khảo sát thành phần hóa học và thử hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hoá và kháng viêm của cây tứ bạch long

ỦY BAN NHÂN DÂN TP. HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH





B
B
Á
Á
O
O


C
C
Á
Á
O
O


N
N
G
G
H
H
I

I
Ệ
Ệ
M
M


T
T
H
H
U
U







KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, CHỐNG OXY HÓA VÀ
KHÁNG VIÊM CỦA CÂY TỨ BẠCH LONG
(BLEPHARIS MADERASPATENSIS (L.) ROTH)




CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

ThS. Văn Đức Thịnh PGS. TS. Trần Hùng

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)









THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 6/2014


VII

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
VIẾT TẮT
THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT
AREC
Ampicillin- resistant Escherichia. coli
C
13

-NMR
Phổ cộng hưởng từ carbon
DMSO
Dimethyl sulphoxid
DPPH
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EA
Ethyl acetat
EDTA
Ethylendiamin tetraacetic acid
EtOH
Ethanol
H
1
-NMR
Phổ cộng hưởng từ proton
IR
Phổ hồng ngoại
LB
Lauria broth
MeOH
Methanol
MRSA
Methicillin- resistant Staphylococcus aureus
MSSA
Methicillin- sensitive Staphylococcus aureus
NSAIDs
Non-steroidal anti-inflammatorial drugs
PA
Pseudomonas aeruginosa

SDA/B
Sabouraud dextrose agar/broth
TBL
Tứ Bạch Long
TM
Trychophyton mentagrophytes
TSA/B
Trypticase soy agar/broth
UV
Phổ tử ngoại

DANH MỤC BẢNG

SỐ
TÊN BẢNG SỐ LIỆU
TRANG
3.1
Tóm tắt phản ứng định tính hóa học cao phân đoạn
29
3.2
Kết quả độ ẩm bột dược liệu
31
3.3
Kết quả độ tro dược liệu
32
3.4
Kết quả độ trong không tan trong acid
32
3.5
Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trên nguyên liệu của

cây Tứ Bạch Long
33
3.6
Hiệu suất chiết cao tổng nước bằng phương pháp siêu âm
35
3.7
Hiệu suất chiết cao tổng cồn bằng phương pháp ngấm kiệt
36
3.8
Hiệu suất chiết các cao phân đoạn
37
3.9
Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học trên các phân
đoạn cao
38
3.10
Các nhóm chất hiện diện trong các phân đoạn dịch chiết
39
4.1
Kết quả đường kính kháng khuẩn (mm) trên 2 cao tổng
51
4.2
Kết quả đường kính kháng khuẩn (mm) trên 5 phân đoạn
52
4.3
Kết quả khảo sát MIC của cao chloroform
53
4.4
Kết quả khảo sát MIC của cao ethyl acetat
54

4.5
Kết quả khảo sát MIC của tetracyclin trên các chủng vi
khuẩn
54
4.6
Kết quả khảo sát MIC của clotrimazol trên C. albicans
54
5.1
Quy trình khảo sát năng lực khử
58
5.2
Quy trình khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH
59
5.3
Quy trình khảo sát khả năng quét gốc hydroxyl tự do
61
5.4
Năng lực khử của cao tổng và cao chiết Tứ Bạch Long
62
5.5
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng
65
5.6
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước tổng
66
5.7
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn ether
67
dầu
5.8

Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn
chloroform
68
5.9
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn ethyl
acetat
69
5.10
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn n-
buthanol
70
5.11
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn nước
còn lại
71
5.12
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitamin C tinh khiết
72
5.13
Giá trị IC
50
về khả năng quét DPPH
73
5.14
Khả năng kháng gốc hydroxyl tự do của Tứ Bạch Long
76
6.1
Quy trình khảo sát khả năng ức chế biến tính albumin
80
6.2

Khả năng ức chế biến tính albumin của các dạng cao chiết
từ cây Tứ Bạch Long
82
6.3
IC
20
khả năng ức chế biến tính albumin của cây Tứ Bạch
Long
86
7.1
Các thông số thực hiện phương pháp sắc ký nhanh – cột
khô
90
7.2
Các thông số thực hiện phương pháp cột cổ điển
91
7.3
Các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh – cột khô
93
7.4
Bảng nhận xét SKLM các phân đoạn thu được từ phương
pháp sắc ký nhanh – cột khô
95
7.5
Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển
97
7.6
Bảng nhận xét kết quả SKLM các phân đoạn thu được từ
sắc ký cột cổ điển
98

