Nghiên cứu nuôi cấy mô invitro ba dòng keo lai KL2, LK20 và KLT A3 Viện Nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

2

BỘ CÔNG THƯƠNG
TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM
VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY





TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ INVITRO BA DÒNG KEO LAI
KL2, KL20 VÀ KLTA3

Thực hiện theo Hợp đồng số 143.12.RD/HĐ-KHCN ngày 29/03/2012
giữa Bộ Công Thương và Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy.






CHỦ NHIỆM:
Th.S. PHẠM ĐỨC HUY
CỘNG SỰ: CN. NGUYỄN THANH BÌNH
KS. PHẠM VĂN HƯNG

PHÚ THỌ, THÁNG 12 NĂM 2012
3

Mục lục
Mục lục i
Biểu thông tin ii
Danh mục đăng ký sản phẩm của đề tài. iv
Quyết định Hội đồng nghiệm thu. v
Bài phản biện 1 và 2 vi
Danh mục bảng biểu 9
Tóm tắt đề tài 5
Chương 1.
Tổng quan tài liệu 11
1.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu 11
1.1.1. Trong nước. 11
1.1.2. Ngoài nước. 12
1.2. Cơ sở lý thuyết 13
Chương 2.
Thực nghiệm 15
2.1. Mục tiêu của đề tài. 15
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. 15
2.2.1. Nội dung nghiên cứu. 15
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu. 16
2.2.2.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng 16
2.2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xác định ảnh hưởng của mùa vụ cấy mẫu và tuổi mẫu
cấy…… 17

2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu
ban đầu 18

2.2.2.4. Thu thập và xử lý số liệu 19
2.3.Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu. 20
Chương 3.
Kết quả và bình luận 21
1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng. 21
3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với
dòng KL2 21

3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với
dòng KL20 23

4

3.1.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với
dòng KLTA3 24

3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy 26
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng KL2 26
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng
KL20… 27

3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng
KLTA3 28

3.3. Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu. 29
3.3.1. Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban

đầu đối với dòng KL2 29

3.3.2. Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu
đối với dòng KL20 30

3.3.3. Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu
đối với dòng KLTA3 31

3.3.4. So sánh về hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu giữa các dòng nghiên cứu 32
Chương 4.
4.1. Kết luận 33
4.2. Kiến nghị 33
Tài liệu tham khảo 35
I. Tiếng việt 35
II. Tiếng Anh 35
5

BIỂU THÔNG TIN
1. Tên đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy mô invitro ba dòng keo
lai KL2, KL20 và KLTA3
2. Mã số :
3. Thời gian thực hiện : 12 tháng
Từ tháng 1 năm 2012 đến tháng 12 năm 2012.
4. Kinh phí : 160.000.000 đồng (Một trăm sáu mươi triệu đồng chẵn)
5. Họ và tên chủ nhiệm đề tài : PHẠM ĐỨC HUY
Học vị : Thạc sĩ
Chc danh : Phó Trng phòng
Điện thoại : 0977.942.884;
Email :
Địa chỉ cơ quan : xã Phù Ninh – Phù Ninh – Phú Thọ

6. Cơ quan chủ trì : Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy
in thoi : 02103.829.241 ; Fax : 02103.829.384
Email :

Địa chỉ cơ quan : xã Phù Ninh – Phù Ninh – Phú Thọ
7. Danh sách những người thực hiện chính
TT
Họ và tên
Học vị, học hàm
chuyên môn
Cơ quan
1 Phạm Đức Huy Thạc sĩ Lâm nghiệp Viện NC cây NLG
2 Nguyễn Thanh Bình Cử nhân Sinh học Viện NC cây NLG
3 Nguyễn Thị Thìn Kỹ sư Lâm nghiệp Viện NC cây NLG
4 Phạm Văn Hưng Kỹ sư Lâm nghiệp Viện NC cây NLG
5 Phạm Thị Hạnh Kỹ sư CN sinh học Viện NC cây NLG
7. Mục tiêu của đề tài
- Xác định được kỹ thuật, điều kiện khử trùng mẫu thích hợp đối với giai
đoạn tạo chồi nuôi cấy mô invitro cho ba dòng keo lai KL2, KL20 và
KLTA3 nhằm đạt tỷ lệ mẫu nảy chồi từ 5-7%.
- Xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu.
8. Nội dung nghiên cứu chính
6

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy và thời vụ cấy mẫu.
- Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh và tạo nguồn vật liệu ban đầu.

