nghiên cứu tổng hợp hai dẫn xuất imine curcumin và khảo sát hoạt tính chống oxi hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư của chúng

am
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN
TP. HỒ CHÍ MINH TP. HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM
SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ
***
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
(ðã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 27/01/2010)
 * 
ð
ð
Ề
Ề


T
T
À
À
I
I


K
K
H
H
O

O
A
A


H
H
Ọ
Ọ
C
C
:
:

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HAI DẪN XUẤT IMINE CURCUMIN
VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HĨA, KHÁNG NẤM,
KHÁNG KHUẨN, KHÁNG UNG THƯ CỦA CHÚNG




Chủ nhiệm đề tài: ThS. LÊ XUÂN TIẾN
Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN
KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ TRẺ


TP. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2009

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ðỀ TÀI

STT

HỌ VÀ TÊN CƠ QUAN GHI CHÚ
01 ThS. Lê Xuân Tiến
BM KT Hữu cơ-Khoa KT Hoá học Chủ nhiệm ñề tài
02 PGS. TS. Trần Thị Việt Hoa


03 ThS. Phan Thị Hoàng Anh

04 KS. ðặng Thị Mỹ Lệ
05 KS. ðỗ Thị XuânVui


XÁC NHẬN CHỈNH SỬA BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Theo góp ý của Hội ñồng nghiệm thu ngày 27/01/2010)
Tên ñề tài: Nghiên cứu tổng hợp 2 dẫn xuất imine curcumin và khảo sát hoạt tính
kháng oxi hoá, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư của chúng
Chủ nhiệm ñề tài: ThS. Lê Xuân Tiến
Cơ quan chủ trì ñề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
TT

Góp ý của Hội ñồng Chỉnh sửa của chủ nhiệm ñề tài Trang
1 Bổ sung tổng quan về phương
pháp tổng hợp các dẫn xuất imine.
ðã bổ sung 10
2 Hình 1.4. ðã sửa 12
3 In nghiêng các chữ latinh. ðã sửa 15

4 Hiệu chỉnh bảng 3.6, thiếu Cg. ðã hiệu chỉnh, bổ sung 33
5 Cách ghi hỗn hợp dung môi cho
sắc ký cột.
ðã hiệu chỉnh

CƠ QUAN CHỦ TRÌ
Giám ñốc





CHỦ NHIỆM ðỀ TÀI
(Ký tên)

ThS. Lê Xuân Tiến
PHẢN BIỆN 1
(Ký tên)
PHẢN BIỆN 2
(Ký tên)
CHỦ TỊCH HỘI ðỒNG
(Ký tên)







PGS. TS. Phạm ðình Hùng TS. Trần Thanh Lương GS. TSKH. Nguyễn Công Hào

TÓM TẮT

Trang 1






TÓM TẮT
Curcumin – thành phần màu vàng chính trong củ nghệ Curcuma longa L. – có nhiều hoạt
tính sinh học như hoạt tính kháng oxi hoá, kháng viêm, kháng ung thư… Nhiều nghiên
cứu gần ñây ñã cải thiện hoạt tính sinh học của curcumin bằng cách biến ñổi cấu trúc của
nó. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp 2 dẫn xuất của curcmin - isoxazolcurmin
và 2-hydrazinobenzothiazolcurcumin (dẫn xuất mới), xác ñịnh cấu trúc và khảo sát hoạt
tính sinh học của hai dẫn xuất này.


ABSTRACT
Curcumin, the main yellow constituent of Curcuma longa L. rhizome, possesses a wide
range of pharmacological activities, including antioxidant, anti-inflammatory and
anticancer properties. Recently, numerous studies hoped to achieve improved biological
activities of curcumin by structural modifications. In this study, we synthesized two
curcumin derivatives, including isoxazolcurcumin and 2-hydrazinobenzothiazolcurcumin
(a novel curcumin derivative), determined their structures and investigated some
biological activities.

