nghiên cứu ứng dụng multiplex pcr phát hiện sự hiện diện của e-coli và s.aureus mang gen sinh độc tố trong thức ăn nhanh tại tp.hcm

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHKT TRẺ
#  "





BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NCKH





NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MULTIPLEX PCR
PHÁT HIỆN SỰ HIỆN DIỆN CỦA E.COLI,
S.AUREUS MANG GEN SINH ĐỘC TỐ TRONG
THỨC ĂN NHANH TẠI TP.HCM






Chủ nhiệm đề tài : ThS. Diệp Thế Tài




Cơ quan chủ trì : Sở Khoa học – Công nghệ TP.HCM

TP. HCM - 7 / 2007


BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NCKH






NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MULTIPLEX PCR
PHÁT HIỆN SỰ HIỆN DIỆN CỦA E.COLI,
S.AUREUS MANG GEN SINH ĐỘC TỐ TRONG
THỨC ĂN NHANH TẠI TP.HCM

( Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu )





Chủ nhiệm đề tài : ThS. Diệp Thế Tài

DANH SÁCH CỘNG TÁC VIÊN

1. PGS. TS. Trương Thò Xuân Liên
2. ThS. Phẩm Minh Thu
3. BS. Nguyễn Thò Phương Lan
4. Th.S. Trần Chí Thành
5. CN. Nguyễn Thò Nguyệt

LỜI MỞ ĐẦU
An toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng đối với sức khỏe con người và ảnh
hưởng đến đời sống của toàn xã hội. Trong số những vụ ngộ độc do tác nhân vi
khuẩn, Staphylococcus aureus, Salmonella, E.coli là những tác nhân chiếm đa số.
Trong quá trình trao đổi chất, các vi khuẩn này tiết ra các độc tố gây ngộ độc cho
người, ví dụ nhự S.aureus chỉ cần một lượng nhỏ độc tố < 1 µg là có thể gây độc cho
người.
Hiện nay, các phương pháp xác đònh vi khuẩn hiện diện trong thực phẩm,
thường mất nhiều thời gian. Mặt khác, khi những thực phẩm đã được xử lý, bằng
phương pháp nuôi cấy khó xác đònh được sự hiện diện của chúng. Tuy nhiên, độc tố
do vi khuẩn tiết ra vẫn còn hiện diện trong thực phẩm, đặc biệt là các độc tố bền
với nhiệt, chúng không bò nhiệt phân hủy nên khả năng gây bệnh cho người vẫn còn
rất cao.
Gần đây, Becker và cộng sự đã dùng multiplex PCR để phát hiện các nhóm
gen mã hoá độc tố cuả Staphylococcus. Mehrotra và cộng sự cũng dùng mutiplex
PCR để phát hiện các gen mã hoá độc tố cuả Staphylococcus aureus. (11). Luca
Cocolin và cộng sự (2000), cũng cho rằng dùng kỹ thuật multiplex PCR để khuyếch
đại các gen mã hoá các độc tố khác nhau cuả vi khuẩn bằng những mồi chuyên biệt
là một đònh hướng tốt cho việc phát hiện các chủng vi khuẩn mang gen gây bệnh

trong thực phẩm.
Tại Việt nam, việc phát hiện các chủng E.coli và S.aureus mang gen sinh
độc tố còn chưa được quan tâm nhiều. Và tỷ lệ hiện diện cuả các chủng này trong
thực phẩm là bao nhiêu vẫn còn là một câu hỏi. Vì vậy, đề tài nghiên cứu ứng dụng
multiplex PCR phát hiện các gen mã hoá độc tố E.coli, S.aureus nhằm mục tiêu:
1. Xâây dựng qui trình phát hiện E.coli và S.aureus mang gen mã hóa độc tố
2. p dụng qui trình này phát hiện trực tiếp E.coli và S.aureus trong thức ăn
nhanh tại Tp.HCM.

1
Thông qua việc tìm hiểu này, chúng tôi có thể đưa ra những cảnh báo về độ
an toàn của thức ăn nhanh, nhằm góp phần hạn chế những tác hại do thực phẩm
không an toàn gây ảnh hưởng đến cộng đồng.

