nghiên cứu sản xuất limo ni trích từ hạt neem azadirachtin indica dùng để giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đồng thời nâng cao hiệu quả phân đạm và thương mại hóa sản phẩm

1


MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG 6
DANH SÁCH HÌNH 7
PHẦN MỞ ĐẦU 8
I. TỔNG QUAN 11
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC ĐỀ TÀI 11
1.1.1. Đặt vấn đề 11
1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 12
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 13
1.1.4. Tính cần thiết của đề tài 14
14
1.2.1. Giới thiệu về cây neem 14
1.2.2. Hoạt chất limonoid trong cây neem 17
19
II. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 20
2.1. NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT
NEEM VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ARL KHỬ MẠNH NHẤT VI SINH VẬT NITRIT HÓA
PHÂN ĐẠM 20
2.1.1. Mô tả nội dung 20
2.1.2. Phương pháp 20
2.2. NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ CHẾ PHẨM
LIMO NI 24
2.2.1. Nội dung và phương pháp 24
2.2.2. Thử độ bền nhiệt và bền nhũ của Limo NI 25
2.3. NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT

HÒA TAN TRONG NƯỚC VÀ THẤM SÂU VÀO ĐẤT. 25
2.3.1. Mô hình thử nghiệm 25
2.3.2. Chỉ tiêu theo dõi 25
2.3.3. Phương pháp 25


2

2.4. NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ
ĐO LƯỢNG NITRAT BỊ THẤT THOÁT. 26
2.4.1. Thay đổi tỷ lệ trộn Limo NI và urê 26
2.4.2. Đo hàm lượng nitrat đối với mỗi nghiệm thức 26
2.5. NỘI DUNG 5: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT
ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI
VỚI URÊ VÀ ĐO LƯỢNG NITRAT ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU. 26
2.5.1. Mô hình thử nghiệm 26
2.5.2. Phương pháp thử nghiệm 26
2.6. NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NHIỆM XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG
LÀM TĂNG NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG CỦA LIMO NI – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ
LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ XÁC ĐỊNH NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG
DƯA CHUỘT, CẢI NGỌT) 27
2.6.1. Mô hình thử nghiệm 27
2.6.2. Phương pháp thử nghiệm 28
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT
NEEM AZADIRACHTA INDICA 29
3.1.1. Ly trích hoạt chất ARL trong hạt neem 29
3.1.2. Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp 34
3.1.3. Thử nghiệm tính sát khuẩn của 6 hoạt chất ARLx trích từ hạt neem đối với 2
chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp theo phương pháp kháng sinh đồ 39

3.2. NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ LIMO NI 47
3.2.1. Ly trích 3 hoạt chất azadirachtin, salannin, nimbin trong nhân hạt neem 47
3.2.2. Điều chế chất làm bền ESO 55
3.2.3. Điều chế chất tạo nhũ sucroester 58
3.2.4. Lập công thức pha chế Limo NI bền nhiệt và bền nhũ 60
3.2.5.Giá thành sản phẩm 66_Toc387343560
3.2.6. Xác định LD
50
của hoạt chất ARL trong Limo NI đối với chuột bạch 69
3.3. NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT
HÒA TAN TRONG NƯỚC VÀ THẤM SÂU VÀO ĐẤT 70
3.3.1. Mô hình thử nghiệm 70
3.3.2. Định lượng nitrat 70


3

3.4. NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ
ĐO LƯỢNG NITRAT BỊ THẤT THOÁT 72
3.4.1. Mô hình thử nghiệm 72
3.4.2. Kết quả định lượng nitrat 72
3.5. NỘI DUNG 5: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT
ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI
VỚI URÊ VÀ ĐO LƯỢNG NITRAT ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU 75
3.5.1. Xây dựng mô hình thử nghiệm 75
3.5.2. Kết quả thử nghiệm 77
3.6. NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG
LÀM TĂNG NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG CỦA LIMO NI – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ
LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ VÀ XÁC ĐỊNH NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG
(DƯA CHUỘT, CẢI NGỌT) 79

3.6.1. Xây dựng mô hình thử nghiệm 79
3.6.2. Kết quả thử nghiệm 84
3.6.3. Hiệu quả kinh tế 88
IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89
TÀI LIỆU THAM KHẢO 91


1
- ………………………………………………………………97
13
- …………………………………………………………… 98
1
- ………………………………………………………….99
13
- azadirachtin……………………………………………………… 100
. ……… 101
5b salannin T salannin …………………101
. ……………………………………………… … 102
. ………………………………………………………… 103
. ………………………………… 104
= f(c …………………………………….….105
…………………… 106
……106
……………………………………………….107


4

(SGT)… 108
………………… 109

/urê (%) ……….110
/urê (%) … 111
= f( /urê (%) 112

…………………………………………………………………………………… ……… 113
neem …………………………………………………………….………………………… 115
Azadirachta indica
………………………………………………………………………….………….117
19: Alpha-glucosidase inhibitory limonoids from the leaves of Azadirachta indicaA. Juss
………………………………………………………………………………………… 123
133

5

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VIẾT TẮC
THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT
A
AZ
ARL

ASTM
CFU
CIPA
13
C-NMR
Dd
EPA
ESO
FAB-MS
1
H-NMR
HPLC-UV
HR MS
LD
Limo NI
NI
NVL

ODS
PA
RT
SA
SPE
SGT
TL
TGT
UV Cary 50
VSV
Absorbance
Azadirachtin
Azadirachtin Related Limonoid
(Các chất limonoid có cấu trúc và tác dụng tương tự azadirachtin)
American Society Testing Materials
Colony Forming Unit
Collaborative International Pesticides Analytical Council
Máy cộng hưởng từ hạt nhân phổ
13
C
Dung dịch
Environment Protection Agency
Epoxidised Soybean oil
Máy khối phổ bắn phá tự do nguyên tử
Máy cộng hưởng từ hạt nhân phổ
1
H
Máy sắc ký hiệu năng cao, ghép máy quang phổ tử ngoại
Máy khối phổ có độ phân giải cao
Lethal dose

Limonoid Nitrification Inhibitor
Nimbin
Nguyên vật liệu
Octadecyl silica gel
Peak area
Retention time
Salannin
Cột sắc ký tách chất rắn
Sau gia tốc
Trích ly
Trước gia tốc
Máy quang phổ tử ngoại hiệu Cary 50
Vi sinh vật



6

DANH SÁCH BẢNG
STT
Tên
Trang
1
2
3
4

5
6

7

8
9
10

11

12

13

14

15

16
Bảng 3.1: Thuốc thử biệt tính để xác định các nhóm chứa hóa học.
Bảng 3.2: Kết quả xác định thành phần hóa học cơ bản của 5 loại cao TL.
Bảng 3.3 : Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrosomonas sp.
Bảng 3.4: Mật độ chủng Nitrosomonas sp thay đổi theo thời gian nuôi cấy ở
pH = 7 và t
o
= 30
o
C.
Bảng 3.5: Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrobacter sp.
Bảng 3.6: Mật độ chủng Nitrobacter spsau 5 ngày nuôi cấy ở pH = 7 và t
o

= 30
o
C.
Bảng 3.7: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các hoạt chất ARLx đối với
2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp.
Bảng 3.8: Thành phần hóa học của dầu đậu nành.
Bảng 3.9: Độc tính của chế phẩm Margosan-O.
Bảng 3.10 c(N) (NO
3
–
thay đổi
theo tỷ lệ bao Limo NI/urê.
Bảng 5.1: Hàm lượng c(N) và c(NO
3
–
) trong cây cải ngọt thay
đổi theo tỷ lệ bao NI/urê.
Bảng 5.2: Hàm lượng c(N) và c(NO
3
–
) trong trái dưa chuột thay
đổi theo tỷ lệ bao NI/urê.
Bảng 6.1: Một số chỉ tiêu về thời tiết, khí hậu trong vụ Hè Thu 2013 tại
Ninh Thuận.
Bảng 6.2: Ảnh hưởng của chế phẩm Limo NI đến chiều cao và số lá của cây
cải ngọt thay đổi theo số ngày sau gieo hạt (NSG).
Bảng 6.3: Ảnh hưởng của chế phẩm Limo NI đến năng suất thu hoạch
của cây cải ngọt.
Bảng 6.4: Ảnh hưởng của chế phẩm Limo NI đến năng suất thu hoạch
dưa chuột.

