bài giảng thực hành hóa sinh môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
BÀI GIẢNG
THỰC HÀNH HÓA SINH MÔI TRƯỜNG
Người biên soạn: Phạm Thị Lan
Bộ môn: CNKTMT
Nha Trang, tháng 3 năm 2012
1
QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
I. An toàn khi làm việc với axit và kiềm
1. An toàn khi làm việc với axit:
Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng
với các hơi axit tự do. Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực
tiếp. Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng tay và kính
bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn. Luôn phải
đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng. H
2
SO
4
: Luôn cho acid vào nước khi
pha loãng, sử dụng khẩu trang và găng tay để tránh phòng khi văng acid. Các acid dạng
hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo hộ.
2. An toàn khi làm việc với kiềm
Kiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp. Mang găng tay
cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc. Thao tác trong tủ hút, mang
mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm. Amoniac: là một chất lỏng và khí rất
ăn da, mang găng tay cao su, khẩu trang, thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. Hơi amoniac
dễ cháy, phản ứng mạnh với chất oxy hoá, halogen, axit mạnh. Amoni hydroxyt: chất
lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kim loại nặng: Ag, Pb, Zn và muối của chúng.
Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO
2

, halogen, axit mạnh, dẫn
xuất clo của hydrocacbon. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. Cần mang dụng cụ bảo vệ da mắt.
Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate, cho vào từ từ. Tránh tạo tinh
thể cứng khi hoà tan. Tương tự khi hoà tan với nước, đồng thời phải làm lạnh nhanh.
Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ da mắt, đường hô hấp do
dễ nhiểm bụi oxit.
Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước. Các biện pháp an
toàn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại.
II. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm
1. Hoá chất thí nghiệm:
Các hoá chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, trong phòng
thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm.
Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na, MgO, NaOH, KCl, (CH
3
COO)
2
; lỏng
(H
2
SO
4
, aceton, ethanon, chloroform, ) hoặc khí (Cl
2
, NH
3
, N
2
, ) và mức độ tinh khiết
khác nhau:
- Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90%

- Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99%
- Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99%
Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu
khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu.
2
2. Nhãn hiệu hoá chất:
Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi
tên hoá chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng
phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản.
3. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất:
Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết
sức cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. Những điều
cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau:
- Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vô cơ,
muối, acid, bazơ, kim loại, ) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm.
- Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi
dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu.
- Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp, cổ
chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai.
- Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ
màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối.
- Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa
ngay, không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.
- Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. Khi cần
sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi, phải đưa vào tủ hút, chú ý đậy kín nắp sau khi
lấy hóa chất xong.
- Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi hay nếm thử
hóa chất.
- Khi làm việc với acid hay base mạnh:
Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào

acid hay base); Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như
ống bóp cao su.
Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết
bỏng NaHCO
3
1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH
3
COOH 1% (nếu bỏng base). Nếu bị
bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%. Trường hợp bị hóa chất vào miệng
hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệng và uống nước lạnh có MgO, nếu là base phải súc
miệng và uống nước lạnh có CH
3
COOH 1%.
3
BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM
HÓA SINH
I. Lý thuyết
1.1. Dung dịch
Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt
vật lý và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. Nếu chất hòa tan
ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. Tùy theo tính chất của
dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch khan. Phần lớn các dung dịch
acid, base, muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch nước, dùng dung môi là nước. Một
số chất khác tan trong dung môi hữu cơ. Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể
hiện ở nồng độ dung dịch. Có nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Mỗi cách sẽ tiện
dụng trong chuẩn bị, phân tích và tính toán khác nhau.
1.1.1. Các đơn vị nồng độ dung dịch
a) Nồng độ phần trăm (%)
i) Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g
dung dịch.

Ví dụ: dung dịch NH
4
Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH
4
Cl
ii) Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch.
Ví dụ: dung dịch CuSO
4
10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO
4
iii) Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml
dung dịch.
Ví dụ: dung dịch glycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerine.
b) Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch.
c) Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số
mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch KH
2
PO
4
M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam
KH
2
PO
4
d) Nồng độ đương lượng (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lit dung
dịch. Số đương lượng chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)
Hệ số đương lượng (z): phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất đó
tham gia.
i) Nếu phản ứng là phản ứng acid, base: z là số ion H

