Nghiên cứu acyl hóa rutin với xúc tác lipase và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các rutin ester

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRẦN THỊ YẾN CHI
NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE VÀ
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA
CÁC RUTIN ESTER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh – 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRẦN THỊ YẾN CHI
NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE VÀ
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA
CÁC RUTIN ESTER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
Thầy hướng dẫn: PGS. TS. TRẦN CÁT ĐÔNG
ThS. VŨ THANH THẢO
Thành phố Hồ Chí Minh – 2012
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược,
Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp. HCM, dưới sự hướng dẫn của: PGS.TS. Trần Cát
Đông và ThS. Vũ Thanh Thảo
Kính gửi đến PGS. TS. Trần Cát Đông và Th.S. Vũ Thanh Thảo lời biết ơn chân
thành vì sự quan tâm, kiên nhẫn và tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành khóa luận này.
Kính gửi đến Quý Thầy Cô trường Đại học Y Dược Tp. HCM lòng biết ơn về
những kiến thức quý báu đã truyền đạt cho em, là nền tảng để thực hiện khóa luận.
Xin cảm ơn các thầy cô trong hội đồng đã đóng góp cho em những ý kiến quý báu
để khóa luận của em thêm hoàn chỉnh.
Gửi đến các anh chị em ở Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược đặc biệt là
anh Văn Sơn, anh Minh Thái, chị Quỳnh Hương, bạn Kim Uyên lời cảm ơn về sự nhiệt

tình giúp đỡ về mọi mặt để tôi hoàn thành tốt khóa luận này.
Cuối cùng, xin gửi trọn tình yêu thương đến bố mẹ, anh chị và những người thân
luôn sát cánh bên tôi, động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện
khóa luận. Gia đình mãi là điểm tựa vững chắc và ấm áp nhất.
Xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên: Trần Thị Yến Chi
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2011 – 2012
NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE VÀ KHẢO SÁT HOẠT
TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC RUTIN ESTER
Trần Thị Yến Chi
Hướng dẫn: PGS. TS. Trần Cát Đông
Th. S. Vũ Thanh Thảo
Mục tiêu và đặt vấn đề
Rutin là một flavonoid có tác dụng tăng độ bền thành mạch, chống oxy hóa Tuy nhiên,
ứng dụng của nó còn bị giới hạn nhiều, do độ tan và độ ổn định kém trong cả pha dầu và pha
nước. Do đó, với mục tiêu cải thiện tính tan của rutin trong pha dầu bằng cách tạo ra các dẫn
xuất acyl hóa của nó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu acyl hóa rutin với xúc tác lipase
và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các rutin ester”.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
1. Khảo sát sơ bộ điều kiện của phản ứng: xác định dung môi và loại enzym thích hợp
2. Tối ưu hóa các thông số của phản ứng acyl hóa rutin: tỷ lệ cơ chất, thời gian phản ứng,
nồng độ enzym.
3. Khảo sát ảnh hưởng chiều dài mạch carbon của acid béo đến phản ứng acyl hóa.
4. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các rutin ester in vitro.
Kết quả và bàn luận
Khảo sát điều kiện cho phản ứng acyl hóa rutin, xác định được điều kiện tối ưu như sau:
dung môi tert-butanol, enzyme lipase cố định 5 g/l, tỷ lệ rutin : acid béo (1:2), thời gian phản
ứng (4,52 ngày) và các acid béo cho hiệu suất cao nhất là acid lauric, acid palmitic và acid
stearic.
Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cho thấy các rutin ester đều có hoạt tính nhưng

kém hơn rutin ở 2 phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH và khử ion sắt III. Ngược lại, trong
phương pháp bảo vệ màu hệ nhũ tương, rutin ester lại có tiềm năng ngăn chặn peroxyd hóa
lipid gấp đôi rutin.
Kết luận
Qua thực nghiệm, đã xác định được điều kiện tối ưu của phản ứng acyl hóa rutin với xúc
tác lipase. Và các rutin ester tạo thành vẫn giữ được hoạt tính chống oxy hóa theo nhiều cơ chế
khác nhau.
Final assay for the degree of BS Pharm – Academic year: 2011 - 2012
ACYLATION OF RUTIN BY LIPASE AS BIOCATALYST AND ANTIOXIDANT
PROPERTIES OF RUTIN ESTERS
Tran Thi Yen Chi
Supervisor: Assoc. Prof. Tran Cat Dong Ph.D.
Vu Thanh Thao M.A.
Introduction
Rutin, a flavonoid, has many biological properties such as blood vessel protection,
antioxidation … However, the use of rutin was strongly limited due to their low solubility and
stability in both lipophilic and aqueous media. The acylation of this molecule can improve it’s
lipophilic properties. We, therefore, carried out the research: “Acylation of rutin by lipase as
biocatalyst and antioxidant properties of rutin esters”
Material and methods
1. Initial investigation the reaction conditions: determine the solvents and the types of
enzymes.
2. Optimization the reaction parameters of acylation reaction: determine substrate ratio,
reaction time and enzyme ratio.
3. Investigation the effects of carbon-chain length of the fatty acids (C6 to C18) on the
rutin acylation performance.
4. Investigation antioxidant properties of rutin ester in vitro.
Results and discussion
The optimum conditions of acylation reaction in tert-butanol solvent with immobilized
lipase were identified as follows the ratio of rutin and fatty acid is 1:2, the reaction time is

