrophosphat pH 8.5 63
Hình 1.8: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri hydrophosphat pH 7.5 63
Hình 1.9: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri acetat pH 10.5 64
Hình 1.10: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri acetat pH 9.5 64
Hình 1.11: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri acetat pH 8.5 65
Hình 1.12: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri acetat pH 7.5 65
Hình 1.13: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 9.5 66
Hình 1.14: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 10.5 66
Hình 1.15: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 8.5 67
Hình 1.16: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 7.5 67
Hình 1.17: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 6.5 68
Hình 1.18: Phổ khảo sát V
Start
trong dung dịch nền Natri borat, V
Start
= 0 mV 68
Hình 1.19: Phổ khảo sát V
Start
trong dung dịch nền Natri borat, V
Start

= -100

mV
69
Hình 1.20: Phổ khảo sát V
Start
trong dung dịch nền Natri borat, V
Start
= -200mV
69
Hình 1.21: Phổ khảo sát V
Start
trong dung dịch nền Natri borat, V
Start
= -300mV
70
Hình 1.22: Phổ khảo sát V
step
trong dung dịch nền Natri borat với V
Step
= 4 mV
70
Hình 1.23: Phổ khảo sát V
step
trong dung dịch nền Natri borat với V
Step
= 6 mV
71
Hình 1.24: Phổ khảo sát V
step

trong dung dịch nền Natri borat với V
Step
= 8 mV
71
Hình 1.25: Phổ khảo sát V
step
trong dung dịch nền Natri borat với V
Step
= 10 mV
72
Hình 1.26: Phổ khảo sát V
Pulse
trong dung dịch nền Natri borat với V
Pulse
= 10mV
72
Hình 1.27: Phổ khảo sát V
Pulse
trong dung dịch nền Natri borat với V
Pulse
= 20mV
73
Hình 1.28: Phổ khảo sát V
Pulse
trong dung dịch nền Natri borat với V
Pulse
= 30mV
73
Hình 1.29: Phổ khảo sát V
Pulse

trong dung dịch nền Natri borat với V
Pulse
= 40mV
74
Hình 1.30: Phổ kết quả khảo sát V
stop
= - 2000mV 74
Hình 1.31: Phổ khảo sát nồng ñộ dung dịch nền Natri borat 0.05M, pH 9.5 75
Hình 1.32: Phổ khảo sát nồng ñộ dung dịch nền Natri borat 0.1M, pH 9.5 75
Hình 1.33: Phổ khảo sát nồng ñộ dung dịch nền Natri borat 0.2M, pH 9.5 76

X
Hình 1.34: Phổ kết quả so sánh dung dịch nền Natri borat ở các nồng ñộ khác nhau
76
Hình 1.35: Phổ khảo sát ñộ lặp trong dung dịch nền Natri borat 0.1M, pH 9.5 nồng
ñộ CLEN trong dung dịch 100ppb 77
Hình 1.36: Phổ khảo sát ñộ lặp trong dung dịch nền Natri borat 0.1M, pH 9.5 nồng
ñộ CLEN trong dung dịch 200ppb 77
Hình 1.37: Phổ khảo sát ñộ lặp trong dung dịch nền Natri borat 0.1M, pH 9.5 nồng
ñộ CLEN trong dung dịch 300ppb 78
Hình 1.38: Phổ thu ñược khi chiết CLEN bằng dung môi ethanol 78
Hình 1.39: Phổ ño dung dịch chiết 4 mẫu trắng 79
Hình 1.40: Phổ thu ñược khi chiết CLEN bằng dung môi methanol 79
Hình 1.41: Phổ thu ñược khi chiết CLEN bằng dung môi hỗn hợp methanol và
isopropanol 80
Hình 1.42: Phổ thu ñược khi phân tích Mẫu 1 80
Hình 1.43: Phổ thu ñược khi phân tích Mẫu 2 81
Hình 1.44: Phổ thu ñược khi phân tích Mẫu 3 81