DANH MỤC ĐỒ THỊ

SỐ
TÊN ĐỒ THỊ
TRANG
5.1
Năng lực khử cao tổng và cao chiết Tứ Bạch Long
62
5.2
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng
65
5.3
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước tổng
66
5.4
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn
ether dầu
67
5.5
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn
chloroform
68
5.6
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn
ethyl acetat

69
5.7
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn n -
buthanol
70
5.8
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn
nước còn lại
71
5.9
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitamin C tinh
khiết
72
5.10
Giá trị IC
50
về khả năng quét DPPH
73
5.11
Khả năng kháng gốc hydroxyl tự do của Tứ Bạch
Long
77
6.1
Khả năng ức chế biến tính albumin của các dạng cao
chiết từ cây Tứ Bạch Long
83
6.2
Khả năng ức chế biến tính albumin của Tứ Bạch Long
ở nồ độ thấp (<100µg/ml)
84

6.3
IC
20
khả năng ức chế biến tính albumin của cây Tứ
Bạch Long
86

DANH MỤC HÌNH ẢNH

SỐ
TÊN HÌNH ẢNH
TRANG
1.1.
Cây Tứ Bạch Long ở Bắc Bình – Bình Thuận
4
1.2.
Cây Tứ Bạch Long ở Tháp Chàm – Phan Rang – Ninh
Thuận
4
2.1
Một đoạn cây Tứ Bạch Long
10
2.2
Cấu tạo vi phẫu rễ Tứ Bạch Long
12
2.3
Cấu tạo vi phẫu thân Tứ Bạch Long
14
2.4
Cấu tạo vi phẫu lá Tứ Bạch Long

17
2.5
Kết quả soi bột dược liệu Tứ Bạch Long
20
3.1
Chiết xuất cao tổng cồn và các cao phân đoạn từ bột
cây Tứ Bạch Long
28
3.2
Sắc đồ hệ chloroform – ethyl acetat (7:3)
41
3.3
Sắc đồ hệ n-Buthanol - a. acetic - nước (7:1:2)
42
3.4
Sắc đồ hệ n-Buthanol – a. acetic – nước (4:1:5)
43
3.5
Sắc đồ hệ ethyl acetat – methanol – nước (100:17:13)
44
3.6
Sắc đồ hệ ethyl acetat – a. acetic – a. formic – nước
(100:11:11:27)
46
7.1
Quy trình tổng quát phân lập hợp chất quan tâm từ Tứ
Bạch Long
89
7.2
Hình SKLM các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh

– cột khô chạy hệ ethyl acetat – methanol – nước
(100:17:13)
94
7.3
Hình SKLM của các phân đoạn thu được từ sắc ký
nhanh – cột khô với dung môi methanol chạy hệ ethyl
acetat – methanol – nước (100:17:13)
94
7.4
Hình SKLM các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ
điển
97
7.5
Phân đoạn A7 khai triển SKLM hệ chloroform –
99
methanol (8:2)
7.6
Các bước phân lập chất 1 và chất 2
100
7.7
SKLM chất 1 hệ ethyl acetat – methanol – nước
(100:17:13)
100

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC
TÓM TẮT / ABSTRACT
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC ĐỒ THỊ
PHẦN MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Giới thiệu chung về Tứ Bạch Long 3
1.1.1 Danh pháp và phân loại 3
1.1.2 Hình thái học 3
1.1.3 Sinh thái học và phân bố 4
1.1.4 Thành phần hóa học 4
1.1.5 Công dụng 5
1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Tứ Bạch Long 5
1.2.1 Thế giới 5
1.2.2 Trong nước 8
Chương 2: KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA TBL 9
2.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật học 9
2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái 9
2.1.2 Khảo sát đặc điểm vi học 9
2.1.2.1 Vi phẫu 9
2.1.2.2 Bột dược liệu 9
2.2 Kết quả nghiên cứu thực vật học 10

2.2.1 Khảo sát về đặc điểm hình thái 10
2.2.2 Khảo sát đặc điểm vi học 11
2.2.2.1 Vi phẫu 11
2.2.2.2 Bột dược liệu 18
Chương 3: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TBL 21



3.1 Phương pháp nghiên cứu hóa học 21
3.1.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu 21
3.1.1.1 Xác định độ ẩm: 21
3.1.1.2 Xác định độ tro trong dược liệu 21
3.1.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 23
3.1.2.1 Chuẩn bị dịch chiết 23
3.1.2.2 Các phản ứng hóa học khảo sát 24
3.1.3 Chiết xuất dược liệu 27
3.1.3.1 Chiết cao toàn phần từ cây Tứ Bạch Long 27
3.1.3.2 Tách phân đoạn cao toàn phần 28
3.1.4 Phân tích định tính thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết 28
3.1.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 30
3.2 Kết quả nghiên cứu hóa học 31
3.2.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu 31
3.2.1.1 Độ ẩm bột dược liệu 31
3.2.1.2 Độ tro dược liệu 31
3.2.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 32
3.2.3 Chiết xuất dược liệu 35
3.2.3.1 Chiết xuất các dạng cao tổng 35
3.2.3.2 Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết 36
3.2.4 Phân tích định tính thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết 37
3.2.5 Khảo sát SKLM các phân đoạn dịch chiết 40