4.52 days, quantity of enzymes is 5g/L. Besides, the suitable fatty acids for reaction are lauric,
palmitic and stearic so the reactions produce the conversion yield is high.
The survey results suggested that lipophilic rutin esters maintain the antioxidant capacity of
the initial flavonoid, but decrease reducing power and radical scavenging abilities.
Conversely, the potential of rutin esters in the inhibition of lipid peroxidation were twice as
much as rutin.
Conclusion
We has identified the optimum conditions of acylation reaction of rutin by lipase as
biocatalyst. And modified rutin esters maintain the antioxidant properties with many different
mechanisms.
Khóa luận Dược sĩ Đại học Mục lục
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN iii
MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii
DANH MỤC HÌNH iii
DANH MỤC BẢNG iv
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 34
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52
Trần Thị Yến Chi
i
Khóa luận Dược sĩ Đại học Danh mục chữ viết tắt
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp
MeOH Methanol
EtOAc Etyl acetate

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
RSM Phương pháp đáp ứng bề mặt
DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
BHT Butylated hydroxytoluene
Trần Thị Yến Chi
ii
Khóa luận Dược sĩ Đại học Danh mục hình
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức hóa học của rutin 4
Hình 1.2. Một số hình ảnh hoa hòe 5
Hình 1.3. Vị trí acyl hóa đặc hiệu của rutin được xúc tác bởi lipase chiết từ Candida
antarctica 12
Hình 2.4. Sơ đồ quá trình thực hiện phản ứng acyl hóa rutin 23
Hình 2.5. Sơ đồ quá trình chiết tách và tinh chế 24
Hình 2.6. Đường chuẩn rutin 26
Hình 2.7. Công thức gốc tự do DPPH 30
Hình 3.8. Sắc ký đồ của sản phẩm sau phản ứng acyl hóa rutin bằng enzym 35
Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm sau phản ứng acyl hóa bằng xúc tác lipase cố
định 37
Hình 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chiều dài mạchf carbon của acid béo đến
phản ứng acyl hóa 42
Hình 3.11. Kết quả khảo sát khả năng đánh bắt gốc tự do của Rutin, Rutin ester, BHT
43
Hình 3.12. Kết quả đánh giá khả năng khử toàn phần của rutin, rutin ester, BHT 44
Hình 3.13. Thử nghiệm bảo vệ màu hệ nhũ tương β-caroten - acid linoleic 45
Hình 3.14. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rutin, rutin ester, BHT và
vitamin C 46
Trần Thị Yến Chi
iii
Khóa luận Dược sĩ Đại học Danh mục bảng

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các phản ứng được xúc tác bởi lipase 10
Bảng 1.2. Các nguồn thu nhận lipase từ động vật có vú, vi nấm và vi khuẩn [20] 10
Bảng 1.3. Phân loại các chất chống oxy hóa dựa trên nguồn gốc và cơ chế 15
Bảng 2.4. Các acid béo sử dụng trong thử nghiệm 20
Bảng 2.5. Giai mẫu xác định đường chuẩn rutin 26
Bảng 2.6. Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp RSM từ phần mềm DX7.1 28
Bảng 2.7. Phản ứng xác định khả năng khử ion sắt III 31
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát những dung môi và enzym khác nhau 38
Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm theo phương pháp RSM 38
Bảng 3.10. Phân tích ý nghĩa thống kê của mô hình và các hệ số hồi qui 39
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ tương thích của mô hình 41
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rutin, rutin ester, BHT và
vitamin C 45
Trần Thị Yến Chi
iv
Khóa luận Dược sĩ Đại học Đặt vấn đề
ĐẶT VẤN ĐỀ
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật, hơn một nửa rau quả
thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid thường có màu vàng nhạt, và cho đến nay
đã có trên 4.000 chất đã được xác định cấu trúc. Bên cạnh các hoạt tính sinh học như
kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm, kháng ung thư, giảm nguy cơ tim mạch…thì
hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid cũng rất khác nhau. Hoạt tính chống oxy
hóa của các flavonoid được thể hiện thông qua khả năng đánh bắt gốc tự do, tạo phức
với ion kim loại.
Rutin là một flavonoid dạng glycosid bao gồm aglycol là quercetin và một đường đôi
rutinose (rhamnose và glucose). Rutin được sử dụng rộng rãi để làm thuốc với mục
đích chống lão hóa tế bào, phòng và trị một số bệnh liên quan đến mạch máu. Một dẫn
xuất quan trọng nữa của rutin là quercetin cũng được sử dụng khá phổ biến. Trong cấu
trúc của cả hai chất này đều có nhiều nhóm OH phenol, làm cho phân tử trở nên khá