+
hay OH
-
mà 1 phân tử, ion của
chất đó tác dụng vừa đủ.
Ví dụ: Phản ứng giữa HCl và NaOH
H
2
SO
4
+ 2NaOH → Na
2
SO
4
+ 2H
2
O
H
2
SO
4
→ 2 H+
z = 2
4
NaOH → 1 OH
-
z = 1
ii) Nếu phản ứng là phản ứng ôxy – hóa khử: z là số electron mà 1 phân tử, ion của chất
đó cho hay nhận.
Ví dụ: 2 Na

2
S
2
O
3
+ I
2
→ Na
2
S
4
O
6
+ 2NaI
I + 1e → I
-
z = 1
S
2+
- 1e → S
+
z = 1
e) Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan có mặt trong
dung dịch.
f) Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng :
- Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch
- Miligam phần trăm, mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch.
- Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch.
- Phần nghìn,0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch.
- Phần triệu, ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch.

- Phần tỷ, ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch.
1.1.2. Cách pha dung dịch có nồng độ xác định
a) Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng, % (w/w)
i) Chất tan là chất rắn khan:
Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w)
100g dung dịch cần 40g NaOH
500g dung dịch cần X g?
Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g
Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml)
Vậy, cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất, hòa tan ta được 500g dung dịch
NaOH 40%
ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO
4
.5H
2
O; Na
2
HPO
4
.12H
2
O; )
Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn.
Ví dụ: Pha 320g dung dịch CuSO
4
10%(w/w) từ CuSO
4
.5H
2
O

M(CuSO
4
) = 160 và M(CuSO
4
.5H
2
O) = 250
Lượng CuSO
4
khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g
Lượng CuSO
4
.5H
2
O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g
Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml)
Vậy, cân 50g CuSO
4
.5H
2
O, đong 270ml nước cất, hòa tan ta được 320g dung dịch
CuSO
4
10%.
5
b) Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn:
Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10%
Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g
Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g
Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g

Vậy, đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%, hòa tan ta được 500g NaOH 5%
c) Pha dung dịch bão hoà:
Lấy chất tan cần pha vào becher, thêm một ít nước cất và khuấy cho tan. Nếu sau
khi khuấy, chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch
bão hòa. Nếu chất tan tan hết, thêm chất tan và tiếp tục khuấy, cứ như thế cho đến
khi chất tan không còn tan được nữa.
d) Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích
i) Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết, chuyển sang bình định mức,
dùng nước cất hòa tan và định mức đến thể tích đúng.
Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v)
Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g
Vậy, cân 50g NaCl, hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất, ta được 1 lít dung
dịch NaCl 5%.
ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO
4
.5H
2
O; Na
2
HPO
4
.12H
2
O; )
Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ở phần a.
iii) Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H
2
SO
4

Việc cân không thuận lợi, có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức
V = M/d
V: Thể tích chất lỏng; M: khối lượng chất lỏng cần cân; d: tỷ trọng chất lỏng
Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất mà là các
dung dịch đậm đặc. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và thay đổi tùy
theo loại hóa chất. Ví dụ như H
2
SO
4
: 95-98%; HCl: 37%. Do đó khi pha các dung dịch
từ các loại hóa chất này ta phải chú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc.
Ví dụ: Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml)
Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4,4g
Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4,4)/37 = 11,9g
= 11,9/1,19 = 10 ml
Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml
Vậy, dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl 37%, và 430ml nước cất ta được 440 ml
HCl 1%
6
Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí nghiệm
trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha
chế theo nồng độ khối lượng - thể tích (w/v).
e) Pha dung dịch nồng độ phân tử gam
i) Chất tan là chất rắn khan
Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó, ta tính khối lượng phân tử chất đó
(hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan, qua phễu cho vào bình
định mức có dung tích 1 lít. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ, lắc để hòa tan hoàn
toàn và đưa nước cất tới mức. Chuyển dung dịch sang bình chứa, lắc để trộn đều đồng
nhất.
Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thì

phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch
định mức.
Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch KOH 1M
Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56
Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g
Vậy, cân 56g KOH, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 1000. Đây là phản
ứng tỏa nhiệt, cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít. Nếu muốn pha
dung dịch 2M; 3M hay 0,1M; 0,05M ta cũng tiến hành tương tự với lượng cân tương ứng.
Ví dụ: Pha 500ml dung dịch KCl 3M
Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35,5 = 74,5
Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74,5 *3*500)/1000 = 111,75g
Vậy, cân 111,75g KCl, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 500, định mức
đến vạch.
ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước: khi tính lượng chất tan cần cân phải tính luôn cả
khối lượng các phân tử nước.
iii) Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào nồng độ
dung dịch đó.
Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37%
Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35,5 = 36,5
Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36,5*100)/37 = 98,65g
Hay 98,65/1,19 = 83ml
Vậy, đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước. Định mức thành
1 lít. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc hại.
Khi pha hóa chất, có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch không chính xác
như việc cân đong không chính xác, các hóa chất không tinh khiết hay bị hút ẩm. Thời
gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa, bị oxy hóa, dung môi bay hơi, vì vậy phải
7
kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung dịch có nồng độ chính
xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal)
a) Dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và được
dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. Các chất dùng trong
dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổi nhanh
chóng theo thời gian.
Pha dung dịch chuẩn, ta phải dùng ống chuẩn. Ống chuẩn là một ống ampun thủy
tinh hay nhựa đóng kín. Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc dung dịch
chất tan. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha thành 1 lít ta
được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống.
Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn :
- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng bình
tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm nước cất vừa lắc
và đưa nước cất tới vạch mức.
- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl, AgNO
3
, acid
oxalic, có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha, pha
loãng và định mức tới thể tích đúng.
- Đối với các chất như NaOH, HCl, không thể pha ngay được dung dịch chuẩn, do các
chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy sau khi pha phải hiệu
chỉnh lại nồng độ.
Ví dụ: NaOH thường nhiễm một lượng Na
2
CO
3
rất dễ chảy nước, HCl dễ bay hơi,
Na
2
S
2
O

3
dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí.
b) Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch có nồng
độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung
dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp.
Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0,1N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn H
2
SO
4
0,1N
để chuẩn độ lại.
Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lại phải xác
định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Xét một phản ứng trung hòa acid - base, 1 ion gam H
+
sẽ phản ứng với 1 ion gam OH
-
.
Do đó:
C1V1 = C2V2
Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta có hệ
số hiệu chỉnh K:
K= Cp/Ct = Vp/Vt
8
Ví dụ: Dung dịch chuẩn là H
2
SO
4
0,1N, dung dịch định pha là NaOH 0,1N.

Lấy 10ml H
2
SO
4
0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien, dùng
burette chuẩn độ bằng NaOH được 11 ml NaOH
Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0,1)/11 = 0,091 N
Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,91
1.2. Dung dịch đệm:
1.2.1. Định nghĩa dung dịch đệm
pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acid có
mạch nhánh phân ly (COO
-
và NH4+ tạo liên kết ion). Họat động tối ưu của protein phụ
thuộc vào cấu trúc không gian nhất định trong môi trường, nghĩa là phụ thuộc vào tỉ lệ
phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại là phụ thuộc vào pH môi trường.
Dung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắm khi một lượng nhỏ
acid (H
+
) hoặc base (OH
-
) được thêm vào. Như vậy, dung dịch đệm bao gồm một cặp
acid base liên hợp (acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu và muối của base
này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch.
Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số
phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau.
Thí dụ, để có đệm pH ở giá trị 4.75, chọn cặp acid – base CH
3
COOH
(0,1M)/CH

3
COONa (0,1M). Nếu thêm vào dung dịch 0.001 mol HCl thì pH của hệ vẫn
chỉ ở mức 4.748 gần bằng 4.75. Nghĩa là pH thay đổi rất ít.
Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng, ví dụ như ổn định pH
của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate. Về nguyên tắc thì phối hợp các loại
đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1 dung dịch là không có vấn đề gì. Tuy nhiên
sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm không
phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại. Các phản
ứng thường thấy là phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử.
Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Ví dụ: muối
natri acetate), dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau:
CH
3
COOH + H
2
O > CH3COO
-
+ H
3
O
+
Có dung dịch khác chẳng hạn, chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: ammoniac) với muối của
nó (Ví dụ: muối amoni clorua),trong dung dịch cân bằng có dạng sau:
NH
3
+ H
2
O > NH
4
+

+ OH
-
Dung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base. Khi
thêm một lượng acid mạnh (H
3
O
+
), base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu (cân
bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm không đáng kể. Trái lại,
khi thêm một lượng base mạnh (OH
-
), acid điện li cho H
3
O
+
(cân bằng chuyển dịch theo
9
chiều thuận), ion hidroni H
3
O
+
trung hòa OH
-
cho base yếu H2O. Kết quả pH của dung
dịch tăng không đáng kể.
III. Bài nộp
1. Ghi chép phương pháp pha các dung dịch thực chuẩn bị.
2. Làm các bài tập sau:
1. Pha 1 L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân … g NaOH khô
2. Pha 0,5 L dung dịch H2SO4 2M cần bao nhiêu ml H2SO4 đậm đặc, biết rằng H