30
31
33
35

35
36

40

56
70
73

77

78

84

84

85

85




7

DANH SÁCH HÌNH

STT
Tên
Trang
1
2
3
4
5
6
7
8

9

10
11
12
13

14
15
16
17
18
19
20

21

22

Hình 2.1: Quy trình ly trích và tách các hoạt chất ARL trong hạt neem.
Hình 3.1: Máy tách vỏ hạt neem.
Hình 3.2 : Máy ép dầu neem.
Hình 3.3 : Trích hoạt chất ARL trong bánh neem trong hình Soxhlet.
Hình 3.4 : Tách dung môi trong máy cô quay dưới áp suất thấp.
Hình 3.5: Hình dạng khuẩn lạc Nitrosomonas sp.
Hình 3.6: Hình dạng khuẩn lạc Nitrobacter sp.
Hình 3.7: Đường kính vòng vô khuẩn của ARL1, ARL4, ARL5 đối với chủng
Nitrosomonas spso với mẫu trắng.
Hình 3.8: Đường kính vòng vô khuẩn của ARL1, ARL4, ARL5 đối với
chủngNitrobacter sp so với mẫu trắng.
Hình 3.9: Quy trình ly trích azadirachtin trong nhân hạt neem.
Hình 3.10: Máy HPLC-UV dùng để đo hàm lượng azadirachtin.
Hình 3.11: Quy trình ly trích salannin trong nhân hạt neem.
Hình 3.12: Máy UV Cary 50 dùng để đo hàm lượng salannin, nimbim và
ARL.
Hình 3.13. Quy trình ly trích nimbin trong nhân hạt neem.
Hình 3.14: Quy trình điều chế ESO.
Hình 3.15: Quy trình điều chế sucroester.
Hình 3.16: Dung dịch nhũ dầu trong nước (o/w) của Limo NI.
Hình 3.17: Thùng thử nghiệm đo nitrat trong nước.
Hình 3.18: Chảo quay bao urê với Limo NI.
Hình 5.1: Hình cây cải ngọt được bón phân Limo NI/urê 0,6% và Limo NI/
urê 0% đối chứng.
Hình 5.2: Hình cây dưa chuột được bón phân Limo NI/urê 0,6% và Limo

NI/ urê 0% đối chứng.
Hình 6.1: Hình cây cải ngọt được bón phân Limo NI/urê 0,6%, 0,4% và 0%
đối chứng.
Hình 6.2: Hình cây dưa chuột được bón phân Limo NI/urê 0,6% và Limo NI
21
32
32
33
33
37
38
41

42

47
49
50
52

53
55
59
65
73
74
80

81

87

79


8

23
0% đối chứng.

PHẦN MỞ ĐẦU

1. Tên đề tài:Nghiên cứu sản xuất Limo NI trích từ hạt neem Azadirachta indica
dùng để giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng, đồng thời nâng cao hiệu quả phân đạm và
thƣơng mại hóa sản phẩm.
Chủ nhiệm đề tài: GS.TS Trần Kim Qui
Cơ quan chủ trì : Viện Công Nghệ Hóa Sinh ứng dụng
Thời gian thực hiện đề tài: 18 tháng (từ tháng 01/2012 đến tháng 7/2013)
Kinh phí đƣợc duyệt: 580.000.000đ
Kinh phí đã cấp: 350.000.000đ theo TB số: 180/TB-SKHCN ngày 15/12/2011
: 172.000.000đ theo TB số: 25/TB-SKHCN ngày 31/10/2013
2. Mục tiêu:
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Limo NI (Nitrification inhibitor) trích từ hạt neem
Azadirachta indica L.Juss dùng bao phân đạm, để khi bón vào đất phần lớn phân đạm không
bị thất thoát dưới dạng nitrat làm ô nhiễm môi trường, như thế nâng cao được hiệu quả sử
dụng phân đạm.
 Mục tiêu cụ thể:
– Dùng chế phẩm Limo NI để khử các vi sinh vật gây ra các phản ứng nitrit hóa
phân đạm sinh ra các chất như NO
2

–
, NO
3
–
một phần ngấm dần theo nước vào đất làm ô
nhiễm nguồn nước ngầm, một phần được cây trồng hấp thu làm ô nhiễm nguồn thực phẩm.
– Đo lượng NO
3
–
sinh ra trong nước ngầm và trong cây trồng để đánh giá tác dụng
khử các vi sinh vật nitrit hóa của chế phẩm Limo NI.
– Chứng tỏ mặc dù sử dụng phân đạm bao Limo NI ít hơn phân đạm không bao
nhưng năng xuất cây trồng vẫn cao hơn.
3. Nội dung nghiên cứu:
 Chiết xuất hoạt chất limonoid ARL trong hạt neem Azadirachta indica dùng để sản
xuất chế phẩm Limo NI.
 Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Limo NI làm giảm lượng nitrat hòa tan trong
nước gây ô nhiễm nguồn nước.


9

 Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Limo NI làm giảm lượng nitrat được cây trồng
hấp thu gây ô nhiễm nguồn thực phẩm.
 Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Limo NI làm tăng năng suất một số cây trồng như
dưa chuột, cải ngọt… do làm tăng hiệu quả sử dụng phân đạm.
3.1. Những nội dung thực hiện ở giai đoạn 1 (đối chiếu với hợp đồng đã ký)
TT
Công việc dự kiến
Công việc đã thực hiện

1
Nghiên cứu ly trích hoạt chất ARL trong
hạt neem Azadirachta indica.
Xác định được 3 hoạt chất ARL trích từ
hạt neem có tác dụng khử mạnh nhất VSV
nitrit hóa phân đạm.
2
Nghiên cứu xác định công thức điều chế
chế phẩm Limo NI.
Chế phẩm Limo NI với 3 hoạt chất ARL
có tính bền nhiệt và tạo nhũ tốt.
3
Xây dựng mô hình thử nghiệm do lượng
nitrat hòa tan trong nước thấm sâu vào
đất.
Thiết kế mô hình thử nghiệm dùng để đo
hàm lượng nitrat thất thoát và thấm vào
đất.
4
Nghiên cứu các tỷ lệ phối trộn Limo NI
với urê và đo lượng nitrat bị thất thoát.
Xác định được tỷ lệ Limo NI/urê làm giảm
thấp nhất lượng nitrat bị thất thoát.
5
Viết báo cáo giám định và giám định đề
tài.
Viết báo cáo giám định trình Hội đồng
thông qua.