phân cực, giảm sự hấp thu qua ruột.
Tuy nhiên, ứng dụng của rutin trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm
đang bị giới hạn, bởi độ ổn định và độ tan kém của nó trong cả pha dầu và pha nước.
Vì vậy, hiện đang có nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi cấu trúc của rutin (acyl hóa hoặc
glycosyl hóa), bằng các phương pháp tổng hợp hóa học, tổng hợp sinh học (enzym) …
nhằm tăng độ ổn định và độ tan của rutin [11]. Trong bào chế dược phẩm, glycosyl hóa
flavonoid sẽ khiến chúng tăng tính thân nước, thích hợp để điều chế các chế phẩm
đường tiêm. Mặt khác, dẫn xuất acyl hóa của flavonoid lại có tính thân dầu cao hơn.
Các phương pháp tổng hợp hóa học hay sinh học để tổng hợp các dẫn xuất trên cũng đã
được nghiên cứu nhiều. Trong đó, phương pháp tổng hợp bằng con đường xúc tác sinh
học (enzym) cho thấy có nhiều ưu điểm và thích hợp hơn bởi phản ứng enzym có tính
đặc hiệu cao. Một số nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố như cấu trúc mạch acyl,
Trần Thị Yến Chi
1
Khóa luận Dược sĩ Đại học Đặt vấn đề
khung flavonoid, nguồn gốc enzym, bản chất dung môi hay hàm lượng nước trong môi
trường có ảnh hưởng khá mạnh đến phản ứng acyl hóa flavonoid bằng enzym.
Vì vậy, với mục tiêu cải thiện tính tan của rutin nhằm tăng cường ứng dụng của nó
trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là dược phẩm. Chúng tôi thực hiện đề tài : “Nghiên cứu
acyl hóa rutin với xúc tác lipase và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các rutin
ester”
Với các nội dung sau:
- Khảo sát sơ bộ điều kiện của phản ứng acyl hóa: xác định dung môi và loại
enzym thích hợp cho phản ứng acyl hóa rutin.
- Tối ưu hóa các thông số của phản ứng acyl hóa: tỷ lệ cơ chất, thời gian phản
ứng và lượng enzym.
- Khảo sát ảnh hưởng chiều dài mạch carbon của acid béo đến phản ứng acyl hóa.
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các dẫn xuất acyl hóa của rutin.
Trần Thị Yến Chi
2

Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trần Thị Yến Chi
3
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
1.1. RUTIN VÀ DẪN XUẤT
1.1.1. Giới thiệu chung
Rutin còn được gọi là rutosid, quercetin-3-rutinosid, hay sophorin, là một O-glycosid
flavonoid thuộc nhóm flavanol, lần đầu tiên được nghiên cứu bởi A. Perkin, sau đó
được nhiều tác giả nghiên cứu thêm và đã xác định được công thức của rutin thô
C
27
H
30
O
16
. Trong cấu trúc của rutin bao gồm flavonoid quercetin và đường đôi rutinose
(rhamnose và glucose) [5]
Hình 1.1. Công thức hóa học của rutin
Công thức phân tử: C
27
H
30
O
16
Khối lượng phân tử: 610,52 (g/mol) [34]
1.1.2. Nguồn rutin ở nước ta
Rutin được chiết xuất chủ yếu từ nụ hoa hòe Sophora japonica L., Fabaceae. Người ta
dùng hoa hòe chưa nở, phơi hay sấy khô, hoặc cả hoa đã nở; Bên cạnh đó, quả hòe và
lá hoa hòe cũng có thể dùng tươi [1].

Ngoài ra rutin còn có nhiều trong một số cây khác như Bạch đàn (Eucalyptus
macrorhyncha F. Muell, Myrtaceae), Lúa mạch ba góc (Polygonum fagopyrum L.,
Trần Thị Yến Chi
4
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Polygonaceae), Táo ta (Zyzyphus jujuba Lank., Rhamnaceae) Ích mẫu (Leonurus
heterophyllus L., Lamiaceae) … [5]
Ở Việt Nam, Hòe được trồng nhiều ở Thái Bình, Nam Hà, Hà Bắc, Hải Hưng, Hải
Phòng, Nghệ An và một số vùng thuộc tây nguyên. Hòe còn được trồng ở Trung Quốc,
Nhật, Brazil.
Nụ hoa Hòe là nguyên liệu giàu rutin so với các nguyên liệu khác (Dược điển Việt
Nam qui định hàm lượng rutin phải đạt 20%). Với nụ hoa Hòe Việt Nam, hàm lượng
rutin có thể đạt tới 34%, 4 – 11% ở vỏ quả, 5 – 6 % ở lá … [1]
Hình 1.2. Một số hình ảnh hoa hòe
1.1.3. Đặc tính lý hóa
1.1.3.1. Vật lý
Rutin là những tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, để lâu ngoài không khí có thể chuyển
sang vàng đậm hay vàng nâu. Rutin ngậm 3 phân tử nước, được làm khan ở 95- 97
o
C,
khan tuyệt đối ở 110
o
C khi sấy ở 10 mm Hg trong 12 giờ [2, 34].
Độ tan: Một phần rutin tan trong 7 phần methanol nóng, 200 phần nước sôi, 650 phần
cồn lạnh, 60 phần cồn nóng và 8000 phần nước ở nhiệt độ thường. Rutin dễ tan trong
methanol, pyridin, formamid, dung dịch kiềm loãng, tan chậm trong aceton, acetonitril.
Rutin không tan trong benzen, cloroform, ether etylic, dung dịch acid [1, 34].
Trần Thị Yến Chi
5
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu

Nhiệt độ nóng chảy: Rutin nóng chảy ở 210
o
C, kèm theo sự phân huỷ. Rutin khan sẽ
chuyển thành màu nâu ở 125
o
C, hóa dẻo ở 196
o
C, dễ bị phân huỷ ở 215-216
o
C [34].
Độ hấp thu: Rutin có hấp thu cực đại λ
max
ở 362,5 nm và 258 nm (ethanol) [5]. Rutin
có hấp thu cực đại λ
max
ở 358 nm và 257 nm (trong methanol) [2].
1.1.3.2. Hóa học
Phản ứng với dung dịch FeCl
3
, dung dịch AlCl
3
, phản ứng ghép đôi với muối diazoni,
phản ứng với dung dịch kiềm, phản ứng cyanidin [5].
1.1.4. Tác dụng sinh học
-Tác dụng chống oxy hóa: Rutin và quercetin đã được chứng minh có tác dụng ức chế
quá trình hình thành các gốc tự do ở cả 3 giai đoạn: giai đoạn hình thành ion
superoxyd, giai đoạn hình thành các gốc hydroxyl trong phản ứng Fenton, giai đoạn
hình thành gốc tự do peroxyd lipid [6]. Ngoài ra, dùng đồng thời rutin và các chất
chống oxy hóa khác (vitamin C) sẽ cho tác dụng hiệp đồng chống lại sự oxy hóa
lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) [25]. Vì vậy, sử dụng rutin (kết hợp vitamin C) sẽ làm

giảm nguy cơ chứng xơ vữa động mạch.
-Tác dụng tăng cường sức đề kháng, giảm tính thấm của mao mạch (tác dụng kiểu
vitamin P): Rutin làm bền thành mạch, chống xuất huyết mao mạch, chống xơ cứng
mạch máu. Rutin có tác dụng tăng cường sức đề kháng, giảm tính thấm của mao mạch,
phục hồi tính đàn hồi của mao mạch đã tổn thương.
Một số nghiên cứu chứng minh rằng trong cơ thể rutin tham gia vào quá trình oxy hóa
– khử, làm giảm hiện tượng oxy hóa adrenalin bằng cách ức chế cạnh tranh với enzym
catecholamine-o-methyltransferase, do đó lượng adrenalin bị phá huỷ trong tuần hoàn
giảm, mà adrenalin chính nó lại có tác dụng tăng cường sức đề kháng của mao mạch.
Ngoài ra, rutin có khả năng gây co mạch trực tiếp hệ mao quản.
Trần Thị Yến Chi
6
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Ở người cao tuổi, rutin có khả năng duy trì tình trạng bình thường của mao mạch, bảo
đảm cho mao mạch làm được chức năng trao đổi chất, tăng trương lực của tĩnh mạch,
củng cố sức bền của thành mạch, do đó hạn chế được hiện tượng suy tĩnh mạch lúc tuổi
già [1].
-Tác dụng chống viêm: Thí nghiệm trên chuột cống trắng, rutin có tác dụng ức chế phù
bàn chân chuột do albumin, histamin, serotonin gây ra cũng như ức chế sưng khớp
khuỷu do enzym hyaluronidase gây ra. Trên thỏ, rutin tiêm tĩnh mạch có thể phòng
ngừa viêm da dị ứng và hiện tượng Arthus (Arthus phenomenon) trên động vật đã được
gây mẫn. Trên chó bị viêm tắc tĩnh mạch thực nghiệm bằng cách tiêm dầu thông, dùng
rutin điều trị có tác dụng thúc đẩy quá trình hồi phục [1].
-Tác dụng bảo vệ cơ thể chống chiếu xạ: Rutin tiêm dưới da với liều 2 mg/kg có tác
dụng làm giảm tỉ lệ tử vong của chuột nhắt trắng bị chiếu xạ với liều lớn và chuột nhắt
trắng tiêm nitromin với liều gây chết.
-Tác dụng hạ huyết áp, hạ cholesterol-máu: Tiêm tĩnh mạch dịch chiết từ nụ hòe trên
chó đã được gây mê, có tác dụng hạ huyết áp rõ rệt. Trên chuột cống trắng cao huyết
áp di truyền, tiêm tĩnh mạch rutin với liều 1 mg/kg cũng có tác dụng hạ huyết áp.
-Tác dụng chống kết tập tiểu cầu: Trên thỏ thí nghiệm rutin tiêm phúc mạc với liều 0,2