Hình 1.45: Phổ thu ñược khi phân tích mẫu 4 82

1
PHẦN MỞ ðẦU

1. Tên ñề tài: “Xác ñịnh nồng ñộ thấp nhất có thể phát hiện khi sử dụng phương
pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ñể phân tích Clenbuterol
trong thức ăn gia súc”.
Chủ nhiệm ñề tài:
- CN. Nguyễn Thị Vân
- KS. Ngô Hữu Thắng
Cơ quan công tác: Chi nhánh phía Nam - Trung tâm Nhiệt ñới Việt - Nga
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ Trẻ.
Thời gian thực hiện ñề tài: 01/2008 – 12/2008.
Kinh phí ñược duyệt: 80.000.000ñ (Tám mươi triệu ñồng)
Kinh phí ñã cấp: 59.000.000ñ (Năm mươi chín triệu ñồng)
2. Mục tiêu của ñề tài: Xác ñịnh nồng ñộ thấp nhất có thể phát hiện khi sử dụng
phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ñể phân tích
Clenbuterol trong thức ăn gia súc
3. Nội dung (Theo ñề cương ñã duyệt)
- Nghiên cứu lựa chọn dung dịch nền.
- Nghiên cứu chọn chế ñộ chạy máy thích hợp.
- Nghiên cứu phương pháp chuẩn bị mẫu .
- Nghiên cứu phương pháp phân tích ñịnh tính.
- Nghiên cứu phương pháp phân tích ñịnh lượng.
- So sánh kết quả với phương pháp khác.

2
4. Những nội dung ñã thực hiện

Công việc dự kiến Công việc ñã thực hiện


Nghiên cứu lựa
chọn dung dịch nền
- ðã nghiên cứu 04 dung dịch nền là: dung dịch nền là
Na
2
B
4
O
7
– H
3
BO
3
nồng ñộ 0,2M; dung dịch nền Natriacetat
0,2M; dung dịch nền Amoni acetat 0,2M; dung dịch nền
Natri hydrophosphat 0,2M
- Chọn ñược dung dịch nền thích hợp ñể phân tích
Clenbuterol trong thức ăn gia súc là natri borat 0,1M, pH =
9,5
Nghiên cứu chọn
chế ñộ chạy máy
thích hợp
ðã chọn ñược chế ñộ chạy máy thích hợp Mode SQF, Vtart =
-200 mV; VStop = -1800mV ;VStep = 8 mV; VPulse = 30;
TDrop = 4000
Nghiên cứu phương
pháp chuẩn bị mẫu.

ðã nghiên cứu ñược quy trình xử lý mẫu
Nghiên cứu phương
pháp phân tích
ñịnh tính.

Phát hiện ñược Clenbuterol trong mẫu ño
Nghiên cứu phương
pháp phân tích ñịnh
lượng
ðã xây dựng ñường chuẩn và ñường thêm chuẩn, xác ñịnh
ngưỡng phát hiện, sai số và ñộ thu hồi
So sánh kết quả với
phương pháp khác
ðã gửi mẫu 04 nền mẫu thức ăn gia súc ñể phân tích bằng
phương pháp sắc ký tại Công ty CP DV KHCN Hải ðăng
Tổng hợp, phân
tích, so sánh các số
liệu thực nghiệm và
viết báo cáo

Báo cáo nghiệm thu





3
ðẶT VẤN ðỀ
Gần ñây, trong chăn nuôi heo cũng như gia cầm ở Việt Nam có những thông