2
SO
4
đđ
là acid 97% có M=98 g/mol, tỉ trọng d=1,84 g/ml.
Nồng độ mol của H2SO4 đđ là:
Thể tích H2SO4 cần sử dụng là:
Lượng nước cần bổ sung là :
3. Pha 250 ml dung dịch CuSO 4 1 M, cân …….g CuSO4.5H2O
4. Pha 1 L dung dịch H2SO4 0.1N từ dung dịch H2SO4 2M:
5. Pha 500 g dung dịch NaOH 10% từ dung dịch NaOH 40%
Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X =
Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y =
Lượng nước cất thêm vào:
6. Pha 500 ml dung dịch HCl 2% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml)
Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X=
Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y =
Lượng nước cất thêm vào:
10
Bài 2: Protein
1.1. Tính chất lưỡng tính của protein
1.1.1. Xác định điểm đẳng điện của casein
a. Nguyên tắc
b. Hóa chất, dụng cụ
CH
3
COOH 0.1N
Dung dịch casein 0.4% trong CH
3
COONa 0.1N

5 ống nghiệm cỡ >10ml đánh số thứ tự từ I – V
c. Tiến hành:
Số TT Số ml
CH
3
COOH
0.1N
Số ml nước Số ml
casein 0.4%
trong
CH
3
COOH
0.1N
pH Mức độ kết tủa
1
2
3
4
5
0.1
0.2
1
4
8
8.9
8.8
8.0
5
1

1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
5.6
5.3
4.7
4.1
3.8
d. Kết quả
Ghi mức độ kết tủa ở các ống, giá trị pI sẽ gần nhất với giá trị pH tại đó ống
nghiệm xuất hiện kết tủa nhiều nhất.
1.2. Tính chất keo của dung dịch protein
1.2.1. Phản ứng kết tủa thuận nghịch
- Kết tủa bằng muối trung tính
a. Nguyên tắc
Các muối này vừa có tác dụng trung hòa điện, vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phần tử
keo. Các protein khác nhau bị kết tủa ở các nồng độ muối khác nhau.
b. Hóa chất, dụng cụ
Lòng trắng trứng không pha loãng
(NH
4
)
2
SO
4
bão hòa
11
NaCl bão hòa

(NH
4
)
2
SO
4
tinh thể
Ống nghiệm sạch loại >10ml
c. Tiến hành
- Cho vào mỗi ống nghiệm
5ml lòng trắng trứng
5ml (NH
4
)
2
SO
4
bão hòa, lắc đều, xuất hiện kết tủa globulin
- Để 5 phút, lọc (thấm ướt trước giấy lọc bằng dung dịch (NH
4
)
2
SO
4
, thu kết tủa
globulin
- Cho tiếp 3g tinh thể (NH
4
)
2

SO
4
(cho 4ml), lắc, nhận được kết tủa albumin, lọc và
thu kết tủa.
d. Kết quả
Cho kết tủa vào các ống nghiệm, thêm nước cất vào các ống, quan sát sự hòa tan lại
kết tủa.
- Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
a. Nguyên tắc
Tiến hành kết tủa protein ở nhiệt độ thấp (0
o
C – 4
o
C) và lấy kết tủa nhanh ra khỏi
dung môi, protein sẽ không bị biến tính. Nếu ở nhiệt độ cao hơn (20-30
o
C) và giữ lâu kết
tủa trong dung môi hữu cơ, protein bị biến tính.
b. Hóa chất và dụng cụ
ống nghiệm
Dung dịch lòng trắng trứng 1%
Etanol 96%
Axeton
NaCl bão hòa
c. Tiến hành
- Lấy 2 ống nghiệm, cho vào 1ml lòng trắng trứng, làm lạnh trong nước đá.
Thêm vào ống 1: 2ml etanol 96% lạnh
Thêm vào ống 2: 2ml axeton lạnh, quan sát
- Cho thêm vào 2 ống vài giọt dung dịch NaCl bão hòa, kết tủa lắng nhanh hơn.
d. Kết quả