MỤC LỤC

Trang 1

MỤC LỤC

TÓM TẮT 1
MỤC LỤC 1
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT 3
DANH SÁCH CÁC HÌNH 4
DANH SÁCH CÁC BẢNG 5
PHẦN MỞ ðẦU 6
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 8
1.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực ñề tài 8
1.1.1. Ngoài nước 8
1.1.2. Trong nước 14
1.2. Tính cấp thiết của ñề tài 15
1.3. Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn 16
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 17
2.1. Nội dung nghiên cứu 17
2.2. Cô lập curcumin 17
2.3. Tổng hợp các dẫn xuất imine curcumin 17
2.3.1. Tổng hợp isoxazolcurcumin (IOZ) 17
2.3.2. Tổng hợp dẫn xuất của 2-hydrazinobenzothiazole và curcumin (HBTC) 19
2.4. Khảo sát hoạt tính sinh học 21
2.4.1. ðánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH 21
2.4.2. ðánh giá hoạt tính kháng oxy hoá tiền in vivo – phương pháp MDA 23
2.4.3. ðánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn – phương pháp MIC 23
2.4.4. ðánh giá hoạt tính kháng ung thư 24
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26
3.1. Phân lập curcumin 26
MỤC LỤC

Trang 2

3.2. Tổng hợp các dẫn xuất imine curcumin 27
3.2.1. Tổng hợp isoxazolcurcumin (IOZ) 27
3.2.1.1. Tính chất vật lý ñặc trưng của isoxazolcurcumin 27
3.2.1.2. Biện luận cấu trúc của isoxazolcurcumin (phụ lục 1) 28
3.2.2. Tổng hợp HBTC 31
3.2.2.1. Tính chất vật lý ñặc trưng của HBTC 31
3.2.2.2. Biện luận cấu trúc của HBTC (phụ lục 2) 32
3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học (phụ lục 3) 35
3.3.1. Hoạt tính kháng oxi hoá 35
3.3.1.1. ðánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH 35
3.3.1.2. ðánh giá hoạt tính kháng oxy hoá tiền in vitro – phương pháp MDA 37
3.3.2. Hoạt tính gây ñộc tế bào 39
3.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 40
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43



DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

Trang 3

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
Cur : Curcumin
HBTC : 2-Hydrazinobenzothiazolecurcumin
IOZ : Isoxazolcurcumin
OD : Mật ñộ quang
HTCO : Hoạt tính kháng oxi hoá

IC
50
: Nồng ñộ hoạt chất ñể ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư hoặc
gốc tự do (half maximal (50%) inhibitory concentration)
IC
70
: Nồng ñộ hoạt chất ñể ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư hoặc
gốc tự do
MIC : Nồng ñộ thấp nhất của chất thử nghiệm có khả năng ngăn cản sự phát
triển của vi khuẩn, vi nấm (minimum inhibitory concentration)
HPLC : Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography)
IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
MS : Khối phổ (Mass spectroscopy)
NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance
spectroscopy)
TLC : Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang 4

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1: Các thành phần của curcuminoid trích từ củ nghệ vàng 8
Hình 1.2: Cơ chế bắt gốc tự do của curcuminsemicarbazone 11
Hình 1.3: Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcumin 11
Hình 1.4: Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcumin 12
Hình 1.5: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine của curcumin 13
Hình 2.1: Quy trình tổng hợp isoxazolcurcumin 18
Hình 2.2: Quy trình tổng hợp HBTC 20
Hình 2.3: Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá 22
Hình 3.1: TLC phân ñoạn curcumin 26

Hình 3.2: Isoxazolcurcumin (A) và TLC của Isoxazolcurcumin (B) 28
Hình 3.3: Isoxazolcurcumin, C
21
H
19
O
5
N

(M=365) 29
Hình 3.4: HBTC (A) và TLC của HBTC (B) 31
Hình 3.5: HBTC, C
28
H
23
SN
3
O
4
(M=497) 33
Hình 3.6: Hoạt tính kháng oxy hoá của IOZ, HBTC, curcumin xác ñịnh theo phương
pháp DPPH 36
Hình 3.7: Hoạt tính kháng oxy hoá của IOZ, HBTC, curcumin xác ñịnh theo phương
pháp MDA 38
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang 5