Chương 4: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA TBL 49
4.1 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 49
4.1.1 Định tính khả năng kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp
khuếch tán đĩa 49
4.1.2 Định lượng khả năng kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp
MIC 50
4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 50
4.2.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa 50


4.2.2 Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp MIC 53
Chương 5: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA TBL 57
5.1 Phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 57
5.1.1 Khảo sát năng lực khử 57
5.1.2 Khảo sát khả năng quét gốc tự do 58
5.1.2.1 Khả năng quét gốc tự do DPPH 58
5.1.2.2 Khả năng quét hydroxyl tự do 60
5.2 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 61
5.2.1 Khảo sát năng lực khử 61
5.2.2 Khảo sát khả năng quét gốc tự do 64
5.2.2.1 Khả năng quét gốc tự do DPPH 64
5.2.2.2 Khả năng quét hydroxyl tự do 75
Chương 6: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA TBL 79
6.1 Phương pháp khảo sát in vitro khả năng kháng viêm bằng tác dụng
ức chế biến tính albumin 79
6.2 Kết quả khảo sát in vitro knăng kháng viêm bằng tác dụng ức chế
biến tính albumin do nhiệt 80
Chương 7: PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TỪ TBL 88
7.1 Phương pháp phân lập hợp chất hóa học từ TBL 88
7.1.1 Sắc ký nhanh – cột khô 90

7.1.2 Sắc ký cột cổ điển 91
7.1.3 Sắc ký lớp mỏng điều chế 91
7.1.4 Phân tích hợp chất đã cô lập 92
7.2 Kết quả phân lập hợp chất từ TBL 92
7.2.1 Kết quả sắc ký nhanh – cột khô 93
7.2.2 Kết quả sắc ký cột cổ điển 96
7.2.3 Kết quả SKLM điều chế 99
7.2.4 Kết quả phổ chất 1 100
Chương 8: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 101
8.1 Kết luận 101
8.1.1 Thực vật học 101


8.1.2 Hóa học 101
8.1.3 Hoạt tính sinh học 101
8.2 Đề nghị 102
TÀI LIỆU THAM KHẢO 104
PHỤ LỤC





1

PHẦN MỞ ĐẦU

1. Tên đề tài/dự án:
“KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, CHỐNG OXY HÓA

VÀ KHÁNG VIÊM CỦA CÂY TỨ BẠCH LONG
(BLEPHARIS MADERASPATENSIS (L.) ROTH)”
Chủ nhiệm đề tài: ThS. Văn Đức Thịnh
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học & Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng (01/2012 – 01/2013)
Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng
Kinh phí đã cấp: theo Thông báo số /TB-SKHCN

2. Mục tiêu:
- Khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa của Tứ Bạch Long
làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng loại dược liệu này.
- Khảo sát thành phần hóa học của Tứ Bạch Long.

3. Nội dung: (đối chiếu với hợp đồng đã ký):
Công việc dự kiến
Công việc đã thực hiện
Khảo sát đặc điểm vi học TBL
- Khảo sát đặc điểm vi học gồm vi
phẫu và bột dược liệu TBL, bao gồm
các bộ phận rễ, thân và lá.
Khảo sát thành phần hóa học thực vật
TBL
- Đánh giá các chỉ số hóa lý (độ ẩm,
độ tro toàn phần, tro không tan trong
acid) của nguyên liệu và các dạng
cao chiết.
- Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực
vật của nguyên liệu tươi và các phân
đoạn cao chiết.
Khảo sát khả năng kháng khuẩn của