2










TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

3
I. TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM:
I.1.
Trên thế giới:
Vệ sinh an toàn thực phẩm là một vấn đề liên quan đến sức khoẻ cộng đồng.
Trong những năm gần đây, ngộ độc thực phẩm có xu hướng ngày càng gia tăng.
Ngay cả những nước đã phát triển như Mỹ, Nhật, Pháp, các bệnh do ngộ độc thực
phẩm gây ra ảnh hưởng nhiều đến sức khoẻ cộng đồng. Số ca ngộ độc thực phẩm và
các tác nhân gây ngộ độc có sự khác biệt giữa vùng và khu vực.
Theo ước tính cuả tổ chức Food and drug Administration, Center for Food
Safety & Applied Nutrition, hằng năm ở Mỹ có 76 triệu người nhiễm bệnh, 325
người nhập viện, và số ca tử vong do ngộ độc thực phẩm khoảng 5200 ca.
Ở Pháp, số người nhiễm bệnh do ngộ độc thực phẩm cũng chiếm khoảng
17.378 người, và theo số liệu thống kê từ các ca ngộ độc do Staphylococcus trong 2
năm 1999 – 2000, các sản phẩm từ sữa đặc biệt là pho mát chiếm 32%, các sản
phẩm từ thòt chiếm 22%, trứng và các sản phẩm từ trứng chiếm 11% ( Haeghebaert
và cộng sự 2002).
Một nghiên cứu tại Cameroun với 400 mẫu bánh mì thòt lấy từ 200 điểm bán
hàng trên đường phố có kết quả là 79,5% mẫu không đạt tiêu chuẩn vi sinh. Trong
đó nhiễm 76,5% Coliformes, 69,25% E.coli, 21,5% Staphylococcus aureus và 9,25%
Shigella, 4,75% Salmonella, 3,5% Bacillus cereu[18].
Ở Đài Loan, năm 1994 xảy ra 102 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.276 người
mắc, 42 vụ do Vibrio parahaemolyticus, 15 vụ do Staphylococcus aureus, 11 vụ do
Bacillus cereus, 6 vụ do Salmonella [18]

I.2. Tại Việt nam:
Tại Việt Nam, theo Cục vệ sinh an toàn thực phẩm : Năm 2001 có 231 vụ
ngộ độc với 3.036 người mắc và 61 người tử vong. Năm 2002 có 194 vụ ngộ độc với
4.694 người mắc và 69 người tử vong. Phân tích xét nghiệm cho thấy 50% các vụ

4
ngộ độc do nguyên nhân là thức ăn nhiễm khuẩn. Ước tính trung bình người dân và
nhà nước đã thiệt hại khoảng 500 tỷ đồng/năm để xử lý các vụ ngộ độc này.[3]
Số vụ Số người mắc Số tử vong
Năm 1999 327 7575 61
Năm 2000 213 4233 59
Năm 2001 245 3901 63
Năm 2002 194 4694 69
Năm 2003 238 6428 37
Năm 2004 145 3584 41
Năm 2005 141 4291 50
Đến tháng 10/2006 139 5564 49
Tổng cộng 1642 40.270 425
Bảng I.1: Tình hình ngộ độc thực phẩm (1999 – 2006) tại Việt Nam
(Theo cục quản lý chất lượng VSATTP)
Tại các khu vực của Việt Nam số ca ngộ độc thực phẩm xảy ra không đồng
đều giữa các năm và các tỉnh thành.
I.2.1. Khu vực miền Bắc, miền Trung, miền Nam:
Theo một nghiên cứu tại các chợ Hà Nội, nhìn chung 100% số mẫu thức ăn
bò nhiễm vi khuẩn hiếu khí, 80% số mẫu bò nhiễm coliform ở mức cao và không đạt
tiêu chuẩn cho phép. Có đến 28.6% số mẫu lòng lợn luộc và 16,1% số mẫu rau sống
đã nhiễm E.coli . [5]
Số ca ngộ độc thực phẩm cũng xảy ra ở các khu vực miền Trung và miền
Nam. Theo báo cáo bệnh truyền nhiễm của Viện Vệ sinh Dòch tễ Tây Nguyên
trong 3 năm từ 2001 đền 2003, cho thấy 39,9% số mẫu bò nhiễm vi sinh vật [8].

Tại Tiền Giang, số ca bệnh do ngộ độc thực phẩm là 3,43%, tỷ lệ chết là
1,2%, trong đó nguyên nhân chủ yếu do vi sinh vật chiếm 57,97%.[10]

I.2.2. Khu vực thành phố HCM:

5
I.2.2.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm:
Tại TP Hồ Chí Minh, theo báo cáo của Trung Tâm Y Tế Dự Phòng TP Hồ
Chí Minh cho thấy tình hình ngộ độc thực phẩm của thành phố khá biến động. Số ca
ngộ độc thực phẩm trước năm 2000 ở mức thấp, từ năm 2000 trở đi, số ca ngộ độc
thực phẩm có xu hướng gia tăng và các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh chiếm tỷ lệ
cao. Năm 1997 có 17/20 (85%) vụ ngộ độc do thức ăn, đồ uống bò nhiễm vi sinh vật
vơí 578 ngươì mắc, tương tự 1998 có 10/14 vụ (71%) với 634 người mắc, 1999 11/16
vụ ngộ độc do ăn uống (68%) với 578 người mắc, hầu hết các vụ ngộ độc xảy ra tại
các bếp ăn tập thể. Năm 2000 có 3/7 vụ ngộ độc do thức nhiễm khuẩn với 295

trường hợp. Từ năm 2002 đến 2004 đã có 77 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó phần
lớn nguyên nhân là do thức ăn bò nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ 66%[6]. Năm 2005 có
1396 người mắc và 3 ca tử vong và tính đến tháng 10 năm 2006, có 1029 người
mắc.


0
500
1000
1500
1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
Số người mắc
Số chết

Biểu đồ I.1: Tình hình ngộ độc thực phẩm tại tp.HCM trong 10 năm
I.2.2.2. Khu vực xảy ra ngộ độc:
Các khu vực xảy ra ngộ độc thường tập trung tại các quận ven trung tâm
thành phố như quận Bình thạnh, quận Gò vấp, quận Củ Chi, và các quận vừa thành
lập như quận 12, quận Tân Phú Các vụ ngộ độc thường xảy ra tại các bếp ăn tập

6
thể, khu công nghiệp và hộ gia đình , và số ca ngộ độc có người mắc trên 100
chiếm tỷ lệ cao.
Hình I.1: Đòa điểm xảy ra ngộ độc thực phẩm trong 3 năm gần đây (2004 - 2006).
II. ĐỘC TỐ CỦA CÁC VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM :[7]

II.1. Độc tố E.coli :[7 ]
E.coli là một trong số các tác nhân gây bệnh liên quan đến đường ruột.Tuy
nhiên, không phải Escherichia coli nào cũng gây bệnh, các chủng E.coli gây bệnh,
chúng thường tiết ra các độc tố ( Echeverria et al., 1989). Các nhóm độc tố E.coli
gây bệnh thường là EPEC, EHEC và ETEC (Levine, 1987). Dựa trên các nhân tố
độc lực người ta chia E.coli thành 5 nhóm khác nhau:
- Enteroaggregative ( EaggEC)
- Enterohemorrhagic (EHEC)
- Enteroinvasive ( EIEC)
- Enteropathogenic (EPEC)
- Enterotoxigenic (ETEC)

7
Mỗi loại E.coli tiết ra các độc tố khác nhau và có khả năng gây bệnh rất đa
dạng: tiêu chảy, viêm đường tiểu, viêm màng não…
II.1.1. Nhóm EaggEC :
Một số chủng có khả năng tạo độc tố bền với nhiệt enterotoxin (ST) (
Savarino S.J. 1993)
II.1.2. Nhóm EHEC:
Nhóm này có khả năng sinh ra độc tố Shiga (Shiga toxin). Độc tố này gồm
hai loại: verotoxin (SLT1) và verocytotoxin (SLT2). Hiện nay, hai độc tố này còn
được ký hiệu là St
x
1 và St
x
2. St
x
1 khác St
x
2 ở 3 nucleotit và một axit amin.
Đây là nhóm gây bệnh tiêu chảy xuất huyết. Chúng tiết ra các độc tố tế
bào được biết là giống độc tố Shiga vì độc tố này giống với độc tố do Shigella
dysenteriae tiết ra, độc tố còn được gọi là verotoxin 1 và 2. Khi bò nhiễm độc tố này
người bệnh có thể tử vong. Có hai loại độc tố thường gặp là stx1, stx2. Gen mã hoá
cho độc tố này hiện diện trên nhiễm sắc thể.

Hình I.2. Các gen mã hoá độc tố EHEC.

8
II.1.3. Nhóm EIEC:
Nhóm này không có khả năng tạo ra enterotoxin như ở ETEC, nhưng chúng
lại có khả năng phát triển rất nhanh và tạo ra enteroinvasive plasmid. Chúng

thường gây đau đầu, nôn mửa, ỉa chảy có đàm máu.
II.1.4. Nhóm EPEC:
Nhóm này cũng không có khả năng tạo ra enterotoxin, mặc dù chúng cũng
có khả năng gây bệnh cho người. Đặc biệt chúng cò khả năng gây bệnh cho trẻ em
dưới một tuổi.