3.2. Những công việc còn lại (tổng quát)

TT
Tóm tắt nội dung
Sản phẩm cần đạt
1
Xây dựng mô hình thử nghiệm đo lượng
nitrat được cây trồng hấp thu.
Xây dựng mô hình thử nghiệm đo lượng
nitrat được cây trồng hấp thu.
2
Nghiên cứu các tỷ lệ phối trộn Limo NI
với urê và đo lượng nitrat được cây trồng
hấp thu.
Xác định được tỷ lệ Limo NI/urê làm giảm
thấp nhất lượng nitrat được cây trồng hấp
thu.
3
Xây dựng mô hình thử nghiệm xác định
khả năng làm tăng năng suất cây trồng
của Limo NI.
Mô hình thử nghiệm dùng để đo khả năng
làm tăng năng suất cây trồng của Limo NI.
4
Nghiên cứu các tỷ lệ phối trộn Limo NI
với urê và xác định năng suất cây trồng
(dưa chuột, cải ngọt).
Xác định được tỷ lệ Limo NI/urê làm tăng
cao nhất năng suất cây trồng (dưa chuột,
cải ngọt).

10

5
Nghiệm thu đề tài cấp cơ sở.
Báo cáo được Hội đồng nghiệm thu cấp cơ
sở thông qua.
6
Nghiệm thu đề tài cấp thành phố.
Báo cáo được Hội đồng nghiệm thu cấp
thành phố thông qua.

4. Sản phẩm của đề tài
TT
Tên sản phẩm
Yêu cầu khoa học, kinh tế
1
Báo cáo tổng hợp.
Đạt yêu cầu của một báo cáo khoa học, đạt
mục tiêu đề xuất của đề tài.
Đảm bảo các yêu cầu của Sở KH&CN.
2
Phương pháp ly trích và định lượng hoạt
chất limonoid trong hạt neem.
Phương pháp có tính khoa học, dựa vào
các quang phổ kế hấp thu hiện đại như
HPLC-UV, NMR
1
H,
13
C.

3
Quy trình công nghệ điều chế Limo NI.
Chế phẩm NI có những tính chất sau:
 Hàm lượng hoạt chất tan trong CH
3
OH
≥ 15%.
 Tỷ trọng d = 0,91 – 0,98 g/cc.
 Hàm lượng C% > 70 (w/w).
 Ẩm độ M% ≤ 20 (w/w).
4
Báo cáo kết quả xác định chế phẩm Limo
NI làm giảm lượng nitrat hòa tan trong
nước và trong rau đồng thời tăng năng
suất cây trồng (dưa chuột, cải ngọt).
Kết quả phân tích có độ chính xác cao, xác
định được:
 Tỷ lệ bao Limo NI/urê để hàm lượng
nitrat trong nước và trong rau thấp
nhất, giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
 Lương urê bao Limo NI sử dụng thấp
hơn nhưng năng suất tăng cao hơn so
với đối chứng.
5
Báo cáo khoa học.
Đăng trên tạp chí trong nước, hội nghị
khoa học trong nước và quốc tế.

11

I. TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC ĐỀ TÀI
1.1.1. Đặt vấn đề
Phân đạm, đặc biệt urê là một loại phân rất quan trọng trong nông nghiệp được nông
dân sử dụng rất rộng rãi để bón cho cây trồng. Tuy nhiên phân đạm ngay sau khi bón vào
đất bị các VSV trong đất tác dụng làm thất thoát một lượng lớn đạm trong phân. Trước tiên
enzym urease thủy giải phân đạm như urê sinh ra carbonat amonium, chất này không bền
nên thủy giải tiếp theo phương trình : [1,2,3]
NH
2
C NH
2
O
urease
(NH
4
)
2
CO
3
NH
3
CO
2
H
2
O

+
+
2

Chỉ có một phần nhỏ NH
3
được cây trồng hấp thu dưới dạng NH
4
+
, còn phần lớn
NH
3
bị thất thoát do bốc hơi vào không khí và bị nitrit hóa thành nitrit NO
2
–
do các vi khuẩn
Nitrosomonas sp trong đất,sau đó thành nitrat NO
3
-
do vi khuẩn Nitrobacter sp theo các
phương trình sau đây: [4,5,6]
NH
3
NH
2
OH NO
2
–

NO

2
–
NO
3
–

Nitrosomonassp là một loại vi khuẩn hóa tự dưỡng hình cầu, một ít hình bầu dục,
hoạt động háo khí biến NH
4
+
và NH
3
thành NO
2
–
trong điều kiện t
o
= 20-35
o
C và pH=6,0-
9,0. Nitrosomonas sử dụng điện tử sinh ra trong phản ứng oxid hóa để tạo ra năng lượng và
hấp thu CO
2
để cấu tạo tế bào. [7,8]
Nitrobactersp cũng là một vi khuẩn hóa tự dưỡng háo khí hình cầu sống cộng sinh
với Nitrosomonassp, oxid hóa NO
2
–
thành NO
3

–
ở nồng độ oxy ≥ 0,5ppm, t
o
= 30-40
o
C,
pH=7,5-8,5. [9,10]
Nitrat có tính hòa tan tốt trong nước nên một phần nitrat sinh ra bị nước kéo theo
thấm sâu vào đất làm ô nhiễm nguồn nước ngầm; một phần nitrat khác được cây trồng hấp
thu làm ô nhiễm nguồn thực phẩm [11, 12]. VSV khử nitrit dùng nguồn C làm thực phẩm để
sống và hấp thu oxy trong các hợp chất nitrat để hoạt động và phát triển. Phản ứng khử nitrit
xảy ra mạnh nhất trong điều kiện háo khí ở pH=7,0-8,5 , t
o
=5-30
o
C. [13,14]

Nitrat vào cơ thể con người từ nguồn thực phẩm và nước uống, trong hệ tiêu hóa
nitrat được khử thành nitrit là chất chuyển hemoglobin trong máu thành chất
methemoglobin không hoạt động làm giảm hô hấp của tế bào và ảnh hưởng đến hệ tuyến
Nitrobacter sp
Nitrosomonas sp


12

giáp, gây đột biến và phát triển khối u dẫn đến bệnh ung thư.Theo WHO và cộng đồng kinh
tế Châu Âu, giới hạn hàm lượng nitrat trong thực phẩm và nước uống là 50ppm [15,16].
Quá trình phân giải phân đạm trong đất do VSV kết thúc trong vòng 15 – 20 ngày,
trong lúc này cây trồng chỉ có thể hấp thu được khoảng 45 – 50% lượng phân đạm bón vào

đất dưới dạng NH
4
+
, phần còn lại bị thất thoát vào không khí dưới dạng NH
3
, N
2
và dưới
dạng NO
3
-
trong đất làm ô nhiễm môi trường nước và thực phẩm [17,18].
Sơ đồ chu trình phân giải phân đạm trong đất:











1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Nhằm giảm thất thoát phân đạm làm ô nhiễm môi trường và gây ra nhiều vụ ngộ độc
và bệnh hiểm nghèo như bệnh ung thư , một số nhà nghiên cứu trong nước đã điều chế
phân nhả chậm để điều chỉnh lượng phân đạm cung cấp cho cây trồng. Theo hướng này có
các nhà nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ Hóa học Tp.Hồ Chí Minh đã tổng hợp được phân
bón ure formaldehyd (UF) với tỷ lệ ure và formaldehyd thay đổi. Kết quả cho thấy sản phẩm

UF nhả nitơ chậm hơn và đều hơn so với ure đối chứng, lượng nitơ nhả ra càng chậm khi
hàm lượng formaldehyd trong UF càng cao[29].
Năm 2004, chất Agrotain [25,26] được đưa từ Mỹ sang Việt Nam. Viện lúa Đồng
Bằng Sông Cửu Long khảo nghiệm Agrotain trên cây lúa ở Cần Thơ và Sóc Trăng, Viện
KHKTNN miền Nam cũng khảo nghiệm trên cây lúa và các cây trồng cạn như dưa chuột,
mướp đắng, cải bẹ xanh ở các tỉnh miền Đông. Kết quả cho thấy nếu phối trộn Agrotain vào
ure để bón cho cây trồng thì giảm được khoảng 25-30% lượng ure mà năng xuất cây trồng
vẫn cao hơn đối chứng (tức cây trồng bón đủ 100% urê). Với những kết quả khảo nghiệm
NO
2
–