g/kg làm giảm số lượng tiểu cầu và ức chế kết tập tiểu cầu.
-Tác dụng trên tim: Rutin làm giảm trương lực cơ tim.
-Các tác dụng khác: Rutin có tác dụng bảo vệ gan, dùng tetracloruacarbon gây tổn
thương gan chuột cống trắng thì hoạt động của enzym cytochrom P- 450 bị ức chế.
Dùng rutin bằng đường uống với liều 100 mg/kg có tác dụng kích hoạt trở lại hoạt
động của enzym trên.
Trần Thị Yến Chi
7
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Có báo cáo cho biết rutin với liều 40 - 400 mg/kg có tác dụng kéo dài thời gian sống
của chuột nhắt đã được tiêm truyền tế bào u NK/Ly. Rutin cũng được khẳng định là
không có tác dụng gây ung thư [1].
1.1.5. Một số sản phẩm chứa rutin và dẫn xuất
Rutin thường được bào chế thành thuốc viên, mỗi viên có 0,02 g với liều dùng trong
ngày từ 0,06 – 0,12 g [3]. Ở thị trường Châu Âu, rutin thường được phối hợp với các
vitamin trong công thức của các chế phẩm thực phẩm chức năng hoặc với các hoạt chất
khác dùng trong tim mạch. Trên thị trường Việt Nam, một số công ty như Mekophar,
Ladophar, Công ty CPDP Hà Tây … sản xuất chế phẩm chứa rutin 50 mg dưới dạng
thực phẩm chức năng. Rutin cũng là thành phần của các thuốc điều trị rối loạn và suy
giãn tĩnh mạch, suy giảm trí nhớ.
Tuy nhiên, ứng dụng của rutin trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm
đang bị giới hạn, bởi độ ổn định và độ tan kém của nó trong cả pha dầu và pha nước.
Vì vậy, hiện đang có nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi cấu trúc của rutin (acyl hóa hoặc
glycosyl hóa), bằng các phương pháp tổng hợp hóa học, tổng hợp sinh học (enzym) …
nhằm tăng độ ổn định và độ tan của rutin. Đối với hướng glycosyl hóa thì alpha-
glycosyl rutin là một dẫn xuất của rutin có ưu điểm là tan tốt trong nước, chống tia UV
và ổn định hơn so với rutin. Vì vậy, alpha-glycosyl có thể được dùng như một chất
chống oxy hóa, chất tạo màu, chất ổn định, chất làm trắng da trong mỹ phẩm, chất hấp
phụ tia UV, chất ngăn ngừa hư hỏng trong thức ăn, nước uống, thuốc lá, thức ăn cho
vật nuôi, gia súc, dược phẩm. Ngoài ra, nó còn được dùng để làm thuốc bổ sung

vitamin P [33].
Mặt khác, dẫn xuất acyl hóa của flavonoid lại có tính thân dầu cao hơn. Đã có nhiều
nghiên cứu về phương pháp tổng hợp các dẫn xuất trên, đặc biệt là phương pháp sinh
học. Ardhaoui và cộng sự đã tiến hành acyl hóa một số flavonoid (quercetin,
hesperidin, rutin và esculin) với xúc tác lipase cố định chiết từ Candida antarctica.
Trần Thị Yến Chi
8
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Trong nghiên cứu này, acid béo sử dụng là acid palmitic, thì hiệu suất phản ứng đạt
80%, 71% và 38% lần lượt đối với esculin, rutin và hesperidin [11].
Ngoài ra, tiềm năng ứng dụng của các dẫn xuất rutin thân dầu như là một chất chống
oxy hóa, bảo vệ các thực phẩm từ dầu, chất béo cũng đã được đánh giá bằng các mô
hình thí nghiệm khác nhau. Kết quả cho thấy rằng các rutin ester thân dầu là những
hợp chất hữu ích trong việc bảo vệ các thực phẩm từ dầu/chất béo chống lại sự oxy hóa
trong suốt quá trình bảo quản và sử dụng [35]. Nghiên cứu khác trên sự ức chế quá
trình oxy hóa LDL ở người còn cho thấy rằng, các dẫn xuất rutin ester có tác dụng
chống oxy hóa hiệu quả. Trong đó, khả năng ức chế quá trình oxy hóa của rutin laurat
cao hơn rutin palmitat, rutin và cả chế phẩm chống oxy hóa tổng hợp hiện đang có trên
thị trường là butylated hydroxytoluene (BHT) [24].
1.2. LIPASE
1.2.1. Khái quát
Lipase (EC 3.1.1.3) là enzym thuộc nhóm enzym thủy giải. Enzym này tham gia quá
trình xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol thành acid béo tự do và glycerol.
Chúng xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên kết chứ không cắt đứt cả 3 liên
kết cùng một lúc. Lipase xúc tác phản ứng thủy giải triglycerid thành diglycerid,
monoglycerid hay glycerol và acid béo nhờ hoạt động của nó trên bề mặt phân cách hai
pha dầu nước.
Lipase còn có khả năng xúc tác phản ứng ester hóa, transester hóa, thủy giải amin, thủy
giải oxim và thiotransester hóa trong dung môi hữu cơ [19, 32].
Trần Thị Yến Chi