- Định tính khả năng kháng khuẩn của
2

TBL
cao chiết cồn, cao chiết nước và các
phân đoạn dịch chiết bằng phương
pháp khuếch tán đĩa trên các chủng
khuẩn và nấm thông dụng.
- Định lượng MIC của 2 phân đoạn
đáp ứng kháng khuẩn tốt nhất (phân
đoạn ethyl acetat và chloroform)
Khảo sát khả năng chống oxy hóa của
TBL
- Đánh giá năng lực khử của các dạng
cao chiết.
- Khảo sát khả năng quét gốc tự do
(DPPH và hydroxyl tự do) của các
dạng cao chiết.
Khảo sát khả năng kháng viêm của Tứ
Bạch Long
- Đánh giá in vitro khả năng kháng
viêm của các dạng cao chiết bằng
phương pháp ức chế biến tính
albumin do nhiệt.
Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất
hóa học có trong Tứ Bạch Long
- Phân tách được một hỗn hợp chất từ
cao chiết ethyl acetat của TBL, tuy
nhiên còn chưa tinh khiết.
Công bố 01 bài báo khoa học về nộ

dung nghiên cứu của đề tài
- Đã công bố bài báo khoa học “Bước
đầu khảo sát tác dụng sinh học của
dược liệu Tứ Bạch Long (Blepharis
maderaspatensis (L.) Roth)” đăng
trên “Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí
Minh”, tập 16, phụ bản số 1, 2012.

3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về TBL
1.1.1 Danh pháp và phân loại
TBL, hay còn gọi là Tai Rìa, có tên khoa học là Blepharis
maderaspatensis (L.) Heyne ex. Roth. Ngoài ra, còn có tên gọi khác là
Blepharis boerhaaviaefolia Pers. hay Acanthus maderaspatensis L. [11], [12]
TBL nằm trong hệ thống phân loại như sau: [5]
Giới: Thực vật (Plantae)
Ngành: Hạt kín (Angiospermae)
Lớp: Song tử diệp (Dicotyledones)
Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae)
Liên bộ: Hoa môi (Lamianae)
Bộ: Hoa mõm sói (Scrophularialess)
Họ: Ô rô (Acanthaceae)
Chi: Lông mi [6] (Blepharis)
Loài: Tứ Bạch Long (Blepharis maderaspatensis
(L.) Heyne ex. Roth).

1.1.2 Hình thái học [11], [12]

TBL là cây cỏ mọc bò có rễ bất định, có khi trườn; thân mảnh.
Lá chụm 4; phiến tròn dài thon, chót có gai mũi, có lông ở mặt dưới.
Gié ngắn ở nách lá, lá hoa có răng nhọn dài; tiền diệp nguyên; lá đài
không bằng nhau, một dài 1,7cm; vành chỉ có một môi, trắng hay hường; tiểu
nhị 4.
Nang 4 hột có lông.


4









1.1.3 Sinh thái học và phân bố
TBL phân bố tự nhiên ở những vùng có điều kiện khí hậu khô nóng,
nhưng lại thường thấy xuất hiên ở những địa điểm có dòng nước chảy qua,
đặc biệt thích hợp với những vùng đất có độ mặn cao. [11], [12], [19]
Cây có nguồn gốc từ Phi Châu. Trên thế giới, cây được tìm thấy ở
những quốc gia có điều kiện khô nóng như các nước châu Phi là Cộng hòa
Dân chủ Congo, Cộng hòa Kenya, Burundi, Rwanda, Mozambique,
Madagascar, Sudan, Trung Phi…; các nước Tây Á và Nam Á là Cộng hòa
Yemen, Iran, Pakistan, Ấn Độ…; đến các nước Đông và Đông Nam Á như
Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Myanmar, Việt Nam… [23], [37], [42],
[43], [44], [48], [55], [68]
Tại Việt Nam thì phân bố ở các vùng khô nóng ven biển như Khánh

Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận. [11], [12]

1.1.4 Thành phần hóa học [30], [54]
14,31% đường, 9,2% saponin, 5,5% alkaloid, 2,4% flavonoid, 3%
tannin, 0,741% chlorophyl.
Ngoài ra còn các thành phần khác như protein, xanthoprotein, steroid,
terpenoid, glycosid, quinon, anthraquinon, phenol, catachin, coumarin…




Hình 1.1: Cây TBL ở Bắc Bình –
Bình Thuận
Hình 1.2: Cây TBL ở Tháp Chàm –
Phan Rang – Ninh Thuận
5

1.1.5 Công dụng
TBL được dùng khá phổ biến trong các bài thuốc dân gian của các
dân tộc ở Tamil Nadu - Ấn Độ như: [32], [33], [38], [41], [47], [59], [60],
[64]
- Làm ổn định tổ chức thần kinh ở vết thương gãy xương: lá TBL
nghiền thành bột nhão trộn với đậu đen, nước ép củ hành và lòng
trắng trứng. Hay lá TBL trộn với lá Pterospermum suberifolium và
vỏ cây Drypetes roxburghii (Sang Trắng Roxburgh) và lòng đỏ
trứng.
- Làm lành vết thương hở, vết thương nhiễm trùng, vết cắt đứt cơ: lá
TBL nghiền thành bột nhão trộn với nước ép quả Chanh Lá Cam
(lime), thoa lên vết thương. Hay lá TBL trộn với củ hành, nghiền
thành bột nhão rồi thoa lên vết đứt. Hay dịch chiết từ lá TBL được

