nghiên cứu thử nghiệm tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất (naja kaouthia) và hổ chúa (ocpgs.tsphiophagus hannah) trên thỏ

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM BỘ Y TẾ
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN PASTEUR TP.HCM






B
B
A
A
Ù
Ù
O
O


C
C
A
A
Ù
Ù
O
O


N
N
G

G
H
H
I
I
E
E
Ä
Ä
M
M


T
T
H
H
U
U


(
(
đ
đ
a
a
õ
õ

c
c
h
h
ỉ
ỉ
n
n
h
h


s
s
ư
ư
û
û
a
a


t
t
h
h
e
e
o

o


y
y
ù
ù


k
k
i
i
e
e
á
á
n
n


c
c
u
u
û
û
a
a

H
H
o
o
ä
ä
i
i


Đ
Đ
o
o
à
à
n
n
g
g


n
n
g
g
h
h
i

i
e
e
ä
ä
m
m


t
t
h
h
u
u


n
n
g
g
a
a
ø
ø
y
y


5

5
/
/
1
1
1
1
/
/
2
2
0
0
0
0
9
9
)
)








NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM
TẠO HUYẾT THANH KHÁNG ðA ðỘC TỐ
HAI LOẠI RẮN HỔ ðẤT (Naja kaouthia),

VÀ HỔ CHÚA (Ophigophagus hannah) TRÊN THỎ








Chủ nhiệm đề tài:
1. PGS.TS. NGUYỄN LÊ TRANG
2. Th.S. NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU






THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 11/ 2009

I

BÁO CÁO NGHIỆM THU
1. Tên đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ
đất (Naja kaouthia) và hổ chúa (Ophigophagus hannah) trên thỏ
Chủ nhiệm đề tài: 1. PGS.TS. NGUYỄN LÊ TRANG
2. Th.S. NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU
Cơ quan chủ trì: VIỆN PASTEUR TP.HCM
Thời gian thực hiện đề tài: 23 tháng (11/2007- 9/2009)

Kinh phí được duyệt: 320.000.000 đồng
Kinh phí cấp đợt 1: 240.000.000 đồng theo TB 224 -12/11/2007
Kinh phí cấp đợt 2: 48.000.000 đồng theo TB 83 - 21/4/2009

2. Danh sách những người tham gia đề tài:
STT

Họ và tên Học hàm, học vị Cơ quan
1
2
3
4
5
Võ Thị Mỹ Duyên
Đỗ Thị Châm
Lạc Ngọc Thêm
Dương Ngọc Diễm
Doãn Thị Sim
Th.S. Sinh học
CN. Sinh học
CN. Xét nghiệm
CN. Sinh học

Viện Pasteur TP.HCM
”
”
”
”

3. Mục tiêu: Nghiên cứu thử nghiệm tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ

đất (Naja kaouthia) và hổ chúa (Ophigophagus hannah) trên thỏ

4. Nội dung:
Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện
Xác định độc lực của nọc rắn hổ
đất và hổ chúa
- Độc lực của nọc rắn hổ đất:
LD
50
= 5,93 µg/chuột 18-20 gam
- Độc lực của nọc rắn hổ chúa:
LD
50
= 9,44 µg/chuột 18-20 gam

II

Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ
đất và hổ chúa và xác định độc
lực của độc tố
- Đã tiến hành tinh chế độc tố qua hai giai đoạn
sắc ký lọc trên Sephadex G-50 và sắc ký trao
đổi ion Biorex-70
- Đã xác định được các thành phần gây độc
chính trong nọc hai loại rắn. Kết quả được
tóm tắt trong bảng 1 (trang 20) và bảng 2
(trang 24).
* Độc lực độc tố peak 3.1 (sau sắc ký trao đổi
ion) của nọc hổ đất:
LD

50
= 0,77µg/chuột 18-20 gam
* Độc lực độc tố peak 3 (sau sắc ký lọc) của
nọc hổ chúa:
LD50 = 3,02 µg/chuột 18-20 gam
Tạo huyết thanh kháng độc tố
của hai loại rắn trên thỏ
- Lô I: 3 thỏ (đánh số 17, 18, 19) được gây
miễn dịch với độc tố peak 3.1 của nọc rắn hổ
đất.
- Lô II: 4 thỏ (đánh số 13, 14, 15, 16) được
gây miễn dịch với độc tố peak 3 của nọc rắn hổ
chúa.
- Lô III: 4 thỏ (đánh số 7, 8, 11, 12) được gây
miễn dịch với cả hai loại độc tố trên.
Sau quá trình gây miễn dịch, thu nhận kháng
huyết thanh và lưu trữ kháng thể dưới dạng tủa
trong ammonium sulfate bão hòa 50%, 4
0
C.

III

Theo dõi đáp ứng miễn dịch
bằng phản ứng ELISA
- Tất cả các thỏ đều có kháng thể đặc hiệu đối
với thành phần kháng nguyên đưa vào và hiệu
giá kháng thể đặc hiệu tăng dần và cao nhất
trong huyết thanh sau lần tiêm thứ 3 và hơi
giảm trong huyết thanh sau lần tiêm thứ 4.