Hình I.3.: Các gen mã hoá độc tố EPEC
II.1.5. Nhóm ETEC:
Chúng có khả năng tạo ra enterotoxin và có khả năng gây bệnh rất nặng ở
người. Độc tố của nhóm này rất nhạy cảm với nhiệt. Ngoài loại độc tố nhạy cảm với
nhiệt, chúng còn có khả năng tạo ra loại độc tố bền nhiệt.
ETEC là một nhóm E.coli gây bệnh tiêu chảy mất nước thường gặp ở trẻ em.
Chúng tiết ra hai loại độc tố ST ( độc tố bền với nhiệt) và LT ( độc tố không bền
với nhiệt). Những chủng E.coli gây bệnh này chúng có thể chỉ tạo ra một loại độc
tố LT, ST hoặc cả hai.


9
 Độc tố không bền với nhiệt:
LT là một loại độc tố oligomeric có cấu trúc và chức năng gần với độc tố của
Vibrio cholerae. Có hai nhóm độc tố LT chính, LT-1 và LT-2. LT-1 được tiết ra bởi
những chủng E.coli gây bệnh cho người và cả động vật. Còn LT-2 chỉ được phát
hiện trên những chủng gây bệnh cho động vật, hiếm khi phát hiện được trên người.
Gen mã hoá cho độc tố LT là elt hay etx, những gen này hiện diện trên plasmid.
 Độc tố bền với nhiệt :
Ngược với LT, ST là một loại độc tố nhỏ monomeric chứa nhiều cysteine,
thông qua những custeine này hình thành những cầu nối disulfide giúp cho các độc
tố này bền với nhiệt. Gen mã hoá cho độc tố này đa phần hiện diện trên plasmid,
nhưng một vài gen mã hoá cho độc tố này hiện diện trên transposons. Có hai loại
độc tố STa và STb. Nhóm STa chỉ gây bệnh cho người, còn STb thường gặp chủ

yếu trên động vật như heo.


Hình I.4. Cơ chế gây bệnh cuả nhóm ETEC
Sau khi bám vào màng tế bào chủ, các độc tố được hoạt hoá, và di chuyển
qua các tế bào thông qua hệ thống lưới golghi. Đích tác động cuả LT là adenylate

10
cyclase nằm bên trong tế bào thành ruột. Tiểu đơn vò A phân giải tạo thành hai tiểu
đơn vò A1 và A2. Tiểu phần A1 hoạt hoá ADP cuả protein G. Tiếp theo đó, protein
G hoạt hoá adenyl cyclase, làm gia tăng hoạt động cuả cAMP nội bào. cAMP là
một tín hiệu nội bào điều hoà những chất vẫn chuyển màng nội mô và những
enzyme khác cuả tế bào chủ. Gia tăng hoạt động cuả cAMp dẫn đến sự tiết các
anion Cl
-
và HCO
3
-
, giảm sự hấp thu Na
+
và Cl
-
.
Còn cơ chế hoạt động cuả ST thì ít được mô tả. Tuy nhiên, ST cũng bám vào
thụ thể GC-C trên màng và làm gia tăng hoạt động của cGMP,ø kết quả làm gia tăng
sự tiết dòch và giảm hấp thu NaCl.

II.2.Độc tố Staphylococcus aureus: [15,19]
Staphylococcus là loại cầu khuẩn gram dương. Các tế bào của chúng thường
liên kết với nhau thành hình chùm nho. Chúng tạo ra độc tố enterotoxin. Hiện nay,

9 loại enterotoxin của Staphylococcus đã được nghiên cứu đầy đủ. Enterotoxin của
tụ cầu là loại chòu nhiệt.
S.aureus là một trong số các tác nhân thường gặp trong các vụ ngộ độc thực
phẩm. Trong quá trình trao đổi chất, chúng tiết ra độc tố và gây ngộ độc cho người.
Độc tố enterotoxin cuả S.aureus được chia thành 7 loại : SEA, SEB, SEC, SED,
SEE ( Su YC et al., 1997). Phần lớn, các độc tố của S.aureus là độc tố bền nhiệt,
không bò phá hủy trong quá trình chế biến thực phẩm ( Tortora GJ, 1995). Trong số
các loại độc tố trên thì SEA, SEB, SECs là những loại độc tố thường gặp.