đun nóng với dầu vừng rồi thoa lên vết thương.
- Chữa đau họng và các bệnh hen suyễn: dịch ép lá TBL.
- Chữa rắn cắn, bệnh bạch bì và suy nhược cơ thể: sử dụng cả cây.
Lá TBL cũng được dùng để chữa các vết thương nhiễm trùng ở những
vùng khác của Ấn Độ như Dharmapuri, Ghats, Peninsular… [29], [39], [45],
[48], [57], [61], [62]
TBL cũng được dùng trong lãnh vực thuốc thú y, là thành phần trong
các bài thuốc dân gian của Nam Ấn chữa sưng mủ, gãy xương, tiêu chảy và
còn có công dụng kích thích tạo sữa cho gia súc.
Tại Bình Thuận - Việt Nam, lá TBL được giã nát, đắp lên vết mổ sau
khi nạo hút ổ áp xe, với công dụng làm vết thương mau lành, không chảy mủ
và chống tái phát áp xe. [19]

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây TBL
1.2.1 Thế giới
Ấn Độ là quốc gia có nhiều nghiên cứu sâu rộng về dược học, đặc biệt
là các loại thảo dược. Tại Ấn Độ, cây TBL được bày bán rộng rãi trong các
6

khu chợ dược liệu lớn nhỏ trên toàn quốc, như một loại dược liệu thông dụng.
Theo các nghiên cứu khảo sát cây thuốc dân gian của địa phương, TBL là
loài dược thảo luôn có mặt trong các danh mục dược liệu cổ truyền của nhiều
dân tộc ở Ấn Độ, các quốc gia Tây Phi, Đông Phi và Nam Phi với các công
dụng như kháng viêm, chống nhiễm trùng vết thương, mau lành vết thương
hở, chữa ung nhọt, chữa gãy xương…[11], [12], [23], [29], [30], [32], [36],
[40], [43], [46], [55], [59], [64]
Tuy được sử dụng rộng rãi từ lâu đời nhưng còn khá ít những nghiên
cứu chuyên sâu về TBL. Công trình nghiên cứu khoa học đầu tiên về loài
thực vật này được công bố bởi Devi và Meera (2010). Công trình này thiên
về phân tích đặc điểm hình thái học thực vật và sơ bộ thành phần hóa thực

vật của lá TBL được thu thập từ Ấn Độ. Kết quả thu được chủ yếu là các
thông số hình thái học bên ngoài của TBL, nghiên cứu hóa học thực vật chỉ ở
mức khảo sát sơ bộ. Theo kết quả nghiên cứu thành phần hóa thực vật được
công bố, lá TBL có các thành phần chủ yếu như sau: đường chiếm tỉ lệ nhiều
nhất (14,31%), sau đó là saponin (9,2%) và alkaloid (5,5%), ngoài ra còn có
flavonoid, tannin và chlorophil chiếm tỉ lệ ít hơn. [30]
Mohan và cộng sự (2010) cũng đã công bố về đặc điểm vi học và
thành phần hóa thực vật của toàn cây TBL. Theo kết quả nghiên cứu này cho
thấy, thành phần hóa học của toàn cây TBL gồm: alkaloid, terpenoid,
coumarin, tannin, saponin, flavonoid, quinon, anthraquinon, phenol và
glycosid. [54]
Nghiên cứu sâu hơn về các hoạt tính sinh học của TBL cũng ghi nhận
được những kết quả sau:
- Hoạt tính kháng sinh: Jeyachandran và cộng sự (2010) khảo sát hoạt
tính kháng khuẩn các dạng cao chiết ether dầu hỏa, ethanol,
methanol, aceton của thân và rễ TBL trên 10 chủng khuẩn:
Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia
marcescens, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Entrobacter aerogens, Bacillus subtilis và
Staphyllococcus sp. Kết quả cho thấy cả thân và rễ TBL đều có khả
7

năng kháng khuẩn; mạnh nhất là cao chiết aceton và methanol; khả
năng kháng khuẩn thể hiện mạnh nhất trên chi Staphylococcus. Tuy
nhiên, nghiên cứu không đề cập đến nồng độ mẫu thử trong khảo sát
kháng khuẩn và khảo sát chỉ mang tính định tính khả năng kháng của
TBL trên các chủng thử nghiệm. [40]
- Hoạt tính hạ lipid máu: Nghiên cứu của Aiyalu, Vellaichamy và
Sabarimuthu (2013) cho thấy TBL có khả năng làm giảm cholesteron
và triglycerid máu trên mô hình chuột được gây tăng lipid máu bằng