Nitrobacter sp
NO
3
–

Hòa tan trong nước
Phân đạm
urease
NH
3

Thất thoát vào
không khí
Nitrosomonas sp
NH
4
+

Cây trồng
hấp thu
(nitrat)
Thấm sâu
vào đất
(nitrit)


13

nói trên Công ty Phân bón Bình Điền ở huyện Bình Chánh Tp Hồ Chí Minh nhập độc quyền
Agrotain từ công ty Agrotain International LLC (Mỹ) để phối chế ra phân bón NPK đầu trâu
TE+ Agrotain và phân đạm hạt vàng 46A+ bán ra thị trường từ năm 2010 [30]. Nhưng do
giá bán cao nên không được nông dân ưa chuộng.
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc
Để giải quyết các vấn đề thất thoát phân đạm trong đất dưới dạng NO
3
–
làm ô nhiễm
môi trường nước và thực phẩm đồng thời làm giảm lượng phân đạm sử dụng, nhiều nhà hóa
học trên thế giới đã nghiên cứu dùng 1 trong 2 biện pháp sau đây:
– Khử enzyme urease để ngăn chặn quá trình thủy giải phân đạm trong đất.
– Khử các chủng vi sinh vật Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp để ngăn chặn các quá
trình nitrit hóa NH
4
+
và NH
3
do phân đạm sinh ra trong đất.
Nhiều hóa chất đã được tổng hợp để trộn vào phân đạm nhằm khử enzyme urease

hoặc khử các vi sinh vật gây ra quá trình nitrit hóa NH
4
+
và NH
3
. Một số hóa chất đã được
thử nghiệm có kết quả tốt và đang được thương mại hóa trên toàn thế giới như:
 Nitrapyrin tên hóa học 2-chloro-6-(trichloromethyl) pyridine do Công ty Dow
Chemical sản xuất, được cơ quan Bảo vệ Môi trường (EPA) Mỹ cho phép sử dụng
trên toàn liên bang dùng để khử các VSV nitrit hóa [19].
 Dicyandiamide (DCD) tên hóa học dicyanodiamide do Công ty SKW Trostberg
AG (Anh) sản xuất dùng để khử các VSV nitrit hóa [20,21,22].
 DMPP tên hóa học 3,4-dimethylpyrazole phosphate do Công ty The International
Fertilizer (Mỹ) sản xuất dùng để khử các VSV nitrit hóa [23,24]
 nBTPT còn gọi Agrotain, tên hóa học N-(n-butyl)thiophosphoric triamide do Công
ty Summit-Quinphos Ltd (Mỹ) sản xuất dùng để khử enzyme urease [25,26]
Trong những năm gần đây một số nhà hóa học Ấn Độ ly trích hoạt chất từ hạt neem
Azadirachta indica dùng để ngăn chặn sự nitrit hóa phân đạm do vi sinh vật trong đất. Kết
quả là đã giảm được khoảng 10% phân đạm bón vào đất mà năng xuất cây trồng lại tăng
khoảng 10–15% [27]
Công ty phân bón NICO ORGO của Ấn Độ nghiên cứu sản xuất chế phẩm N–Guard
với hoạt chất trích từ cao hạt neem Azadirachta indica để bao phân đạm theo tỷ lệ 0,6%, kết
quả là đã giảm được lượng phân đạm sử dụng khoảng 25% mà năng xuất cây trồng trong 3
mùa vụ tăng đến 55%. Kết quả này được công bố tại Hội nghị Quốc tế về "Các biện pháp
nâng cao hiệu quả sử dụng phân bón" tổ chức tại Miami, FL, USA tháng 3 năm 2010 [28]



14

1.1.4. Tính cần thiết của đề tài
Như đã trình bày trên đây, phân đạm đặc biệt urê một loại phân bón quan trọng nhất
được nông dân sử dụng để tăng năng suất cây trồng. Nhưng khi bón vào đất, phân đạm này
bị các enzym thủy phân urease và cặp vi khuẩn nitrit hóa Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp
tác dụng sinh ra nitrat NO
3
–
làm thất thoát khoảng 45-50% lượng phân đạm trong thời gian
ngắn khoảng 15-20 ngày, làm ô nhiễm nguồn nước ngầm do có chứa nhiều chất nitrat sinh
ra các bệnh như ung thư… đồng thời làm ô nhiễm nguồn thực phẩm do làm tăng hàm lượng
nitrat trong các loại rau, củ, quả dẫn đến nhiều chứng bệnh khác về gan, thận… rất nguy hại
[15,16].
Mặc khác, chu kỳ sinh trưởng của cây trồng thường kéo dài từ 30-100 ngày mà phân
đạm chỉ có thể tồn tại trong đất khoảng 15 ngày nên cây trồng chỉ sử dụng được khoảng 50-
55% lượng đạm bón vào đất trong thời gian ngắn 15 ngày ban đầu, sau đó cây trồng không
còn đạm để sử dụng. Người nông dân phải mua một lượng lớn phân đạm, giá ngày càng
tăng để bón thêm mà năng suất cây trồng vẫn không cao như mong muốn. Nhà nước cũng
phải bỏ ra một lượng lớn ngoại tệ để nhập siêu mỗi năm hơn 3 triệu tấn phân urê và các loại
phân đạm khác.
Với mục đích nâng cao hiệu quả sử dụng phân đạm đồng thời bảo vệ môi trường
nhiều nhà hóa học trên thế giới đã tổng hợp một số hóa chất có giá thành cao để khử cặp vi
khuẩn nitrit hóa phân đạm như Nitrapyrin, DCD, DMPP nói ở phần trên nhưng bản thân các
hóa chất này cũng làm ô nhiễm không ít môi trường nước, đất và cũng không phải hoàn toàn
vô hại đối với các vi sinh vật hữu ích trong đất. Một số nhà khoa học Ấn Độ đã nghiên cứu
sử dụng hoạt chất ly trích từ hạt neem để điều chế chất N-Guard nhằm khống chế sự nitrit
hóa do cặp vi khuẩn Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp, nhưng các tác giả này cũng chỉ
công bố tác dụng của N-Guard là đã giảm được 25% lượng phân đạm sử dụng và năng xuất
cây trồng tăng được khoảng 5–15%. Các vấn đề khác như phương pháp điều chế, thành
phần của chế phẩm N-Guard và nhất là các tác động tích cực của N-Guard đến môi trường
thì không được đề c p đến. Trong nước ta thì chưa ai nghiên cứu vấn đề này.

Do đó việc nghiên cứu sản xuất một chế phẩm từ cây neem như các nhà khoa học Ấn
Độ đang làm,nhằm ngăn chặn sự nitrit hóa phân đạm sinh ra chất NO
3
–
gây ô nhiễm môi
trường đất, nước và nguồn thực phẩm, đồng thời làm tăng năng suất cây trồng và giảm
lượng phân đạm sử dụng là rất cần thiết đối với chúng ta hiện nay.
1.2.
1.2.1. Giới thiệu về cây neem
Cây neem tên khoa học Azadirachta indica A. Juss, họ xoan (Meliaceae) xuất xứ từ
Ấn Độđược trồng đại trà thành rừng khắp nước này và là nguồn l i rất lớn cho Ấn Độ [31].