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư 14

Bảng 3.1: Kết quả các quá trình phân lập curcumin 26
Bảng 3.2: Tính chất vật lý ñặc trưng của curcumin 27
Bảng 3.3: Tính chất vật lý ñặc trưng của isoxazolcurcumin 28
Bảng 3.4: Dữ liệu phổ NMR của isoxazolcurcumin 30
Bảng 3.5: Tính chất vật lý ñặc trưng của HBTC 32
Bảng 3.6: Dữ liệu phổ NMR của HBTC 33
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá theo phương pháp DPPH 35
Bảng 3.8: Hoạt tính kháng oxy hoá của vitamin C theo phương pháp DPPH 36
Bảng 3.9: Giá trị IC
50
trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá DPPH 37
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá theo phương pháp MDA 37
Bảng 3.11: Hoạt tính kháng oxy hoá của trolox theo phương pháp MDA 38
Bảng 3.12: Giá trị IC
50
trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá MDA 39
Bảng 3.13: Kết quả xác ñịnh giá trị IC
50
trong khảo sát hoạt tính kháng ung thư của
IOZ, HBTC,curcumin với 3 dòng tế bào Hep-G2, Lu và RD 39
Bảng 3.13: Nồng ñộ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml môi trường) của IOZ, HBTC và
curcmin ñối với một số chủng vi khuẩn, vi nấm 40
PHẦN MỞ ðẦU

Trang 6

PHẦN MỞ ðẦU
Tên ñề tài/dự án: Nghiên cứu tổng hợp 2 dẫn xuất imine curcumin và khảo sát
hoạt tính kháng oxi hoá, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư của chúng
Chủ nhiệm ñề tài/dự án:ThS. Lê Xuân Tiến

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện: 11/2008-11/2009
Kinh phí ñược duyệt: 80.000.000 VNð
Kinh phí ñã cấp: 80.000.000 VNð

Mục tiêu:
− Nghiên cứu phương pháp và ñiều kiện tổng hợp hai dẫn xuất imine
curcumin.
−
Khảo sát hoạt tính chống oxi hoá, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư
của các dẫn xuất imine curcumin tổng hợp ñược và so sánh với hoạt tính
sinh học của curcumin

Nội dung:
− Cô lập curcumin từ hỗn hợp curcuminoid trích ly từ củ nghệ vàng.
− Nghiên cứu tổng hợp hai dẫn xuất imine curcumin.
PHẦN MỞ ðẦU

Trang 7

−
Tinh chế và xác ñịnh cấu trúc của các dẫn xuất imine curcumin.
−
Khảo sát hoạt tính sinh học của imine curcumin và curcumin như khả năng
quét gốc DPPH, kháng quá trình peroxyde hóa lipid, kháng nấm, kháng
khuẩn, kháng ung thư.

Sản phẩm của ñề tài/dự án:
− Báo cáo khoa học về kết quả nghiên cứu tổng hợp imine curcumin và hoạt
tính sinh học của chúng.

− Khoảng 250 mg mẫu isoxazole curcumin.
−
Khoảng 250mg mẫu một dẫn xuất imine curcumin chưa ñược công bố trên
các tạp chí và hội nghị khoa học trong và ngoài nước.

TỒNG QUAN

Trang 8

Chương 1:

TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực ñề tài
1.1.1. Ngoài nước
Củ nghệ vàng Curcuma longa L. từ lâu ñã ñược biết ñến là một phương thuốc dân gian
hiệu quả trong ñiều trị các vết thương ngoài da như phỏng, mụn nhọt, các bệnh rối loạn
tiêu hóa, ñau dạ dày, viêm gan, vàng da, viêm khớp Thành phần hoạt tính chính trong
củ nghệ vàng là curcumin (hay curcuminoid) (hình 1) và tinh dầu nghệ. Cho ñến nay,
nhiều nghiên cứu ñã chứng minh curcumin có hoạt tính sinh học cao và ña dạng như
kháng viêm, kháng oxy hóa, kháng ñông máu, kháng khuẩn, kháng virus… và ñặc biệt
kháng ñột biến, kháng ung thư hiệu quả [1, 2].
R
1
HO
O
O
OH
R
2

Curcumin (cur): R
1
= R
2
= OMe, M=368
Demethoxycurcumin (DMC): R
1
= OMe, R
2
= H, M = 338
Bisdemethoxycurcumin (BDMC): R
1
= R
2
=H, M=308
Hình 1.1: Các thành phần của curcuminoid trích từ củ nghệ vàng
Curcumin có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, mạnh hơn so với vitamin E [3]. Curcumin
có khả năng ức chế in vitro và in vivo hiệu quả với sự tạo thành các dạng oxygene hoạt
ñộng (ROS) trong cơ thể như các anion superoxide, H
2
O
2
, gốc nitrite [4,5,6]. Các ROS
TỒNG QUAN