Triton WR-1339. Dịch chiết các phân đoạn của TBL thể hiện hoạt
tính giảm cholesteron và triglycerid máu tăng dần như sau:
chloroform < ethyl acetat < ethanol. Trong đó, phân đoạn chloroform
thể hiện hoạt tính rất yếu, gần như không có. Ngược lại, phân đoạn
ethanol ở liều dùng 100mg/ml thể hiện hoạt tính gần nhất với thuốc
hạ lipid máu thử nghiệm là simvastatin ở liều dùng 20mg/ml. [25]
- Hoạt tính chống oxy hóa: Trong nhiều nghiên cứu in vitro, TBL có
khả năng quét các loại gốc tự do như DPPH, hydroxyl, superoxid,
NO. [24], [26], [31]
- Hoạt tính gây độc tế bào: Khả năng gây độc tế bào của dịch chiết
phân đoạn ethyl acetate của TBL có ý nghĩa với dòng tế bào ung thư
ruột kết người (COLO 320 DM) sau thời gian điều trị là 72 giờ
(IC
50
=45µg/ml, trong khi IC
50
đối với dòng tế bào thường VERO là
86µg/ml). Ngoài ra, cùng thời gian điều trị thì IC
50
gây độc tế bào
của phân đoạn ethyl acetate đối các dòng tế bào ung thư khác như dạ
dày (AGS), vú (MCF-7) và phổi (A549) lần lượt là 72µg/ml,
80µg/ml và 153µg/ml. Phân đoạn hexane của TBL hầu như không có
khả năng gây độc đối với các dòng tế bào ung thư theo dõi nhưng ở
nồng độ cao sẽ gây độc cho tế bào thường (IC
50
=182µg/ml sau 72
giờ điều trị và IC
50
=325µg/ml sau 24 giờ điều trị). Phân đoạn

methanol của TBL có ngưỡng gây độc đối với các dòng tế bào ung
thư rất cao trong khi đối với dòng tế bào thường thì ngưỡng này thấp
hơn nhiều (gần gấp 3 lần). [26]
8

- Hoạt tính lợi tiểu: TBL có khả năng tăng loại thải Na, K và Cl kéo
theo tăng thể tích nước tiểu trên mô hình thử nghiệm chuột nhắt
trắng được cho uống nước muối. Các dạng cao chiết TBL với nhiều
loại dung môi khác nhau thể hiện hoạt tính tăng dần như sau: benzen
< nước < chloroform < cồn. Trong đó, hoạt tính của 2 dạng cao chiết
cồn và chloroform gần như không có sự khác biệt và ở liều dùng
250mg/kg thì thể hiện hoạt tính gần nhất với thuốc lợi tiểu furosemid
ở liều dùng 20mg/kg. [31]

1.2.2 Trong nước
TBL được ghi nhận lần đầu tiên trong báo cáo kết quả đợt điều tra
dược liệu tại tỉnh Bình Thuận của Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM
(2007). Báo cáo ghi nhận tọa độ, vị trí phân bố của TBL trên địa bàn khu vực
này và cũng ghi nhận về công dụng dân gian của TBL là kháng khuẩn, làm
vết thương mau lành. [9]
Hội Đông Y tỉnh Bình Thuận cũng đã nhắc đến TBL trong chuyên
luận tại Hội thảo Cây dược liệu quý hiếm của địa phương (2008). Chuyên
luận cho biết cách sử dụng TBL trong điều trị áp xe ở địa phương và so sánh
những trường hợp được điều trị áp xe bằng kháng sinh với điều trị bằng TBL.
Kết quả cho thấy vết thương áp xe sau khi mổ nạo hút mủ được đắp TBL giã
nát thay cho kháng sinh thông thường sẽ làm vết thương mau lành, không
làm mủ, không tái phát. [19]
Các tài liệu về thực vật, cây thuốc Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ, Võ
Văn Chi cũng chỉ đề cập tới TBL như một loài cỏ mọc hoang dại phân bố từ
nam Khánh Hòa vào bắc Bình Thuận. [11], [12]

9

Chương 2: KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC
CỦA TBL

2.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật học
2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái
Khảo sát đặc điểm hình thái của cây TBL trồng tại Bộ môn Tài
nguyên – dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh.