- Để lắng kết tủa, gạn dung môi, hòa tan lại kết tủa trong nước.
- Làm lại ở nhiệt độ phòng (20-30
o
C), quan sát và so sánh kết quả.
12
1.2.2. Biến tính protein
Biến tính chỉ trạng thái biến đổi cấu trúc bậc cao của phân tử protein, dẫn đến sự
thay đổi các tính chất của protein như tính tan, hoạt tính sinh học… Khi biến tính, protein
thường đông tụ thành dạng keo không hòa tan.
- Tác dụng ở nhiệt độ cao
a. Nguyên tắc
b. Hóa chất, dụng cụ
Ống nghiệm sạch V>5ml
Giấy lọc
Dung dịch lòng trắng trứng 5% đã được lọc qua giấy lọc nhiều lần
CH3COOH 1% và 10%
NaOH 10%
NaCl bão hòa
c. Tiến hành
Cho vào 5 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5%
Ống I: đun và quan sát kết tủa xuất hiện
Ống II: 1 giọt axit acetic 1% và đun. Kết tủa hình thành nhiều và nhanh hơn
Ống III: 0.5ml axit axetic 10%; ống IV: 0.5ml NaOH 10%. Đun và quan sát thấy kết
tủa không hình thành cả khi đun và sôi
Ống V: 0.5ml axit axetic 10% và 3-4 giọt NaCl bão hòa. Đun và quan sát kết tủa xuất
hiện nhanh và mạnh.
d. Kết quả
So sánh và giải thích kết quả tạo thành
- Kết tủa protein bằng axit vô cơ đặc
a. Nguyên tắc

b. Hóa chất, dụng cụ
Dung dịch lòng trắng trứng 5%, HNO
3
đặc
c. Tiến hành
- Cho vào ống nghiệm 1ml HNO
3
đặc, cầm nghiêng ống nghiệm, nhỏ cẩn thận theo
thành ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5%. Ở bề mặt tiếp xúc thấy xuất hiện kết tủa
protein
d. Kết quả
Giải thích kết quả tạo thành kết tủa.
13
- Kết tủa bằng axit hữu cơ (TCA)
a. Nguyên tắc
b. Hóa chất, dụng cụ
Ống nghiệm sạch V>5ml
Dung dịch lòng trắng trứng 5%
TCA 10%
c. Tiến hành
Cho vào ống nghiệm
1ml dung dịch lòng trắng trứng 5%, thêm 5-6 giọt axit axit tricloaxetic 10%. Kết tủa
xuất hiện.
d. Kết quả
Giải thích kết quả tạo thành
- Kết tủa bằng muối kim loại nặng
a. Nguyên tắc
b. Hóa chất, dụng cụ
Dung dịch lòng trắng trứng 5%
FeCl

3
5%
Pb(CH
3
COO)
2
5%
CuSO
4
7%
c. Tiến hành
Cho vào 3 ống nghiệm 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5%
Thêm vào ống I: 1 giọt dung dịch FeCl
3
5%
Ống II: 1 giọt chì axetat 5%
Ống III: 1 giọt CuSO
4
7%
Quan sát, thêm 1 lượng muối kim loại nặng tương ứng vào từng ống, kết tủa tan.
d. Kết quả
So sánh và giải thích kết quả thu được ở các ống.
Bảng tóm tắt các phản ứng kết tủa protein
TT Tên yếu tố làm kết
tủa protein
Hóa chất Màu của kết
tủa
Ghi chú
1 Muối trung tính
2 Nhiệt độ

3 Dung môi hữu cơ
4 Axit vô cơ
14
5 Axit hữu cơ
6 Muối kim loại nặng
1.3. Các phản ứng màu của axit amin và protein
1.3.1. Phản ứng biure
a. Nguyên tắc
Phản ứng đặc trưng của liên kết peptit: trong môi trường kiềm, các hợp chất có từ 2
liên kết peptit trở lên có thể phản ứng với CuSO
4
tạo thành phức chất màu xanh tím đến
màu đỏ tùy thuộc vào số lượng liên kết peptit ít hay nhiều. Vì màu của phức chất giống
nhau ở tất cả các protein nên khi đo độ hấp thụ phức màu ở bước sóng 540nm trên máy
so màu, so sánh với đường chuẩn của protein chuẩn thì có thể định lượng được protein
tổng số.
b. Hóa chất, dụng cụ
Dung dịch lòng trắng trứng 1%
Ure tinh thể
NaOH 10%
CuSO4 1%
c. Tiến hành
- Phản ứng với biure:
+ Bỏ 1 lượng tinh thể ure vào ống nghiệm khô, đun trên ngọn lửa yếu, ure nóng chảy,
khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun. Phản ứng giải phóng NH3, axit xianuric (ngửi mùi
hoặc thử bằng giấy quỳ).
+ Để nguội ống, thêm vào 2ml NaOH 10%, lắc cho tan. Thêm vào vài giọt CuSO4
1%, quan sát màu.
- Phản ứng với protein
Cho vào ống nghiệm 3ml dung dịch lòng trắng trứng 1%, 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt

dung dịch CuSO4 1%, lắc kỹ, quan sát.
- Định lượng: sử dụng chất chuẩn là albumin huyết thanh bò.
- Lập đồ thị chuẩn protein: cho vào 5 ống nghiệm 3ml các nồng độ 0mg/ml,
20μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml và 400 μg/ml
albumin chuẩn. Làm phản ứng biure, đo độ hấp thụ trên máy so màu ở λ=540nm,
vẽ đồ thị.
d. Kết quả
Quan sát sự tạo phức màu đỏ. Tính nồng độ protein tổng số trong lòng trắng trứng.
1.3.2. Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho triptophan
15
a. Nguyên tắc
Trong môi trường axit, triptophan cho phản ứng với nhiều loại aldehit tạo thành các
sản phẩm có màu đỏ tím đặc trưng.
Hóa thức:
B1: Tác dụng với
b. Hóa chất, dụng cụ
Dung dịch lòng trắng trứng 1%
Dung dịch gelatin 1%
Axit axetic đặc
H2SO4 đặc
CuSO4 5%
c. Tiến hành
- Cho vào 2 ống nghiệm
Ống nghiệm I: 1ml dung dịch lòng trắng trứng 1%
Ống nghiệm II: 1ml gelatin 1%
- Thêm vào cả 2 ống 1ml axit axetic đặc (có chứa axit glioxilic dạng vệt), lắc đều
(có thể đun nóng và để nguội), thêm vài giọt CuSO4, lại lắc.
- Cầm nghiêng ống nghiệm, nhỏ theo thành ống 1ml H
2
SO

4
, chảy từ từ.
d. Kết quả
Quan sát sự xuất hiện vòng tím ở mặt phân cách hai chất lỏng ở ống I. Giải thích sự
sai khác giữa 2 ống.
1.3.3. Phản ứng của các axit amin chứa lưu huỳnh
a. Nguyên tắc
Axit amin chứa S có thể phản ứng với kiềm để tạo thành Na2S, thêm chì axetat vào sẽ
tạo thành kết tủa nâu đen PbS.
b. Hóa chất, dụng cụ
Dung dịch lòng trắng trứng 1%
NaOH 10%
(CH3COO)
2
Pb 1%
c. Tiến hành
Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch lòng trắng trứng 1% và 2ml NaOH 10%. Đun sôi
3 phút, lắc đều. Thêm vài giọt chì axetat.
d. Kết quả
16
Quan sát sự tạo thành kết tủa.
1.4. Định lượng axit amin và protein
- Các phương pháp định lượng protein
+ Dựa vào sự hấp thụ phổ ánh sáng ở vùng tử ngoại (278-280nm) của một số axit
amin vòng thơm như trytophan, tyrozin và phenylalanin.
+ Xác định hàm lượng N protein, nhân với hệ số (6.25 với động vật – N thường chiếm
16% và 5.96 với thực vật- N thường chiếm 16.8%).
+ Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp đo hấp thụ ánh sáng của phức chất tạo
thành sau khi cho protein phản ứng với một số thuốc thử: thuốc thử Folin trong phương
pháp Lowry, CBB-Coomassie Brilliant Blue trong phương pháp Bradford.

