sử dụng kỹ thuật pcr -rflp để phát hiện đột biến kháng lamivudine và đột biến basal core promter của virus viêm gan b

PHIẾU ĐĂNG KÝ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KH-CN


Tên đề tài: SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT
BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER
CỦA VIRUS VIÊM GAN B

Mã số:


Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Cơng nghệ Trẻ

Địa chỉ: Số 1 Phạm Ngọc Thạch, P. Bến Nghé, Q1, Tp. Hồ Chí Minh

Điện thoại: 8233363


Tổng chi phí thực chi:


Trong đó: - Từ ngân sách Nhà nước: 50.000.000 VND
- Kinh phí của Bộ/Tỉnh:
- Vay tín dụng:
- Vốn tự có:
- Thu hồi:



Thời gian nghiên cứu:
Thời gian bắt đầu:

Thời gian kết thúc


12 Tháng
9/2006
9/2007

Tên cán bộ phối hợp nghiên cứu:
1. PGS. TS Hồ Huỳnh Thùy Dương – Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM
2. GS.BSCKII Phạm Hòang Phiệt – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM
3. ThS. Nguyễn Chí Vinh – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM
4. CN. Hoàng Ngọc Diễm Mi – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM
5. CN. Hồ Thò Thanh Thủy – Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM


Số đăng ký đề tài:



Ngày:

Số chứng nhận đăng ký KQNC:



Ngày:


Bảo mật:
A. Phổ biến rộng rãi

B. Phổ biến hạn chế
C. Bảo mật

Tóm tắt kết quả nghiên cứu
1. Đã xây dựng Quy trình xác đònh đột biến basal core promoter bằng kỹ thuật Nested PCR -
RFLP, khả năng phát hiện đột biến ở 30% (3x10
3
bản sao/ml).
2. Đã xây dựng Quy trình xác đònh đột biến kháng lamivudine rt180, rt204 bằng kỹ thuật Nested
PCR – RFLP, khả năng phát hiện đột biến ở 10% (1x10
3
bản sao/ml), độ nhạy 6,25x10
2
bản
sao/ml. Đã tạo được các dòng mang đột biến 180M-204V có tỉ lệ tương đồng về trình tự gene
96,3% và dòng 204I có tỉ lệ tương đồng 95,8% trên plasmid pGEM-T.
3. Đã thử nghiệm 2 quy trình trên 127 mẫu huyết thanh bệnh nhân, đột biến basal core promoter
chiếm tỉ lệ 32% trên nhóm khảo sát, đột biến kháng lamivudine chiếm tỉ lệ 74,4% trên nhóm
khảo sát phổ biến ở 2 dạng 204I và 180M-204V. Các kết quả xác đònh đột biến phù hợp với lâm
sàng.



Kiến nghị về quy mơ và đối tượng áp dụng kết quả nghiên cứu:
1. Kiến nghò sử dụng quy trình để ứng dụng cho các bệnh nhân viêm gan B đang điều trò
lamivudine, trước tiên là các bệnh nhân của Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM.
2. Kiến nghò chuyển giao kết quả nghiên cứu cho Công ty TNHH CNSH Khoa Thương để
tiếp tục các nghiên cứu sâu hơn và phổ biến quy trình.
3. Đề nghò mở rộng nghiên cứu về tình hình kháng lamivudine trong bệnh nhân viêm gan B
tại TPHCM hiện nay, có thể thực hiện các khảo sát theo thời gian điều trò (1, 2, 3 năm)

hoặc theo phân loại thuốc sử dụng (lamivudine, entecavir, telbivudine).


Chức vụ Chủ nhiệm đề tài Cơ quan
chủ trì đề tài
Chủ tịch Hội đồng
Đánh giá chính thức
Cơ quan
quản lý đề tài

Họ và tên


Nguyễn Chí Vinh
Nguyễn Cơng Tĩnh
Nguyễn Văn Thanh
Phan Minh Tân
Học vị ThS CN GS. TS PGS.TS

Ký tên








Đóng dấu

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM



CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ




BÁO CÁO NGHIỆM THU

(ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU)

ĐỀ TÀI


SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH
ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL
CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B






CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. NGUYỄN CHÍ VINH
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TT PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRẺ








THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 01/ 2008

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM



CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ




BÁO CÁO NGHIỆM THU
(ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU)

ĐỀ TÀI

SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH
ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL
CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B




CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. NGUYỄN CHÍ VINH
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TT PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRẺ


CỐ VẤN CHUYÊN MÔN:
1. PGS.TS HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG
2. GS.BSCKII PHẠM HOÀNG PHIỆT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 01/ 2008


THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI:
09/2006 – 01/2008

ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI:
Khoa Xét nghiệm - Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM
Bộ môn Di truyền - Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM


THÀNH PHẦN THAM GIA:
ThS. Nguyễn Chí Vinh: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Đại học Y dược
CN. Hoàng Ngọc Bảo Mi: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y dược
CN. Dương Thò Thanh Hương: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y dược
CN. Hồ Thò Thanh Thủy: Bộ môn Di truyền – ĐH Khoa học Tự nhiên
CN. Nguyễn Vũ Trung Kiên: Bộ môn Di truyền – ĐH Khoa học Tự nhiên
CN. Ngô Thò Thanh Tuyền: Trung tâm xét nghiệm Diag Center

CỐ VẤN CHUYÊN MÔN:
PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương – Bộ môn Di truyền
Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM
GS.BSCKII Phạm Hoàng Phiệt – Khoa Xét nghiệm
Bệnh viện Đại học Y dược TP.HCM

Bảng ghi chú các chữ viết tắt:

Antiviral : Thuốc kháng virus
BCP : Basal core promoter
BET : Ethidium bromide
bp : base pair – cặp base
DNA : Deoxyribonucleic acid
dATP : 2’-deoxyadenosin- 5’- triphosphate
dCTP : 2’-deoxycytidin- 5’- triphosphate
dGTP : 2’-deoxyguanosin- 5’- triphosphate
dTTP : 2’-deoxythymidin- 5’- triphosphate
dUTP : 2’-deoxyuridin- 5’- triphosphate
dNTP : 2’-deoxynucleosid- 5’- triphosphate
DW : Distilled water – nước cất vô trùng
EDTA : Ethyldiamin tetra-acetic acid
HBV : Hepatitis B Virus, Virus viêm gan B
IFN : Interferon
LAM : Lamivudine
M : Methionine
Mut : Mutation – đột biến
Nu : Nucleotide
OLT : Orthotopic liver transplant – ghép gan
PCR : Polymerase chain reaction
Phage : Thực khuẩn thể
Plasmid : Thể mang DNA mục tiêu – dùng trong kỹ thuật tạo dòng
Primer : Mồi – dùng trong phản ứng PCR

RFLP : Restriction fragment length polymorphisms –
tính đa hình kích thước của các trình tự giới hạn
rpm : rounds per minute – vòng trên phút
Sequencing : Giải trình tự nucleotide
Taq : Thermus aquaticus
V : Valine
YMDD : Tyrosine Methionine Aspartate Aspartate
Wt : Wild type – hoang dại









PHAÀN 1:

TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

PHAÀN 2:

NOÄI DUNG – PHÖÔNG PHAÙP















PHAN 3:

KET QUA BAỉN LUAN

MỤC LỤC


Trang
Bảng ghi chú các chữ viết tắt
Mục lục

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Việt Nam thuộc vùng nhiễm và bệnh lý do HBV nặng, số lượng bệnh
nhân có chỉ đònh điều trò lớn
1
2. Chẩn đoán được đột biến Basal core promoter và đột biến kháng
lamivudine sẽ giúp ích cho việc theo dõi và điều trò bệnh viêm gan B
1
3. Nested PCR-RFLP là kỹ thuật đơn giản và tiện ích để xác đònh đột biến
Basal core promoter và đột biến kháng lamivudine
7

PHẦN 2: NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP
1. Tạo vật liệu cho quy trình

1.1. Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương của đột biến Basal core
promoter
8
1.2. Tạo dòng lưu trữ các dạng cơ bản của đột biến kháng lamivudine,
từ đó tạo các sản phẩm PCR chứng dương
8
2. Thử nghiệm thay đổi một số yếu tố
2.1. Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa thay cho phương pháp
Boom
9
2.2. Nested PCR thay cho PCR 1 bước 10
2.3. Phản ứng ủ thích hợp cho các enzyme giới hạn 11
2.4. Điện di microfluidic thay cho điện di agarose 3% 12
3. Thử khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh có hỗn hợp HBV đột
biến/hoang dại
3.1. Khả năng phát hiện đột biến Basal core promoter trong huyết thanh
hỗn hợp
12
3.2. Khả năng phát hiện đột biến kháng lamivudine trong huyết thanh
hỗn hợp
13
3.3. Độ nhạy của quy trình xác đònh đột biến kháng lamivudine 13
4. Thực hiện 2 quy trình đã được cải tiến trên huyết thanh bệnh nhân
4.1. Xác đònh đột biến Basal core promoter trên huyết thanh bệnh nhân 14
4.2. Xác đònh đột biến kháng lamivudine trên huyết thanh bệnh nhân 14