2.1.2 Khảo sát đặc điểm vi học
2.1.2.1 Vi phẫu [4]
Chọn mẫu tươi, không quá già cũng không quá non và đảm bảo đầy
đủ các đặc điểm thực vật như sau:
- Thân và rễ nhỏ: lấy một đoạn có đủ mặt cắt ngang.
- Lá: lấy một đoạn gân giữa có dính mỗi bên một ít phiến lá.
Cắt ngang mẫu thành lát mỏng và sao cho lát cắt nằm trong mặt phẳng
vuông góc với trục mẫu cắt.
Nhuộm 2 màu bằng màu kép (lục iod 0,1% và đỏ carmin 1%). Giữ
mẫu đã nhuộm trong nước cất.
Làm tiêu bản mẫu trong giọt nước cất dưới kính hiển vi điện tử ở các
độ phóng đại x40, x100, x400. Ghi nhận đặc điểm, chụp hình và chú thích
đầy đủ các chi tiết.

2.1.2.2 Bột dược liệu [2], [4]
Làm tiêu bản bột soi trong dung dịch KOH 5% và trong nước cất.
Quan sát dưới kính hiển vi ở các độ phóng đại x100 và x400. Ghi nhận, chụp
hình và chú thích các phần tử quan sát được.

10

2.2 Kết quả nghiên cứu thực vật học
2.2.1 Khảo sát về đặc điểm hình thái
TBL là cây cỏ thân mảnh, đường kính thân khoảng 1mm, mọc bò có
rễ bất định, chiều dài của lóng khoảng 85 – 92mm, mấu phình to.
Lá mọc vòng, chụm 4; cuống lá vừa, dài khoảng 4 – 5mm; phiến lá
tròn dài, phần đầu rộng và thuôn dần về phía cuống (dài 30 – 40mm, rộng 12
– 15mm), đầu lá nhọn, có lông ở mặt dưới.
Gié hoa ngắn, ở nách lá. 4 lá đài dài khoảng 7 – 8mm, mép có răng
nhọn dài như lông mi, xếp 2 lá nằm ngoài và 2 lá nằm trong đối diện từng
đôi một. Tràng hoa có 1 cánh lớn dài 18 – 20mm, đầu xẻ 3 thùy, màu trắng
sọc hồng tím, đối diện với 1 cánh dạng lưỡi dài 15 – 17mm, màu hồng tím. 4
tiểu nhị hướng nội, dài 7 – 8mm. Bầu nhụy trên, 4 buồng, mỗi buồng mang 1
tiểu noãn đính trung trục.

Lóng thân
Hoa
Rễ bất định
Lá
Hình 2.1: Một đoạn cây TBL


11

2.2.2 Khảo sát đặc điểm vi học
2.2.2.1 Vi phẫu:
 Rễ:
Tiết diện rễ có dạng tròn. Nội bì và trụ bì rõ phân biệt rễ thành 2 vùng
là vỏ và tủy, vùng vỏ có phần rộng hơn vùng tủy. Ngoài cùng còn có thêm
vùng lông hút.
Vùng lông hút của rễ chỉ gồm 2 thành phần:
- Ngoài cùng là tầng lông hút với một lớp tế bào mô mềm, vách mỏng
không phân biệt rõ rệt và vết tích của lông hút đã đứt gãy, dập nát.
- Sát dưới tầng lông hút là vùng tẩm suberin gồm 2 hay 3 hàng tế bào
hình khối, đường kính khoảng 27 – 38µm, vách dày.
Vùng vỏ rễ gồm các thành phần:
- Hầu hết vùng này chỉ là các tế bào mô mềm với các tế bào màng
mỏng, hình lục giác gần tròn, đường kính khoảng 43 – 68µm.
- Trong cùng của vùng vỏ rễ là 1 vòng tế bào nội bì rõ rệt, gồm các tế
bào hình chữ nhật nằm ngang, kích thước khoảng 20µm x 50µm.

Vùng tủy rễ gồm các thành phần:
- Trụ bì bắt đầu cho vùng tủy. Trụ bì là 1 vòng tế bào hình chữ nhật
nằm ngang, kích thước khoảng 17µm x 45µm, nằm sát dưới nội bì.
- Mô dẫn truyền chiếm phần lớn diện tích vùng tủy, nằm sát dưới trụ bì,
gồm libe II nằm ngoài và gỗ II nằm trong, xếp thành vòng liên tục.
Ống gỗ có đường kính khoảng 15 – 55µm. Libe I và gỗ I thường tiêu
biến. Gỗ I đôi khi còn thấy vết tích tại vị trí tận cùng của gỗ II, nhưng
không rõ.
- Trong cùng của vùng tủy đôi khi còn thấy mô mềm tủy là các tế bào
màng mỏng, hình tròn, đường kính khoảng 28 – 33µm.





