nghiên cứu quy trình cắt mạch chitosan trạng thái rắn bằng hydroperoxit để sản xuất chitosan có phân tử lượng thấp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG



VŨ LỆ QUYÊN


NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CẮT MẠCH CHITOSAN
TRẠNG THÁI RẮN BẰNG HYDROPEROXIT ĐỂ SẢN
XUẤT CHITOSAN CÓ PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã ngành: 60.54.10


LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS-TS. TRANG SĨ TRUNG




NHA TRANG - NĂM 2013




i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên
cứu nêu trong Luận văn là trung thực.

Tác giả Luận văn
Vũ Lệ Quyên




ii


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin dành cảm ơn đến lãnh đạo trường Đại học Nha Trang đã tạo
điều kiện cho tôi có cơ hội được học tập nâng cao trình độ.
Tôi xin được cảm ơn các thầy cô giáo đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến
thức quí báu trong suốt khóa học. Đặc biệt cảm ơn PGS-TS. Trang Sĩ Trung người đã
tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Sự hướng dẫn của Thầy
đã đóng góp rất lớn cho việc hoàn thành luận văn này.
Tiếp theo, tôi xin được dành lời cảm ơn đến Quí thầy cô giáo phụ trách phòng
thí nghiệm – Trung tâm Thí nghiệm Thực hành đã tạo điều kiện cho tôi về hóa chất và
trang thiết bị thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin được cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp vì những tình cảm của họ là nguồn động
viên tinh thần lớn lao đối với tôi.
Và cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình. Họ là
những người luôn ủng hộ tôi trên từng bước đường học tập và công tác.

Khánh Hòa - 2012
Vũ Lệ Quyên



iii

MỤC LỤC
Trang

LỜI CAM ĐOAN
i
LỜI CẢM ƠN
ii
MỤC LỤC
iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
vii
MỞ ĐẦU
1
Chương 1. TỔNG QUAN
3

1.1. CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG 3

1.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitosan 3

1.1.2. Ứng dụng của chitosan 4

1.2. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP 7

1.2.1. Nghiên cứu về chitosan PTLT trên thế giới 7

1.2.2. Nghiên cứu về chitosan phân tử lượng thấp ở Việt Nam 13

1.3. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN

PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP
14

1.3.1. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và gây hại của vi sinh vật 14

1.3.2. Sử dụng chitosan và chitosan PTLT để diệt khuẩn 17
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
25

2.1. VẬT LIỆU 25

2.1.1. Chitosan 25

2.1.2. Hydroperoxit (H
2
O
2
) 25

2.1.3. Một số hóa chất khác 25

2.1.4. Vi sinh vật 26

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26

2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước chitosan, nồng độ H
2
O
2,


nhiệt độ và thời gian thủy phân
27



iv

Trang



2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn của chitosan 31


2.2.4. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan PTLT
trên cá Ngừ

33

2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 34

2.3.1. Phương pháp xác định khối lượng phân tử 34

2.3.2. Độ ẩm được phân tích theo phương pháp chuẩn của AOAC 34

2.3.3. Xác định độ deacetyl theo phương pháp nung 34

2.3.4. Xác định số lượng vi sinh vật 35


2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 35
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1. XÁC ĐỊNH CÁC CHẾ ĐỘ CẮT MẠCH CHITOSAN BẰNG H
2
O
2
36


3.1.1. Xác định kích thước chitosan nguyên liệu thích hợp 36


3.1.2. Xác định nồng độ H
2
O
2

thủy phân chitosan trạng thái rắn 37


3.1.3. Xác định thời gian thủy phân chitosan bằng H
2
O
2
39


3.1.4. Xác định nhiệt độ thủy phân chitosan bằng H
2
O
2
41

3.2. KIỂM TRA HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN VÀ

CHITOSAN PTLT
43


3.2.1. Kết quả nghiên cứu trên vi khuẩn Gram (-) 43


3.2.2. Kết quả nghiên cứu trên vi khuẩn Gram (+) 48

3.3. SO SÁNH KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GRAM (-) VÀ GRAM (+)

CỦA CHITOSAN VÀ CHITOSAN PTLT

53

3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA
CHITOSAN VÀ CHITOSAN PTLT TRÊN CÁ NGỪ
55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

KẾT LUẬN 57

KIẾN NGHỊ 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC 60







v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Diễn giải
COS Chitosan oligosaccharide
CFU Colony forming unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc)
E. coli Escherichia coli
KNXK Kim ngạch xuất khẩu
KL Khuẩn lạc

KLPT Khối lượng phân tử
Listeria Listeria monocytogenes
MIC Nồng độ thấp nhất để ức chế VSV
PTLT Phân tử lượng thấp
S. aureus Staphylococus aureus
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
TSVKHK Tổng số vi khuẩn hiếu khí
VSV Vi sinh vật
V. parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus




vi




DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Chế độ cắt mạch và độ nhớt của các sản phẩm chitosan 14
Bảng 1.2. Nồng độ nhỏ nhất của chitosan (%) ức chế 11 chủng VSV khác nhau 20
Bảng 2.1. Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật 34
Bảng 3.1. Kết quả kháng khuẩn của chitosan và chitosan PTLT khi bảo quản cá