9
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Bảng 1.1. Các phản ứng được xúc tác bởi lipase
Phản ứng Phương trình phản ứng
Thủy phân
Tổng hợp ester
Transester hóa
Thủy giải acid
Phản ứng ester
nội
Thủy giải amin
1.2.2. Nguồn thu nhận lipase
Lipase được thu từ 3 nguồn là động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong đó nguồn thu từ
vi sinh vật cho lượng enzym cao nhất do vi sinh vật có khả năng tăng trưởng, phát triển
và sinh tổng hợp enzym nhanh hơn các nguồn khác.
Bảng 1.2. Các nguồn thu nhận lipase từ động vật có vú, vi nấm và vi khuẩn [20]
Động vật Vi nấm Vi khuẩn
Lipase từ tụy người Pencillium camberti Bacillus thermocatenulatus
Lipase từ tụy ngựa Aspergillus niger Staphylococcus hyicus
Lipase từ tụy heo Candida rugosa Staphylococcus aureus
Lipase từ tụy heo
Guinea
Candida antarctica Staphylococcus epidermidis
Pseudomonas cepaci
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Trần Thị Yến Chi
10
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase

Hoạt tính chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, hàm lượng nước và mặt
phân cách giữa chất béo và nước. Tốc độ phản ứng sẽ tăng lên gấp đôi khi nhiệt độ
tăng lên 10
o
C, sản phẩm phản ứng sẽ tăng lên nhiều lần nếu lipase chịu nhiệt. Trong
một vài trường hợp, nhiệt độ sẽ làm giảm hoạt tính enzym do làm duỗi các nếp xoắn
của chuỗi polypeptide. Các lipase từ vi sinh vật hoạt động mạnh ở pH 4,5 – 8,5. Tỷ lệ
phân giải lipid của lipase cao ở lớp phân cách giữa chất béo và nước. Chất béo được
nhũ hóa tốt sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho lipase hoạt động do làm tăng diện tích tiếp
xúc giữa enzym và cơ chất. Sự hiện diện của các ion Na
+
, Ca
+
cũng ảnh hưởng đến
hoạt động của enzym: Na
+
cần thiết cho hoạt động của lipase từ tụy heo, Ca
2+
cần cho
sự thủy giải triglycerid mạch dài. Các acid mật kìm hãm sự thủy giải lipid, nhưng với
hàm lượng thấp nó có thể làm cho hoạt tính enzym từ tụy tạng ổn định hơn [22].
1.2.4. Lipase cố định
Enzym cố định thường là những enzym hòa tan được gắn vào chất mang bằng các kỹ
thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzym chuyển từ trạng thái hòa tan sang
trạng thái không hòa tan.
Việc sử dụng enzym lipase cố định đem lại lợi ích kinh tế cao hơn so với việc sử dụng
enzym tự do [27]. Các lợi ích của enzym cố định bao gồm: khả năng tái sử dụng, độ
bền lớn hơn enzym tự do nhờ được chất mang bảo vệ, dễ dàng tách enzym ra khỏi hỗn
hợp sau phản ứng, khả năng bảo quản tốt hơn enzym tự do cùng loại … Vì vậy mà ta
có thể kiểm soát được phản ứng xúc tác của enzym, tiết kiệm chi phí và nâng cao hiệu

quả sản xuất.
Một số tác giả đã tiến hành khảo sát nhiều loại enzym khác nhau cho phản ứng acyl
hóa các flavonoid. Kết quả đều cho thấy enzym lipase nguồn chiết từ Candida
antarctica là một trong những enzym cho kết quả tốt nhất [9, 10, 29]. Tuy nhiên đối
với phản ứng acyl hóa, hoạt tính enzym cũng bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như bản
Trần Thị Yến Chi
11
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
chất dung môi, hàm lượng nước trong môi trường phản ứng, nồng độ và chiều dài
mạch carbon của acid béo … Hàm lượng nước cần được kiểm soát dưới 200 ppm để
hiệu suất phản ứng đạt được cao nhất [12, 21]. Trong khi đó, một số tác giả đã so sánh
các dung môi phản ứng khác nhau, và kết quả cho thấy hoạt tính enzym (lipase chiết từ
Candida antarctica) đạt cao nhất với dung môi aceton, acetonitril …
Trong một nghiên cứu của Ardhaoui và cộng sự, ông đã thực hiện phản ứng acyl hóa
một số flavonoid (rutin, quercetin, hesperidin và esculin) bằng enzym lipase cố định
chiết từ Candida antarctica. Do tính đặc hiệu của phản ứng enzym mà trong tất cả
trường hợp, chỉ có một sản phẩm được tạo thành. Đối với rutin, liên kết ester được tạo
thành ở OH vị trí C4’’’ (C4 của nhánh rhamnose) [11].
Hình 1.3. Vị trí acyl hóa đặc hiệu của rutin được xúc tác bởi lipase chiết từ
Candida antarctica
1.3. QUÁ TRÌNH OXY HÓA – CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA
1.3.1. Quá trình oxy hóa
1.3.1.1. Sự tạo thành gốc tự do trong cơ thể vi sinh vật
Trong cơ thể sinh vật, các dạng oxi hoạt động luôn được tạo ra từ các phản ứng oxi hóa
khử của các quá trình chuyển hóa. Oxi từ chuỗi hô hấp tế bào sẽ nhận điện tử chủ yếu
ở ty lạp thể và tạo ra các gốc superoxid (
°
O
2
-