Trang 9

tham gia vào các cơ chế gây bệnh khác nhau trong cơ thể [7,8], do vậy thông qua hoạt
tính kháng oxy hóa , curcumin có khả năng khống chế sự phát triển nhiều loại bệnh tật
và các tác nhân gây hại khác nhau. Curcumin thể hiện khả năng ức chế mạnh với

những thương tổn gây ra do H
2
O
2
trong tế bào sừng, tế bào fibroblast và các tế bào NG
108 [9,10]. Curcumin ngăn chặn sự peroxy hóa lipid trong vi lạp thể gan , màng hồng
cầu và dịch ñồng thể não chuột [11] nhờ duy trì hoạt ñộng của những enzyme kháng
oxy hóa như SOD, catalase và glutathione peroxidase [12]. Curcumin và các dẫn xuất
cũng là những tác nhân kháng viêm hiệu quả [13], giảm phù nề gây ra do carageenin ở
chuột. Các bệnh nhân bị thấp khớp sau khi uống curcumin ñã cho thấy những triệu
chứng cải thiện ñáng kể [14]. Curcumin cũng thể hiện khả năng kháng viêm thông qua
sự ức chế hoạt ñộng của NF B [15], nhờ ñó ñiều tiết ức chế (downregulate) các
enzyme COX-2 và iNOS [16,17].
Nhiều nghiên cứu cũng ñã chứng tỏ khả năng của curcumin trong việc ñiều trị ung thư,
trong ñó tác dụng gây tự hủy diệt tế bào theo chương trình (apoptosis) ñóng vai trò
quan trọng trong hoạt tính kháng ung thư của curcumin. Curcumin gây ra apoptosis và
ngăn chặn tiến trình của chu kỳ tế bào, do ñó ức chế sự phát triễn các tế bào ung thư ở
cơ trơn ñộng mạch chủ ở chuột [18]. Curcumin gây apoptosis do sai hỏng DNA trong
một số dòng tế bào ung thư ở người TK-10, MCF-7 và UACC-62 với vai trò như là
chất ñầu ñộc men topoisomerase II. Curcumin gây ra apoptosis trong các tế bào bạch
cầu HL-60 ở người [19], và ức chế ung thư tế bào biểu mô ruột kết [20], tế bào biểu mô
ngực theo nhiều cơ chế khác nhau [21].
Một trong những hướng nghiên cứu ñang ñược quan tâm nhằm làm thay ñổi hoạt tính
của curcumin, ñó là biến ñổi cấu trúc curcumin bằng cách tạo các dẫn xuất imine như
curcuminoxime, curcuminsermicarbazone, curcuminthiosermicarbazone [22,23],
hydrazinocurcumin [24,26,27], hydrazinobenzoylcurcumin [24,27], các dẫn xuất
pyrazole và isoxazole curcumin [25,26,27].
TỒNG QUAN

Trang 10

Cấu trúc β-diketon cho phép curcumin thực hiện phản ứng ngưng tụ với các amine tạo
imine. Cơ chế phản ứng như sau:

Trong cơ chế phản ứng này, pH của hỗn hợp phản ứng có ảnh hưởng hết sức quan
trọng ñến hiệu suất imine hoá. Hiệu suất imine hoá kém khi pH hỗn hợp phản ứng quá
acid vì amine bị proton hoá, không tham gia phản ứng ái nhân trong giai ñoạn 1 hoặc
khi pH hỗn hợp phản ứng quá base vì không ñủ H
3
O
+
cho giai ñoạn tách nước ra khỏi
chất trung gian trong giai ñoạn 2. pH phản ứng tối ưu nằm trong khoảng pH=4-6.
Các dẫn xuất dị vòng pyrazole và isoxazole của curcumin ñược tổng hợp bằng phản
ứng giữa curcumin và amine, hydroxylamine tương ứng trong dung môi methanol,
ethanol…, ñiều chỉnh pH bằng các acid yếu hoặc base yếu như acetic acid,
triethylamine, potassium carbonate , phản ứng ñược thực hiện trong khoảng nhiệt ñộ
phòng cho ñến nhiệt ñộ sôi của dung môi [24-26].
Nghiên cứu của Sabari Dutta và các cộng sự [23] cho thấy curcuminsemicarbazone
(hình 1.2) thể hiện hoạt tính kháng quá trình peroxy hóa lipid của microsome gây ra
TỒNG QUAN