Ngừ Ồ
56

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Trang

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan 3
Hình 1.2. Công thức hóa học của chitosan 3
Hình 1.3. Đồ thị biểu diễn mức độ hấp thụ chất béo của chitosan 9
Hình 1.4. Minh họa cơ chế cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit 11
Hình 1.5. Ảnh hưởng của thời gian, DD đến khả năng cắt mạch chitosan của H
2
O
2
12
Hình 1.6. Hình ảnh của VSV trước (A) và sau khi xử lý chitosan 30 phút (B) 21
Hình 1.7. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn của chitosan 23
Hình 1.8. Ảnh hưởng của EDTA đến khả năng kháng E.

coli (A) và S.

aureus (B)

của chitosan
24


Hình 2.1. Chitosan dạng bột 25

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước chitosan thích hợp 27
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ H
2
O
2
thích hợp 28
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp 29
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp 30
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và

chitosan phân tử lượng thấp
31


Hình 2.8. Sơ đ
ồ bố trí thí nghiệm kiểm tra khả năng kháng khuẩn của chitosan
và chitsan phân tử lượng thấp khi bảo quản cá Ngừ
33


Hình 3.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu

đến KLPT chitosan (kDa) và

hiệu suất (%)
36

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ H
2

O
2
đến KLPT chitosan (kDa) và hiệu

suất (%)
37


Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

đến KLPT chitosan (kDa) và hiệu

suất (%)
39





viii

viii

Trang

Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến KLPT chitosan (kDa) và hiệu

suất (%)
41

Hình 3.5. Qui trình sản xuất chitosan phân tử lượng thấp 42
Hình 3.6. Kết quả kháng E. coli của C và C1 ở thời gian xử lý: 90 phút (a),

120 phút (b) và 180 phút (c)
44


Hình 3.7. Kết quả kháng Salmonella của C, C1 ở thời gian xử lý: 90 phút
(a),
120 phút (b) và 180 phút (c)
47


Hình 3.8. Kết quả kháng S. aureus của C, C1 ở thời gian xử lý: 90 phút
(a),
120 phút (b) và 180 phút (c)
49


Hình 3.9. Kết quả kháng Listeria của C, C1 ở thời gian xử lý: 90 phút
(a),
120 phút (b) và 180 phút (c)
52


Hình 3.10. Biểu đồ so sánh khả năng kháng khuẩn của C (a), C1 (b) ở thời gian

xử lý: 120 phút trên bốn chủng VSV nghiên cứu
54

1

MỞ ĐẦU
Năm 2011, Việt Nam khai thác được 2,2 triệu tấn thủy sản; nuôi đạt 3 triệu tấn
hàng thủy sản xuất đi 150 nước trên thế giới. Kim ngạch xuất khẩu đạt 6,1 tỷ USD.
Trong đó, riêng tôm đạt 402.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 2,1 tỷ USD. Phế liệu
tôm có thể lên tới (40 ÷ 70)% khối lượng nguyên liệu. Tương ứng với sản lượng tôm
năm 2011 có thể ước tính lượng phế liệu tôm là (160.000 ÷ 281.400) tấn.
Ở Việt Nam, phế liệu tôm chủ yếu dùng để sản xuất thức ăn gia súc, chitosan
thô với chất lượng thấp để xuất khẩu. Phần nhỏ được dùng để sản xuất chitosan chất
lượng cao, olygochitosan và glucosamin. Tuy nhiên, việc ứng dụng chúng trong cuộc
sống còn nhiều hạn chế. Nguyên nhân là chưa có nhiều công trình nghiên cứu về lĩnh
vực này được công bố, chitosan có trọng lượng phân tử lớn, không tan trong nước nên
có nhiều hạn chế cho việc ứng dụng. Để cải thiện khả năng hoà tan và hoạt tính sinh
học của chitosan, người ta đã sản xuất ra loại chitosan phân tử lượng thấp:
Chitosan trọng lượng phân tử thấp có một số đặc tính đặc biệt như kháng nấm,
kháng khuẩn, tăng cường hệ miễn dịch và có nhiều ứng dụng trong y dược như ngăn
ngừa được sự phát triển của bệnh đái tháo đường, ngăn ngừa được sự gia tăng của
cholesterol của chuột khi sử dụng thức ăn đã được bổ sung cholesterol [35].
Chitosan có hoạt tính kháng khuẩn nên đã được nghiên cứu và ứng dụng trong
thực phẩm để bảo quản thực phẩm, cá, thịt bò và trái cây (thanh long, táo, vú sữa…)
[1, 2, 7, 8, 9]. Ngoài ra, chitosan còn được ứng dụng như một phụ gia để tăng khả năng
tạo gel trong sản xuất giò, chả, xúc xích, surimi [10].
Để có chitosan phân tử lượng thấp, người ta thường sử dụng các phương pháp
hoá học, sinh học và vật lý để cắt mạch chiosan có phân tử lượng cao.

Có thể dùng HCl, H
2
SO
4
, H
2
O
2
, enzyme hoặc thủ pháp chiếu xạ (chùm tia năng
lượng cao), để tạo chitosan phân tử lượng thấp [11, 21, 39, 41, 43]. Tuy nhiên, các
phương pháp cắt mạch đã trình bày ở trên thường phải thực hiện trong thời gian dài, và
phải sử dụng acid để hòa tan chitosan trước khi cắt mạch, tinh sạch sản phẩm khó khăn
nên chi phí cao, hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp và có nguy cơ gây ô nhiễm
môi trường.