). Các gốc này được chuyển thành H
2
O
2
Trần Thị Yến Chi
12
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
với sự xúc tác của superoxid dismutase (SOD). Tuy nhiên các gốc (
°
O
2
-
) và H
2
O
2
chỉ
tồn tại ở nồng độ thấp và vô hại với cơ thể. Nếu các yếu tố này tồn tại ở nồng độ cao,
kết hợp với sự xúc tác của enzym hoặc các ion Fe
2+
, Cu
2+
thì sẽ tạo ra các gốc tự do
như gốc hydroxyl (HO
°
), gốc lipoxyl (LO
°
), gốc alkoxyl (RO
°
), gốc lipoperoxyl

(LOO
°
). Các gốc tự do này rất không bền với thời gian, tồn tại ngắn hơn 10
-6
giây nên
nó phải nhận điện tử từ các phân tử khác để đạt được cấu trúc bền vững. Quá trình này
tạo thành một dây chuyền phản ứng và dẫn đến sự hư hại các phân tử chung quanh.
Bên cạnh đó, các ảnh hưởng từ điều kiện sống như tiếp xúc với bức xạ ion hóa, tia tử
ngoại, ô nhiễm môi trường, stress, chế độ ăn uống, dùng thuốc, các xenobiotic, hút
thuốc, có thể làm gia tăng sự hình thành gốc tự do trong cơ thể [4].
1.3.1.2. Quá trình oxy hóa – phản ứng gốc tự do:
Các gốc tự do thường gây ra phản ứng dây chuyền. Phản ứng dây chuyền này thường
có 3 giai đoạn:
- Giai đoạn khơi mào.
- Giai đoạn dây chuyền tăng mạch.
- Giai đoạn ngắt mạch.
Bất kỳ quy trình nào có thể sinh ra gốc tự do đều có thể khơi mào cho 1 phản ứng dây
chuyền. Gốc tự do bị tiêu hủy, phản ứng dây chuyền sẽ kết thúc.
Phản ứng khơi mào: nói chung chất khởi đầu không phải là oxygen, mà có thể là:
- Một số gốc peroxy khác có mặt trong dung dịch.
- Một lượng vết của các ion kim loại như sắt hoặc đồng.
- Những gốc tạo thành trong dung dịch từ sự hấp thu ánh sáng (khả kiến hay tử ngoại).
Các phương trình phản ứng dây chuyền tăng mạch có thể là:
- Một gốc tạo ra một gốc mới và hydrogen peroxid.
- Gốc mới trong dung dịch tiếp tục phản ứng với oxygen.
Phản ứng ngắt mạch: Có thể phản ứng giữa các gốc tạo ra những sản phẩm bền vững.
Trần Thị Yến Chi
13
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
1.3.1.3. Các tác động của gốc tự do và sự liên quan của gốc tự do tới một số bệnh tật

của con người
Gốc tự do sinh ra quá mức sẽ vượt qua hệ thống enzym bảo vệ của cơ thể (enzym
superoxid dismutase, catalase, peroxidase…), và tấn công vào các thành phần tế bào
như ADN, protein, hydratcarbon, lipid
Gốc tự do tấn công vào các phospholipid màng gây ra quá trình peroxy hóa lipid. Hậu
quả dẫn đến tính lỏng, tính thấm của màng bị thay đổi. Quá trình peroxy hóa ở các bao
myelin quanh các sợi thần kinh có thể dẫn đến các dấu hiệu của bệnh thần kinh (bệnh
Alzheimer). Nếu peroxy hóa các chất hoạt động ở bề mặt phế nang sẽ gây ra các rối
loạn chức năng phổi (dấu hiệu suy kiệt hô hấp ở người lớn). Quá trình peroxy hóa lipid
xảy ra mãnh liệt ở cơ quan tổ chức tế bào khiến chúng bị phá hủy nghiêm trọng và dẫn
đến ung thư. Các gốc tự do còn có thể gây ra các tổn thương phân tử ADN cũng dẫn
đến đột biến và ung thư.
Sự tác động vào các yếu tố gây viêm, sự hủy hoại cấu trúc các phân tử peroxy hóa
lipidisaccharid do oxy hóa có thể làm mất tính nhớt của acid hyaluronic - chất làm trơn
ở khớp, ảnh hưởng tới quá trình viêm có thể xuất hiện các bệnh như viêm khớp dạng
thấp, lupus ban đỏ
Gốc tự do có liên quan chặt chẽ với sự điều hòa của các chất tiết ra từ thành trong
mạch (prostacyclin, NO, ) để quyết định sự bám dính của tiểu cầu làm tiền đề cho các
cục máu đông, các mảng xơ vữa là nguyên nhân của các bệnh về tim mạch (nhồi máu
cơ tim, xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não )
Như vậy, việc sử dụng các chất chống oxy hóa thật sự cần thiết để chống lại bệnh tật.
Do đó, người ta không ngừng nghiên cứu, tìm kiếm các chất chống oxy hóa nhằm mục
đích sử dụng để bảo vệ sức khoẻ con người [7].
Trần Thị Yến Chi
14
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
1.3.2. Các chất chống oxy hóa
1.3.2.1. Khái niệm
Các chất chống oxy hóa là những chất giúp bảo vệ tế bào khỏi các gốc tự do (những
chất là căn nguyên gây tổn hại tế bào) tạo ra trong các quá trình oxy hóa nên ngăn cản