1.4.1. Phản ứng biure
a. Nguyên tắc
Phản ứng đặc trưng của liên kết peptit: trong môi trường kiềm, các hợp chất có từ 2
liên kết peptit trở lên có thể phản ứng với CuSO
4
tạo thành phức chất màu xanh tím đến
màu đỏ tùy thuộc vào số lượng liên kết peptit ít hay nhiều. Vì màu của phức chất giống
nhau ở tất cả các protein nên khi đo độ hấp thụ phức màu ở bước sóng 540nm trên máy
so màu, so sánh với đường chuẩn của protein chuẩn thì có thể định lượng được protein
tổng số.
b. Hóa chất, dụng cụ
Dung dịch lòng trắng trứng 1%
Ure tinh thể
NaOH 10%
CuSO4 1%
c. Tiến hành
- Phản ứng với biure:
+ Bỏ 1 lượng tinh thể ure vào ống nghiệm khô, đun trên ngọn lửa yếu, ure nóng chảy,
khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun. Phản ứng giải phóng NH3, axit xianuric (ngửi mùi
hoặc thử bằng giấy quỳ).
+ Để nguội ống, thêm vào 2ml NaOH 10%, lắc cho tan. Thêm vào vài giọt CuSO4
1%, quan sát màu.
- Phản ứng với protein
Cho vào ống nghiệm 3ml dung dịch lòng trắng trứng 1%, 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt
dung dịch CuSO4 1%, lắc kỹ, quan sát.
17
- Định lượng: sử dụng chất chuẩn là albumin huyết thanh bò.
- Lập đồ thị chuẩn protein: cho vào 5 ống nghiệm 3ml các nồng độ 0mg/ml,
20μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml và 400 μg/ml
albumin chuẩn. Làm phản ứng biure, đo độ hấp thụ trên máy so màu ở λ=540nm,

vẽ đồ thị.
d. Kết quả
Quan sát sự tạo phức màu đỏ. Tính nồng độ protein tổng số trong lòng trắng trứng.
4.2. Định lượng dựa vào sự hấp thụ tử ngoại của tyrozin ở bước sóng 280nm
- Xây dựng đường chuẩn tyrozin:
- Đo OD của casein
- Tính nồng độ casein dựa vào % tyrozin trong casein:
Bài 3. Định tính và định lượng saccharide
1.1 Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng axit
Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định tinh bột: các phương pháp hóa học,
phương pháp cực phổ, phương pháp khúc xạ kế, phương pháp hóa sinh
Các phương pháp hóa học xác định bằng cách đo cường độ màu của tinh bột với iot
hoặc bằng cách định lượng glucose tạo thành sau khi thủy phân tinh bột bằng axit hoặc
bằng enzyme amylaza. Phương pháp này không chính xác vì amylose và amylopectin tạo
màu với iot rất khác nhau mà hàm lượng của chúng trong từng loại tinh bột lại khác
nhau.
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bằng axit cũng không cho kết quả thật
đáng tin cậy vì khi thủy phân tinh bột bằng axit, không những chỉ có tinh bột mà cả
hemixunlulose và các polysaccarit phân tử thấp cũng bị phân giải. Do đó khi dùng
phương pháp thủy phân bằng axit, trước tiên phải tách tinh bột ra khỏi nguyên liệu thực
vật, sau đó mới thủy phân và xác định hàm lượng glucose.
Phương pháp thủy phân bằng enzyme có kết quả chính xác hơn cả, vì khi dùng chế
phẩm enzyme đặc hiệu thì chỉ có tinh bột bị phân giải.
Dưới đây là phương pháp thủy phân bằng axit.
1.1.1 Nguyên tắc
18
Dưới tác dụng của axit tinh bột bị thủy phân tạo thành đường glucose. Xác định hàm
lượng glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 ta được hàm lượng tinh bột.
(C
6

H
10
O
5
)
n
+ nH
2
O → nC
6
H
12
O
6
90,0
12,180
1,162
==
F
1.1.2 Hóa chất
- Dung dịch HCl 5%
- Dung dịch NaOH 5%
- Dung dịch Pb(CH
3
COO)
2
10% hoặc Pb(NO
3
)
2

10%
- Dung dịch Na
2
SO
4
hoặc NaHPO
4
bão hòa
- Các thuốc thử dùng để xác định đường khử.
2.2.3 Tiến hành
1. Cân 200-250 mg mẫu tinh bột đã nghiền nhỏ (đã biết rõ độ ẩm), cho vào bình cầu
dung tích 100 ml.
2. Cho thêm vào bình 50 ml nước cất, lắc đều, giữu yên 30-45 phút, lọc, bỏ nước lọc
để loại bỏ đường tan.
3. Rửa tinh bột bằng nước cất 2-3 lần. Chọc thủng giấy lọc và chuyển tinh bột vào
bình cầu chứa 25 ml dung dịch HCl 5%. Đậy kín bình bằng nút cao su có lắp ống làm
lạnh hồi lưu.
4. Đun cách thủy hỗn hợp 3-5 giờ. Thử sự thủy phân hoàn toàn của tinh bột bằng
dung dịch iot.
5. Làm nguội. Trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến pH=5,6-6,0 (bỏ
trực tiếp giấy quỳ vào bình).
6. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 ml. Kết tủa protein bằng dung dịch chì
axetat 10%. Loại bỏ chì axetat bằng dung dịch Na
2
HPO
4
hoặc Na
2
SO
4