12

Nhận xét: Cấu tạo vi phẫu của rễ TBL chủ yếu có cấu tạo cấp II, ít
khi thấy các thành phần cấp I và thường không rõ. Ngoài ra, những đặc điểm
vi phẫu khác cũng khá thông thường đối với rễ cây lớp Ngọc Lan, không
mang tính đặc trưng.
 Thân:
Tiết diện thân TBL có dạng hình vuông với 4 góc bầu tròn. Vùng vỏ
và vùng tủy phân biệt nhờ nội bì và trụ bì rõ, vùng tủy chiếm hầu hết và rộng
gấp 4 lần vùng vỏ.




1
9
8
7
6
5
4
3
2


Chú thích:
I. Tiết diện rễ TBL (x100) II. Vùng lông hút và vùng vỏ rễ TBL (x400)
III. Vùng tủy rễ TBL (x400)

1. Tầng lông hút 2. Vùng tẩm suberin 3. Mô mềm vỏ 4. Nội bì
5. Trụ bì 6. Libe II 7. Gỗ II 8. Gỗ I 9. Mô mềm tủy
Hình 2.2: Cấu tạo vi phẫu rễ TBL

III
I
II


13

Vùng vỏ thân gồm các thành phần:
- Ngoài cùng là biểu bì, gồm những tế bào hình chữ nhật nằm ngang,
kích thước 7 – 8µm x 17 – 18µm, vách ngoài dày hơn các vách trong
và có tẩm cutin dạng răng cưa.
- Trên biểu bì có mang các lông che chở và lông tiết. Lông che chở
dạng đa bào, vách dày, gồm 3 tế bào: tế bào dưới thường ngắn, tế bào
giữa dài và và tế bào trên có đầu nhọn. Lông tiết có vách mỏng, chân
ngắn, nằm sát với biểu bì, đầu gồm 2 tế bào tiết to bằng nhau.
- Sát dưới biểu bì là mô dày, gồm 2 hàng tế bào hình lục giác gần tròn,
đường kính khoảng 15 – 20µm, có vách dày cellulose ở góc.
- Bên trong có mô mềm vỏ gồm các tế bào màng mỏng, hình lục giác
gần tròn, kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 17 – 30µm.
- Trong cùng của vùng vỏ là nội bì gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật
nằm ngang, kích thước khoảng 12µm x 23µm, xếp khít nhau.
Vùng tủy thân gồm các thành phần:
- Trụ bì nằm sát dưới nội bì, là 1 hàng tế bào hình chữ nhật nằm ngang,
kích thước tương đối nhỏ hơn nội bì, khoảng 9µm x 20µm.
- Bó mạch gồm 4 thành phần theo thứ tự lần lượt từ ngoài vào trong là
libe I, libe II, gỗ II và gỗ I. Libe II và gỗ II xếp tập trung thành vòng

liên tục sát dưới trụ bì, gỗ Ii chèn ép libe II thành 1 dãi hẹp. Libe I và
gỗ I chỉ tìm thấy ở 4 góc thân, libe I hóa sợi, gỗ I phân hóa li tâm. Các
ống gỗ có đường kính khoảng 12 – 23µm.
- Trong cùng là mô mềm tủy, chiếm ½ đường kính thân, là các tế bào
màng mỏng, kích thước rất lớn, đường kính khoảng 50 – 90µm.







14

Nhận xét: Thân TBL có cấu tạo vi phẫu khá phổ biến của thân cây
lớp Ngọc Lan với các thành phần cơ bản như biểu bì, mô dày, mô mềm, các
thành phần mạch. Ngoài ra, những đặc điểm đặc trưng của thân cây họ Ô Rô
cũng được ghi nhận như là: thân có dạng gần vuông, có 4 bó mạch cấp I tập
trung ở 4 góc thân, nội bì và trụ bì thấy rõ. Những đặc điểm riêng của loài có
thể dùng làm cơ sở kiểm nghiệm là đặc điểm của lông che chở đa bào và
lông tiết; libe I hóa sợi.





1
5
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
II
I
I
Chú thích:

I. Tiết diện thân TBL (x100) II. Chi tiết thân TBL (x400)
1. Lông che chở đa bào 2. Biểu bì 3. Lông tiết 4. Mô dày 5. Mô mềm vỏ
6. Nội bì 7.Trụ bì 8. Libe I hóa sợi 9. Libe II
10. Gỗ II 11. Gỗ I 12. Mô mềm tủy
Hình 2.3: Cấu tạo vi phẫu thân TBL