hay làm chậm quá trình này [30].
Trong cơ thể chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ những chất hóa học khỏi những
phản ứng oxy hóa có hại bằng cách phản ứng với các gốc tự do hay những dạng oxy
hoạt động khác, vì vậy ngăn cản tiến trình oxy hóa. Tuy nhiên sự cung cấp các chất
chống oxy hóa có giới hạn vì một phân tử chất chống oxy hóa chỉ có thể phản ứng với
một gốc tự do. Vì thế cần có nguồn bổ sung chất chống oxy hóa thường xuyên, có thể
từ nguồn nội sinh hay ngoại sinh.
Ngoài ra, các chất chống oxy hóa còn được sử dụng trong ngành dược và mỹ phẩm với
mục đích bảo vệ sự ổn định của dược chất. Do đó, chất chống oxy hóa cũng được định
nghĩa là những chất khử mạnh có hoạt tính oxy hóa cao hơn so với dược chất. Các chất
chống oxy hóa trong dược phẩm được chia ra làm nhiều nhóm dựa trên cơ chế khác
nhau bao gồm các cơ chế chống oxy hóa trực tiếp và chống oxy hóa gián tiếp. Các chất
chống oxy hóa gián tiếp là những tác nhân chelat hóa tác động lên các ion kim loại như
Fe
2+
, Cu
2+
, Ni
2+
, Mn
2+
… vì đây là các ion xúc tác cho các quá trình khơi mào phản ứng
oxy hóa. Các chất chống oxy hóa trực tiếp bao gồm các chất khử hóa, các chất oxy hóa
chọn lọc và các chất ngắt mạch.
Bảng 1.3. Phân loại các chất chống oxy hóa dựa trên nguồn gốc và cơ chế
Nguồn gốc Các chất điển hình Cơ chế
Có sẵn trong cơ thể
Catalase, SOD, GSH,
GSHPO
Khử hóa superoxid, H

2
O
2
Bổ sung vào cơ thể từ thực
phẩm, thức ăn, thuốc, mỹ
phẩm.
Vitamin E, vitamin C,
vitamin A, selen,
flavonoid, polyphenol,
Tác động trên các gốc tự
do như những chất ngắt
mạch.
Trần Thị Yến Chi
15
Khóa luận Dược sĩ Đại học Tổng quan tài liệu
Nguồn gốc Các chất điển hình Cơ chế
carotenoid …
Chất ổn
định trong
dược phẩm
Chất chống
oxy hóa
gián tiếp
EDTA (etylen diamin
tetraacetic aicd)
Tạo phức với ion kim loại
Chất chống
oxy hóa trực
tiếp
Chất khử hóa: các hợp chất

chứa sulfit như cystein,
methionin, unithiol, natri
thiosulfat …
Khử các dược chất đã bị
oxy hóa
Chất chống oxy hóa chọn
lọc: natri bisulfit, natri
ascorbat, ascorbyl palmitat,
natri thioglycerol …
Tác động trực tiếp với oxy
Chất ngắt mạch: các thiol,
BHA (butyl hydroanisol),
BHT (butyl
hydroxytoluen),
hydroquinon, vitamin E,
propyl gallat …
Tác động trên các gốc tự
do R
°
hay RO
°
, ROO
°
như
những chất ngắt mạch.
1.3.2.2. Một số chất chống oxy hóa.
Trong cơ thể bình thường, những gốc tự do
°
OH,
°

O
2
−
, H
2
O
2
vô cùng ít, các gốc tự do
này đã được một hệ thống các chất khử tự nhiên như: superoxid dismutase (SOD),
glutathion (GSH), glutathion peroxidase (GSHPO), catalase bảo vệ, nên cơ thể chúng
ta vẫn bình thường.
Các chất chống oxy hóa nội sinh bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do bao gồm:
Những chất chống oxy hóa enzym bao gồm: Superoxid dismutase (SOD): xúc tác cho
phản ứng chuyển O
2
°
−
thành H
2
O
2
và H
2
O, Glutathion peroxidase (GSHPO); catalase.
Những chất chống oxy hóa không enzym bao gồm: các vitamin tan trong lipid như
vitamin E và vitamin A hay tiền vitamin A (β-caroten), vitamin C tan trong nước và
GSH. Vitamin E được xem như chất chống oxy hóa ngắt mạch chính yếu trong cơ thể.
Trần Thị Yến Chi
16