tin về việc phát hiện chất Clenbuterol trong thịt và thức ăn chăn nuôi của một số
công ty trong nước. Năm 2006, một ñợt khảo sát trên diện rộng tại ñịa bàn thành
phố Hồ Chí Minh do Chi cục Thú y thực hiện, kết quả kiểm tra 500 mẫu thịt heo
ñang bày bán tại các chợ, thịt ở một số lò vừa giết mổ xong, có gần 30% mẫu dương
tính với Clenbuterol. ðồng thời, khảo sát các doanh nghiệp kinh doanh chế biến
thức ăn gia súc trong cả nước phát hiện trên 02 doanh nghiệp có kết quả mẫu thức
ăn gia súc dương tính với Clenbuterol.
Clenbuterol là một chất thuộc nhóm beta – agonist có tác dụng làm giãn phế
quản, ñây là một dược phẩm ñược ñiều chế ñể ñiều trị giãn phế quản trên người, các
trường hợp viêm phổi dị ứng trên ngựa và viêm ñường hô hấp trên bò. Vào giữa
thập kỷ 1980, người ta khám phá rằng khi dùng liều cao các chất beta – agonist theo
ñường miệng, thuốc có thể tạo ra sự gia tăng nhanh chóng và rõ rệt sự tăng khối cơ
ñồng thời làm giảm khối lượng mỡ. Các nhà chăn nuôi phát hiện tác dụng kỳ diệu
này của Clenbuterol cũng như các chất thuộc họ beta – agonist nên ñã bổ sung vào
thức ăn gia súc nhằm tạo ra những con thú có tỷ lệ nạc hơn, tăng trọng nhanh hơn
nhằm thu lợi nhuận cao.
Tuy nhiên, ngừơi ta phát hiện sự tồn dư của Clenbuterol trong thịt và phủ tạng,
ñặc biệt là gan của những thú ñược nuôi bằng thực phẩm có chứa Clenbuterol ảnh
hưởng ñến sức khỏe người tiêu dùng, ñôi khi gây ngộ ñộc cấp tính. ðã có nhiều báo
cáo về các trường hợp ngộ ñộc trên người sau khi tiêu thụ thịt, gan tồn dư
Clenbuterol tại các nước Châu Âu và Châu Á. Dù vậy, chất này vẫn sử dụng bất
hợp pháp trên thị trường thức ăn chăn nuôi.
Hiện nay Mỹ, Canada và và các nước thuộc Liên minh Châu Âu cấm sử dụng
Clenbuterol và các chất thuộc nhóm beta – agonist. Tại Việt Nam, ngày 20/06/2002
Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn chính thức cấm sử dụng hoá chất này trong
sản xuất, nhập khẩu, lưu thông tại quyết ñịnh số 54/2002/Qð – BNN
Do ñó ñể bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, vấn ñề vệ sinh an toàn thực phẩm
phải ñặt lên hàng ñầu. Phải ñảm bảo cung cấp cho người dân những sản phẩm
không bị nhiễm bẩn vi sinh vật mà còn không tồn dư những chất có hại cho sức

4
khỏe bao gồm kháng sinh và các chất kích thích tăng trưởng trong ñó có
Clenbuterol.
ðể có ñược những sản phẩm an tòan, không chỉ có biện pháp quản lý ở khâu
chuyên chở, giết mổ, chế biến mà cần có biện pháp quản lý từ khâu chăn nuôi,
nguyên liệu chế biến thức ăn cũng như thành phẩm tại các cơ sở chế biến thức ăn
trước khi xuất bán ñến người chăn nuôi. Việc phân tích phát hiện ra dư lượng các
chất tồn dư này ở tất cả các công ñoạn từ nguồn nguyên liệu ñến chế biến thì vấn ñề
xét nghiệm nhanh là rất cần thiết ñối với các cơ quan quản lý và kiểm soát an tòan
thực phẩm, mặt khác xu hướng toàn cầu hoá kinh tế và gia nhập vào Tổ chức
Thương mại thế giới (WTO) của nước ta thì việc tồn dư lượng thuốc trong thực
phẩm sẽ là rào cản ñối với các doanh nghiệp xuất khẩu thịt và sản phẩm ñộng vật.
Vì vậy, chúng tôi ñề xuất ñề tài nghiên cứu: “Xác ñịnh giới hạn thấp nhất có thể
phát hiện Clenbuterol trong thức ăn gia súc bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh
trên cực giọt chậm” [5, 6, 11, 18, 28]

5
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về CLENBUTEROL
1.1.1. Cấu trúc khung của các β
ββ
β
2
– agonist:
Họ β
2
– agonist gồm 15 chất dùng làm thuốc ñiều trị bệnh ñường hô hấp ở
người, ñộng vật.
Bảng 1.1: Họ β
ββ

β
2
– agonist


R
1
R
2
R
3
R
4
R
5
Clenbuterol H Cl NH
2
Cl C(CH
3
)
Salbutamol H CH
2
OH OH H C(CH
3
)
3