PHẦN 3: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
1. Kết quả về việc tạo vật liệu cho quy trình
1.1. Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương của đột biến Basal core 15
promoter

1.2. Tạo dòng lưu trữ các dạng cơ bản của đột biến kháng lamivudine,
từ đó tạo các sản phẩm PCR chứng dương
15
2. Kết quả về việc thử nghiệm thay đổi một số yếu tố
2.1. Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa thay cho phương pháp
Boom
22
2.2. Nested PCR thay cho PCR 1 bước 23
2.3. Phản ứng ủ thích hợp cho các enzyme giới hạn 25
2.4. Điện di microfluidic thay cho điện di agarose 3% 26
3. Kết quả về việc thử khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh có
hỗn hợp HBV đột biến/hoang dại
3.1. Khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh hỗn hợp
3.1.1 Khả năng phát hiện đột biến Basal core promoter trong huyết
thanh hỗn hợp
33
3.1.2. Khả năng phát hiện đột biến kháng lamivudine trong huyết
thanh hỗn hợp
34
3.2. Độ nhạy của quy trình xác đònh đột biến kháng lamivudine 35
4. Kết quả về việc thực hiện 2 quy trình đã được cải tiến trên huyết thanh
bệnh nhân
4.1. Xác đònh đột biến Basal core promoter trên huyết thanh bệnh nhân 37
4.2. Xác đònh đột biến kháng lamivudine trên huyết thanh bệnh nhân 40

Kết luận – Đề nghò 47

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt:
1.
Nguyễn Hữu Chí, Bệnh viêm gan siêu vi, trang 69-140, NXB ITAXA 1993.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, 1997.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Kỹ thuật Di truyền, Giáo trình sau đại học 2005.
4. Đinh Dạ Lý Hương, Bùi Hữu Hoàng, Trần Thiện Tuấn Huy, Trần Ngọc Bảo,
Viêm gan siêu vi B
– từ cấu trúc siêu vi đến điều trò, NXB Đà Nẵng, 2000.
5. Trương Thò Xuân Liên, Virus học, Bài giảng sau đại học 2005.
6. Phạm Hoàng Phiệt, Diễn biến tự nhiên của nhiễm siêu vi viêm gan B mạn tính,
Sinh hoạt thường kỳ lần II Hội gan mật TP HCM, 1999.
7. Trương Bá Trung, Điều trò thêm Adefovir dipivoxyl trên bệnh nhân viêm gan B
kháng lamivudine, Hội nghò Tiếp cận đa phương với bệnh viêm gan virus B/C, TP
HCM 10/2006.

8. Cao Văn Viên, Bệnh viện Việt Đức, Những điều cần biết khi bò nhiễm viêm
gan B, vietduchospital.edu.vn.

Tài liệu Tiếng Anh:
9. Allen MI, Two sensitive PCR-based methods for detection of Hepatitis B virus
variants associated with reduced susceptibility to Lamivudine, Journal of Clinical
microbiology, 1999, p. 3338-3347.
10. Chang TT, Lai CT, Four years of lamivudine treatment in Chinese patients
with chronic hepatitis B, J. Gastroenterol Hepatol 2004;19:1276-1282.
11. Clavel F, Hance AJ, HIV drug resistance, N Engl J Med 2004; 350:1023-1035.
12. Dan Yang H, PCR restriction fragment length polymorphism in detection of
YMDD variants of viral polymerase in hepatitis B virus patients treated with
lamivudine, 2002.
13. Dary T., Michael Craig, Outcomes after HBV treatment failure due to
resistance, Clinical Care Options 2006.
14. Doo E., Liang TJ, Molecular anatomy and pathophysiologic implications of
drug resistance in hepatitis B virus infection, Gastroenterology 2001;120:1000-
1008.
15. Zoulim F., Hepatitis B virus resistance to antivirals, Inserm U271. 25.
Hepatology 2001; 34:1225-1241.
16. Zoulim F., Michael Craig, Tools for the assessment of HBV resistance in
clinical practice, Clinical Care Options, 3, 2006.
17. Tacke F., Hannover medical school, Basal core promoter and precore
mutations in the hepatitis B virus genome enhance replication efficacy of
lamivudine resistant mutants, 03/2004.
18. Gastroenterol 16, Washington D.C, 03/2001.
19. Geoffrey M., Michael Craig, Role of HBV DNA in patient management,
Clinical Care Options, 2, 2006.
20. George K.K, Michael Craig, Natural history of chronic HBV infection in
patients receiving anti-HBV therapy, Clinical Care Options, 6, 2006.