- Sử dụng huyết thanh sau lần tiêm thứ 3 và
thứ tư để thực hiện phản ứng trung hòa trên
chuột.
Xác định khả năng trung hòa
của huyết thanh kháng độc tố
đối với nọc toàn phần trên chuột

- Huyết thanh kháng độc tố thần kinh rắn hổ
đất có khả năng trung hòa với nọc rắn hổ đất
và nọc rắn hổ chúa.
- Huyết thanh kháng độc tố thần kinh rắn hổ
chúa không có khả năng trung hòa với nọc hổ
chúa (theo qui trình gây miễn dịch của đề tài).
Đây là một vấn đề cần được nghiên cứu thêm.
- Huyết thanh kháng đa độc tố của hai loài rắn
hổ đất và rắn hổ chúa có khả năng trung hòa
với nọc rắn hổ đất và nọc rắn hổ chúa. Kháng
huyết thanh đa giá có thể cải thiện hiệu giá
trung hòa đối với nọc rắn hổ chúa so với tác
dụng trung hòa chéo của huyết thanh kháng
độc tố thần kinh rắn hổ đất. Tuy nhiên tác dụng
trung hòa đối với nọc rắn hổ đất bị giảm.
Viết báo cáo Hoàn thành báo cáo




IV

4. Sản phẩm của đề tài:

1. Kết quả xác định độc lực của nọc rắn hổ đất và hổ chúa trên chuột nhắt trắng
2. Độc tố của nọc rắn hổ đất và hổ chúa sau tinh chế
3. Các thành phần gây độc của nọc hổ chúa và hổ đất sau tinh chế
4. Kết quả xác định độc lực của các thành phần gây độc
5. Kháng thể thỏ kháng độc tố của rắn hổ đất và hổ chúa ở dạng tủa trong
ammonium sulfate bão hòa 50%
6. Kết quả xác định hiệu lực trung hòa nọc toàn phần của 3 loại kháng thể thỏ (kháng
độc tố hổ đất, kháng độc tố hổ chúa, kháng độc tố hỗn hợp) sau tinh chế trên
chuột.
7. Báo cáo nghiệm thu đề tài

V

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HUYẾT THANH ĐA ĐỘC TỐ KHÁNG HAI LOÀI
RẮN HỔ ĐẤT (Naja kaouthia) VÀ HỔ CHÚA (Ophigophagus hannah)
TRÊN THỎ

Các phân đoạn độc tố thần kinh có trọng lượng phân tử thấp được tinh chế từ
nọc của hai loài rắn hổ đất và hổ chúa. Đây là những phân đoạn độc tố gây chết chủ
yếu trong nọc. Kháng huyết thanh được chế tạo bằng cách gây miễn dịch trên 3 lô thỏ:
lô I- gây miễn dịch với độc tố thần kinh của nọc rắn hổ đất; lô II- gây miễn dịch với
độc tố thần kinh của nọc hổ chúa và lô III- gây miễn dịch với phức hợp hai loại độc tố
trên.
Huyết thanh kháng độc tố rắn hổ đất của thỏ ở lô I có khả năng trung hòa nọc hổ
đất với hiệu giá là 60 LD
50
/mL huyết thanh, đồng thời có tác dụng trung hòa chéo nọc
rắn hổ chúa với hiệu giá là 13,3 LD

50
/mL huyết thanh. Huyết thanh kháng đa độc tố
của thỏ ở lô III có khả năng trung hòa nọc hổ đất với hiệu giá là 35 LD
50
/mL huyết
thanh và trung hòa nọc hổ chúa với hiệu giá là 25 LD
50
/mL huyết thanh. Huyết thanh
kháng độc tố rắn hổ chúa của thỏ lô II không có khả năng trung hòa nọc hổ chúa cũng
như phân đoạn độc tố hổ chúa.

VI

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT


PRODUCTION OF ANTI-POLYTOXINS AGAINST TWO ELAPID VENOMS :
Naja kaouthia AND Ophiophagus hannah

Low molarcular weigh neurotoxin fractions were isolated from the venom of
Naja kaouthia and Ophiophagus hannah. These fractions were the major lethal toxin
fractions in these venoms. Antisera were prepared by immunizing rabbits with the
Naja kaouthia neurotoxin fraction (group I), the Ophiophagus hannah neurotoxin
fraction (group II) and the mixture of both neurotoxin fractions (group III),
respectively. The potency of sera from group I and group III rabbits against the
toxicity of the Naja kaouthia venom were 60 LD
50
and 35 LD
50
/ml serum. The

serum of group II rabbits gave no protection against the toxicity of the Ophiophagus
hannah venom as well as of the Ophiophagus hannah neurotoxin fraction. The
potency of sera from group I and group III against the toxicity of the Ophiophagus
hannah venom were 13 LD
50
and 25 LD
50
/ml serum.




VII

MỤC LỤC

Trang
Tóm tắt báo cáo I
Mục lục VII
Danh sách các chữ viết tắt X
Danh sách bảng XI
Danh sách hình XI

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1
1.1. Tình hình nhiễm nọc độc rắn
1
1.2. Độc tố nọc rắn hổ
1
1.3. Huyết thanh kháng nọc rắn hổ

2
1.4. Huyết thanh đơn giá và huyết thanh đa giá kháng nọc rắn
3
1.5. Tình hình sản xuất huyết thanh kháng nọc trên thế giới và tại Việt
Nam
4
1.6. Đặt vấn đề
4

CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
6

CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
7
3.1. Phương pháp xác định độc lực của nọc rắn hổ đất và hổ chúa
7
3.1.1. Vật liệu
7
3.1.2. Phương pháp
7
3.1.2.1. Các thông số kỹ thuật 8
3.1.2.2. Gây nhiễm 8
3.2. Phương pháp tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất và nọc rắn hổ chúa
9
3.2.1. Vật liệu
9
3.2.2. Phương pháp
9
3.3. Phương pháp tạo huyết thanh kháng độc tố của hai loài rắn hổ đất và
hổ chúa

9
3.3.1.
Vật liệu
9
3.3.2. Phương pháp
10

VIII

3.4. Phương pháp kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ
10
3.4.1. Nguyên tắc
10
3.4.2. Vật liệu
10
3.4.3. Phương pháp
11
3.5. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu với các độc tố
bằng phản ứng ELISA
11
3.5.1. Phương pháp gắn biotin vào độc tố
11
3.5.2. Kỹ thuật ELISA hai kháng nguyên kẹp kháng thể
12
3.6. Phương pháp tách và lưu trữ kháng thể bằng kỹ thuật tủa với
ammonium sulfate 50% độ bão hòa
13
3.6.1. Nguyên tắc
13
3.6.2. Vật liệu

14
3.6.3. Tiến hành
14
3.7. Phương pháp xác định hiệu lực trung hòa độc lực nọc toàn phần của
kháng thể kháng độc tố trên chuột
15
3.7.1. Vật liệu và các thông số kỹ thuật
16
3.7.2. Phản ứng trung hòa
16

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
18
4.1. Kết quả
18
4.1.1. Xác định độc lực của nọc rắn hổ đất và hổ chúa
18
4.1.2. Tinh chế độc tố và xác định độc tính
18
4.1.2.1. Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia) 18
a)

Tinh chế qua sắc ký lọc Sephadex G-50 superfine 18
b)

Tinh chế độc tố của nọc rắn hổ đất qua sắc ký trao đổi ion BioRex -70 19
c)

Phân tích độ tinh khiết peak 3.1 trên điện di gel SDS-PAGE gradient 8-
18%

20
4.1.2.2. Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ chúa (Ophigophagus hannah) 21
a)

Tinh chế qua sắc ký lọc Sephadex G-50 superfine 21

IX

b)

Tinh chế độc tố của nọc hổ chúa qua sắc ký trao đổi ion Bio-Rex 70 22
c)

Phân tích độ tinh khiết độc tố trên điện di gel SDS- PAGE gradient 8-
18%
23
4.1.3. Gây miễn dịch và theo dõi đáp ứng miễn dịch
25
4.1.3.1. Gây miễn dịch trên 3 lô thỏ thí nghiệm 25
4.1.3.2. Theo dõi đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp khuếch tán miễn dịch kép
Ouchterlony
25
4.1.3.3. Theo dõi đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp Elisa 26
4.1.4.

4.1.4.1.
4.1.4.2.
4.1.4.3.
4.2.
Xác định khả năng trung hòa của huyết thanh kháng độc tố đối với nọc

toàn phần trên chuột
Khả năng trung hòa đối với nọc hổ đất toàn phần
Khả năng trung hòa đối với nọc hổ chúa toàn phần
Khả năng trung hòa đối với độc tố peak 3 của nọc hổ chúa
Bàn luận
29

29
29
30
30

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
32

TÀI LIỆU THAM KHẢO
33

PHỤ LỤC 1
37

PHỤ LỤC 2
44

PHỤ LỤC 3
47



X

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT


APS Ammonium persulfate
AS Ammonium sulfate


BSA Bovine serum albumin
DMSO Dimethyl sulfoxide


DTT Dithiothreitol


ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
FLT Fatal Limit Time
LD50 Lethal dose:
liều gây chết tối thiểu 50% số súc vật thí nghiệm
LMT Last Mortality Time
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
PBS Phosphate buffered saline
SDS Sodium dodecylsulfate

XI

DANH SÁCH BẢNG

Bảng

Nội dung Trang
1 Tóm tắt quá trình tinh chế độc tố nọc rắn hổ đất 26
2 Tóm tắt quá trình tinh chế nọc rắn hổ chúa 30
3 Hiệu lực trung hòa của kháng huyết thanh đối với nọc rắn
hổ đất toàn phần
35
4 Hiệu lực trung hòa của kháng huyết thanh đối với nọc rắn
hổ chúa toàn phần
36




DANH SÁCH HÌNH

Hình

Nội dung Trang

1 Dụng cụ tạo gradient 14
2 Phản ứng cộng hợp NHS-LC-Biotin II vào protein 18
3 Protein tan trong nước 20
4 Protein trong đệm ammonium sulphate 21
5 Phân tách nọc rắn hổ đất bằng sắc ký lọc G-50 Superfine 24
6 Tinh chế độc tố của nọc rắn hổ đất bằng sắc ký trao đổi ion
BioRex-70
25

7 Kết quả điện di kiểm tra độ tinh khiết của peak 3.1 (nọc hổ
đất) sau sắc ký trao đổi ion
27
8 Phân tách nọc rắn hổ chúa bằng sắc ký lọc Sephadex G-50
Superfine
28
9 Phân tách peak 3 bằng sắc ký trao đổi ion BioRex-70 29
10 Kết quả điện di kiểm tra độ tinh khiết của các phân đoạn
độc tố nọc hổ chúa sau sắc ký trao đổi ion
30
11 Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp
khuếch tán kép trên thạch Ouchterlony
32
12 Đường biểu diễn mức độ kháng thể trong huyết thanh của
từng con thỏ sau mỗi lần tiêm miễn dịch với độc tố nọc rắn
hổ đất.
33
13 Đường biểu diễn mức độ kháng thể trong huyết thanh của
từng con thỏ sau mỗi lần tiêm miễn dịch với độc tố nọc rắn
hổ chúa.
34

Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-1-

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nhiễm nọc độc rắn:
Nhiễm nọc độc rắn là một vấn đề y tế cần lưu tâm, nhất là tại các nước có khí

hậu nhiệt đới thuận lợi cho điều kiện sinh sống và phát triển của các lồi rắn. Ước tính
số người chết vì nhiễm nọc độc rắn có thể lên đến 100.000 người/năm (1). Tại Việt
Nam chưa có một cơng trình khoa học nào thống kê tương đối số nạn nhân bị rắn cắn
trên phạm vi cả nước. Tại Thái Lan, một quốc gia có khí hậu, địa hình và phân bố dân
số rất gần với Việt Nam con số này là 9.000 người/năm (2). Tuy nhiên con số này có
thể còn cao hơn do có nhiều nạn nhân khơng đến điều trị tại các cơ sở y tế mà dùng các
bài thuốc dân gian nên khơng thống kê được. Tình trạng trên rất giống với nước ta.
Ở nước ta chủ yếu có 2 họ rắn độc là rắn hổ (Elapidae) và rắn lục (Viperidae).
Theo các thống kê sơ bộ, rắn hổ là họ rắn chủ yếu gây ra tử vong cho nạn nhân. Các
lồi rắn trong họ rắn hổ thường gây tai nạn là hổ đất (Naja kaouthia), hổ chúa
(Ophigophagus hannah) và cạp nong (Bungarus fasciatus).

1.2. Độc tố nọc rắn hổ:
Nọc rắn là hỗn hợp phức tạp của nhiều loại protein khác nhau về độc tính cũng
như chức năng. Trong họ rắn hổ thành phần gây chết chủ yếu là các độc tố liên kết với
thụ quan hậu khớp thần kinh cơ (3). Các độc tố liên kết mạnh vào các tiểu đơn vị alpha
của thụ thể nicotinic acetylcholine gây ra ức chế dẫn truyền thần kinh cơ, làm liệt cơ
sườn và gây chết do làm nạn nhân ngừng hơ hấp (4). Các độc tố này là các peptides có
trọng lượng phân tử thấp 6000 - 8000 dalton (3). Trong họ rắn hổ, rắn hổ đất là lồi rắn
có thành phần độc tố có trọng lượng phân tử thấp chiếm tỷ lệ cao nhất (20-30% tổng
lượng protein của nọc thơ). So với nọc rắn hổ đất, trong nọc rắn hổ chúa, thành phần
protein có trọng lượng phân tử thấp chỉ chiếm khoảng 8% tổng lượng protein tồn
phần. Vì thế độc lực của nọc rắn này cũng thấp đi đáng kể so với độc lực của nọc rắn
hổ đất (5). Nhưng khả năng gây độc của nó cũng rất cao do khi cắn lượng nọc độc đưa
vào nạn nhân nhiều.

Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-2-

1.3. Huyết thanh kháng nọc rắn hổ:
Dùng huyết thanh kháng nọc rắn được xem như là phương pháp điều trị hiệu quả
nhất để trung hòa các độc tố tác động hệ thống và gây nguy hiểm đến tính mạng nạn
nhân (6).
Huyết thanh kháng nọc cổ điển được sản xuất từ huyết thanh của ngựa hay cừu
được gây miễn dịch cao độ với nọc tồn phần của một lồi rắn (huyết thanh kháng nọc
đơn đặc hiệu – monospecific antivenom) hay hỗn hợp nọc của nhiều lồi rắn (huyết
thanh kháng nọc đa đặc hiệu – polyspecific antivenom). Huyết thanh kháng nọc rắn vì
vậy chứa kháng thể kháng nhiều thành phần trong nọc khơng quan tâm đến độc tính
cũng như tính sinh miễn dịch của từng thành phần. Do đó, trong kháng huyết thanh này
chứa một số lớn các kháng thế kháng các thành phần kháng ngun khơng gây độc
trong nọc và dẫn đến làm phải tiêm một lượng lớn protein lúc điều trị (7). Mặt khác các
thành phần gây độc nhất trong nọc cũng khơng nhất thiết là những thành phần có tính
sinh miễn dịch mạnh nhất, đặc biệt là trong trường hợp của những độc tố có trọng
lượng phân tử thấp (8, 9, 10).
Trong nọc rắn hổ, các độc tố có trọng lượng phân tử thấp có tính sinh miễn dịch
thấp hơn rất nhiều so với các thành phần có trọng lượng phân tử cao. Theo tác giả
Leera Chinonavanig (11), huyết thanh đơn giá kháng nọc rắn hổ chúa được gây miễn
dịch trên thỏ khơng cho kháng thể chống lại các protein trong vùng có trọng lượng
phân tử thấp của các độc tố hậu khớp thần kinh cơ của nọc hổ chúa. Kháng huyết thanh
đơn giá đặc hiệu với nọc rắn cạp nong và nọc rắn hổ đất có tỷ lệ thấp kháng thể kháng
các độc tố có trọng lượng phân tử thấp của các lồi rắn này. Phản ứng chéo giữa huyết
thanh kháng nọc rắn hổ này với độc tố nọc rắn hổ khác hầu như khơng phát hiện được,
trừ một phản ứng thấp giữa huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất với nọc rắn hổ chúa (11).
Do đó tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ có hiệu lực điều trị là một điều rất khó
khăn. Tại Queen Saovabha Memorial Institute, Thái Lan dưới 20% số ngựa được gây
miễn dịch với nọc rắn hổ đất sản xuất được kháng huyết thanh có hiệu lực điều trị (12).
Điều này lý giải tại sao huyết thanh kháng nọc rắn hổ được cung cấp trên thị trường có
hiệu giá thấp (10-100 LD

50
/ml huyết thanh) (13).
Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-3-

Do hiệu giá thấp, trong các trường hợp bị rắn hổ cắn, lượng huyết thanh cần dùng
để điều trị rất lớn từ 30 – 600 ml (13) vì vậy khoảng một nửa nạn nhân xuất hiện các
phản ứng q mẫn (14, 15). Dùng phân đoạn độc tố để gây miễn dịch có thể tăng hiệu
lực bảo vệ của huyết thanh kháng nọc, giảm lượng huyết thanh điều trị, trong khi tránh
được sự tạo thành kháng thể khơng cần thiết với phần protein khơng gây độc (16). Gây
miễn dịch tạo ra các kháng thể đặc hiệu với độc tố sẽ tăng hiệu quả điều trị, giảm thiểu
nguy cơ gây các phản ứng nguy hiểm đòi hỏi phải can thiệp với adrenaline (17). Huyết
thanh kháng độc tố đã được nghiên cứu tại một số nước trên thế giới và nhận thấy có
hiệu giá trung hòa cao hơn hẳn huyết thanh kháng nọc tồn phần (18, 19, 20, 21, 26).

1.4. Huyết thanh đơn giá và huyết thanh đa giá kháng nọc rắn:
Huyết thanh kháng nọc rắn độc được sản xuất tại nhiều nước trên thế giới, chủ
yếu là huyết thanh đơn giá và thường các huyết thanh này hiếm khi có tác dụng trung
hòa chéo với các lồi rắn độc khác trong cùng vùng địa lý (5). Vì thế việc điều trị hiệu
quả phụ thuộc vào việc xác định chính xác lồi rắn gây tai nạn. Đối với các bác sĩ
thường là khó hay khơng thể quyết định được dùng loại kháng huyết thanh đơn giá nào
trong trường hợp lồi rắn gây tai nạn khơng xác định được, đặc biệt khi các triệu
chứng nhiễm độc hệ thống tương tự do bị lồi rắn cùng họ gây nên. Chỉ khoảng 20%
các trường hợp bị rắn độc cắn có thể xác định chính xác lồi rắn gây tai nạn (2). Ngồi
ra huyết thanh kháng nọc được sử dụng để điều trị nạn nhân càng sớm càng tốt, thời
gian tiêu hao cho việc chờ xác định rõ ràng dấu hiệu và triệu chứng chẩn đốn có thể
gây nguy cơ cao hơn cho nạn nhân. Sử dụng kháng huyết thanh đơn giá sai đã làm chết
một số nạn nhân bị rắn cắn (22).

Huyết thanh đa giá, được sản xuất đầu tiên vào năm 1911 (23), chứa những
kháng thể đặc hiệu có khả năng trung hòa một số nọc được sử dụng khi gây miễn dịch.
Thơng thường, huyết thanh kháng nọc đa giá được sản xuất để chống lại tất cả các lồi
rắn có liên hệ trong một vùng đặc thù. Huyết thanh này có thể được dùng để chữa trị
cho các nạn nhân bị nhiễm độc nặng ngay lập tức mà khơng cần xác định lồi rắn gây
độc. Điều trị bằng huyết thanh đa giá góp phần làm giảm đáng kể số người chết trong
Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-4-

những trường hợp lồi rắn cắn khơng xác định được. Một số thầy thuốc chống lại có
định kiến việc sử dụng huyết thanh đa giá vì cho rằng nó ít hiệu quả hơn huyết thanh
đơn giá. Điều này thật sự là khơng đúng. Khi một huyết thanh đa giá được sản xuất
kháng lại một số lồi rắn trong cùng họ (ví dụ như giữa các lồi rắn lục) thì hiệu giá
kháng thể trung hòa chống lại từng loại nọc có thể cao hơn khi kháng huyết thanh đơn
giá được sử dụng (24). Tác động hiệp lực của một số nọc trong q trình gây và trung
hòa miễn dịch sẽ bị mất khi chúng đi từ các lồi rắn khơng có liên hệ về phân loại (ví
dụ như giữa rắn hổ và rắn lục). Thơng thường sản xuất một loại kháng huyết thanh đa
giá thì đơn giản và ít tốn kém hơn là sản xuất nhiều loại huyết thanh kháng nọc đơn
giá. Mặt khác, huyết thanh đa giá còn có thuận lợi là khả năng trung hòa chéo cao hơn;
q trình sản xuất, pha chế thuận tiện, kinh tế hơn; bảo quản và dự trữ dễ dàng hơn
(24).

1.5. Tình hình sản xuất huyết thanh kháng nọc trên thế giới và tại Việt Nam:
Hiện nay trên thế giới đã có 50 nước sản xuất huyết thanh kháng 185 loại nọc
độc. Do thành phần nọc rắn thay đổi theo từng vùng địa lý, địa dư nên WHO khuyến
cáo các quốc gia nên tự sản xuất huyết thanh kháng các lồi rắn độc của quốc gia mình.
Ở Việt Nam đã có bệnh viện Chợ Rẫy, bệnh viện Bạch Mai (Hà Nội) sản xuất huyết
thanh kháng nọc rắn chúa tồn phần (25, 38). Viện quốc gia sản xuất Vắc xin và chế

phẩm sinh học sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất theo qui trình gây miễn dịch
với độc tố thần kinh có hiệu giá trung hòa rất cao so với huyết thanh kháng nọc rắn
tồn phần (26). Và huyết thanh này đã được tiến hành thực địa trên bệnh nhân và
chứng minh được hiệu quả điều trị cũng như tính an tồn tốt (27).

1.6. Đặt vấn đề:
Tác động gây chết trên chuột của nọc rắn hổ chúa và nọc của các rắn thuộc lồi
Naja chủ yếu là do phân đoạn protein có trọng lượng phân tử thấp gây nên (29). Ở
nước ta, rắn hổ đất và hổ chúa là hai lồi rắn độc gây tử vong trên người với tỷ lệ cao
nhất, đồng thời hai loại độc tố gây chết được tách từ nọc của chúng có trình tự amino
Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-5-

acid tương đồng cao (28). Vì thế, chúng tơi dự định thực hiện nghiên cứu qui trình tạo
huyết thanh đa giá kháng độc tố của lồi rắn hổ đất (Naja kaouthia) và lồi rắn hổ chúa
(Ophigophagus hannah) qua đó khảo sát khả năng trung hòa độc lực nọc rắn tồn phần
của chúng. Thành cơng của đề tài sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo huyết thanh đa
giá dựa trên độc tố đối với các lồi rắn cùng họ rắn hổ phổ biến tại Việt Nam.

Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-6-

CHƯƠNG II : NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1. Xác định độc lực của nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia) và hổ chúa
(Ophigophagus hannah)

2.2. Tinh chế các thành phần gây độc của hai lồi rắn: hổ đất (Naja kaouthia) và
hổ chúa (Ophigophagus hannah)
2.3. Tạo huyết thanh kháng độc tố của nọc rắn hổ đất Naja kaouthia
2.4. Tạo huyết thanh kháng độc tố của nọc rắn hổ chúa Ophigophagus hannah
2.5. Xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu với các độc tố bằng phản ứng ELISA
2.6. Tạo huyết thanh kháng đa độc tố của hai loại rắn hổ đất và rắn hổ chúa
2.7. Xác định hiệu lực trung hòa của từng loại kháng huyết thanh với nọc tồn
phần của hai loại rắn trên.







Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-7-

CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Phương pháp xác định độc lực của nọc rắn hổ đất và hổ chúa:
3.1.1. Vật liệu:
- Nọc rắn (do Trung tâm Ni trồng Nghiên cứu Chế biến Dược liệu Qn khu 9,
Tiền Giang cung cấp): Nọc rắn dạng tinh thể có màu từ vàng nhạt đến vàng đậm.
3.1.2. Phương pháp xác định độc lực của nọc và độc tố rắn hổ đất và hổ chúa:
Độc lực của nọc hoặc dung dịch có độc tố được biểu hiện bằng giá trị LD
50

(lethal dose 50%).
LD
50
là liều tối thiểu gây chết 50% số súc vật thử nghiệm; nọc càng độc giá trị
LD
50
càng thấp.
Động vật dùng trong thử nghiệm có thể là thỏ, chuột lang hay chuột nhắt trắng.
Nhưng thơng thường nhất người ta dùng chuột nhắt trắng.
Đường tiêm có thể là tiêm dưới da, tiêm bắp, tiêm trong phúc mạc, tiêm tĩnh
mạch hay tiêm trong màng não. Đường tiêm khác nhau có thể cho những kết quả LD
50
khác nhau [30]. Thơng thường, liều gây chết khi tiêm tĩnh mạch < tiêm màng não <
tiêm dưới da. Đường tiêm tĩnh mạch đi chuột cho kết quả có tính đồng nhất cao và
được sử dụng trong các qui trình chuẩn.
Để kết quả thu được có độ lặp lại cao, các điều kiện tiến hành thí nghiệm phải
được tn thủ chặt chẽ. Trọng lượng và tuổi chuột phải ít dao động (18-20 gam đối với
chuột nhắt trắng). Các con chuột này phải khỏe mạnh, cùng giới tính, cùng một dòng,
khơng mang thai. Đường tiêm vào mỗi con chuột phải giống nhau, tiêm chậm (0,2 ml
trong 15 giây). Nhiệt độ mơi trường ấm và ổn định trong suốt q trình quan sát (48
giờ) [31].
Các lồi động vật khác nhau, nhạy cảm với nọc cũng khác nhau. Cùng một lồi
nhưng khác dòng sự đáp ứng cũng khác nhau.
Thành phần nọc cũng có thể thay đổi từ cá thể này đến cá thể khác trong cùng
lồi rắn. Thậm chí nó có thể thay đổi tại những khoảng thời gian khác nhau trong cùng
một cá thể. Các thay đổi này có thể do nguồn gốc địa lý, chế độ ăn uống, tuổi rắn …
Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-8-

[32]. Thực hiện tốt xét nghiệm nọc sử dụng trong xét nghiệm nên lấy từ một hỗn hợp
nọc của một số lớn rắn hổ có nguồn gốc khác nhau [33].
Tiến hành thử nghiệm:
3.1.2.1. Các thơng số kỹ thuật:
Súc vật: chuột nhắt trắng 18-20 gam
Đường tiêm : tĩnh mạch đi
Liều tiêm: 0,2 ml/chuột
Đơn vị tính: liều gây chết 50% súc vật thí nghiệm được diễn tả bằng µg/ chuột.
Số chuột cho một lơ: 3 con
3.1.2.2. Gây nhiễm
:
* Pha dung dịch nọc thử nghiệm:

Cân 10 mg nọc rắn pha trong 10 mL .
* Lơ chứng : 3 con, mỗi con nhận 0,2 ml nước muối sinh lý, còn sống sau 48 giờ.
* Lơ thí nghiệm
: Pha các dung dịch thử nghiệm trong nước muối sinh lý có nồng
độ liên tục cách nhau một tác nhân độ pha lỗng.
Chọn các nồng độ gây nhiễm sao cho trong các nồng độ này có hai điểm gây 0%
và 100% số chuột chết.
Tiêm 0,2 ml cho mỗi chuột. Mỗi lơ 3 chuột.
q
Đọc kết quả sau 48 giờ
q
Tính kết quả theo phương pháp Spearman - Karber:
Log LD
50
= X
0

+ d/2 -dΣR
i
/n
Với X
o
: log của độ pha lỗng có nồng độ thấp nhất gây ra 100% số chuột chết.
d: log của tác nhân độ pha lỗng
n: số chuột trong mỗi lơ
R
i
: số chuột chết trong mỗi lơ

Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-9-

3.2. Phương pháp tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất và nọc rắn hổ chúa (phụ lục1):
3.2.1. Vật liệu:
- Nọc rắn: dạng tinh thể có màu từ vàng nhạt đến vàng đậm.
- Gel sắc ký lọc Sephadex G-50 Superfine
- Gel sắc ký trao đổi ion BioRex 70
- Các hóa chất khác sử dụng đều ở mức độ phân tích.
3.2.2. Phương pháp:
Q trình tinh chế độc tố từ nọc rắn được tiến hành theo phương pháp Karlsson
[30] qua hai giai đoạn sắc ký :
* Sắc ký lọc Sephadex G - 50 Sperfine
* Sắc ký trao đổi ion BioRex 70
- Nồng độ protein trong các đoạn sắc ký được xác định qua quang phổ ở 280 nm.
- Độc lực của các phân đoạn protein sau sắc ký được đánh giá trên chuột nhắt trắng 18-

20 gam.
- Đánh giá độ tinh khiết của các phân đoạn protein sau các giai đoạn sắc ký bằng kỹ
thuật điện di trên gel polyacrylamide (PAGE) gradient 8-18% với Sodium
dodecylsulfate (SDS) sau khi đã xử lý các protein bằng dithiothreitol (DTT).

3.3. Phương pháp tạo huyết thanh kháng độc tố của hai lồi rắn hổ đất và hổ chúa
(phụ lục 2):
3.3.1. Vật liệu:
- Thỏ dùng để gây miễn dịch được chọn từ những con thỏ non khoảng 2 tháng
tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng khoảng 1-1,5 kg, được ni trước 1 tháng. Sau đó chọn
những con thỏ khỏe mạnh có trọng lượng trên 2kg để gây miễn dịch.
- Độc tố nọc rắn hổ đất và hổ chúa sau tinh chế
- Tá chất Freund tồn phần (complete Freund’s complete adjuvant) (Sigma-
Aldrich)
- Tá chất Freund bán phần (incomplete Freund’s incomplete adjuvant) (Sigma-
Aldrich)
Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-10-

3.3.2. Phương pháp:
3.3.2.1. Tạo huyết thanh kháng độc tố của nọc rắn hổ đất và hổ chúa:
* Lơ I: 3 thỏ (đánh số 17, 18, 19) được gây miễn dịch với độc tố peak 3.1 của nọc rắn
hổ đất để tạo huyết thanh kháng độc tố rắn hổ đất. Liều tiêm mũi thứ 1 là 32 µg/thỏ và
giảm ½ liều ở những mũi tiêm kế tiếp nhằm chọn lọc các dòng tế bào B sản xuất kháng
thể có ái lực cao.
* Lơ II: 4 thỏ (đánh số 13, 14, 15, 16) được gây miễn dịch với độc tố peak 3 của nọc
rắn hổ chúa để tạo huyết thanh kháng độc tố rắn hổ chúa. Liều tiêm mũi thứ 1 là 50
µg/thỏ và giảm ½ liều ở những mũi tiêm kế tiếp.

3.3.2.2. Tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai lồi rắn hổ đất và hổ chúa:
* Lơ III: 4 thỏ (đánh số 7, 8, 11, 12) được gây miễn dịch với cả hai loại độc tố trên
để tạo huyết thanh kháng đa độc tố. Liều tiêm mũi thứ 1 là 32 µg độc tố peak 3.1 của
nọc rắn hổ đất/thỏ và 50 µg độc tố peak 3 của nọc rắn hổ chúa/thỏ và giảm ½ liều ở
những mũi tiêm kế tiếp.

3.4. Phương pháp kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ:
Phương pháp này sử dụng kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch, đây là một kỹ
thuật cổ điển, dùng để phân tách các kháng thể trong mẫu thử nghiệm về tính đặc hiệu
với kháng ngun.
3.4.1. Ngun tắc:
Làm một thạch agar 1% trên phiến kính. Đục các giếng ở các vị trí đã định. Cho
các dung dịch kháng ngun, kháng thể vào đúng giếng đã định. Kháng ngun và
kháng thể sẽ khuếch tán trong gel. Khi gặp nhau chúng sẽ hình thành phức hợp và sẽ
tủa nếu nồng độ kháng ngun và kháng thể tương ứng. Hình của vết tủa cho phép
phân tách về phản ứng giữa các thành phần trong các giếng.
3.4.2. Vật liệu:
- Agarose
- Dung dịch huyết thanh thỏ trước khi gây miễn dịch
Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-11-

- Dung dịch huyết thanh thỏ sau lần tiêm thứ 2
- Hóa chất khác đều đạt mức độ phân tích
3.4.3. Phương pháp:
- Làm thạch agar 1% (6 x 6 x 0,2cm) trong đệm PBS
- Đục các giếng (thể tích của một giếng khoảng 20 µl) trên thạch và cho mẫu
vào các giếng

- Để thạch vào hộp đóng kín: 100% độ ẩm ở 4
0
C. Quan sát kết quả sớm nhất là
sau 24 giờ.

3.5. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu với các độc tố bằng phản
ứng ELISA:
3.5.1. Phương pháp gắn biotin vào độc tố:
3.5.1.1. Vật liệu:
- Độc tố
- NHS-LC-biotin II
- Gel Biogel P-200
- Các hóa chất khác đều ở mức độ phân tích
3.5.1.2. Tiến hành
:
Hình 1
: Phản ứng cộng hợp NHS-LC-Biotin II vào protein

- Toxin alpha (8mg/ml) trong đệm 50 mM NaHCO
3
; pH 8.5
- Dung dịch NHS-LC-Biotin II: 0.23 mmoles/ml trong đệm DMSO
N
O
C (CH
2
)
5
N
O

H
(CH
2
)
4
C
O
S
NH
N
O
H
Protein
N
(CH
2
)
5
C
N
S
NH
N
O
+
N
O
O
OH
Protein

+
H
H
H
NH
2
(CH
2
)
4
C
Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-12-

- Cho 25µl dung dịch NHS-LC-Biotin II vào 1ml dung dịch toxin alpha.
- Ủ 4°C trong 2 giờ.
- Tách dẫn xuất Biotin thừa qua cột Biogel P- 200 đã được cân bằng trước với đệm
PBS. Hứng đoạn 2ml
- Chọn các đoạn có protein bằng cách đo ở bước sóng 280nm.
3.5.2. Kỹ thuật ELISA hai kháng ngun kẹp kháng thể:
3.5.2.1. Vật liệu:
- Phiến nhựa Nunc – Maxisorp
- Độc tố tinh chế từ nọc rắn hổ đất và nọc rắn hổ chúa
- Độc tố - biotin
- BSA (Bovine serum albumin)
- Streptavidine – peroxydase
- Tween 20
- O-phenylendiamine

- Các hóa chất khác đều ở mức độ phân tích
3.5.2.2. Tiến hành
:
a) Gắn độc tố vào pha rắn:
- Pha rắn sử dụng là phiến nhựa 96 giếng.
- Dung dịch độc tố 0.25 µg/ml trong đệm Na
2
CO
3
0.075 M, pH 9.6. Ủ vào mỗi giếng
100 µl dung dịch trên qua đêm tại nhiệt độ phòng.
- Rửa các giếng 3 lần với đệm PBS – 0.05% Tween 20 để loại bỏ độc tố còn thừa.
- Bão hòa phiến nhựa bằng dung dịch PBS – 1% BSA - 0.05% Tween 20 trong 45
phút, tại 37°C.
- Rửa các giếng 3 lần với đệm PBS – 0.05% Tween 20.
b) Cho kháng thể trong huyết thanh kết hợp với độc tố trên pha rắn:
- Cho 100 µl mẫu huyết thanh pha lỗng 1/100 vào mỗi giếng
- Ủ 37°C trong 60 phút.
- Rửa 3 lần với đệm PBS – 0.05% Tween 20 để loại bỏ protein còn thừa.

Sở Khoa Học & Cơng Nghệ TP.HCM Báo cáo nghiệm thu - 9/2009
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất & hổ chúa trên thỏ

-13-

c) Cho độc tố – biotin kết hợp với kháng thể trên pha rắn:
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl dung dịch toxin – biotin 0.5 µg/ml pha trong đệm
bão hòa.
Ủ
37°C trong 60 phút.

- Rửa phiến 3 lần với dung dịch PBS – 0.05% Tween 20 để loại bỏ các chất khơng
bám.
d) Cho Streptavidin – Peroxydase (Streptavidine PO) kết hợp với biotin trên
pha rắn:
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl dung dịch streptavidin – PO 1/ 100 pha trong đệm
bão hòa.

Ủ 37°C trong 60 phút.
- Rửa phiến 3 lần với dung dịch PBS – 0.05% Tween 20 để loại bỏ những chất khơng
bám.
e) Hiện màu:
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl dung dịch cơ chất O-phenylenediamine và hydrogen
peroxide. Hiện màu đúng trong 15 phút cho tất cả các giếng. Ngừng phản ứng bằng 50
µl dung dịch H
2
SO
4
2N. Độ hấp phụ quang trong các giếng được đo ở bước sóng 492
nm.

3.6. Phương pháp tách và lưu trữ kháng thể bằng kỹ thuật tủa với ammonium
sulfate 50% độ bão hòa:
3.6.1. Ngun tắc:
Các protein tan trong dung dịch do có liên kết chặt với rất nhiều phân tử nước
(Hình 3)

Hình 2:
Protein tan trong nước