II.2.1 Độc tố :
II.2.1.1 Độc tố bề mặt:
Gồm các loại độc tố staphylosin (gồm α-hemolysin và β-hemolysin) ,
leukocidin, protein A, polysacharide vỏ.
• α-hemolysin
Đây là một loại độc tố phá màng. Độc tố là một monomer kết hợp với màng
của những tế bào dễ bò độc. Ở người, tiểu cầu và bạch cầu đơn bào nhạy với α-

11
toxin. Những tế bào dễ bò độc có một thụ thể chuyên biệt cho α toxin và cho phép
độc tố kết hợp tạo ra những lỗ nhỏ cho những ion đơn hoá trò đi qua. Do đó, cách
thức hoạt động của α toxin là phá hủy tính thấm chọn lọc của tế bào.
• β-hemolysin
Đây là enzyme sphingomyelinase phá những màng có nhiều loại lipid.
• Leukocidin:
Leukocidin là một phức hợp protein được tạo thành từ nhiều thành phần riêng
biệt và cùng hoạt động với nhau để phá màng. Leukocidin ít độc hơn α toxin. Đây
là một nhân tố rất quan trọng trong sự xâm nhiễm da bò hoại tử.
Ngoài ra, leukocidin là một độc tố có chức năng diệt bạch cầu đa nhân và
chống lại sự thực bào của vật chủ và giúp cho sự xâm nhiễm của S.aureus dễ dàng
hơn.

• Protein A :
Protein A là một protein bề mặt của S.aureus có khả năng liên kết với phân tử
IgG gần vùng Fc. IgG là kháng thể của vật chủ, có nhiều nhất trong huyết tương
gắn được với bổ thể và có thể trung hoà độc tố. Trong huyết tương, vi khuẩn sẽ kết
hợp những phân tử IgG với sự đònh hướng sai trên bề mặt của kháng thể này và điều
này phá vỡ sự thực bào của vật chủ. Những đột biến mất protein A làm thực bào
hiệu quả hơn và giảm sự nhiễm độc tố.
• Polysaccharide vỏ
Polysaccharide vỏ đặc trưng của S.aureus là polysaccharide A. Polysaccharide
A có tính kháng nguyên và được phân biệt với polysaccharide B của S. albus ( loài
không gây bệnh) bằng phản ứng miễn dòch. Chức năng của vỏ trong việc gây độc
không hoàn toàn rõ nhưng nó có chức năng ngăn cản sự thực bào.




12
II.2.1.2 Độc tố gây triệu chứng:
• Độc tố Exfoliatin (ET):
Exfoliatin là độc tố kết hợp với hội chứng làm bỏng da, gây ra sự phân tách
bên trong biểu bì giữa những lớp tế bào đang sống và những tế bào chết ở bề mặt
tạo ra các vết bỏng.
• Độc tố đường ruột enterotoxin và đặc điểm của nó:
Độc tố enterotoxin là những protein ngắn do S.aureus tiết vào trong môi trường
và là nguyên nhân chủ yếu trong các vụ ngộ độc thực phẩm gây ra bởi vi khuẩn này.
Hiện nay, ngươi ta đã ghi nhận được 14 loại ngoại độc tố khác nhau gồm
SEA, SEB, SEC, SED, SEG, SEH… SEO. Trong đó, các độc tố gây ngộ độc thường
gặp là SEA, SEB, SEC… Các độc tố có chung những đặc điểm về cấu trúc và trình
tự acid amin. Mỗi loại độc tố được mã hoá bởi một gen khác nhau và mức độ gây
độc của các loại độc tố là khác nhau.

Ngoại độc tố có tính chòu nhiệt cao và khả năng chòu nhiệt của chúng trong
thực phẩm cao hơn trong môi trường nuôi cấy phòng thí nghiệm, các xử lý nhiệt qua
chế biến thực phẩm thông thường không thể phá hủy được các độc tố.
Ngoại độc tố hoà tan được trong nước và trong dung dòch muối, đặc điểm này
giúp độc tố có thể nhiễm đựơc vào nhiều loại thực phẩm khác nhau. Ngoại độc tố
có tính ổn đònh cao, kháng với hầu hết các enzyme tiêu hoá như pepsin hay trypsin
và vì vậy nó có thể duy trì đựơc hoạt động của nó trong hệ thống tiêu hoá của vật
chủ.
• Độc tố gây hội chứng shock TSST - 1:
S.aureus sản xuất độc tố TSST-1 gây ra hội chứng sốc do độc tố. Biểu hiện
của hội chứng diễn ra một cách có hệ thống. Đầu tiên, độc tố gây sốt nhanh, nôn
mửa và tiêu chảy. Sau đó là đau họng, đau cơ và phát ban rồi tróc da nhất là trong
lòng bàn tay và bàn chân. Huyết áp tăng đột ngột dẫn đến tr tim. Hội chứng sốc

13
do độc tố có thể xảy ra ngay sau sự xâm nhiễm S.aureus nếu độc tố được phóng
thích với số lượng lớn và cơ thể thiếu kháng thể.