2

Vì vậy, nghiên cắt mạch chitosan trạng thái rắn là một hướng đi mới với nhiều
ưu điểm như không gây ô nhiễm môi trường, qui trình sản xuất đơn giản, giảm chi phí
trong quá trình sản xuất do loại bỏ được công đoạn tinh sạch sản phẩm. Đó là lý do tác
giả thực hiện đề tài “Nghiên cứu qui trình cắt mạch chitosan trạng thái rắn bằng
hydroperoxit để sản xuất chitosan có phân tử lượng thấp”
Mục tiêu của đề tài:
- Xây dựng quy trình sản xuất chitosan phân tử lượng thấp bằng phương pháp
thủy phân chitosan trạng thái rắn.
Nội dung của đề tài bao gồm:
- Nghiên cứu xác định chế độ cắt mạch chitosan trạng thái rắn bằng hydroperoxit
và thử nghiệm sản xuất chitosan phân tử lượng thấp.

- Thử nghiệm hoạt tính kháng

khuẩn của

chitosan

và

chitosan

phân tử lượng thấp.
Tính mới của đề tài: Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về cắt mạch
chitosan trạng trái rắn bằng H
2
O
2
.
Ý nghĩa khoa học của đề tài: Nghiên cứu qui trình cắt mạch chitosan trạng thái
rắn bằng hydroperoxit đã tạo ra một phương pháp thủy phân chitosan mới với nhiều ưu
điểm so với các phương pháp đã và đang thực hiện ở Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Hiện nay các nhà khoa học cũng như các nhà
doanh nghiệp sản xuất chitosan và olygochitosan đang mong đợi một phương pháp sản
xuất chitosan phân tử lượng thấp mới, hiệu quả cao, không gây ô nhiễm môi trường,
và sản phẩm có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng trong y học, thực phẩm và công
nghệ sinh học. Vì vậy, khả năng ứng dụng của đề tài này là khá cao.



3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG
1.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitosan
1.1.1.1. Cấu trúc của chitosan
Chitosan là một dẫn xuất của chitin. Trong tự nhiên, chitosan có ở màng tế bào
nấm mốc, thuộc họ Zygemyceces và ở một vài loại tảo; cũng như ở một số côn trùng.
Chitosan có nhiều trong vỏ động vật giáp xác như: Tôm, cua, ghẹ và mai mực.
Vì vậy, các loại vỏ này được dùng để sản xuất chitin - chitosan và dẫn xuất của chúng.

Hình 1. 1. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan
Tuy nhiên, trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân
tử chitosan (khoảng 10%). Vì vậy, công thức chính xác của chitosan được thể hiện trên
Hình 1.2.





Hình 1.2. Công thức hóa học của chitosan
(Trong đó tỷ lệ
n
m
phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa.)
O

O

O

O

O

CH
2
OH
OH

OH

CH
2
OH
NH
2
NHCOCH
3

n

m




4

Tên hoá học của chitosan là: Poly--(1,4)-D-glucosamin, hay còn gọi là
poly--(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose.
Như vậy, chitosan là một polymer hữu cơ, có cấu trúc tuyến tính, từ các đơn vị

β- D- Glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết 1- 4 glucoside
Công thức phân tử: (C
6
H
11
O
4
N)
n
.
Phân tử lượng: M
chitosan
= (161,07)
n

1.1.1.2. Một số tính chất của chitosan
- Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng bột có màu trắng ngà, ở dạng
vảy có màu trắng trong hay màu hơi vàng.
- Chitosan thương mại ít nhất phải có DD (độ deacetyl) > 70% và trọng
lượng phân tử (100.000 – 1.200.000) Dalton.
- Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hoà tan trong nước, trong dung dịch
kiềm. Nhưng hoà tan trong dung dịch acid acetic loãng, tạo thành dung dịch keo
dương. Nhờ đó, keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng
như: Pb
3+
, Hg
+
,…
- Chitosan tác dụng với Iốt trong môi trường H
2

SO
4
cho phản ứng lên màu
tím. Phản ứng này dùng để phân tích định tính chitosan.
- Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một
polycationic (pH < 6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như
protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của
nhóm amino (- NH
2
) [36].
- Chitosan có tính kháng nấm, kháng khuẩn cao [8, 13, 29].
- Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân
huỷ sinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể [1, 13].
Những đặc tính quý giá trên đã nâng cao khả năng ứng dụng của chitosan trong
sinh học, y học, công nghệ thực phẩm.
1.1.2. Ứng dụng của chitosan
Do tính chất không tan trong nước, chitin ít được sử dụng trực tiếp. Nhưng từ
nó có thể điều chế dẫn xuất như: Chitosan, COS, glucosamine [6, 11]. Chúng được
ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.