Trang 11

bởi bức xạ γ trong thử nghiệm TBARS (Thiobarbiturate reactive substances) tương tự
như curcumin. Cả curcumin và curcuminsemicarbazone ñều thể hiện hoạt tính ức chế
quá trình peroxy hóa này ở mọi liều dùng. Kết quả thử nghiệm khả năng khử proton và
khử electron thông qua phản ứng với các gốc azide (khả năng khử electron), gốc
methyl, peroxyhalocarbon (khả năng khử proton) cho thấy curcumin có tốc ñộ quét các
gốc tự do này nhanh hơn curcuminsemicarbazone. ðiều này có thể là do sự hiện hiện

của nhóm thế hút ñiện tử semicarbazone làm thế oxy hóa của nhóm phenolic trong
semicarbazone cao hơn trong curcumin.
c
Hình 1.2: Cơ chế bắt gốc tự do của curcuminsemicarbazone
Mặc dù khả năng kháng oxi ở mức ñộ in vitro của curcuminsemicarbazone có phần
thấp hơn curcumin tuy nhiên khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư tuyến vú
dòng MCF-7 mạnh gấp 3 lần so với curcumin (theo phương pháp MTT (3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)) [23].
R•
R• = gốc tự do Azide, methyl,
halocarbon peroxyl
O N
HO
H
3
CO
NH
NH
2
O
OH
OCH
3
O N
H
O
H
3
CO
N

NHO
O
H
OCH
3
O N
O
H
3
CO
N
NH
2
O
O
H
OCH
3
TỒNG QUAN

Trang 12

Nhóm nghiên cứu của Joong Sup Shim và các cộng sự [24] ñã tổng hợp một số dẫn
xuất hydrazinocurcumin (hình 1.3) và hydrazinobenzoylcurcumin (hình 1.4).
Hình 1.3: Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcuminoid
Hình 1.4: Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcuminoid
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hydrazocurcurcumin có hoạt tính ức chế tế bào BAEC
(bovine aortic endothelial cell), ngăn chặn tiến trình angiogenesis (một trong các tiến
trình phát triển của ung thư) cao hơn 30 lần so với curcumin (curcumin: IC
50

=15µM).
Hydrazinocurcumin có tác dụng ức chế ngay ở nồng ñộ nanomolar
(hydrazinocurcumin: IC
50
=520nM) và không gây ñầu ñộc các tế bào lành khác. Các
dẫn xuất hydrazinobenzoylcurcuminoid cũng thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển tế
bào BEAC tốt hơn các curcuminoid ban ñầu, nhưng kém hơn so với
hydrazinocurcumin. Ngoài ra, hydrazinocurcumin còn có khả năng ức chế các loại tế
bào ung thư khác như NIH3T3 (fibroblast), Chang
Nhóm nghiên cứu của Daniele Simoni và các cộng sự [25] ñã tổng hợp một số dẫn xuất
imine của curcumin (hình 1.5) và nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển các tế bào
ung thư ña kháng thuốc của chúng ở mức ñộ in vitro.
TỒNG QUAN

Trang 13

Hình 1.5: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine của curcumin
Kết quả cho thấy dẫn xuất (8) và dẫn xuất (7) có khả năng ức chế sự phát triển tế bào
ung thư gan ña kháng thuốc HA22T/VGH, tế bào ung thư vú MCF-7, dòng tế bào ung
thư vú ña kháng thuốc MCF-7R cao hơn curcumin (bảng 1). Trong ñó, dẫn xuất (8) có
khả hủy diệt tế bào ung thư cao hơn cả.



TỒNG QUAN

Trang 14

Bảng 1.1: Khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư (theo phương pháp MTS (3-
(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-

tetrazolium))
Hoạt chất
HA22T/VGH MCF-7 MCF7-R
IC
50
(µ
µµ
µM) IC
70
(µ
µµ
µM) IC
50
(µ
µµ
µM) IC
70
(µ
µµ
µM) IC
50
(µ
µµ
µM) IC
70
(µ
µµ
µM)
Curcumin
(1)