7

DANH MỤC ĐĂNG KÝ SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI
TT Nội dung công việc Dự kiến kết quả đạt đượcKết quả đạt được
1
Nghiên cứu ảnh
hưởng của chất khử
trùng và thời gian
khử trùng
Xác định được chất khử
trùng mẫu, thời gian khử
trùng, phương pháp khử
trùng mẫu thích hợp đạt
tỷ 5-7%
Xác định được chất khử
trùng mẫu, thời gian khử
trùng, phương pháp khử
trùng mẫu thích hợp đạt tỷ
8,7-13,0%
2
Nghiên cứu ảnh hưởng
của tuổi mẫu cấy và
thời vụ cấy mẫu
Xác định được mùa lấy
mẫu và tuổi mẫu thích
hợp
Xác định được mùa lấy
mẫu thích hợp là vụ hè và
tuổi mẫu hiệu quả là 2 tuần
tuổi.
3
Nghiên cứu xác định

môi trường tái sinh và
tạo nguồn vật liệu
ban đầu
Xác định môi trường
tái sinh và tạo nguồn
vật liệu ban đầu.
Xác đinh được môi trường
dinh dưỡng MS cho hệ số
nhân chồi từ 1,24 đến 1,32
lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu
từ 20% đến 21,2%.
4
Tạo bình giống gốc Tạo được 15 bình
giống gốc cho 3 dòng
nghiên cứu (mỗi dòng
5 bình)
Đã tạo được 37 bình
giống gốc cho 3 dòng
nghiên cứu, trong đó:
- Dòng KL2: 10 bình
- Dòng KL20: 16 bình
- Dòng KLTA3: 11 bình

8

Mở đầu
Hiện nay, gỗ là nguồn nguyên liệu chính phục vụ cho sản xuất của Tổng
công ty giấy Việt Nam. Nhu cầu nguyên liệu hàng năm của Tổng công ty là
khoảng 500.000m
3

, trong khi đó các công ty lâm nghiệp mới chỉ cung cấp được
khoảng 60% nhu cầu trên. Thêm vào đó diện tích đất trồng các loài cây nguyên
liệu giấy ngày càng bị thu hẹp do nhu cầu trồng các loài cây công nghiệp và
nông nghiệp khác. Vì vậy việc nghiên cứu nâng cao năng suất và chất lượng
rừng ngày càng cấp thiết. Trong khi đó nhiều diện tích rừng trồng trong Tổng
công ty giấy còn thấp và không đạt yêu cầu, một trong những nguyên nhân
chính là giống đưa vào trồng rừng sản xu
ất có chất lượng không cao. Do đó việc
tăng năng suất rừng trồng bằng sử dụng nguồn giống có chất lượng là việc làm
cần thiết.
Trong những năm gần đây, bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn đã
công nhận ba giống keo lai KL2, KL20 và KLTA3 do tập thể cán bộ Trung tâm
nghiên cứu cứu cây nguyên liệu giấy nay là Viện nghiên cứu cây nguyên liệu
giấy chọn tạo là giống tiến bộ kỹ thuậ
t. Đây là những giống rất thích hợp cho
trồng rừng vùng Trung tâm Bắc Bộ và các vùng có điều kiện sinh thái tương tự.
Thực tế cho thấy rừng trồng các dòng keo lai nêu trên tại vùng Trung tâm Bắc
Bộ cho năng suất cao, chất lượng rừng đồng đều và ổn định hơn tương đối nhiều
so với các loài khác.
Khi đã có giống năng suất cao thì việc nhân nhanh và đưa các giống đã
được chọn lọc và trồ
ng rừng sản xuất là vô cùng quan trọng. Trong các kỹ thuật
nhân giống hiện nay ở nước ta thì nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô
cho hiệu qua cao nhất, đặc biệt là chất lượng di truyền của cây giống được đảm
bảo và khả năng cung cấp số lượng lớn cây giống ở quy mô công nghiệp. Tuy
nhiên, ba giống keo lai nêu trên chưa được tiến hành nghiên cứu bằng kỹ thuật
nuôi cấy mô.
Xuất phát từ những
đặc điểm nêu trên, để góp phần nâng cao năng suất và
duy trì tính ổn định của rừng trồng thì việc làm chủ công nghệ nuôi cấy mô ba

dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 là cần thiết. Do vậy cần sớm thực hiện nội
dung nghiên cứu: “Nghiên cứu nuôi cấy mô invitro ba dòng keo lai KL2, KL20
và KLTA3” là cần thiết.