21. Gerald Y., Antonio Giulivi, Hepatitis B viral mutants and their relevance to the
health care system, 9, 2001.
22. Gish RG, Leung N, Safety and antiviral activity of emtricitabine (FTC) for the
treatment of chronic hepatitis B infection: a two-year study, J. Hepatol
Jul.2005;43(1): 60-68
23. Jake Liang T, Michael Craig, Summary of mutations associated with resistance
to HBV drugs, Clinical Care Options, 7, 2006.
24. Kakumu S., Prevalence of hepatitis B, hepatitis C and GB virus/ hepatitis G
virus in liver disease patients and in habitants in Ho Chi Minh City, VietNam, J
Med Virol 54, pp. 243-248.
25. Kenji Abe, Naoto Aiba, Complete nucleotide sequence of hepatitis B virus,
6/2003.
26. Kenji Abe, Tran Thien Tuan Huy, Characteristics of core promoter and precore
stop codon mutants of hepatitis B virus in Viet Nam, Journal of medical virology
2004,74:228-236.
27. Kenji Abe, Traàn Thieän Tuaán Huy, Molecular epidemiology of Hepatitis B and
C virus infection in Asia, Pediatrics International, 2004.
28. Lai CL, Dienstag J, Prevalence and clinical correlates YMDD variants during
lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B, Clin Infect Dis
2003;36:687-696.
29. Lai CL, Leung N, A 1-year trial of telbivudine, lamivudine, and the
combination in patients with Hepatitis B e antigen-positive chronic Hepatitis B,
Gastroenterology 2005;129:528-536.
30. Levine, 2002, Efficacies of entecavir against lamivudine-resistant Hepatitis B
virus replication and recombinant polymerases in vitro, Antimicrobial agents and
chemotherapy, Aug.2002, p.2525-2532.
31. Liaw YF, Chien RN, Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after
emergence of YMDD motif mutation during lamivudine therapy, Hepatology
1999,30:567-572.
32. Locarnini S, Molecular virology and the development of resistant mutants:

implications for therapy, Semin Liver Dis. 2005(suppl 1):9-19.
33. Locarnini S, Michael Craig, Assessing HBV virologic markers, Clinical Care
Options 2006.
34. Lok AS, Lai CL, Long-term safety of lamivudine treatment in patients with
chronic hepatitis B, Gastroenterology 2003; 125:1714-1722.
35. Maria H., Hepatitis B treatment – new directions for future therapy.
36. Melegan M., hepatitis B virus mutants associated with 3TC and famciclovir
administration are replication defective, Hepathology 27, pp628-633.
37. Meyer PR, Matsuura SE, Differential removal of thymidine nucleotide
analogues from blocked DNA chains by human immunodeficiency virus reverse
transcriptase in the presence of physiological concentrations of 2’-deoxynucleoside
triphosphates, Antimicrob Agents Chemother 2000; 44:3465-3472.
38. Naeger LK, Margot NA, Increased drug susceptibility of HIV-1 reverse
transcriptase mutants: analysis of enzyme processivity, chain-terminator removal
and viral replication, Antivirther 2001; 6:115-126.
39. Paul Martin, Michael Craig, Natural history of hepatitis B virus infection,
Clinical Care Options 2006.
40. Perrillo R., Hepatitis B – Treatment strategies for current available drugs,
Current hepatitis reports, Volume 2, Number 2, 05/2003.
41. Qi X, Ray AS, In vitro characterization of anti-HBV afficacy and intracellular
metabolism of tenofovir, J. Hepatol 2005; 42(suppl 2):A75.
42. Robinson W.S., Hepatitis B virus and hepatitis D virus – principles and practice
of infectious diseases, 1995, 1406-1428.
43. Schuurman R, Nijhuis M, Rapid changes in human immunodeficiency virus
type 1 RNA load and appearance of drug resistance virus populations in persons
treated with lamivudine (3TC), J Infect Dis 1995;171:1411-1419
44. Stephen Locarnini, Molecular virology and the development of resistant
mutants: implications for therapy, Liver disease 25, 2005.
45. Steven Han, UCLA Division of Digestive Diseases, Liver 411 Educational
articles, 2003.

46. Sugauchi F., Epidemiologic and virologic characteristic of hepatitis B virus
genotype B having the recombination with genotype C, Gastroenterology 2003,
124:925-932.
47. Sugauchi F., Hepatitis B virus of genotype B with or without recombination
with genotype C over the precore region plus the core gene, J Virol 2002, 76:5985-
5992.
48. Tanaka T., Okamoto H., Hepatitis B virus strains with mutations in the core
promoter, Hepatology 2001; 33:1527-1532.
49. Takahashi K., The precore/core mutant T
1762
A
1764
of hepatitis B virus: clinical
significance and an easy method for detection, 1995, J Hepatol. 2005, 43:60-66.
50. Tenny DJ., Levine SM., Clinical emergence of entercavir resistant hepatitis B
virus requires additional substitutions in virus already resistant to lamivudine,
Antimicrob Agents Chemother 2004;48:3498-3507.
51. Yuen MF, Sablon E, Factors associated with hepatitis B virus DNA
breakthrough in patients receving prolonged lamivudine therapy, Hepatology
2001;34:785-791.
52. Zarski 2004, Hepatitis B: Treatment strategies for current available drugs.
Josee Gauthier – Eric J. Bourne, Quantitation of hepatitis B viremia and
emergence of YMDD variants in patients with chronic hepatitis B treated with
lamivudine, The journal of infectious disease 1999, 180:1757-62.
53. World Health Organization Fact Sheet/204, Hepatitis B, 2000.
53. Kenji Abe, Characteristic of HBV in Ghana: Full length genome sequences
indicate the endemecity of Genotype E in West Africa, Journal of Medical
Virology 78, 2006, 178-184.

PHỤ LỤC:

Phụ lục 1: Kết quả đònh lượng HBV DNA so sánh

Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct
SQ Mean SD
Mean SD

C02 Standard 1 12.74 8.000 1.00E+08 1.00E+08 N/A
12.74 N/A
C03 Standard 2 19.59 6.000 1.00E+06 1.00E+06 N/A
19.59 N/A
C04 Standard 3 26.05 4.000 1.00E+04 1.00E+04 N/A
26.05 N/A
C05 Standard 4 33.14 2.000 1.00E+02 1.00E+02 N/A
33.14 N/A
D02 Unknown 1T 1 29.28 3.109 1.29E+03 1.29E+03 N/A
29.28 N/A
D03 Unknown 2T 2 28.41 3.365 2.32E+03 2.32E+03 N/A
28.41 N/A
D04 Unknown 3T 3 26.88 3.820 6.60E+03 6.60E+03 N/A
26.88 N/A
D05 Unknown 4T 4 23.85 4.714 5.18E+04 5.18E+04 N/A
23.85 N/A
D06 Unknown 5T 5 23.88 4.704 5.06E+04 5.06E+04 N/A
23.88 N/A
D07 Unknown 6T 6 23.54 4.811 5.24E+04 5.24E+04 N/A
23.54 N/A
D08 Unknown 7T 7 21.61 5.375 2.37E+05 2.37E+05 N/A
21.61 N/A

D09 Unknown 8T 8 22.95 4.980 9.54E+04 9.54E+04 N/A
22.95 N/A
D10 Unknown 9T 9 14.98 7.335 2.26E+07 2.26E+07 N/A
14.98 N/A
D11 Unknown 10T 10 15.39 7.214 1.64E+07 1.64E+07 N/A
15.39 N/A


E02 Unknown 1B 11 29.33 3.093 1.04E+03 1.04E+03 N/A
29.33 N/A
E03 Unknown 2B 12 29.14 3.151 1.42E+03 1.42E+03 N/A
29.14 N/A
E04 Unknown 3B 13 28.65 3.295 1.97E+03 1.97E+03 N/A
28.65 N/A
E05 Unknown 4B 14 26.08 4.055 1.13E+04 1.13E+04 N/A
26.08 N/A
E06 Unknown 5B 15 26.80 3.841 6.94E+03 6.94E+03 N/A
26.80 N/A
E07 Unknown 6B 16 23.60 4.699 4.49E+04 4.49E+04 N/A
23.60 N/A
E08 Unknown 7B 17 21.76 5.331 2.14E+05 2.14E+05 N/A
21.76 N/A
E09 Unknown 8B 18 24.62 4.487 3.07E+04 3.07E+04 N/A
24.62 N/A
E10 Unknown 9B 19 15.09 7.326 2.01E+07 2.01E+07 N/A
15.01 N/A
E11Unknown 10B 20 15.54 7.171 1.48E+07 1.48E+07 N/A

Mẫu 1T đến 10T: Mẫu theo thứ tự 1 đến 10, tách chiết bằng phương pháp Tủa
Mẫu 1B đến 10B: Mẫu theo thứ tự 1 đến 10, tách chiết bằng phương pháp Boom

Phụ lục 2: Đối chiếu kết quả giải trình tự và kết quả PCR-RFLP phân tích đột
biến Basal core promoter

Kí
hiệu
Trình tự gen hoang dại
(1758-TTAAAGGTCT-1767)
Kết quả
giải trình
Kết quả
PCR-RFLP
Kết luận
mẫu tự gen

BCP01
BCP02
BCP03
BCP04
BCP05
BCP06
BCP07
BCP08
BCP09
BCP10
BCP11
BCP12
BCP13

-TTAAAGGTCT-
-TTAATGATCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAAAGGTCT-
-TTAATGATCT-
-TTAATGATCT-


Hoang dại
T
1762
A
1764
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại

T
1762
A
1764
T
1762
A
1764

Hoang dại
T
1762
A
1764
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
Hoang dại
T
1762
A
1764
T
1762
A

1764

Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp


Phụ lục 3: Một số kết quả đối chiếu giữa giải trình tự và PCR-RFLP
phân tích tại codon rt180

Kí
hiệu
mẫu
Trình tự gen hoang dại
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT
(Pol nu seq 657 676)

Kết quả
giải trình
tự gen

Kết quả
PCR-RFLP
Kết luận

KL01
KL02

CAGTCCGTTTCTCCATGGCT
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT

180 LỈM
180wt

180 LỈM
180wt

Phù hợp
Phù hợp
KL04
KL05
KL06
KL07
KL08
KL09
KL12
KL13
KL15
KL16
KL17
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT

CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT
CAGTCCGTTTCTCCATGGCT
CAGTCCGTTTCTCCATGGCT
CAGTCCGTTTCTCCATGGCT
CAGTCCGTTTCTC
CATGGCT
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT
CAGTCCGTTTCTC
CATGGCT
CAGTCCGTTTCTCCTTGGCT

180wt
180wt
180wt
180 LỈM
180wt
180 LỈM
180 LỈM
180 LỈM
180wt
180 LỈM
180wt

180wt
180wt
180wt
180 LỈM
180wt

180 LỈM
180 LỈM
180 LỈM
180wt
180 LỈM
180wt

Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp


Phụ lục 4: Một số kết quả đối chiếu giữa giải trình tự và PCR-RFLP
phân tích tại codon rt204

Kí
hiệu
mẫu
Trình tự gen hoang dại
GGCTTTCAGTCATATGGATGAT
(Pol nu seq 729 750)

Kết quả
giải trình
tự genï
Kết quả
PCR-
RFLP
Kết luận

KL01
KL02
KL04

KL05


GGCTTTCAGT
CATGTGGATGAT
GGCTTTCAGTCATATTGATGAT
GGCTTTCAGTCATATGGATGAT
(thiếu dạng đột biến 204 MỈV)
GGCTTTCAGT
CATATGGATGAT
(thiếu dạng đột biến 204 MỈV)

204 MỈV
204 MỈI
204wt

204wt

204 MỈV
204 MỈI
204wt
204 MỈV
204wt
204 MỈV

Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
(thiếu V)
Phù hợp
(thiếu V)
KL06
KL07
KL08
KL09
KL12
KL13
KL15
KL16
KL17

GGCTTTCAGTCATATTGATGAT
GGCTTTCAGTCATGTGGATGAT
GGCTTTCAGTCATATTGATGAT
GGCTTTCAGTCATGTGGATGAT
GGCTTTCAGTCATATTGATGAT
GGCTTTCAGTCATGTGGATGAT

GGCTTTCAGTCATATTGATGAT
GGCTTTCAGT
CATGTGGATGAT
GGCTTTCAGTCATATGGATGAT

204 MỈI
204 MỈV
204 MỈV
204 MỈV
204 MỈI
204 MỈV
204 MỈV
204 MỈV
204wt

204 MỈI
204 MỈV
204 MỈI
204 MỈV
204 MỈI
204 MỈV
204 MỈI
204 MỈV
204wt

Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp

Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp
Phù hợp

Phụ lục 5: Một trình tự bộ gen của HBV dùng để so sánh

AUTHORS Takahashi,K., Brotman,B., Usuda,S., Mishiro,S. and Prince,A.M.
TITLE Full-genome sequence analyses of hepatitis B virus (HBV) strains
recovered from chimpanzees infected in the wild: implications for
an origin of HBV
JOURNAL Virology 267 (1), 58-64 (2000)
MEDLINE 20115968
REFERENCE 2 (bases 1 to 3182)
AUTHORS Mishiro,S.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (16-SEP-1999) Shunji Mishiro, Toshiba General Hospital,
Department of Medical Sciences; 6-3-22 Higashi Oh-i, Shinagawa,
Tokyo 140-8522, Japan (E-mail:)

ORIGIN
1 aactccacaa cattccacca agctctgcta gaccccagag taaggggcct atactttcct
61 gctggtggct ccagttccgg aacagtaaac cctgttccga ctactgcctc acccatatcg
121 tcaatcttct cgaggactgg ggaccctgca ccgaacatgg agaacacaac atcaggattc
181 ctaggacccc tgctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata
241 ccacagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggagc acccacgtgt
301 cctggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcttg tcctccaatt
361 tgtcctggct atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tattcctctt catcctgctg
421 ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactaccaag gtatgttgcc cgtttgtcct
481 ctacttccag gaacatcaac taccagcacg ggaccatgca agacctgcac gattcctgct

541 caaggcacct ctatgtttcc ctcttgttgc tgtacaaaac cttcggacgg aaactgcact
601 tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc gcaagattcc tatgggagtg ggcctcagtc
661 cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc
721 actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacaacatc
781 ttgaatccct ttttacctct attaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttgaacc
841 ctaataaaac caaacgttgg ggctactccc ttaacttcat gggatatgta attggaagtt
901 ggggtacttt accgcaagac catattatac taaaactcaa gcaatgtttt cgaaaactgc
961 ctgtaaatag acctattgat tggaaagtat gtcagagaat tgtgggtctt ttgggctttg
1021 ctgccccttt tacacaatgt ggctatcctg ccttaatgcc tttatatgca tgcatacaat
1081 ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatatctga
1141 acctttaccc cgttgcccgg caacggtcag gtctctgcca agtgtttgct gacgcaaccc
1201 ccactggatg gggcttggct attggccatc gccgcatgcg tggaaccttt gtggctcctc
1261 tgccgatcca tactgcggaa ctcctagcag cttgttttgc tcgcagccgg tctggagcga
1321 aactgatcgg aacagacaac tctgttgttc tctctcggaa atacacctcc tttccatggc
1381 tgctagggtg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg
1441 cgctgaatcc cgcggacgac ccgtctcggg gccgtttggg tctctaccgt ccccttcttc
1501 atctgccgtt ccggccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggtctcc ccgtctgtgc
1561 cttctcatct gccggtccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac
1621 cgtgaacgcc caccaggtct tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc
1681 aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaagg actgggagga
1741 gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt
1801 ctgttcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcatg ttcatgtcct
1861 actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgacccgtat
1921 aaagaatttg gagcttctgt ggagttactc tcttttttgc cttctgactt ctttccttct
1981 attcgagatc tcctcgacac cgcttctgct ctgtatcggg aggccttaga gtctccggaa
2041 cattgttcac ctcaccatac agcactcagg caagctattc tgtgttgggg tgagttgatg
2101 aatctggcca cctgggtggg aagtaatttg gaagacccag catccaggga attagtagtc
2161 agctatgtca atgttaatat gggcctaaaa atcagacaac tactgtggtt tcacatttcc
2221 tgtcttactt ttggaagaga aactgttctt gagtatttgg tgtcttttgg agtgtggatt
2281 cgcactcctc ctgcttacag accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggaaact

2341 actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga
2401 aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtatccc
2461 ctggactcat aaggtgggaa actttactgg gctttattct tctactgtac ctgtctttaa
2521 tcctgagtgg caaactccct cctttcctca cattcattta caggaggaca ttattaatag
2581 atgtcaacaa tatgtgggcc ctcttacagt taatgaaaaa aggagattaa aattaattat
2641 gcctgctagg ttctatccta accttaccaa atatttgccc ttggacaaag gcattaaacc
2701 atattatcct gaacatgcag ttaatcatta cttcaaaact aggcattatt tacatactct
2761 gtggaaggct ggcattctat ataagagaga aactacacgc agcgcctcat tttgtgggtc
2821 accatattct tgggaacaag agctacagca tgggaggttg gtcttccaaa cctcgacaag
2881 gcatggggac aaatctttct gttcccaatc ctctgggatt ctttcccgat catcagttgg
2941 accctgcgtt cggagccaac tcaaacaatc cagattggga cttcaacccc aacaaggatc
3001 actggccaga ggcaaatcag gtaggagcgg gagcattcgg gccagggttc accccaccac
3061 gcggcggtct tttggggtgg agccctcagg ctcagggcac attgacaaca gtgccggtag
3121 cacctcctcc tgcctccacc aatcggcagt caggaagaca gcctactccc atctctccac
3181 ctctaagaga cagtcatcct caggccatgc agtgg
BÁO CÁO NGHIỆM THU
Tên đề tài: “ SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH
ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE
PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B ”

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Chí Vinh
Cơ quan công tác: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Đại học Y dược TP.HCM
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng, từ tháng 9/2006 đến tháng 9/2007, gia hạn
đến hết tháng 2/2008.
Kinh phí được duyệt: 50.000.000 đồng (Năm mươi triệu đồng).
Kinh phí đã cấp: 50.000.000 đồng (Năm mươi triệu đồng).
Mục tiêu: Xây dựng 2 quy trình cải tiến trên cơ sở quy trình của Allen MI và K.
Takahashi, ứng dụng 2 quy trình cải tiến trên huyết thanh bệnh nhân để xác đònh:
- Đột biến kháng lamivudine

- Đột biến Basal core promoter
Nội dung: Đề tài đạt được các nội dung như đã đăng ký.
Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện
Tạo vật liệu cho quy trình Đã tạo được:
- Sản phẩm PCR chứng dương của đột biến
kháng lamivudine (rt180, rt204)
- Sản phẩm PCR chứng dương của đột biến
Basal core promoter (1762/1764)
- Plasmid lưu trữ các dạng cơ bản của đột
biến kháng lamivudine.
Thử nghiệm thay đổi một số yếu tố Đã thực hiện các cải tiến:
- Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa thay
cho phương pháp Boom
- Nested – PCR thay cho PCR 1 bước
- Phản ứng ủ thích hợp cho các enzyme giới
hạn
- Điện di microfluidic thay cho điện di
agarose 3%

Thử khả năng phát hiện đột biến
trong huyết thanh có hỗn hợp HBV
hoang dại và đột biến. Mục tiêu là
phát hiện được đột biến ở tỉ lệ 30%.



Xây dựng quy trình kháng
lamivudine có độ nhạy 10
3
-10

4
bản
sao/ml
Khảo sát khả năng phát hiện đột biến trong
huyết thanh có hỗn hợp HBV đột biến và
hoang dại. Khẳng đònh quy trình có thể xác
đònh đột biến trong huyết thanh hỗn hợp với
tỉ lệ 10% đột biến (đối với ĐB kháng
lamivudine) và 30% đột biến (đối với ĐB
Basal core promoter)
Đã xây dựng được quy trình kháng
lamivudine có độ nhạy 6.25x10
2
bản sao/ml
Ứng dụng 2 quy trình đã được cải
tiến: Số lượng mẫu dự kiến gồm 30
mẫu kháng lamivudine và 30 mẫu
Basal core promoter (số mẫu cho
mỗi loại có thể thay đổi theo sự chỉ
đònh xét nghiệm của bác só điều trò).

- Đã ứng dụng 2 quy trình cải tiến trên tổng
số 127 mẫu huyết thanh bệnh nhân, gồm:
* 102 mẫu kháng lamivudine
* 25 mẫu Basal core promoter