Hình I.5. Cơ chế hoạt động của enterotoxin:
Độc tố có thể hoạt động theo hai dạng khác nhau là hoạt động sinh học và
hoạt động miễn dòch. Hai phương thức hoạt động này là hai chức năng riêng bòêt
được đònh vò trên những chuỗi khác nhau của protein độc tố. Hầu hết các trường hợp
đột biến gen dẫn đến mất hoạt động miễn dòch thì cũng dẫn đến mất hoạt động sinh
học và ngược lại.

Hoạt động miễn dịch :
Sau khi độc tố vào máu thi hoạt động như một siêu kháng nguyên, siêu kháng
nguyên không phải là một kháng nguyên thực sự vì nó không gây đáp ứng miễn
dòch một cách bình thường.
Kháng nguyên bình thường có khả năng liên kết một cách đặc hiệu với thụ thể

kháng nguyên của tế bào T (TCR) và phân tử nhóm phù hợp mô (MHC II) của tế
bào trình diện kháng nguyên APC.
Siêu kháng nguyên độc tố không được xử lý và trình diện như kháng nguyên
thông thường. Chúng có khả năng trực tiếp liên kết với phần ít biến đổi trên chuỗi

14
vβ ( không thuộc vò trí nhân diện kháng nguyên) của hai phân tử TCR và MHC II.
Do tính chất không đặc hiệu chặt chẽ này nên chúng hoạt hoá số lượng tế bào T và
tế bào trình diện kháng nguyên. Kết quả của việc hoạt hoá này là sản xuất hàng loạt
cytokin như IL-1, TNF, IL -2… gây ra hôi chứng nhiễm độc thức ăn như sốt, nôn
mữa…

Hình I.6. Hoạt động miễn dòch

Hoạt động sinh học:
Hoạt động sinh học gây ra các triệu chứng bìnht hướng của ngộ độc thực
phẩm là nôn, mửa, tiêu chảy Cơ chế của hoạt động này là có thể do hậu quả của
hoạt động miễn dòch nói trên đồng thời có thể do ngoại độc tố tác động trực tiếp lên
màng ruột và dây thần kinh phế vò dẫn đến kích thích thành ruột gây tiêu chảy và
kích thích trung tâm gây nôn mửa.

III. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ E.COLI VÀ S.AUREUS:
III.1.
Xác đònh độc tố ruột (ETEC) của E.coli [16]
III.1.1
Phương pháp truyền thống:
Việc xác đònh chủng E.coli thường được dựa trên cơ sở phát hiện độc tố LT,
ST. Ban đầu ST được phát hiện bằng thử nghiệm thắt đoạn ruột thỏ. Nhưng đây là
phương pháp tốn kém và đã đựơc thay thế bằng phương pháp thử nghiệm tiêm độc
tố vào dạ dày chuột ổ. Phương pháp này đựơc xem là phương pháp chuẩn để phát

hiện Staphyloccocus trong nhiều năm.

15
Phương pháp truyền thống để phát hiện độc tố LT dựa trên việc nuôi tế bào
chuột tàu (CHO) hoặc tế bào thượng thận chuột Ý. Độc tố LT làm tế bào chuột Ý co
tròn và tế bào CHO bò kéo dài ra. Phát hiện độc tố nhờ sự quan sát hình dạng tế bào
nuôi.
Về sau, một vài phương pháp miễn dòch đã sử dụng để phát hiện độc tố ST,
LT bao gồm phương pháp phân tích miễn dòch phóng xạ và phương pháp hấp phụ
dùng men liên kết (ELISAs) hay còn gọi là phương pháp miễn dòch dùng men
(EIA). Đây là phương pháp đựơc dùng khá phổ biến trong các phòng thí nghiệm.
Phương pháp này dựa trên cơ sở sử dụng một thể tiếp hợp chứa kháng thể đặc hiệu
với một kháng nguyên và được gắn với một loại men nhất đònh. Men liên kết trong
thể tiếp hợp có tác dụng xúc tác cho một phản ứng hoá học, phản ứng này sinh ra
một sản phẩm có màu từ cơ chất không màu. Sản phẩm có màu này có thể phát
hiện bằng mát thường khi cần kết quả đònh tính hoặc có thể đo bằng quang phổ kế
hay khúc xạ kế khi cần kết quả đònh lượng.