Mabuterol H Cl NH
2
CF

3
C(CH
3
)CH
3

Mapenterol H Cl NH
2
CF
3
C(CH
3
)CH
2
CH
3

Clenproperol H Cl NH
2
CF
3
CH(CH
3
)CH
2

Terbutaline H OH H OH C(CH
3
)
3

Clenpenterol H Cl NH
2
Cl C(CH
3
)CH
2
CH
3

Bromobuterol H Br NH
2
Br C(CH
3
)
NA 1141 H Cl NH
2
Cl C(CH
3
)CH
2
OH
Tulobuterol Cl H H H C(CH
3
)
3
Cimaterol H CN NH
2
H
CH(CH

3
)
2
Cimbuterol H CN NH
2
H C(CH
3
)
3

Orciprennaline H OH H OH CH(CH
3
)
2

Ractopamine H H OH H CH(CH
3
)CH
2
-PhOH

6

1.1.2 Công thức cấu tạo Clenbuterol:
 Công thức phân tử: C
12
H
18
Cl
2

N
2
O
 Trọng lượng phân tử: 277.20 g/mol
 Tên quốc tế: 4 – amino – 3,5 dichloro - α [[(1,1 – dimethylethyl) amino]
methyl] benzenethanol
 Một số tên khác: 4 – amino - α [tert – terbutylamino) methyl] - 3 – 5
dichlorobenzylalcol
 Thường ở dạng dẫn xuất hydrochloride

Cl
H
2
N
Cl
OH
N
H
C(CH
3
)
3

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của CLENBUTEROL

1.1.3. Tính chất lý hoá:
 Dạng bột, tinh thể không màu, tan nhiều trong methanol, ethanol, nước, ít tan
trong chloroform. Không tan trong benzene
 ðiểm nóng chảy: mp 174 – 175.5
0

C
 Liều gây chết ñối với chuột nhắt 176 mg/kg, chuột cống 315 mg/kg, chuột
bạch 61,1 mg/kg (bằng ñường miệng)
1.1.4. Công dụng:
Fenoterol H OH H OH CH(CH
3
)CH
2
-PhOH

7
CLEN là một chất thuộc nhóm β
2
– agonist ñược sử dụng ñể ñiều trị các
chứng bệnh liên quan ñến hô hấp như hen, suyễn ở người và ñộng vật. Do CLEN
gây giãn mạch, kích thích tim, giãn phế quản, không phân giải ñường, không tiêu
thụ năng lượng, ái lực với các các thụ thể có mạch hydrocacbon… nên dược sử
dụng trong chăn nuôi với mục ñích tăng tỷ lệ nạc trên gia súc, gia cầm thương
phẩm. Clen còn làm tăng tỷ lệ ñẻ trứng trên gà. Tuy nhiên, CLEN cũng gây ngộ ñộc
cho ñộng vật nuôi như gà sẽ chết nếu sử dụng thức ăn có chứa CLEN với hàm
lượng khoảng 137,05 ppb. [1, 2]
1.1.5. Dược ñộng học:
Trong mạch máu CLEN kết hợp với Gs _ protein làm tăng hoạt ñộng cAMP,
cAMP làm hoạt ñộng cAMP – dependent protein kinase (PK – A) dẫn ñến lượng
Ca
++
ñi vào tế bào tăng lên ảnh hưởng ñến màng cơ tim, làm tăng nhịp tim.
Trong phổi: CLEN ñược hoạt hóa ở dạng phế nang, CLEN làm tăng sự hoạt
hóa glycogen ở gan và tụy, ảnh hưởng tới glucose trong huyết tương.
Trong thận: CLEN kích thích tạo ra aldosterone ở vỏ thượng thận

Hình 1.2: Quá trình chuyển hóa CLEN trong cơ thể

8
Nghiên cứu sự chuyển hóa của Clenbuterol trong mẫu nước tiểu của chó, tác
giả Schmid & Prox kết luận quá trình chuyển hóa xảy ra chậm do không có các liên
kết có khả năng phản ứng với enzym, monoamine oxidase và cotechol – O – methyl
transferdase, diễn tiến của quá trình chuyển hóa xảy ra như sau:

Hình 1.3: Quá trình chuyển hóa Clenbuterol trong nước tiểu chó
(A) Clenbuterol; (B) 2.3%; (C) 2.2%; (D) 0.5%; (E) 4.5%;
(F) 20% 4 – amino - 3,5dichloromandelic acid; (G)1.6%; (H ) 6.5%; (I) 2.2%
(J) 9% 4 – amino - 3,5 dichlorobenzoic acid
(K) 9% 4 – amino - 3,5 dichlorohippuric acid, (L) -; (M) 2.2%

9
Trong một thí nghiệm trên gia súc, khi ñược cho uống, tiêm bắp và tiêm ven
bằng
14
C – Clenbuterol thì có sự ñào thải qua nước tiểu (50 – 80% của liều sử
dụng); qua phân (5 – 30% của liều sử dụng). Có sự ñào thải qua sữa (0,9 – 3% liều
sử dụng) một cách ñều ñặn sau khi qua sử dụng từ 4 – 15 ngày.

Bảng 1.2: Thời gian ñào thải CLEN trong nước tiểu và phân ñộng vật
Loài
Thời gian sau

khi sử dụng (h)
% trong
nước tiểu
% trong
phân
Tham khảo
Chuột
0 – 72 62,5 20,8 Kopitar, 1970
0 – 72 88,5 8,9 Zimmer, 1971
Thỏ
0 – 96 92 0,2 – 5,0 Zimmer, 1974b
0 – 96 85 – 87 3,5 – 9 Zimmer, 1974a
Chó
0 – 96 74 3,7 Zimmer, 1974b
Ngựa
0 – 336 75 – 91 6 – 15
Johnston &
Dunsire, 1993

Những năm 1980 của thế kỷ 20, Công ty Cyanamid Hoa Kỳ ñã thực hiện
chứng minh CLEN còn là chất ñiều tiết sinh trưởng ở ñộng vật. Khi dùng CLEN ở
liều cao 5 – 10 lần liều trị bệnh cho người và ñộng vật (hàm lượng Clenbuterol dùng
trong kích thích tăng trưởng từ 10 – 20 µg/kg/ngày theo ñường miệng), nó có tác
dụng thúc ñẩy phát triển cơ bắp và phân giải lipid, tăng cao tỷ lệ nạc so với tỷ lệ
mỡ. Có tác dụng phân phối lượng năng lượng (repartitioning) nâng cao hiệu quả sử
dụng thức ăn. Vì vậy, CLEN thường bị lợi dụng dùng làm chất tăng trưởng làm tăng
tỷ lệ nạc so với mỡ.
Ngoài ra, CLEN còn ñược dùng làm thuốc giảm béo cho người mập và dùng
làm chất kích thích cho các vận ñộng viên thể thao, năm 2001 Uy ban thể thao
Olympic quốc tế ñã ra lệnh cấm sử dụng CLEN và các β

2
– agonist khác [ 8, 9, 10,
12,13; 14; 15; 16; 17;19; 20; 21; 22; 23]