7
8
17.4±1.2
12.8±1.5
5.9±1.2
24.6±1.8
18.3±1.7
8.4±0.6
29.3±1.7
13.1±1.6
7.1±0.2
51.7±2.2
23.2±2.9
9.2±0.6
26.2±1.6
12.0±2.0
9.3±1.7
46.2±3.9
24.7±2.7
12.9±1.9
Nghiên cứu của C. Selvam và các cộng sư [26] cho thấy các dẫn xuất
hydrazynocurcuminoid và isoxazole curcumin (dẫn xuất (7) hình 1.5) có hoạt tính
kháng oxi hóa ở mức ñộ in vitro (quét gốc DPPH), ở mức ñộ tiền in vivo (trên ñộng
vật), ức chế cyclooxygenase (COX1/COX2), kháng viêm cao hơn các curcuminoid
tương ứng.
Nghiên cứu của Satyendra Mishra và các cộng sự [27] cho thấy pyrazole curcumin và
3-nitrophenylpyrazole curcumin có khả năng ức chế sự phát triển của Plasmodium
falciparum (ký sinh trùng gây bệnh sốt rét) cao hơn nhiều lần so với curcumin, thể hiện
hoạt tính này ngay ở nồng ñộ nanomolar (curcumin: CQ-S (chloroquine-sensitive: ức
chế ký sinh trùng nhạy với thuốc chloroquine) IC

50
=3.25±0.6µM, CQ-R (chloroquine-
resistant: ức chế ký sinh trùng kháng thuốc chloroquine) IC
50
=4.21±0.8µM; pyrazole
curcumin: CQ-S IC
50
=0.48±0.04µM, CQ-R IC
50
=0.45±0.07µM; 3-nitrophenylpyrazole
curcumin CQ-S IC
50
=0.87±0.07µM, CQ-R IC
50
=0.89±0.10µM).
1.1.2. Trong nước
Theo kiến thức của chúng tôi, các nghiên cứu trong nước về curcuminoid chỉ mới dừng
lại ở việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học và ứng dụng của curcuminoid trong y dược
TỒNG QUAN

Trang 15

và thực phẩm, chưa có nhiều nghiên cứu về các dẫn xuất của curcuminoid. ðặt biệt là
dẫn xuất imine của curcuminoid, ñến nay có rất ít nghiên cứu về lĩnh vực này ñược
công bố tại Việt Nam.
Nghiên cứu về việc trích ly curcumin từ củ nghệ vàng có: ðào Hùng Cường, Nguyễn
ðình Anh (ðại học ðà Nẵng): nghiên cứu chiết curcumin thô từ củ nghệ vàng bằng
phương pháp kiềm hóa [34]; Lê Văn Hoàng, ðào Hùng Cường, Nguyễn ðình Anh (ðại
học ðà Nẵng): nghiên cứu ảnh hưởng của ñiều kiện sấy ñến hàm lượng curcumin của
củ nghệ vàng [35]; ðào Hùng Cường (ðại học ðà Nẵng): chiết tách curcumin từ củ

nghệ bằng dung môi thực phẩm [36]; nhóm nghiên cứu của Nguyễn Minh Chính và
cộng sự (Học viện Quân y) ñã nghiên cứu tách chiết và một số thông số hóa lý của
curcumin từ củ nghệ vàng (Curcuma Longa L.)[37].
Nhóm tác giả ðào Hùng Cường, Lê Hải Lợi (ðại học ðà Nẵng) [38] ñã tổng hợp dẫn
xuất pyrazole của phenylhydrazin và curcumin, dẫn xuất isoxazole của hydroxylamin
và curcumin; nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế gốc tự do DPPH
của chúng. Kết quả cho thấy curcumin và hai dẫn xuất tổng hợp trên ñều có khả năng
kháng oxi hóa và có khả năng kháng 4 chủng vi khuẩn E.Coli, P.aeruginosa,
B.subtillis, S.aureus. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, các sản phẩm tổng hợp ñược chỉ
ñược tinh chế bằng kết tinh lại và có các tính chất vật lý như nhiệt ñộ nóng chảy, màu
sắc khác biệt rất nhiều so với các bài báo quốc tế ñã ñược công bố [25,26,27].
1.2. Tính cấp thiết của ñề tài
Các dẫn xuất imine curcumin như semicarbazone curcumin, các dẫn xuất pyrazone
curcumin (như hydrazinocurcumin, hydrazynobenzoylcurcumin…) các dẫn xuất
isoxazole có khả năng kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng ký sinh trùng gây bệnh sốt
rét, ñặt biệt là khả năng kháng mạnh nhiều chủng tế bào ung thư. Nếu ñược ñầu tư
nghiên cứu sâu hơn, các dẫn xuất imine curcuminoid có thể ứng dụng làm thuốc chữa
bệnh, ñặc biệt là thuốc phòng và chữa bệnh ung thư.
TỒNG QUAN