III.1.2. Phương pháp chuẩn đoán phân tử:
ETEC là một trong những vi sinh vật gây bệnh đầu tiên được phát hiện bởi
việc sử dụng các phương pháp chẩn đoán phân tử. Năm 1982, người ta đã sử dụng
có hiệu quả các mẫu dò DNA để phát hiện gen mã hoá ST và LT trong mẫu phân
và mẫu môi trường bằng phương pháp lai phân tử. Kể từ đó, mặc dù có nhiều
phương pháp khác được đề nghò nhưng kỹ thuật phân tử vẫn thu hút sự quan tâm và
được sử dụng nhiều hơn. . Cơ sở của hiện tượng lai phân tử là sự tách rời hai mạch
đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ môi trường vượt quá nhiệt độ nóng chảy
(Tm) của phân tử và sự tái bắt cặp giữa các trình tự tương đồng sau đó. Một trong
hai trình tự bổ sung ( thường là trình tự đích, tức là trình tự cần tìm) được cố đònh
trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên mô hoặc tế bào. Sự lai phân tử xảy ra khi
các trình tự bổ sung gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp

hơn Tm ít nhất vài độ. Sự lai phân tử còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá

16
trình lai phân tử chòu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA trong môi
trường, nhiệt độ, thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi
trường. Tuy nhiên, việc sử dụng các mẫu dò để phát hiện các gen ST và LT gặp khó
khăn khi phát hiện ETEC hiện diện ở mức độ thấp và thời gian phát hiện vẫn dài.
Một phương pháp sử dụng phổ biến và có nhiều ưu điểm hơn là sử dụng phản
ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase ( polymerase chain reaction – PCR).
Phương pháp này đã khắc phục các hạn chế của việc sử dụng mẫu dò và nâng cao
hiệu quả của việc phát hiện ETEC. Đặc biệt phản ứng multiplex PCR có khả năng
phát hiện cùng lúc nhiều E.coli gây bệnh khác nhau.
III.2.
Xác đònh độc tố S.aureus:[11]
III.2.1
. Các phương pháp miễn dòch:
Những phương pháp hiện nay dùng để phát hiện ngoại độc tố enterotoxin
của S.aureus hầu hết là các phương pháp miễn dòch dựa trên nguyên tắc sử dụng
kháng thể đơn dòng và đa dòng như kỹ thuật miễn dòch phóng xạ (RIA), kỹ thuật
miễn dòch men (ELISA), và kỹ thuật ngưng kết…[20]
III.2.2.
Kỹ thuật miễn dòch men (ELISA):
ELISA là phương pháp được quan tâm nhiều trong số các phương pháp miễn
dòch do tính đơn giản và có thể sử dụng hầu hết cho các loại kháng nguyên với độ
nhạy và độ đặc hiệu cao.
Nguyên tắc kỹ thuật ELISA trong phát hiện độc tố là sử dụng kháng thể đặc
hiệu cho một loại độc tố của S.aureus hấp phụ lên giá thể rắn, sau đó bổ sung mẫu
thử nghiệm độc tố và một kháng thể thứ hai đặc hiệu với độc tố có gắn enzyme,
cuối cùng bổ sung cơ chất đặc hiệu cho enzyme, nếu có sự hiện diện của loại độc tố
cần phát hiện thì enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất tạo ra sản phẩm có

màu hay phát sáng [11].


17

Hình I.7.: Sơ đồ nguyên tắc phản ứng ELISA. [11]
Một sản phẩm ELISA đã được thương mại hóa là bột Kit TECRA
TM
có khả
năng phát hiện và đònh danh được các loại độc tố enterotoxin A, B, C, D, E của vi
khuẩn Staphylococcus aureus. [11]
III.2.3.
Kỹ thuật miễn dòch phóng xạ(RIA): [4]
Nguyên tắc kỹ thuật RIA gần giống như kỹ thuật ELISA nhưng kháng thể
phát hiện được đánh dấu phóng xạ và sự hiện diện của kháng nguyên độc tố được
phát hiện bằng tín hiệu phóng xạ.
III.2.4.
Kỹ thuật ngưng kết: [9]
* Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động ngược (RPHA):
Nguyên tắc của RPHA là kháng thể đặc hiệu được gắn với tế bào hồng cầu,
khi gặp kháng nguyên là độc tố cho phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên, kháng
thể xảy ra và có thể quan sát hiện tượng ngưng kết các hạt hồng cầu bằng mắt
thường.
Phương pháp này dễ thực hiện nhưng có nhiều trường hợp không cho phản
ứng đặc hiệu. Do đó, phương pháp được cải tiến bằng kỹ thuật RPLA.
* Kỹ thuật ngưng kết latex thụ động ngược (RPLA):
Nguyên tắc: kháng thể được gắn với giá thể rắn là các hạt latex bằng nhựa
polystyrene. Khi mẫu thử có kháng nguyên là độc tố cần phát hiện thì phản ứng
ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể gắn trên hạt latex xảy ra tạo nên đám
ngưng kết lớn.