10
1.1.6. Ảnh hưởng của sự tồn dư Clenbuterol trong thịt gia súc, gia cầm lên
người sử dụng
Clenbuterol có những tác động không mong muốn một cách mạnh mẽ lên
người nếu ăn phải sản phẩm động vật có tồn đọng chất này. Các hội chứng ngộ độc
cấp cho con người gồm các triệu chứng như: run cơ, tim đập nhanh, tăng huyết
áp, choáng váng, đau đầu, đau cơ, buồn nôn, sốt ói, gây tổn thương hệ thần kinh
và hệ tuần hồn của con người.
Theo báo cáo của một bác sĩ thuộc Trung Tâm Phân Tích ðộc Chất Thú Y
Lyons ở miền Nam nước Pháp, những người ăn phải thực phẩm có chứa CLEN
thường xuất hiện triệu chứng ngộ độc trong thời gian từ 30 – 360 phút, trung bình
khoảng 100 phút, thời gian xuất hiện triệu chứng khơng phụ thuộc tuổi tác và giới
tính. Sau 72 giờ thì đa số các bệnh nhân khơng còn triệu chứng trên.
Ở Mỹ cơ quan thuốc và thực phẩm FDA cho rằng CLEN hồn tồn có thể gây
chết nếu người ăn phải thịt ngộ độc vốn nhạy cảm hay đang điều trị một loại thuốc
có tác dụng tương tự. Năm 2006, cơ quan thuốc và thực phẩm Mỹ cấm sử dụng kể
cả trong điều trị cho người [11, 12, 18 ]
1.2. Tình hình nghiên cứu ngồi nước
Để kiểm tra phát hiện Clenbuterol trong thức ăn gia súc, sản phẩm thòt gia
súc, các nước EU đang sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng (HPLC) hoặc sắc ký khí
khối phổ (GC-MS) với giới hạn phát hiện 1,02 ppb, đònh lượng được 85%
Clenbuterol, độ lệch chuẩn tương đối tương ứng 6,2%. Các phương pháp này có
ngưỡng phát hiện thấp nhưng quy trình xử lý mẫu phức tạp, thời gian dài.
Clenbuterol có chứa nhóm chức amino vì vậy phương pháp sắc ký lỏng sử
dụng đầu dò điện hoá cũng tỏ ra hiệu quả với điện cực glassy cacbon, điện cực

so sánh Ag/AgCl hoặc Calomel với độ phát hiện mẫu thấp nhưng có nhược điểm
là điện cực phải được làm sạch mài nhẵn sau mỗi lần phân tích.
Để tiện dụng, người ta đã chế tạo ra các kit thử còn gọi là Test kits. Sử
dụng Test-kit tiện lợi do không cần sử dụng máy móc phức tạp, không cần có

11
lượng mẫu lớn, đạt hiệu quả phát hiện, đạt tốc độ trả lời kết quả rất nhanh, tốn ít
hóa chất. Tuy nhiên ở một số trường hợp có thể gặp dương tính giả nếu nhân
viên phân tích không có kinh nghiệm,… và có thể phải kiểm tra lại bằng phương
pháp phân tích khác [8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 19, 21, 22, 23].
1.3. Các phương pháp xác định Clenbuterol
Dựa vào tính chất và cấu trúc của Clen có rất nhiều phương pháp xác định
trong thức ăn gia súc, thịt, gan, . . . dùng các phương pháp dụng cụ như: phát quang
hóa học, sắc ký lỏng, sắc ký khí, điện hóa, phương pháp miễn dịch enzym.
1.3.1. Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA)
1.3.1.1. Ngun tắc
Cơ sở định lượng dựa trên phản ứng miễn dịch giữa chất kháng ngun đặc
hiệu và chất kháng thể. ðó là sự cạnh tranh của enzym cộng hợp và dư lượng CLEN
trong mẫu để gắn vào kháng thể đặc biệt CLEN cố định trên giếng microtiter. Trong
q trình thử nghiệm, mẫu và enzym cộng hợp cho vào giếng đã có sẵn kháng thể.
Thuốc trong mẫu sẽ cạnh tranh với enzym cộng hợp để gắn vào lượng giới hạn của
kháng thể đã có sẵn trong giếng. Khi có đủ lượng thuốc hiện diện trong mẫu, thuốc
sẽ làm bão hòa lượng kháng thể có sẵn. Do vậy, phản ứng của enzym sẽ khơng xảy
ra và chỉ nhận màu nhạt thể hiện kết quả dương tính. Nếu mẫu âm tính, nó sẽ tạo
màu đậm do phản ứng giữa enzym với chất nền [23]
1.3.1.2. ðộ nhạy và tính chọn lọc
Phép thử nghiệm miễn dịch enzym CLEN dùng một kháng thể đặc trưng
chống lại CLEN liên hợp protein, khả năng phản ứng chéo của kháng thể này so với
các chất trong họ β
2

– agonist

12
Bảng 1.3: ðộ phản ứng chéo của các chất trong họ β
ββ
β
2
– agonist
STT Hợp chất ðộ phản ứng chéo (%)
1 Clenbuterol 100,0
2 Mabuterol 67,0
3 Mapenterol 55,0
4 Tulobuterol 12,0
5 Terbutaline 8,3
6 Salbutamol 6,0
7 Cimaterol 1,6
8 Pirbuterol 0,5
9 Isoprealine 0,3