Trang 16

Hoạt tính của các dẫn xuất imine curcuminoid ñang thu hút sự quan tâm của các nhà
hóa học, dược học… trên thế giới. Tuy nhiên theo hiểu biết của chúng tôi, các nghiên
cứu trong nước về curcuminoid chỉ mới dừng lại ở việc nghiên cứu các hoạt tính sinh
học và ứng dụng của curcuminoid trong y dược và thực phẩm, chưa có nhiều nghiên
cứu về các dẫn xuất của curcuminoid. ðặt biệt là dẫn xuất imine của curcuminoid, ñến
nay vẫn rất ít nghiên cứu về lĩnh vực này ñược công bố tại Việt Nam. Do ñó việc
nghiên cứu thêm về các dẫn xuất này sẽ góp phần tạo tiền ñề cho các nghiên cứu tiếp
theo về dẫn xuất imine curcuminoid nói riêng và các hoạt chất có khả năng chống ung

thư nói chung.
1.3.
Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu một cách ñầy ñủ hơn các hoạt tính kháng oxi hóa của các dẫn xuất imine
curcuminoid. Cung cấp thêm những thông tin mới về khả năng kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng ung thư của các dẫn xuất imine curcuminoid. Kết quả nghiên cứu ñạt ñược
sẽ ñịnh hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về các dẫn xuất curcumin và ứng dụng của
chúng trong y dược.
PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Trang 17

Chương 2:

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung nghiên cứu
- Cô lập curcumin từ hỗn hợp curcuminoid trích ly từ củ nghệ vàng.
- Nghiên cứu tổng hợp hai dẫn xuất imine curcumin.
- Tinh chế và xác ñịnh cấu trúc của các dẫn xuất imine curcumin.
- Khảo sát hoạt tính sinh học của imine curcumin và các dẫn xuất curcumin như khả
năng quét gốc DPPH, kháng quá trình peroxyde hóa lipid, kháng nấm, kháng
khuẩn, kháng ung thư.
2.2.
Cô lập curcumin
Hỗn hợp curcuminoid 3 thành phần (Viện dược liệu, Bộ y tế, Hà Nội) ñược kết tinh lại
3 lần với hệ dung môi nước/methanol 1/5. Phần tinh thể thu ñược sau quá trình kết tinh
ñược sắc ký cột (silica gel, dung môi CH
2
Cl

2
) thu curcumin tinh khiết.
2.3.
Tổng hợp các dẫn xuất imine curcumin
2.3.1.
Tổng hợp isoxazolcurcumin (IOZ)
2.3.1.1. Quy trình tổng hợp isoxazolcurcumin

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Trang 18


Hình 2.1: Quy trình tổng hợp isoxazolcurcumin
Hoá chất sử dụng: curcumin (phân ñoạn curcumin tinh khiết từ sắc ký cột mục 2.2.),
hydroxylamine hydrochloride (hàm lượng ≥98.5%), sodium acetate (Trung Quốc),
ethanol (Chemsol Vina), nước cất.
Phương pháp thực hiện: Hoà tan 497 mg hydroxylamine hydrochloride trong ethanol,
chỉnh pH dung dịch về ~5.0 bằng sodium acetate. Cho 500mg curcumin vào hỗn hợp
trên. Thực hiện phản ứng imine hoá trong 16 giờ, ñun sôi hoàn lưu. Kiểm tra ñiểm
dừng phản ứng bằng bản mỏng aluminium oxide 60 trung tính với hệ dung môi
dichloromethane/methanol 97/3. Sau phản ứng, cô giảm áp loại ethanol, rửa sản phẩm
bằng trích ly ethylacetate/nước. Thu lớp ethylacete, cô giảm áp thu ñược cao sản phẩm
Cucumin,
hydroxylamine hydrochloride

Imine hoá
Dung môi ethanol
CH
3

COONa chỉnh pH ñến 5.0

- ðun sôi hoàn lưu
- Thời gian: 16 giờ

Loại dung môi
Cô giảm áp
Rửa, chiết
Dung môi: ethylacetate + nước
Sắc ký cột
Isoxazolcurcumin