5

1.1.2.1. Trong nông nghiệp [13]
Trong nông nghiệp olygoglucosamin ảnh hưởng đến sinh trưởng của rau cải,
đậu cove và một số loại rau khác, nó còn có tác dụng tăng năng suất, tăng khả năng
kháng bệnh, hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, góp phần bảo vệ môi trường.
Chitosan được sử dụng để bọc nang các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự
tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ

sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt.
Ngày nay, chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho
tôm, cá, cua , gà, để kích thích sinh trưởng và tăng khả năng kháng bệnh.
1.1.2.2. Trong y học [3, 4, 5]
Ứng dụng quan trọng nhất và mang lại hiệu quả kinh tế cao của chitosan là ở
lĩnh vực y học. Các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nhiều đến lĩnh vực
ứng dụng này.
Do khả năng kháng khuẩn và tạo màng nên chitosan được ứng dụng phối hợp
với một số thành phần phụ liệu khác để tạo các sản phẩm dùng trong y học: Da nhân
tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép chống
nhiễm khuẩn và cầm máu,
Chitosan dùng làm hoạt chất chính để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết
thương, vết bỏng, vết mổ vô trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể: Hạ lipid và cholesterol
trong máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu đường, xưng khớp, viêm khớp, viêm
xương, loãng xương, chống đông tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm
miễn dịch,
Ngoài ra, chitosan còn được dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế
dược phẩm:
- Làm tá dược độn, tá dược dính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang
mềm, nang cứng,…
- Làm chất mang sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer có tác dụng chậm,
kéo dài thời gian tác dụng của thuốc,



6

1.1.2.3. Trong công nghiệp [13]
Chitosan dùng làm phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm trong kỹ nghệ
làm giấy, chế biến gỗ, điện tử, mực in, phim ảnh,

Trong công nghiệp giấy
Do cấu trúc tương tự cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm
nguyên liệu sản xuất giấy. Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời làm cho
việc in trên giấy tốt hơn [13].
Trong công nghiệp dệt
Dung dịch chitosan có thể thay hồ tinh bột, để hồ vải. Nó có tác dụng làm sợi tơ
bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được acid và kiềm nhẹ.
Chitosan có thể kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt,
vải chống thấm, sản xuất vải cold.
Trong ngành hóa mỹ phẩm
Chitosan có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm -NH
3
+
. Các
nhóm này liên kết với tế bào sừng hoá của da. Dựa vào đặc tính này, người ta sử dụng
chitosan làm các loại kem dưỡng da: Giữ ẩm, chống khô, làm mềm da, ngăn ngừa tia
cực tím làm hại da,
Trong công nghiệp xử lý nước
Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết
dính tốt với các ion kim loại như: Pb
2+
, Hg
+
,… chitosan được dùng để lọc nguồn nước
thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm
Trong công nghiệp thực phẩm
Là một hợp chất polymer tự nhiên, không độc và rất an toàn đối với thực phẩm,
có khả năng kháng khuẩn, chống ẩm, tạo màng, hấp phụ màu mà không hấp phụ mùi,
hấp phụ một số kim loại nặng,… nên chitosan được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực
công nghệ sản xuất và bảo quản thực phẩm, góp phần bảo đảm an toàn cho

người [8, 9].
Chitosan cùng với các loại vật liệu tạo màng khác nhau, tạo ra các màng bao có
khả năng kéo dài thời gian bảo quản rau quả, thịt, [1, 2].



7

Chitosan dùng để lọc các loại nước quả ép, bia rượu vang,
Ở Việt Nam, chitosan đã được sử dụng thay hàn the trong sản xuất chả giò, bánh
cuốn, bánh phu thê… như một chất phụ gia tăng độ dòn, độ dai cho chúng [10].
1.1.2.4. Trong công nghệ sinh học
Trong công nghệ sinh học, chitosan dùng để cố định enzyme và các tế bào vi
sinh vật, làm chất mang, sử dụng trong sắc ký chọn lọc [13].
1.2. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP
Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất và ứng dụng của chitosan đã
được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX.
Hiểu biết của loài người về những nội dung trên, được trình bày ở mục 1.1. đã
khái quát toàn diện, đầy đủ thành tựu nghiên cứu của thế giới 90 năm qua về các vấn
đề này.
Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là:
Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp.
Nhật Bản được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản xuất chitosan. Họ là nước
đầu tiên trên thế giới, sản xuất 20 tấn/năm. Đến nay Nhật Bản đạt 700 tấn/năm,
Hoa Kỳ chỉ đạt trên 300 tấn/năm.
Người ta ước tính sản lượng chitosan của thế giới sẽ đạt tới 118.000 tấn/năm.
Trong đó Nhật Bản, Hoa Kỳ vẫn là hai nước sản xuất chính.
Trong phạm vi Đề tài được giao, chúng tôi quan tâm đến các phương pháp cắt
mạch chitosan để tạo chitosan có phân tử lượng thấp, với mục đích giảm nguy cơ gây
ô nhiễm môi trường và cắt giảm một số công đoạn phức tạp trong qui trình sản xuất.

1.2.1. Nghiên cứu tạo chitosan phân tử lượng thấp trên thế giới
Có rất nhiều phương pháp để sản xuất chitosan có phân tử lượng thấp, nhưng
người ta phân loại chúng thành các phương pháp sau: Phương pháp sinh học, hoá học
và vật lý. Trong đó, phương pháp hóa học và sinh học được ứng dụng nhiều nhất trong
cuộc sống bởi chúng có một số ưu điểm vượt trội.