ðường chuẩn tuyến tính từ 0,05 – 4,5 ppb. Phương pháp có thể phát hiện trực
tiếp tổng không cần qua bước thủy giải vì khả năng phản ứng chéo của CLEN miễn
dịch enzym với các chất còn lại trong họ β
2
– agonist giảm dần.
Giới hạn phát hiện nằm ở mức ppb phù hợp với phát hiện dư lượng CLEN
trong mẫu thức ăn gia súc (LoD = 0,2 ppb) theo quyết ñịnh cấm của Bộ Nông
nghiệp Phát triển nông thôn Việt Nam
1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS)
1.3.2.1. Nguyên tắc
Dựa vào ái lực của các cấu tử giữa pha tĩnh (pha ñảo hoặc pha nghịch)

thường là chất rắn và pha ñộng (lỏng) mà mỗi cấu tử sẽ ñược rửa giải ra khỏi cột
theo thứ tự khác nhau. Cấu tử ra khỏi cột ñược ñưa vào ñầu dò MS và ở ñây cấu tử
ñược ion hóa, phân mảnh và ñược phát hiện dựa vào ñộ giàu m/z. Trên cở sở này
nên ñầu dò có thể nhận danh và ñịnh lượng một cách rõ ràng, khẳng ñịnh về hợp
chất nào ñó
1.3.2.2. ðộ nhạy và tính chọn lọc
Phương pháp có tính chọn lọc rất cao và rất nhạy. Giới hạn phát hiện cỡ 0.01
ppb. ðường chuẩn tuyến tính rất dài 0.1 – 100 ppb rất tốt khi ñịnh lượng. Phương
pháp này phù hợp ñể phân tích và khẳng ñịnh dư lượng CLEN trong thức ăn gia
súc. Giới hạn phát hiện LOD = 0,2 ppb

13
1.3.3. Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC – MS)
1.3.3.1. Nguyên tắc
Dựa vào sự khác nhau về nhiệt ñộ sôi và ái lực của các cấu tử với pha tĩnh,
mỗi cấu tử sẽ ra khỏi cột theo thứ tự khác nhau nhờ sự vận chuyển liên tục của pha
ñộng (khí mang) trên pha tĩnh và ñược phân biệt bởi thời gian lưu giữ khác nhau.
Khi phân tích dùng ñầu dò khối phổ, mẫu phải ñược tạo dẫn xuất ñể giảm ñộ
phân cực, tăng khả năng bay hơi, nâng cao tính chọn lọc và ñộ hoàn hảo về mặt sắc
ký khí và mặt phổ. Khi phân tích ở mức dư lượng trong các loại nền mẫu khác nhau
thì mẫu cần phải ñược làm sạch và làm giàu ñảm bảo tính chọn lọc và ñộ ñúng [22,
23]
1.3.3.2. ðộ nhạy và tính chọn lọc
GC – MS là một phương pháp khá nhạy và có tính chọn lọc khá cao vì cho
thêm thông tin về mặt cấu trúc. ðộ nhạy của GC – MS phụ thuộc rất nhiều vào kỹ
thuật ion hóa ñược sử dụng. Ngoài ra, khi phân tích dùng ñầu dò khối phổ ta có thể
nâng cao ñộ nhạy (hạ thấp giới hạn phát hiện) bằng cách dùng kỹ thuật SIM ñồng
thời thỏa mãn các yêu cầu cho phương pháp khẳng ñịnh dư lượng CLEN mẫu thức
ăn gia súc (LoD = 0,75 ppb). ðường chuẩn tuyến tính từ 0,4 – 5000 ppb tốt cho
ñịnh lượng.