15

Neem là cây thân gỗ to, cao 5-10 m, ở điều kiện thích hợp đạt độ cao khoả
- chịu hạn tốt. Nó là loại cây có lá xanh quanh năm, phát triển tốt ngay trên đất
cát nghèo kiệt, khô cằn.
Cây có nhánh rộng, tán lá hình oval hay tròn đường kính khoảng 15-20 cm.
Thân cây ngắn, thẳng, vỏ cây cứng, xù xì, có nhiều rãnh nứt, bên ngoài màu xám và
đỏ lợt bên trong, có mùi tỏi, vị rất đắng. Đặc điểm bên ngoài và độ dày của vỏ phụ thuộc
vào tuổi của cây và điều kiện môi trường. Vỏ thân cây non thường nhẵn, màu xanh nhạt pha
đồng, có độ dày khoảng 1,25-2,5 cm.
Lá neem thuộc loại lá kép lông chim một lần, dạng mác, bìa lá có khía hình răng cưa,
cuống lá ngắn. Cây ra lá non vào tháng 3 – 4 và bộ lá thường xanh tốt quanh năm, không có
thời kỳ rụng lá.
Hoa mọc thành chùm ở nách lá, màu trắng, hương thơm, cuống ngắn và có 5 cánh.
Hoa lưỡng tính và hoa đực có thể xuất hiện trên cùng một cây, cánh hoa rời, xếp lớp, phủ
đầy lông mịn. Ống nhụy hình trụ, cao khoảng 3 – 5mm, miệng hơi loe. Ở Sri Lanka, Ấn Độ
và Việt Nam, cây thường ra hoa từ tháng 3 đến tháng 4. Tuy nhiên ở vài vùng của Ấn Độ,

cây có thể ra hoa quanh năm.
Trái neem có hình bầu dục, trơn láng và dài khoảng 2cm. Trái hình thành, phát triển
và chín trong vòng 1 – 2 tháng. Thời điểm thu hoạch trái tốt nhất là lúc trái vừa chuyển sang
màu xanh vàng và nên hái trái khi còn trên cây không để trái rụng xuống đất chất lượng bị
giảm. Cây trưởng thành mỗi năm có thể cho 30 – 50kg trái. Thông thường, trái chín từ tháng
6 đến tháng 8. Mỗi hecta có thể trồng từ 100 – 200 cây, sản lượng trái hàng năm khoảng 5 –
10 tấn.
Tại Ấn Độ, cây neem từ lâu đã được xem là một tài nguyên quý giá do tính chất đa
dụng của nó và là một trong số ít loài thực vật mà tất cả bộ phận đều có công dụng tốt.
* Lá: Một cây neem cao 7,5 – 8m cho trung bình hàng năm khoảng 350kg lá tươi
(khoảng 50kg lá khô).
Tại một số vùng ở Ấn Độ, nông dân thường cho gia súc ăn lá neem sau khi sinh con
để gia tăng sự tiết sữa. Ngoài ra, lá neem còn có tác dụng phòng trị bệnh giun sán cho gia
súc, kiểm soát nhiều loại tác nhân gây bệnh cho người, gia súc và cây trồng do lá có chứa
nhiều hợp chất như nimbin, nimbinene, nimbandiol, nimbolide, quercetin…. Nhiều nơi lá
neem non còn được dùng làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất, vừa phòng ngừa giun sán
hoặc viêm nhiễm đường ruột ( Srivastav và ctv, 1998).
* Trái: Trái neem khi chín có vị ngọt, có thể ăn được hoặc sử dụng trong công nghệ
lên men. Trái neem được làm thuốc tẩy giun, thuốc giảm đau và thuốc trị bệnh đường tiết


16

niệu, bệnh trĩ. Quả khô ngâm nước có thể trị một số bệnh ngoài da. Nước thịt quả khi phun
lên cây có thể xua đuổi nhiều côn trùng, đặc biệt rất hữu hiệu đối với châu chấu.
* Nhân: Nhân hạt neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như azadirachtin,
salanin, nimbin, meliantriol… Dầu chiết từ nhân hạt neem được dùng để sản xuất thuốc
giảm đau, thuốc sát trùng và thuốc ngừa thai. Ngoài ra, dầu hạt neem còn được sử dụng
trong ngành mỹ phẩm, xà phòng và nhiều công nghiệp khác. Tại Ấn Độ và Sri Lanka,
khoảng 25% hạt neem được sử dụng cho ngành dược, số còn lại được dùng làm thuốc trừ

sâu.
* Bánh dầu neem: Bánh dầu neem chứa khoảng 1,00 – 1,40% hợp chất sulfur,
khoảng 1,5 – 2,5% N, khoảng 0,7 – 1,2% P
2
O
5
và 1,2 – 1,5% K
2
O. Bánh dầu neem là nguồn
phân hữu cơ rất tốt, vừa cung cấp chất dinh dưỡng cho cây, vừa diệt được các loại tuyến
trùng, kiến mối trong đất và có khả năng ức chế quá trình nitrat hóa trong đất làm tăng hiệu
quả sử dụng đạm của đất trồng. Theo Rao (1993), khi bón phân ure trộn với dầu neem, mức
hấp thụ đạm, lân và kali ở cây cỏ hương (Cymbopogon winterianus Jowitt.) tăng theo thứ tự
17, 15 và 25% so với khi chỉ bón phân ure. Lượng đạm mất do bay hơi NH
3
cũng giảm
31%.
* Vỏ cây: Dịch chiết từ vỏ cây neem được dùng làm thuốc chữa đau răng, trị bệnh sốt
rét, bệnh vàng da hoặc dùng để nhuộm lụa. Vỏ cây có chứa nimbin, nimbidin, nimbinin nên
cũng được dùng để điều chế thuốc bảo vệ thực vật và một số thuốc trị bệnh ngoài da.
Từ năm 1960, cây neem đã nổi tiếng trên khắp thế giới do từ cành, lá và hạt neem các
nhà hóa học đã trích được một số hoạt chất limonoid có tác dụng gây ngán ăn và xua đuổi
côn trùng rất có hiệu quả. Các loại thuốc bảo vệ thực vật như Neemgold, Margocide CK…
điều chế từ cây neem rất được ưa chuộng ở Ấn Độ. Nhiều nước trên thế giới đã mang cây
neem về trồng trên đất nước họ để sử dụng. Hai sản phẩm Neem Azal và Neem Azal F sản
xuất từ cây neem tại Đức được bán khắp châu Âu. Năm 1975, Bộ Nông nghiệp Mỹ đã xây
dựng kế hoạch trồng cây neem trên khắp nước Mỹ. Đến năm 1985, Cơ quan Bảo vệ Môi
trường Mỹ đã cho phép bán ra trên khắp nước Mỹ hai loại thuốc bảo vệ thực vật trích ly từ
lá và hạt cây neem với tên thương mại Margosan-O và Izatin. Từ năm 1985, Bộ Nông
nghiệp Nhật, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc cũng đã đưa cây neem về trồng và đến nay họ

cũng đã sản xuất ra nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật và thuốc trị bệnh cho người, gia súc, gia
cầm. Hai chế phẩm Yu Teng và Ku Seng chiết xuất từ hạt neem để xua đuổi côn trùng rất
được nông dân Trung Quốc ưa chuộng.
Từ năm 1980 đến nay đã có 8 hội nghị khoa học quốc tế về cây neem tổ chức tại
CHLB Đức (lần 2, 1983), Pakistan (1986), Kenya (lần 3, 1987), Mỹ (1992), Ấn Độ (1993),
Philippin (IRRI,1994), Úc (1996), Anh(1999). Họ đã khẳng định giá trị của cây neem trong
lĩnh vực thuốc bảo vệ thực vật, diệt trừ sâu mọt, nấm mốc và trị bệnh cho người. Đến nay


17

người ta đã xác định được trên 150 limonoid trong cây neem, trong đó có khoảng 30 chất có
cấu trúc và tác dụng tương tự như azadirachtin. Các limonoid chỉ gồm các nguyên tố C, H,
O, N không có Cl, P và các nhóm có độc tính khác nên không hại đối với người và gia súc
gia cầm, không làm ô nhiễm môi trường và không có dư lượng độc trong rau quả như các
loại thuốc trừ sâu tổng hợp.
Cây neem ở nước ta được GS Lâm Công Định mang hạt giống từ Senegal về trồng từ
năm 1993 trên các vùng đất khô cằn Tuy Phong tỉnh Bình Thuận. Đến nay tỉnh Ninh Thuận
đã trồng được khoảng 4.700 ha cây neem làm rừng phòng hộ và có kế hoạch đến năm 2015
trồng được 7.000 ha. Cây neem ở 2 tỉnh Bình Thuận và Ninh Thuận phát triển tốt, hàng năm
có thể cho trên 10.000 tấn trái và hơn 15.000 tấn cành lá để đưa ra sản xuất.
1.2.2. Hoạt chất limonoid trong cây neem [32,33,34]
Hoạt chất đầu tiên có tác dụng gây ngán ăn cho loại châu chấu Schistocerca gregaria
được 2 nhà hóa học Morgan và Butterworth ly trích từ năm 1968 và đặt tên là azadirachtin
(AZ). Kết quả thử nghiệm sau đó cho thấy azadirachtin ở nồng độ 50ppm gây ngán ăn cho
loài Earias fabia (Phytoparasiteca 9/1, 27, 1981), ở nồng độ 5 – 10 ppm ngăn chặn sự phát
triển của loài Spodoptera litura (Indian J. Exp. Biol, 23(3), 16,1985) và ở nồng độ 10 – 100
ppm ngăn chặn sự phát triển và sự sinh sản của loài Epilachna verivestis (Z. Angew
Entomol, 93, 12, 1982). LD
50

của azadirachtin đối với S.litura là 1,1 γ/g (J. Entomol. Res.
11/2, 166, 1987). Tác dụng lưu dẫn của azadirachtin từ rễ đến lá cũng được Saxena và ctv
chứng minh (J. Econ. Entomol. 77/2, 502, 1984).
Từ đó đến nay có gần 100 tetranortriterpenoid (limonoid) trong đó có khoảng 30 dẫn
xuất của azadirachtin được cô lập từ các dịch trích của cây neem được gọi tên chung là ARL
(Azadirachtin related limonoid)
azadirachtin A, B, D, E, F, G, H, I, K, L nồng độ 1 – 10 ppm có tác dụng ngăn chặn sự phát
triển đối với Epilachna verisestis (Insectisides of Plant Origin ACS Symposium series, 387,
150, 1989), azadirachtin do Morgan và Butterworth trích ra trước đây nay được gọi là
azadirachtin A. 3-Tigloylazadirachtol nồng độ 1 ppm có tác dụng gây ngán ăn 97% nhiều
loại côn trùng (Tetrahedron 45, 5175, 1989). Các hợp chất khác đều có ít nhiều tác dụng
gây ngán ăn, diệt sâu bọ hay xua đuổi hoặc ngăn chặn sự phát triển và sự sinh sản của côn
trùng (Proceeding, 3
rd
International Neem Conference, 1997).
Ngoài ra, các chế phẩm neem chứa limonoid còn có tác dụng diệt được vi khuẩn và
nấm bệnh hại cây trồng. Nhiều thí nghiệm chứng tỏ dầu neem có tác dụng bảo vệ các loại
đậu chống các loại nấm bệnh như Rhizocionia solani, Sclerotium solfsii, Sclerrotinia
sclerotiorum, Fusarium oxysporum. Bánh dầu neem trộn trong đất diệt được nấm R. solani.
Dịch trích hạt neem có tác dụng trị được các bệnh nấm lá. Dịch trích dầu neem trị được các


18

loại mốc sương trên cây (tốt hơn thuốc diệt nấm Benlat) và trị được 90% bệnh rỉ sét và bệnh
cháy lá.
Dịch trích lá neem có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Fusarium equiseti, F.
semitectum, Aspergillus flavus, A.niger và nấm bệnh gây bệnh cháy lá lúa Pyricularia
oryzae (Rajeswari and Mariappan, 1993).
Loại vi nấm rất dễ lây lan do nhiều loại côn trùng nhiễm vi nấm mang từ nơi này sang

nơi khác. Đến nay vẫn chưa có thuốc đặc trị. Các chế phẩm neem cho kết quả khá tốt.
Một số thí nghiệm ở Philippines cho thấy khi phun dung dịch dầu neem trên cánh
đồng lúa bị nhiễm vi nấm hoại sinh, sau 3 ngày các cây lúa dần dần hồi phục.
Một số thí nghiệm ở Ấn Độ cho thấy dịch trích lá neem có thể ngăn chặn sự lây lan
của vi nấm gây bệnh đốm lá trên vườn rau quả.
Chế phẩm neem chứa ARL diệt được nhiều loại tuyến trùng trong đất. Điều này rất có
ý nghĩa vì tuyến trùng rất khó trị, một số thuốc tổng hợp trị tuyến trùng đều rất độc nên bị
cấm sử dụng ở nhiều nơi.
Theo Siddiqui và Alam (1985) dịch trích từ lá, trái và nhân hạt neem trị được nhiều
loại tuyến trùng như Helicotylenchus indicus, Tylenchus filiformis, Rotylenchus reniformis.
Trong bánh dầu neem sau khi ép dầu và trích hoạt chất còn chứa một ít limonoid nên khi
trộn với phân bón như phân ure có thể diệt được các tuyến trùng gây bệnh bướu rể, một loại
bệnh lây lan nhanh và có tác hại rất lớn cho cây trồng.
Việc nghiên cứu chiết xuất hoạt chất ARL trong cây neem ở nước ta còn rất hạn chế:
 Năm 2002, Dương Anh Tuấn và CTV thuộc Viện Hóa học Trung tâm KHTN –
CNQG và Viện Bảo vệ thực vật Bộ NN – PTNT đã trích ly được hoạt chất azadirachtin từ
nhân hạt cây neem lấy ở Thuận Hải và cũng đã thử nghiệm thấy nó có tác dụng gây ngán ăn
mạnh đối với sâu khoang Spodoptera litura [35].
 Năm 2004, Nguyen Thuong Dong và CTV thuộc Viện Dược liệu Bộ Y Tế nghiên
cứu sơ bộ thành phần hóa học và tác dụng dược lý của lá neem, Tạp chí Dược liệu, tập 9 số
01/2004 [36].
 Năm 2011, Vũ Văn Độ Viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh đã nghiên cứu
thành công đề tài cấp Thành phố “Thử nghiệm tạo một số dạng chế phẩm diệt muỗi truyền
bệnh sốt rét và sốt xuất huyết từ dịch chiết lá và nhân hạt neem Azadirachta indica A. Juss
trồng tại Việt Nam [37].
 Năm 2012, Nguyễn Thị Ý Nhi dưới sự hướng dẫn của Trần Lê Quan và Trần Kim
Qui đã bảo vệ thành công luận án Tiến sĩ “Nghiên cứu thành phần limonoid của lá cây neem
Azadirachta indica trồng ở Ninh Thuận”, trong luận án này tác giả đã chiết được 20

19

limonoid trong đó có 16 limonoid mới mà thế giới chưa công bố (kiểm tra theo phần nềm
Scifinder) [38].
 Từ năm 2006 đến năm 2013 Trần Kim Qui cùng các cộng sự đã thực hiện thành công
các đề tài và dự án sau đây:
 Đề tài NCKH: Ly trích hoạt chất từ cành, lá cây neem và cây cóc hành (còn gọi là
cây neem địa phương) làm thuốc trị bệnh cho người và gia súc, gia cầm; đề tài cấp
Tỉnh Ninh Thuận nghiệm thu tháng 10 năm 2007, được Hội đồng nghiệm thu đánh
giá đạt loại 1 [39].
 Đề tài NCKH: Hoàn thiện quy trình trích ly hoạt chất limonoid ARL trên quy mô
pilot từ cây neem và điều chế các phụ gia thích hợp để làm nguyên liệu pha chế thuốc
bảo vệ thực vật; Đề tài cấp Tp Hồ Chí Minh nghiệm thu tháng 9 năm 2006, được Hội
đồng nghiệm thu đánh giá đạt loại Khá [40].
 Dự án NCKH: Ly trích hoạt chất Azadirachtin≥ 3% trong hạt neem để làm thuốc bảo
vệ thực vật; Dự án cấp Thành phố Hồ Chí Minh nghiệm thu tháng 12 năm 2011,
được Hội đồng nghiệm thu đánh giá đạt loại Khá [41].
 Dự án CGCN: Xây dựng mô hình ứng dụng công nghệ chiết xuất hoạt chất
Azadirachtin limonoid ARL từ cây neem (Azadirachta indica) làm nguyên liệu để
sản xuất chế biến một số sản phẩm khác; Dự án cấp Nhà nước chuyển giao công
nghệ cho Trung tâm Thông tin và ứng dụng tiến bộ KHCN Ninh Thuận, Sở Khoa học
Công nghệ tỉnh Ninh Thuận, nghiệm thu tháng 4
đánh giá đạt loại khá [42].
1.3.
Như đã trình bày trên đây khi bón phân đạm vào đất thì chỉ trong vòng 15 ngày
khoảng 45-50% phân đạm bị thất thoát do cặp vi sinh vật nitrit hóa tác dụng sinh ra chất
nitrat làm ô nhiễm môi trường đất, nước và nguồn thực phẩm. Để giải quyết vấn đề trên,nhất
thiết phải khử cặp vi khuẩn nitrit hóa này.
Việc nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất một số limonoid trong hạt
cây neem trồng ở Ninh Thuận để phối chế ra một chế phẩm mới đặt tên là Limo NI từ

những nguyên liệu trong nước có khả năng khử được cặp vi khuẩn nitrit hóa phân đạm trong
đất là một đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Nếu đề tài được thành công thì chẳng
những nó góp phần đáng kể vào việc bảo vệ nguồn nước ngầm và rau củ quả không bị
nhiễm độc nitrat mà còn giúp nông dân sử dụng một lượng đạm ít hơn mà năng suất cây
trồng vẫn tăng cao; như thế người nông dân được tăng thêm thu nhập và Nhà nước không
phải chi nhiều ngoại tệ để nhập nhiều phân đạm như hiện nay.



20

II. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT
NEEM VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ARL KHỬ MẠNH NHẤT VI SINH VẬT NITRIT HÓA
PHÂN ĐẠM
2.1.1. Mô tả nội dung
2.1.1.1. Ly trích và tách các hoạt chất ARL trong hạt neem
a. Dùng 5 dung môi thông dụng có độ phân cực khác nhau như: hexane, ether dầu,
ethyl acetate, ethanol, dichlorometane lần lượt trích ly các ARL trong bánh neem.
Chưng cất áp xuất thấp, tách dung môi, thu cao ARL của các dung môi khác
nhau.
b. Chạy sắc ký điều chế bản mỏng với các dung môi giải ly có độ phân cực khác
nhau, chọn chất giải ly thích hợp để tách các ARL.
c. Pha thuốc thử Salkowski (dung dịch vanillin, H
2
SO
4
trong methanol tạo ra màu
xanh lục khi có sự hiện diện của limonoid) phun vào bản sắc ký đểphát hiện các

chất ARL,hiện ra với màu xanh lục trên bản sắc ký.
d. Tách các chất ARL, tìm dung môi thích hợp hòa tan từng chất ARL.
2.1.1.2. Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp trong
đất trồng rau (có bón phân đạm) và nhân giống 2 chủng vi khuẩn này.
a. Phân lập chủng Nitrosomonas sp trong môi trường Winogradsky P
1
và phân lập
chủng Nitrobacter sp trong môi trường Winogradsky P
2
.
b. Nhân giống Nitrosomonas sp trong môi trường Watson và nhân giống Nitrobacter sp
trong môi trường Hall-Murphy.
2.1.1.3. Thử tính sát khuẩn của các chất ARL đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và
Nitrobacter sp theo phƣơng pháp kháng sinh đồ dựa vào vòng tròn vô khuẩncủa các
ARL trên bề mặt môi trƣờng Nutrient agar nuôi cấy vi khuẩn.
a. Chọn 3 chất ARL có tác dụng khử mạnh nhất 2 chủng Nitrosomonas sp và
Nitrobacter sp (có vòng tròn vô khuẩn lớn nhất).
b. Dùng phương pháp phổ nghiệm để định danh 3 chất ARL có tác dụng khử mạnh nhất
2 chủng vi khuẩn này.
2.1.2. Phƣơng pháp
2.1.2.1. Ly trích và tách các hoạt chất ARL trong hạt neem
Hoạt chất ARL trong hạt neem được ly trích và tách ra theo hình sau đây: (Hình 2.1)


21

Hình2.1: Quy trình ly trích và tách các hoạt chất ARL trong hạt neem.

Tách vỏ hạt neem
Nghiền mịn nhân
hạt
Ép dầu neem
Tách dung
dịch trích
Chưng cất áp suất
thấp thu 5 loại cao
trích ly (TL)

0
Sắc ký bản mỏng
tách các hoạt chất
ARL trong cao TL
Dung môi
thu hồi
Hạt neem khô
Dầu
neem
Ly trích các ARL
trong bánh neem
Bả hạt
neem
Vỏ hạt
neem
Dùng 5 dung môi có độ
phân cực khác nhau
ARL1
ARL2
ARL3
ARL4
ARL5
ARL6
Phun thuốc thử
Salkowski để hiện
màu các ARL
Tách các ARL
Thu 6 ARL có hàm lượng cao nhất

22

2.1.2.2. Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp.
a. Phân lập và nhân giống chủng Nitrosomonas sp.
i. Phân lập:
Lấy 1g đất trồng rau có bón phân đạmở độ sâu khoảng 10cm;pha loãng đến nồng độ
thích hợp;cấy trải trên môi trườngWinogradsky P
1
. Ủ ở 28 ± 2
o
C trong 4 ngày; quan sát đại
thể, vi thể và nhuộm Gram để nhận biết giống vi sinh vật.
Môi trường Winogradsky P
1
:
(NH
4
)
2
SO
4
: 0,2g
K
2
HPO
4
: 1,0g
MgSO

4
,7H
2
O : 0,5g
NaCl : 2,0g
FeSO
4
,7H
2
O : 0,4g
CaCO
3
: 0,01g
Agar : 15,0g
Nước cất qsp : 1000ml
ii. Nhân giống
Nhân giống trong môi trườngWatson ở nhiệt độ 30
o
C. Theo dõi quá trình lên men
bằng kỹ thuật đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu.
Môi trường Watson:
(NH
4
)
2
SO
4
: 3g
K
2

HPO
4
: 0,5g
MgSO
4
,7H
2
O : 0,05g
NaCl : 0,04g
Phenol red : 0,05mg
FeSO
4
,7H
2
O : 0,05g
CaCO
3
: 1g
Nước cất qsp : 1000ml
b. Phân lập và nhân giống chủng Nitrobacter sp.
i. Phân lập:
Lấy1g đất trồng rau có bón phân đạm ở độ sâu khoảng 10cm;pha loãng đến nồng độ
thích hợp, cấy trải trên môi trườngWinogradsky P
2
. Ủ ở 28 ± 2
o
C trong 4 ngày; quan sát đại
thể, vi thể và nhuộm Gram để nhận biết giống vi sinh vật.

23

Môi trường Winogradsky P
2
:
KNO
2
: 0,1g
Na
2
CO
3
: 1,0g
NaCl : 0,5g
FeSO
4
,7H
2
O : 0,4g
Agar : 15,0g
Nước cất qsp : 1000ml
ii. Nhân giống
Nhân giống trong môi trường Hall-Murphy ở nhiệt độ 30
o
C. Theo dõi quá trình lên
men bằng kỹ thuật đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu.
Môi trường Hall-Murphy:
KNO

2
: 0,5g
K
2
HPO
4
: 0,25g
NaCl : 0,3g
MgSO
4
,7H
2
O : 1,4g
CaCO
3
: 1g
Nước cất qsp : 1000ml
3.1.2.3. Thử nghiệm tính sát khuẩn của 6 chất ARL có hàm lƣợng cao nhấttrích từ
hạt neem, đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp.
a. Vật liệu và môi trường
 Vi khuẩn thử nghiệm: Các chủng vi khuẩn Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp được
giữ giống trong ống thạch nghiêng ở 4
o
C.
 Môi trường kháng sinh đồ: Môi trường Nutrient agar.
Cao thịt : 3g
Pepton : 5g
NaCl : 5g
Agar : 20g
Nước qsp : 1000ml

 Mẫu thử nghiệm: Các chất ARL1, ARL2, ARL3, ARL4, ARL5, ARL6 (tên chung là
ARLx) bảo quản ở nhiệt độ 4
o
C trong chai có màu và đậy kín nắp.
 Dụng cụ:
 Hộp petri thủy tinh có đường kính 110mm vô trùng (36 hộp).
 Que cấy trải tam giác vô trùng.
 Các đĩa giấy có đường kính 5mm, được tiệt trùng qua nồi hấp autoclave ở
121
o
C, 1atm trong 30 phút và sấy khô hoàn toàn.


24

b. Làm kháng sinh đồ
 Phương pháp thử nghiệm: Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (Agar dilution) đo
đường kính vòng vô khuẩn tức là vòng không có vi khuẩn mọc xung quanh đĩa giấy có đẫm
mẫu chất ARLx.
 Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn chọn và tách ra 3 chất trong số các ARLx có tác
dụng ức chế mạnh nhất 2 chủng vi khuẩn Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp (có vòng vô
khuẩn lớn nhất).
 Dùng phương pháp phổ nghiệm để định danh 3 chất ARLx này.
2.2. NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ CHẾ
PHẨM LIMO NI
2.2.1. Nội dung và phƣơng pháp
2.2.1.1. Ly trích 3 hoạt chất ARLx trong nhân hạt neem có tác dụng ức chế mạnh
nhất 2 chủngNitrosomonas sp và Nitrobacter sp (Theo kết quả của nội dung 1).
a. Dùng hệ dung môi có tính năng trích ly chọn lọc các limonoid để trích các ARLx
trong hạt neem. Chưng cất dưới áp suất thấp thu hồi dung môi và thu được cao trích

ly ARLx.
b. Để tách các ARLx trong cao trích ly dùng phương pháp sắc ký cột điều chế với các
cột hấp phụ khác nhau.
 Cột silica gel với dung môi giải ly có độ phân cực yếu và trung bình hoặc hỗn hợp
gradient các dung môi.
 Cột alumina hạ hoạt với dung môi giải ly có độ phân cực trung bình và mạnh
hoặc hỗn hợp gradientcác dung môi.
 Cột ODS pha đảo với dung môi giải ly phân cực mạnh.
c. Thu hồi dung môi giải ly và tinh chế 3 hoạt chất ARLx có tác dụng ức chế mạnh
nhất.
2.2.1.2. Điều chế chất tạo màngESOđể bảo vệ các hoạt chất ARLx trong chế phẩm
Limo NI.
Một trong những chất mà các nhà hóa học sử dụng để tạo màng che, ngăn chặn ánh
sáng mặt trời tác dụng làm giảm cấp hoạt chất ARL là một loại dầu đậu nành epoxy ESO
(Epoxidised Soybean Oil) tên thương mại là dầu vernolat.
Dầu ESO được điều chế qua các giai đoạn:
 Epoxid các nối đôi trong dầu đậu nành bằng hỗn hợp H
2
O
2
- formic acid.
 Trung hòa hỗn hợp phản ứng với Na
2
CO
3
đến pH=7.


25

2.2.1.3. Điều chế chất hoạt diện Sucroester nhằm giúp chế phẩm Limo NI thấm đều
và tác dụng tốt trong đất
Sucroester được điều chế qua 2 giai đoạn:
 Điều chế ethyl laurat từ ethanol và dầu dừa.
 Xuyên ester hóa giữa sucrose và ethyl laurat với xúc tác lipase trong thời gian 20 giờ
ở t
o
40
o
C và áp suất thường.
2.2.1.4. Lập công thức pha chế Limo NI bền nhũ và bền nhiệt.
Công thức pha chế Limo NI dựa vào tính chất các thành phần và công dụng của sản
phẩm.
2.2.2. Thử độ bền nhiệt và bền nhũ của Limo NI
2.2.2.1. Thử độ bền nhiệt của Limo NI theo tiêu chuẩn CIPAC, vol F, MT 46.
2.2.2.2. Thử độ bền nhũ của Limo NI theo tiêu chuẩn CIPAC vol F, MT20.
2.3. NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƢỢNG NITRAT
HÒA TAN TRONG NƢỚC VÀ THẤM SÂU VÀO ĐẤT.
2.3.1. Mô hình thử nghiệm
Thử nghiệm được thực hiện trong thùng bằng thép không rỉ hình trụ đường kính 1,2m
x cao 2m đáy hình nón có máy khuấy trộn,giữa đáy có van xả nước, chứa đầy đất trồng cây,
pH=7. Cho 1kg urê đã bao Limo NI vào thùng thử nghiệm và trộn với lớp đất mặt. Sau 20
ngày tưới đều với 15l nước sạch trên bề mặt đất trong thùng, xả van đáy thùng lấy nước ra
để định lượng nitrat.
Thử nghiệm đối chứng được thực hiện giống như trên nhưng cho 1kg urê không bao
Limo NI vào thùng thử nghiệm.
2.3.2. Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng nitrat trong nước xả.
2.3.3. Phƣơng pháp
Xác định hàm lượng nitrat trong nước xả theo phương pháp đo phổ TCVN 7323-

1:2004. Phản ứng của nitrat với 2,6-dimethylphenol xúc tác H
2
SO
4
/H
3
PO
4
(1:1 w/w) cho ra
4-nitro-2,6-dimethylphenol có màu. Đo độ hấp thu của sản phẩm sinh ra bằng quang phổ kế
ở bước sóng 324nm và xác định nồng độ nitrat trong mẫu thử dựa theo đường chuẩn.