bão hòa. Thêm
nước cất tới vạch mức, lắc đều và lọc.
7. Định lượng đường glucose trong dung dịch (lấy 5ml hoặc 10ml) bằng phương
pháp Betrand, qua đó tính được hàm lượng tinh bột.
2.2.4 Tính kết quả
Hàm lượng tinh bột theo công thức sau:
19
WV
Va
X
*
9,0*100**
1
=
Trong đó:
X- hàm lượng tinh bột tính bằng %,
a- Số mg glucose tra bảng tính được (ứng với số ml KMnO
4
dùng chuẩn độ mẫu thí
nghiệm trừ đi số ml KMnO
4
dùng chuẩn độ mẫu đối chứng),
V
1
- thể tích dung dịch đường (sau khi thủy phân) lấy để xác định đường glucose (ml),
V- dung tích bình định mức,
W- khối lượng mẫu thí nghiệm (mg),
100- hệ số tính chuyển thành %,
0,9- hệ số quy chuyển glucose thành tinh bột,
1.2 Định lượng dextrin

1.2.1 Nguyên tắc
Phương pháp dựa vào tính chất dextrin kết tủa hoàn toàn trong nồng độ cồn cao, còn
đường glucose, mantose tan trong cồn.
1.2.2 Hóa chất
Cồn tuyệt đối
1.2.3 Tiến hành
1. Cân 5g mẫu cho vào cốc. Cho thêm 50ml nước cất. Khuấy kĩ cho tan.
2. Lọc qua giấy lọc và cho vào bình định mức. Rửa vài lần bằng nước cất định mức
đến vạch lắc đều
3. Dùng pipet lấy 100ml dung dịch trong bình định mức cho vào cốc. Thêm từ từ vào
cốc 30ml cồn tuyệt đối, lắc đều. Để yên cố khoảng 30 phút cho kết tủa dextrin màu trắng
lắng xuống.
4. Lọc lấy kết tủa qua hai lớp giấy lọc (đã biết khối lượng). Rửa kết tủa vài lần bằng
cồn tuyệt đối. Sấy giấy lọc có chứa kết tủa ở 105
o
C đến khi có khối lượng không đổi.
5. Hàm lượng % dextrin trong mẫu là hiệu số giữa giấy lọc có chứa dextrin và giấy
lọc không chứa dextrin.
1.2.4 Tính kết quả
Hàm lượng dextrin được xác định theo công thức sau:
20
( )
WV
Vba
X
*
100**
1
−
=

Trong đó:
X- % dextrin trong mẫu,
a- Khối lượng của giấy lọc và kết tủa sau khi sấy (gam),
b- Khối lượng giấy lọc (gam),
V- thể tích định mức (ml),
V
1
- thể tích lấy xác định (ml),
W- khối lượng mẫu phân tích (gam).
Bài 4. Xác định hoạt tính enzyme phân giải protein của các chủng
vi sinh vật
Môi trường phân lập vi khuẩn
Môi trường TSB
Casein peptone 17g
Soya peptone 3g
NaCl 5g
K
2
HPO
4
4g
Glucose 2.5g
Bile Salts 1.5g
pH 7.4 ± 0.2
Agar-agar
2.2.3. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất: được
đánh giá qua hoạt tính sinh protease
• Phương pháp xác định hoạt tính sinh protease: theo phương pháp đo đường
kính phân giải casein
Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 180 vòng/phút ở 30

0
C trong môi trường dịch thể, sau
24h tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch
enzyme nhỏ vào lỗ thạch đã khoan trên đĩa petri chứa môi trường cơ chất. Để vào tủ ấm
30
0
C sau 24h xác định vòng phân giải.
21
Sử dụng thuốc thử Liugol, thuốc thử không bắt màu với phần cơ chất bị phân giải,
tạo ra vòng phân giải.
• Hoạt tính enzyme được xác định theo công thức:
H D d
= −
• Trong đó D: đường kính vòng phân giải + đường kính lỗ khoan
• d: đường kính lỗ khoan
22
23