Theo chỉ thị cộng ñồng Châu Âu 2002/657/EC bắt buộc phải dùng phương
pháp phổ ñể khẳng ñịnh các chất bị cấm tuyệt ñối, nghĩa là phải nhận danh rõ ràng
theo quy tắc 4 ñiểm nhận danh (identification point, ký hiệu IP) ñối với các hợp chất
cấm thuộc nhóm A theo chỉ thị 96/23/EC và chỉ ñược quyền kết hợp tối ña ba kỹ
thuật (ví dụ: HPLC, GC – ECD và TCL) [15]
1.3.4. Phương pháp cực phổ sóng vuông
Kỹ thuật cực phổ sóng vuông là kỹ thuật vi phân biên ñộ lớn, trong ñó hình
dạng xung ñược sắp xếp cân xứng, hình dạng thế là hình cầu thang, ñược áp dụng
cho ñiện cực làm việc. Theo phương pháp này, ñiện cực giọt Hg ñược phân cực bởi
một ñiện áp một chiều Estep biến thiên theo thời gian có dạng hình bậc thang và
ñược cộng thêm một xung ñiện áp xoay chiều dạng hình vuông Esw có góc biên ñộ
nhỏ và giữ không ñổi trong suốt quá trình ño.Chiều dài mỗi bước bậc thang có ñiện
áp và chu kỳ của xung phải ñồng nhất (khoảng 5 ms), bước thế của thang ñiện áp

14
Estep thường có giá trị 10 mV, cường độ xung Esw thường là 10 – 60 mV. Các điều
kiện này tương ứng với tần số xung là 200 Hz, tốc độ qt thế là 200 mV/s.
Với các phản ứng thuận nghịch, kích thước của một xung đủ lớn để q trình
oxy hóa sản phẩm hình thành ở trong xung thuận ban đầu sẽ diễn ra trong suốt q
trình xung ngược. Do đó, xung ban đầu sinh ra dòng i
1
sau đó sẽ sinh ra dòng i
2
.
Tương ứng như vậy sẽ ghi dòng Faraday 2 lần: lần thứ nhất là cuối ban đầu và lần
thứ 2 là cuối xung ngược, tại thời điểm này diện tích bề mặt giọt Hg khơng đổi để
dòng tụ điện gần như triệt tiêu. Sự khác biệt giữa 2 dòng ∆ i = [i(t2)-i(t1)] được vẽ
Hình theo bước thế, ta thu được cực phổ ở dạng sóng, trong đó chiều cao của sóng
phổ và diện tích sóng phổ tương ứng với thế bán sóng trong cực phổ DC.
Thời gian phân tích nhanh nên có thể lặp lại phép phân tích nhiều lần. Theo

tính tốn, với xung sóng vng có chu kỳ 5ms và bước thế 10 mV, để thu được cực
phổ hồn chỉnh trong phạm vi thế qt là 0 – 1V chỉ trong 0.5s. Trong cùng điều
kiện trên với cực phổ xung vi phân phải cần 50 s Loại trừ ảnh hưởng của dòng tụ
điện, giảm LOD đến mức 10
-7
– 10
-8
M
1.4. Tính cấp thiết của đề tài
Trong thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về tình hình ngộ độc Clenbuterol
xảy ra trên người. Đầu năm 1990, tại Tây Ban Nha người ta nghi ngờ vì ăn gan
bò bò nhiễm độc làm 135 người phải nhập viện. Đây là bằng chứng đầu tiên cho
việc quản lý thuốc dùng trong chăn nuôi đã gây nên triệu chứng ngộ độc cấp
tính đối với người tiêu thụ. Ngày 24/09/1990 tại Pháp có 22 người đã bò ngộ độc
do dùng thòt còn tồn dư Clenbuterol. Chính vì những tác động không mong muốn
này mà hiện nay Clenbuterol đã bò cấm sử dụng trong chăn nuôi tại Mỹ
(năm1991), tại Châu u (năm1998) và tại Canada (năm 2004). Tại Việt Nam,
ngày 20/06/2002 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn chính thức cấm sử dụng
hoá chất này trong sản xuất, nhập khẩu, lưu thông tại quyết đònh số 54/2002/QĐ
– BNN. Tuy nhiên hoạt động kiểm soát dư lượng hóa chất có hại đến sức khỏe
người tiêu dùng vẫn chưa được thực hiện nghiêm túc ở tất cả các công đoạn từ