18
Kỹ thuật này được thương mại hóa thành bộ Kit SET-RPLA. Đây là bộ Kit
được sử dụng để phát hiện các loại độc tố enterotoxin A, B, C, D của
Staphylococcus aureus trong nhiều loại thực phẩm.
* Ưu điểm và hạn chế của phương pháp miễn dòch:
- Ưu điểm:
- Các kỹ thuật miễn dòch được thương mại hóa thành các bộ Kit như SET-
RPLA, TECRA
TM
có khả năng phát hiện nhiều loại độc tố enterotoxin của
S.aureus với hiệu quả cao và ổn đònh.
- Phương pháp miễn dòch chỉ cần lượng ít mẫu thử thực phẩm nên có thể
tiết kiệm được thời gian và cho độ nhạy cao.
- Hạn chế:
Mặc dù các bộ Kit thương mại rất tiện lợi nhưng giá thành quá cao nên khó
thể áp dụng trên diện rộng.

IV. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SHPT PHÁT HIỆN E.COLI VÀ S.AUREUS:
IV.1.
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction)
Phương pháp miễn dòch với các bộ Kit thương mại cho hiệu quả ổn đònh
nhưng giá thành cao nên khó thể áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm vi
sinh. Trong khi đó, PCR không phải là phương pháp xác đònh trực tiếp độc tố
enterotoxin của S.aureus nhưng có khả năng phát hiện gen sinh độc tố mã hóa cho
các loại độc tố tương ứng. Mặt khác, hiện nay PCR là kỹ thuật sinh học phân tử
được áp dụng phổ biến và đem lại hiệu quả cao.
* Nguyên tắc: [4],[13]
Phương pháp tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của DNA polymerase và một cặp
mồi (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ sung với một trình tự DNA đích. Độ dài

đoạn DNA tổng hợp được giới hạn bởi hai đoạn mồi.
* Quy trình:

19
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
. Bước 1 (biến tính): phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn T
m
của
phân tử, thường là 94-95°C. Mạch đôi DNA đươc tách ra thành dạng mạch đơn.
Thời gian kéo dài từ 30-60 giây.
. Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp hơn T
m
của các mồi, cho phép các mồi
bắt cặp với mạch khuôn, thường nhiệt độ dao động trong 40 - 70°C tùy thuộc T
m
của
các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây.
. Bước 3 (kéo dài): nhiệt độ được tăng lên 72°C giúp cho DNA polymerase-
một enzyme chòu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này tùy
thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường từ 30 giây đến nhiều phút.


20


Hình I.8.: Sô ñoà phaûn öùng PCR[13]

21
Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần,
mỗi lần làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp

số nhân. Khoảng 30 - 40 chu kỳ sự khuếch đại sẽ cho ra 10
6
bản sao.
*Ưu điểm và nhược điểm: [13]
-Ưu điểm:
¾ Phát hiện gen sinh độc tố với một lượng mẫu nhỏ. Độ nhạy cao.
¾ Thời gian cho kết quả nhanh.
- Nhược điểm:
¾ Sự ức chế hoạt tính của Taq polymerase bởi thành phần của mẫu vật do
mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp.
¾ Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết, do
vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết.
Một giải pháp chung cho các nhược điểm trên là kết hợp một bước tăng sinh
ngắn và một bước ly tâm loại bỏ thành phần môi trường nuôi cấy tế bào trước khi
tiến hành PCR.

IV.2. PCR đa mồi (Multiplex PCR): [13]
-Nguyên tắc:
PCR đa mồi là kỹ thuật sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để nhân bản nhiều
đoạn DNA mục tiêu ở các vò trí khác nhau của bộ gen trong cùng một phản ứng
PCR.
-Ý nghóa của PCR đa mồi trong việc phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm:
Việc phát hiện các mầm bệnh vi sinh đơn lẻ trong thực phẩm bằng phương pháp
PCR thường gây tốn kém. Do đó, các nhà nghiên cứu đang tìm cách giảm chi phí và
thời gian bằng cách sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR gọi
là multiplex PCR để có thể phát hiện đồng thời nhiều vi sinh vật gây bệnh khác
nhau hoặc phát hiện đồng thời nhiều loại gen sinh độc tố của vi sinh vật gây bệnh.

22

VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP

















23