8

1.2.1.1. Dùng tác nhân sinh học để thủy phân
Có hơn 30 loại enzyme có thể được sử dụng để cắt mạch chitosan: Chitosanase,
cellulase thu được từ các VSV khác nhau (vi khuẩn, nấm mốc), papain chiết tách từ đu
đủ…[15, 18, 31, 43, 46]. Phương pháp cắt mạch bằng enzyme có hiệu quả cắt mạch tốt
và không gây ô nhiễm môi trường. Tuy vậy, phương pháp này vẫn còn những hạn chế
khi sản xuất ở quy mô lớn như: Chi phí sản xuất cao do công đoạn tinh sạch sản phẩm
khó khăn, qui trình sản xuất phức tạp, tính đặc hiệu của enzyme cao nên có những
enzyme chỉ cắt liên kết giữa các đơn vị có chứa nhóm acetyl, hoặc chỉ cắt liên kết giữa
các đơn vị đã bị khử nhóm acetyl nên hiệu quả thủy phân chưa cao.
1.2.1.2. Dùng tác nhân hóa học để thủy phân
Có nhiều tác nhân hóa học đã được nghiên cứu và ứng dụng để thủy phân
chitosan để thu chitosan PTLT hoặc COS: acid nitrous, acid acetic, acid sulfuric, acid
phosphotungtic và acid hydrofluoric [16, 28, 31, 36, 50]. Tuy nhiên, các phương pháp
này đòi hỏi thời gian dài, quá trình tinh sạch sản phẩm khó khăn, không thân thiện với
môi trường và phải dùng thiết bị hiện đại nếu sản xuất ở qui mô công nghiệp.
Ngoài ra, các tác giả Allan, Chang, Tanioka đã sản xuất thành công chitosan có
trọng lượng phân tử thấp bằng việc cắt mạch chitosan trạng thái lỏng (sau khi đã pha
loãng trong môi trường acid) bởi các tác nhân oxy hóa như ozone, natri nitrite và
hydroperoxit (H
2

O
2
) [17, 22, 45]. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn chưa khắc phục
được những nhược điểm lớn nhất của phương pháp hóa học là có nguy cơ gây ô nhiễm
môi trường và quá trình tinh chế sản phẩm còn gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, acid HCl
đã được nghiên cứu để thuỷ phân chitosan trạng thái rắn với mong muốn tìm ra
phương pháp mới với nhiều ưu điểm như giảm chi phí, giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi
trường và dễ thực hiện. Nghiên cứu đã thành công với 80% chitosan được chuyển
thành glucosamin. Tuy nhiên, phương pháp này rất khó để thương mại hóa sản phẩm
vì việc xử lý nước thải gặp nhiều khó khăn và sản phẩm chủ yếu không phải là
chito – olysaccharide [28]
Phương pháp hóa học thường cho hiệu quả cắt mạch cao. Tuy nhiên, các nhà
khoa học lo ngại về hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân tạo thành (hoạt tính
kháng khuẩn, chống oxi hóa, khả năng hấp thụ chất béo) không cao và có nguy cơ gây



9

ô nhiễm môi trường. Do đó cần phải tìm ra một phương pháp hóa học hoàn hảo hơn có
thể khắc phục được hai nhược điểm trên.
1.2.1.3. Dùng tác nhân vật lý để thủy phân
Wasikiewicz và cộng sự, 2004 đã dùng tia gamma, tia UV và sóng siêu âm để
thủy phân chitosan. Kết quả thu được COS có phân tử lượng khá thấp (> 25kDa). Tuy
nhiên, nhược điểm của phương pháp này là chitosan phải hòa tan trong môi trường
acid trước khi thủy phân với nồng độ thấp (0,1 – 1)% và thời gian thủy phân dài, nên
đã gây khó khăn cho quá trình sản xuất ở qui mô công nghiệp [30].
Czechowska-Biskup và cộng sự, 2005 [40] đã thử nghiệm với phương pháp vật
lý để thủy phân chitosan thu được COS đồng thời thử nghiệm khả năng kết hợp giữa
COS và chất béo với mục đích ứng dụng COS trong dược phẩm hoặc thực phẩm chức

năng để làm giảm khả năng hấp thụ chất béo của con người (với 1g chitosan có thể hấp
thu 8 – 20g chất béo) Hình 1.3.












Khối lượng phân tử (kDa)
Hình 1.3. Đồ thị biểu diễn mức độ hấp thụ chất béo của chitosan [40]
Có những phương pháp chiếu xạ sau:
- Chiếu xạ ở trạng thái khô: dùng tia gamma phát ra từ nguồn
60
Co với liều
lượng là 0.56 Gy s
_
.
Khả năng kết hợp với chất béo
(g/g chitosan)



10

- Chiếu xạ trong dung dịch: dùng tia gamma phát ra từ nguồn
60
Co với liều
lượng là 0.023 Gy s
_
.
- Siêu âm trong dung dịch. Phương pháp này cũng dễ dàng thu được chitosan
phân tử lượng thấp phụ thuộc vào tần số của sóng siêu âm sử dụng.
Nguyễn Ngọc Duy, 2011 đã kết hợp phương pháp vật lý và hóa học khi cho
thủy phân chitosan bằng tia gamma trong môi trường có bổ sung H
2
O
2
và thu được
olygochitosan có khối lượng phân tử thấp (5 – 10kDa) [38].
1.2.1.4. Cơ chế cắt mạch chitosan bằng H
2
O
2
[22, 23, 32]
Trong quá trình thủy phân chitosan bằng hydroperoxit, liên kiết glucoside trong
chuỗi polysaccharide bị bẻ gẫy, làm giảm trọng lượng phân tử của chitosan.
Quá trình cắt mạch chitosan diễn ra qua một loạt các phản ứng hóa học. Chitosan
ưu tiên nhận thêm một proton (tức cation H
+
) do H
2
O
2
sinh ra để ion hóa nhóm - NH

2

trong phân tử thành nhóm - NH
3
+


theo phản ứng:
H
2
O
2
= H
+
+ HOO
−
(1)
R – NH
2
+ H
+
= R – NH
3
+

(2)
Hay là: H
2
O
2

+ R - NH
2
= R - NH
3
+
+ HOO
-
(3)
Nồng độ ion H
+
giảm dần làm tăng pH trong suốt quá trình thủy phân.
Thêm vào đó anion hydroperoxit (HOO
-
) rất linh động, dễ dàng phân phủy tạo
ra gốc tự do HO
*
, O
*
và nhóm - OH
-
, điều đó có nghĩa H
2
O
2
bị phân hủy liên tục.
Quá trình diễn ra theo phản ứng sau:
HOO
−
→ OH
−

+ O
*
(4)
H
2
O
2
+ HOO
−
→ HO
*
+ O
2
*
+ H
2
O (5)
Gốc hydroxyl có khả năng oxy hóa rất mạnh, nó phản ứng với carbohydrates rất
nhanh. Gốc tự do HO
*
lấy hydro nguyên tử của mạch phân tử chitosan. Đồng thời
nước được hình thành, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân, cho ra
glucosamine (GlcN).
Phản ứng diễn ra như sau:
(GlcN)
m
− (GlcN)
n
+ HO
*

→ (GlcN
.
)
m
− (GlcN)
n
+ H
2
O (6)
(GlcN
.
)
m
− (GlcN)
n
+ H
2
O→ (GlcN)
m
+ (GlcN)
n
(7)



11

Trong quá trình phản ứng, cấu trúc chitosan không thay đổi. Mạch ngắn lại do
liên kết glucoside1,4 bị cắt đứt.
Toàn bộ quá trình cắt mạch chitosan được mô tả trên Hình 1.4.

Phân tích cơ chế cắt mạch trên đây cho thấy: Hoàn toàn có thể trực tiếp tiến
hành cắt mạch chitosan rắn ở dạng bột mịn, bằng H
2
O
2
mà không cần hòa tan chitosan
trong dung dịch acid. Giả thuyết trên đã được kiểm định. Tác giả đã thực hiện thành
công vào tháng 04 năm 2012 tại Trường Đại học Nha Trang.

Hình 1.4. Minh họa cơ chế cắt mạch chitosan bằng H
2
O
2
[20]

(a) Quá trình phá vỡ cấu trúc kết tinh, (b) Quá trình phân cắt phần không kết tinh
Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng cắt mạch
Phản ứng cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit phụ thuộc vào nhiều yếu tố.
Đáng kể nhất là: kích thước nguyên liệu, nồng độ H
2
O
2
, DD nhiệt độ và thời gian
thủy phân.
- Ảnh hưởng của nồng độ hydroperoxit
Nghiên cứu của Tian, 2004 [23] chỉ ra rằng trọng lượng phân tử của sản phẩm
thủy phân chitosan giảm dần khi nồng độ H
2
O
2

tăng. Một lượng nhỏ H
2
O
2
cũng có thể
làm giảm trọng lượng phân tử của chitosan. Khi điều kiện phản ứng được giữ không
đổi, nồng độ H
2
O
2
càng cao thì trọng lượng phân tử càng giảm.



12

Ở nồng độ hydroperoxit lớn hơn 0,5M sản phẩm tạo thành có thể coi là chitosan
có trọng lượng phân tử thấp.

- Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý
Cũng theo Tian và cộng sự, 2004 tốc độ cắt mạch chitosan tăng mạnh khi nhiệt
độ và thời gian tăng lên. Chitosan phân tử lượng thấp đạt được khi thủy phân ở nhiệt
độ (40 – 70)
o
C sau 3 giờ [23].
Quan hệ giữa khối lượng phân tử chitosan được tạo ra với thời gian xử lý của
các loại chitosan ban đầu khác nhau nêu ở đồ thị trên Hình 1.5.

Thời gian (giờ)
Hình 1.5. Ảnh

hưởng của thời gian và DD đến khả năng cắt mạch

chitosan

của H
2
O
2
[23]
- Ảnh hưởng của loại chitosan
Các loại chitosan khác nhau bị thủy phân khác nhau bởi H
2
O
2
.
Nghiên cứu của Tian, 2004 thể hiện ở Hình 1.5 cho thấy: Chitosan có DD càng
cao thì tốc độ thủy phân càng nhanh và quá trình thủy phân càng triệt để.
Ngoài các yếu tố trên, tốc độ và hiệu quả của phản ứng cắt mạch chitosan còn
phụ thuộc vào môi trường phản ứng. Trong môi trường H
+
hoặc OH
-
, H
2
O
2
có tác động
mạnh với chitosan, hơn là khi nó đứng một mình.
Hydroperoxit đã được sử dụng để thủy phân chitosan còn vì dễ thao tác, rẻ tiền

và thân thiện với môi trường [6].
Khối lượng phân tử (kDa)



13

Kỹ thuật này dựa vào sự hình thành các gốc tự do, có khả năng tấn công vào liên
kết β -
D
- (1 - 4) glucoside của chitosan.
Thông thường, việc oxi hoá chitosan bằng H
2
O
2
xảy ra trong pha đồng nhất
(khi chitosan được hòa tan trong môi trường acid). Tuy nhiên, quá trình này cũng có
thể được thực hiện khi chitosan ở trạng thái không đồng nhất [28]. Như vậy, tránh
được việc sử dụng acid để chuyển chitosan từ trạng thái rắn sang trạng thái lỏng trước
khi thủy phân, giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

1.2.2. Nghiên cứu tạo chitosan phân tử lượng thấp ở Việt Nam
Hiện nay nhiều cơ sở khoa học của Việt Nam đang nghiên cứu sản xuất
chitosan như: Trường Đại học Nha Trang, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh, Trung tâm nghiên cứu polymer - Viện khoa học Việt Nam, Viện Hoá thuộc
Viện khoa học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ và Sinh
học Thủy sản - Viện Nghiên cứu Môi trường Thuỷ sản 2,…
Gần đây, Đại học Nha Trang đã công bố nhiều quy trình sản xuất chitosan theo
hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý và những nghiên cứu ứng dụng công
nghệ enzyme [6, 11].

Đáng kể nhất là các công trình của GS. Trần Thị Luyến và các cộng sự, 2006
đã nghiên cứu sản xuất COS bằng HCl. Sản phẩm thu được có màu sắc trắng, đẹp và chất
lượng tốt.
- Cũng năm 2006, GS. Trần Thị Luyến đã nghiên cứu sản xuất COS có nguồn gốc
từ chitin, chitosan bằng enzyme papain, hemicellulose, enzyme cellulase từ xạ khuẩn [11].
Theo tác giả Trần Thị Luyến khi dùng enzyme papain chiết rút từ đu đủ xanh, kết
quả thu được 95% COS từ chitosan. Khi dùng enzyme thương phẩm thì thu được 97%
COS.
Khi dùng enzyme hemicellulose thương phẩm, kết quả thu được 88,9% COS từ
chitosan và 86,7% COS từ chitin.
Khi dùng enzyme cellulase từ xạ khuẩn [11] sẽ thu được 52,6% COS từ chitosan
và 45,6% COS từ chitin.
Đỗ Thị Liền (2008), đã nghiên cứu cắt mạch chitosan trong dung dịch acid
acetic bằng hydroperoxit (H
2
O
2
) [6]. Tác giả Đỗ Thị Liền đã sản xuất thử nghiệm



14

thành công 9 sản phẩm chitosan ngắn mạch. Bảng 1.1 là loại chitosan, các chế độ cắt
mạch và độ nhớt của sản phẩm chitosan ngắn mạch, do tác giả Liền chế tạo được.
Bảng 1.1. Chế độ cắt mạch và độ nhớt của các sản phẩm chitosan [6]

Chitosan DD75% Chitosan DD85% Chitosan DD95%

Nồng độ

H
2
O
2
(%)


Nhiệt
độ
(
o
C)
Thời
gian

(giờ)

Nồng độ
H
2
O
2
(%)


Nhiệt
độ
(
o

C)
Thời
gian

(giờ)

Nồng độ

H
2
O
2
(%)


Nhiệt
độ
(
o
C)
Thời
gian

(giờ)

100 1,40 40 1,9 1,35 35 1,69

0,50 30 1,0
10 1,65 65 3,4 1,60 60 3,04

1,62 60 2,9
5 1,70 70 3,7 1,65 65 3,31

1,68 65 3,1

Đây là bước tiến mới so với các phương pháp tạo chitosan phân tử lượng thấp ở
Việt Nam trước năm 2008.
Tuy nhiên, độ nhớt thấp của chitosan đã được dùng để biểu thị rằng phân tử
lượng của nó là thấp, khả dĩ có thể chấp nhận về phương diện định tính. Tuy nhiên, xét
về phương diện định lượng thì chưa đủ.
Hơn nữa, việc dùng acid để pha loãng dung dịch chitosan sẽ ảnh hưởng đến môi
trường. Công đoạn tách, tinh sạch sản phẩm là rất khó khăn và tốn kém.
Phân tích cơ chế cắt mạch chitosan như đã trình bày ở Hình 1.4, cho thấy: Có
thể trực tiếp cắt mạch chitosan rắn ở dạng bột mịn, bằng H
2
O
2
mà không cần hòa tan
chitosan trong dung dịch acid acetic.
1.3. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN PHÂN
TỬ LƯỢNG THẤP
1.3.1. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và gây hại của vi sinh vật [12, 14]
Hiểu biết về vi sinh vật (VSV) nói chung, về loại có hại nói riêng và những biện
pháp khống chế, tiêu diệt chúng, hiện có, là rất phong phú.
VSV sống trong đất, không khí, nước và ở ngay trong động, thực vật ở cả ba
vùng nước: Mặn, lợ, ngọt, Đương nhiên, chúng có cả ở các sản phẩm thủy sản đang
sống, sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản.

Độ nhớt
(mPa/s)

Chế độ
cắt mạch



15

Chẳng hạn, ở cá, chúng có tại các túi vẩy, trên toàn bề mặt ngoài da, khoảng
(10
2
- 10
7
) CFU/cm
2
; có trong ruột cá, khoảng (10
3
- 10
9
) CFU/g.
Tốc độ phát triển của VSV rất cao. Chẳng hạn, với S. aureus trong sữa,
cá, thịt, xấp xỉ 200.000 lần trong một giây. Ở 37
o
C, cứ khoảng (8

-

9) phút chủng
V. parahaemolycus lại sinh thêm một thế hệ. Sau 24 giờ có thể có 400 tấn.
Sau đây là đặc điểm sinh trưởng và phát triển của một số VSV gây bệnh:
1.3.1.1. Escherichia coli (E. coli)

E. coli là trực khuẩn Gram (-), hiếu khí, phổ biến nhất trong ruột người và động
vật máu nóng. Chúng chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí sống ở ruột. Bình thường
chúng không gây bệnh. E. coli có lợi cho đường ruột nhờ hạn chế được một số vi
khuẩn gây bệnh khác, giữ thế cân bằng sinh thái trong ruột và sinh tổng hợp một số
vitamin.
E. coli có dạng hình que, hai đầu tròn, kích thước khoảng (2 - 3μm) x 0,5μm.
Có tiêm mao mọc khắp bề mặt và có khả năng di động. Không có khả năng hình thành
bào tử. E. coli dễ mọc được trên môi trường hiếu khí cũng như kị khí. Có thể sống ở
nhiệt độ từ (5 – 40)
o
C, pH từ 5,5 – 8,0, nhưng thích hợp nhất là ở 37
o
C và pH trong
khoảng 7 – 7,2. Có thể phát triển ở điều kiện hoạt độ của nước (a
w
) là 0,91. Trên môi
trường thạch thường có khuẩn lạc dạng S (nhẵn, bóng, bờ đều), đôi khi hình
thành khuẩn lạc dạng R (nhăn nheo) hoặc dạng M (nhày). Khuẩn lạc thường có màu
xám, đục.
E. coli sinh nội độc tố chịu nhiệt. Bình thường E. coli sống trong ruột không
gây bệnh nhưng khi cơ thể suy yếu E. coli không những gây ra các bệnh ở đường ruột
như: Ỉa chảy, kiết lị mà còn có thể gây một số bệnh khác như viêm đường tiết niệu,
viêm gan, viêm phế quản, viêm màng phổi Tuy nhiên, E. coli dễ bị tiêu diệt bằng
các thuốc sát trùng thông thường và bị tiêu diệt ở 60
o
C trong 30 phút.
1.3.1.2. Staphylococcus aureus
S. aureus thuộc họ Micrococceae là chủng tụ cầu khuẩn hiếu khí tùy nghi,
Gram (+), thường kết thành dạng chùm. Đường kính tế bào (0,5 ÷ 1)µm. Không tạo
bào tử, không di động, ưa mặn, có thể phát triển ở nồng độ muối (7 ÷ 15)%.

16

S. aureus là chủng vi khuẩn có sức sống tương đối mạnh. Ở nhiệt độ 37
o
C sau
24h trong môi trường sữa, khối lượng của nó tăng lên 190.000 lần, trên thịt tăng
184.000 lần còn trên cá 195.000. S. aureus chịu được sự thay đổi của môi trường và có
thể phát triển ở điều kiện hoạt độ của nước (a
w
) thấp tới 0,85. S. aureus phát triển
mạnh nhất ở pH 7,0 – 7,5, có thể chịu được pH thấp nhất là 4,2 và cao nhất là 9,3,
nhiệt độ tối thích 30 – 37°C, có thể chịu được 70°C.
Sự nguy hiểm của S. aureus ở chỗ nó có mặt phổ biến mọi nơi, thường thấy trên
da, xoang mũi, mắt, các vết thương, móng tay, kẽ tay, tóc,… ở người (đây chính là
nguồn lây nhiễm quan trọng nhất vào thực phẩm). Khi phát triển trong thực phẩm,
S. aureus có khả năng sinh một loại độc tố protein phân tử lượng thấp (30.000 dalton)
gọi là độc tố đường ruột của Staphylococcus (A, B, C1,C2, C3, D và E). Các độc tố
này thuộc loại chịu nhiệt, một khi đã hình thành trong thực phẩm, việc đun sôi rất khó
phá huỷ được chúng. Nhiệt độ sôi thì phải đến 2h hoặc 120°C cũng phải đến 20 phút
mới phá hủy được các độc tố này. Đặc biệt ở nhiệt độ thấp nó vẫn giữ được độc tính
sau 2 tháng.
S. aureus gây bệnh mụn nhọt và gây chứng ngộ độc ở dạ dày, ruột. Những triệu
chứng phổ biến thường xảy ra từ 2 - 4 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm là: Nôn mửa,
đau thắt bụng, đôi khi cả tiêu chảy. Các triệu chứng này thường kéo dài không quá
24 giờ. Nạn nhân không chết nhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội, trong
một số trường hợp nghiêm trọng hiện tượng mất nước có thể dẫn tới sốc và suy sụp.
Nguy cơ bị nhiễm S. aureus cao ở những thức ăn đã nấu chín, sản phẩm muối, thực

phẩm ăn liền đặc biệt là các sản phẩm từ cá, thịt, trứng như cá khô, cá hun khói,
pho mát, bơ, Chỉ cần 4 giờ ở nhiệt độ phòng, S. aureus cũng tạo ra một lượng độc tố
đủ gây tai họa.
Trên môi trường nuôi cấy TSA (Tryptone Soya Agar), S. aureus tạo khuẩn lạc
tròn, bờ đều, màu vàng.
Là VSV ưa áp: Có thể sinh trưởng trong một phạm vi rộng về hoạt tính của
nước và nồng độ thẩm thấu.
1.3.1.3. Salmonella
Salmonella thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Chúng sinh sống trong
đường ruột của người và một số động vật.