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Trang 19

thô. Sắc ký cột ñối với sản phẩm thô, thu ñược 306mg isoxazolcurcumin. Hiệu suất quá
trình tổng hợp isoxazolcurcumin: 61.71%.
2.3.1.2. Tinh chế isoxazole bằng sắc ký cột
Hoá chất, nguyên liệu: Methanol, dichloromethane (Chemsol Vina), sản phẩm
isoxazole thô (mục 2.3.1.1.).
ðiều kiện sắc ký cột:
- Aluminium oxide 60, 0.063-0.200 mm, trung tính (Merck) ñược hoạt hoá ở 110
o
C, 4
giờ trước khi nhồi cột.
- Cột sắc ký: ñường kính 25mm, chiều cao aluminium oxide trong cột: 15cm.
- Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: CH
2
Cl

2
/CH
3
OH 99/1.
ðiều kiện sắc ký bản mỏng:
- TLC Aluminium 60 trung tính, F254 (Merck) ñược hoạt hoá ở 110
o
C, 1 giờ.
- Bản mỏng 5cmx10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm.
- Hệ dung môi triển khai TLC: CH
2
Cl
2
/CH
3
OH 97/3.
- Hiện màu TLC: ñèn UV (254nm/365nm), H
2
SO
4
10% trong ethanol, hơi I
2
.
2.3.2. Tổng hợp dẫn xuất của 2-hydrazinobenzothiazole và curcumin (HBTC)
2.3.2.1. Quy trình tổng hợp HBTC
PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Trang 20

Hình 2.2: Quy trình tổng hợp HBTC
Hoá chất sử dụng: curcumin (phân ñoạn curcumin tinh khiết từ sắc ký cột mục 2.2.),
2-
hydrazinobenzothiazole (Sigma, hàm lượng ≥97%), acetic acid (Trung Quốc),
ethanol (Chemsol Vina), nước cất.
Phương pháp thực hiện: Hoà tan 449 mg
2-
hydrazinobenzothiazole trong methanol,
chỉnh pH dung dịch về ~5.0 bằng acetic acid. Cho 500mg curcumin vào hỗn hợp trên.
Thực hiện phản ứng imine hoá trong 24 giờ, 60
o
C có khuấy trộn. Kiểm tra ñiểm dừng
phản ứng bằng bản mỏng silica gel 60G, F254 với hệ dung môi
dichloromethane/methanol 98/2. Sau phản ứng, cô giảm áp loại methanol, rửa sản
phẩm bằng trích ly ethylacetate/nước. Thu lớp ethylacete, cô giảm áp thu ñược cao sản
Cucumin,
2-hydrazinobenzothiazole
Imine hoá
Dung môi methanol
CH
3
COOH chỉnh pH ñến 5.0

- Nhiệt ñộ: 60
o
C
- Thời gian: 24 giờ

Loại dung môi
Cô giảm áp

Rửa, chiết
Dung môi: ethylacetate + nước
Sắc ký cột
HBTC
PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Trang 21

phẩm thô. Sắc ký cột ñối với sản phẩm thô, thu ñược 360mg HBTC. Hiệu suất quá
trình tổng hợp HBTC: 53.33%.
2.3.2.2. Tinh chế HBTC bằng sắc ký cột
Hoá chất, nguyên liệu: Methanol, dichloromethane (Chemsol Vina), sản phẩm HBTC
thô (mục 2.3.2.1.).
ðiều kiện sắc ký cột:
- Silica gel 60, 0.063-0.200 mm (Merck) ñược hoạt hoá ở 110
o
C, 4 giờ trước khi nhồi
cột.
- Cột sắc ký: ñường kính 30mm, chiều cao silica gel trong cột: 30cm.
- Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: CH
2
Cl
2

ðiều kiện sắc ký bản mỏng:
- TLC Silica gel 60, F254 (Merck) ñược hoạt hoá ở 110
o
C, 1 giờ.
- Bản mỏng 5cmx10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm.
- Hệ dung môi triển khai TLC: CH

2
Cl
2
/CH
3
OH 98/2.
- Hiện màu TLC: ñèn UV (254nm/365nm), H
2
SO
4
10% trong ethanol, hơi I
2
.
2.4. Khảo sát hoạt tính sinh học
2.4.1. ðánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH
(Thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.Hồ Chí Minh)
Ở mức ñộ in vitro, các chất nghiên cứu ñược ñánh giá sàng lọc tác dụng kháng oxy hoá
theo phương pháp thử nghiệm quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl).