Công nghệ chuyển gen C3

Chương 3
Các phương pháp xác định sự hiện diện
và biểu hiện của gen ngoại lai
I. Southern blot
Southern blot là một trong những phương pháp trung tâm của
Sinh học phân tử. Nó còn có tên gọi khác là Southern blotting,
phương pháp lai Southern hay phương pháp lai DNA .
Nguyên tắc của Southern blot là màng lai nitrocellulose có khả
năng tiếp nhận DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong
các nghiên cứu lai axit nucleic khác nhau vào những thập niên 1950
và 1960. Vào thời kỳ này DNA cố định không được phân đoạn, chỉ
đơn giản bao gồm DNA tổng số được gắn trên màng lai
nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel vào đầu
thập niên 1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn
chế có thể được phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. Từ
đó bước phát triển tiếp theo của phương pháp là chuyển các đoạn
DNA phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose. Phương pháp này
được E. M. Southern mô tả tại Ðại học Edingburgh vào năm 1975.
Phương pháp Southern blot đơn giản và hiệu quả. Mặc dù đã được
cải tiến nhưng phương pháp đang được sử dụng ở nhiều phòng thí
nghiệm sinh học phân tử sai khác không đáng kể so với phương
pháp ban đầu.
Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
- Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
- Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose.
- Làm biến tính DNA (thông thường khi nó còn ở trên gel):
ví dụ có thể nhúng nó vào trong dung dịch NaOH 0.5M,
DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn. Chỉ DNA
sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.
94
- Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai. Thông thường

màng lai được sử dụng là màng nitrocellulose. Người ta
cũng có thể sử dụng màng nylon. Màng nitrocellulose điển
hình có khả năng tiếp nhận 100µg DNA/cm
2
, trong khi
màng nylon có khả năng tiếp nhận 500µg DNA/cm
2
. Mặt
khác màng nylon có khả năng giữ DNA chắc hơn và ít đứt
gãy hơn. Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng
hoạt tính mao dẫn trong khoảng vài tiếng hoặc có thể dùng
một thiết bị thấm chân không. Nếu dùng thiết bị thấm chân
không thì sẽ nhanh hơn, chỉ mất khoảng một tiếng. Trong
quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ nguyên
không thay đổi.
- Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe)
DNA có đánh dấu. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ
sung (giữa DNA trên màng lai với mẫu dò). Ðể đánh dấu
người ta thường sử dụng P
32
, biotin/streptavidin hoặc một
mẫu dò phát quang sinh học.
- Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò. Nếu sử dụng mẫu dò
đánh dấu phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi
(autoradiograph) để xác định, nếu sử dụng
biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc nếu
sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự
phát quang.
Phương pháp Southern blot được thiết kế để xác định sự hiện
diện, kích thước, số lượng bản sao, tính đồng dạng của DNA trong

một phức hợp. Ví dụ, Southern blot có thể được sử dụng để phát
hiện một gen đặc biệt ở trong một genome nguyên vẹn.
II. Northern blot
Sau khi E. M. Southern mô tả phương pháp Southern blot vào
năm 1975, người ta đã dùng một phương pháp tương tự để xác định
các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot. Phương pháp này còn
được gọi là Northern blotting, phương pháp lai Northern hay phương
pháp lai RNA.
Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
95
- RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) được phân tách bằng
điện di trên gel agarose.
Hçnh 3.1: Så âäö mä taí phæång phaïp Southern blot
- RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các
phân tử RNA giữ nguyên vị trí như ở trên gel).
96
- RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn
(hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một
enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase)
tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép.
Hình 3.2: Sơ đồ mô tả phương pháp Northern blot
- Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự
ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu
dò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất không
97
màu. Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản
phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ
được phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp.
Phương pháp Northern blot cho phép phát hiện sự có mặt, xác
định kích thước, trọng lượng phân tử, khối lượng mRNA ở trong các

mẫu khác nhau. Ðây là một phương pháp rất tốt để phân tích sự biểu
hiện của gen khi chúng ta cần định lượng để phân biệt sự khác nhau
giữa hai mẫu và nó rất nhạy bởi vậy chúng ta có thể điện di một
lượng lớn RNA tổng số hoặc mRNA trên gel.
III. Western blot
Western blot là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc
hiệu của kháng thể để phát hiện protein đã được điện di trên gel
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis) và chuyển lên màng lai.
Western blot cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân
tử, định lượng protein có mặt trong các mẫu khác nhau.
Western blot còn có tên gọi khác là Western blotting hay là
phương pháp lai thấm protein.
Western blot bao gồm các bước cơ bản sau:
- Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE.
- Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ
nguyên vị trí như đã phân tách trên gel.
- Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp
(primary antibody). Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc
hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp
protein-kháng thể đối với protein quan tâm.
- Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary
antibody) có enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish
peroxidase) đi kèm. Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng
thể sơ cấp giống như kháng thể sơ cấp đã bám vào protein.
- Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu
với enzyme. Nếu mọi việc đều diễn ra một cách chính xác
sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức
98
hợp protein-kháng thể sơ cấp- kháng thể thứ cấp-enzyme

hay nói cách khác là ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan
tâm.
- Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện
các điểm sáng phát ra do enzyme.
Hình 3.3: Sơ đồ mô tả phương pháp Western blot
IV. ELISA (Enzymee-Linked Immunosorbent Assay)
99