9

Danh mục bảng biểu

Bảng 01. Công thức khử trùng mẫu cấy 17
Bảng 02. Công thức thí nghiệm tuổi mẫu cấy và thời vụ cấy mẫu 18
Bảng 03. Công thức thí nghiệm xác định môi trường tái sinh chồi. 19
Bảng 04. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với
dòng KL2 21

Bảng 05. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với
dòng KL20 23

Bảng 06. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với
dòng KLTA3 25

Bảng 07. Kết quả nghiên cứu thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng KL2 27
Bảng 08. Kết quả nghiên cứu thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng KL20 28
Bảng 09. Kết quả nghiên cứu thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng KLTA3 29
Bảng 10. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chồi dòng KL2 30
Bảng 11. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chồi dòng KL20 31
Bảng 12. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chồi dòng KLTA3 32

10

Tóm tắt đề tài
Ba giống keo lai KL2, KL20 và KLTA3 là những giống năng suất cao đã
được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống tiến bộ kỹ
thuật. Nhằm tạo cây giống chất lượng cao của những giống trên vào trồng rừng
sản xuất, năm 2012 đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy mô invitro ba dòng keo lai
KL2, KL20 và KLTA3” đã được phê duyệt và thực hiện, đề tài dự kiến thực
hiện trong 3 năm từ 2012-2014.
Năm 2012, đề tài tiến hành nghiên cứu một số bước của giai đoạn tạo
nguồn vật ban đầu gồm: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng mẫu và thời
gian khử trùng; Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu và thời vụ cấy mẫu; Nghiên
cứu xác định môi tái sinh chồi tạo nguồn vật liệu ban đầu. Qua một năm nghiên
cứu và tiến hành các thử nghiệm
đề tài đã thu được những kết bước đầu và tạo
được bình giống gốc của ba dòng nghiên cứu. Đây là những kết quả vô cùng ý
nghĩa để từng bước hoàn thiện và làm chủ công nghệ nhân giống invitro cho ba
dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3.
11

Chương 1
Tổng quan tài liệu
1.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu.
1.1.1. Trong nước.
Cây keo lai tự nhiên đã được phát hiện tại Việt Nam, Thái Lan, Malaysia,
Indonesia, Australia, nam Trung Quốc và một số nước khác ở vùng Châu Á -
Thái Bình Dương, ở vĩ độ 8 - 22
o
Bắc, độ cao 5 - 300 m trên mặt biển, nơi có
lượng mưa hàng năm 1500 - 2500 mm/năm, nhiệt độ trung bình năm 23 - 27

o
C,
nhiệt độ tối cao trung bình tháng nóng nhất 31 - 34
o
C, nhiệt độ tối thấp trung
bình tháng lạnh nhất 15 - 22
o
C.
Vùng trồng Keo lai thích hợp là các tỉnh từ Bắc Trung Bộ đến Nam Bộ
(đặc biệt là các tỉnh Nam Bộ) và Tây Nguyên. Keo lai cũng sinh trưởng tốt ở
vùng thấp các tỉnh Bắc Bộ. Ở những nơi đất tốt và trồng thâm canh có thể đạt
năng suất 25- 35 m
3
/ha/năm.
Cây keo lai được xác định là một trong những loài cây ưu tiên cho các
chương trình trồng rừng hiện nay ở Việt Nam (Cẩm nang lâm nghiệp, Chương:
Chọn loài cây ưu tiên cho các chương trình trồng rừng ở Việt Nam, 2004). Hiện
nay, có rất nhiều dòng keo lai đã được công nhận giống quốc gia là BV10,
BV16, BV32, các dòng được công nhận giống tiến bộ kỹ thuật là BV5, BV29,
BV33, TB6, TB12, KL2, KL20 và KLTA3. Trong đó, có 3 dòng KL2, KL20 và
KLTA3 là 3 dòng được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy tuyển chọn và
nhân giống
đưa vào sản xuất phục vụ trồng rừng.
Các dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 được công nhận là giống tiến bộ
kỹ thuật theo Quyết định số 2722 QĐ/BNN-KHCN, ngày 07/09/2004; Quyết
định số 1773 QĐ/ BNN-KHCN, ngày 17/07/2005 và Quyết định số 1686
QĐ/BNN-KHCN, ngày 09/06/2006.
Kết quả khảo nghiệm ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 (Nguyễn
Quang Đức, 2005) cho thấy rừng trồng dòng KLTA3 đạt năng suất trung bình
40 m

3
/ha/năm (vượt đối chứng keo tai tượng 3.3 lần), rừng trồng dòng KL2 đạt
năng suất 38.6 m
3
/ha/năm (vượt đối chứng 3.2 lần), dòng KL20 đạt năng suất 27
m
3
/ha/năm (vượt đối chứng 3 lần)[5]. Tuy nhiên, hiện nay mới chỉ sản xuất được
cây giống 3 dòng keo lai nói trên bằng phương pháp giâm hom, vẫn còn chưa có
các nghiên cứu nuôi cấy mô cho 3 dòng trên.
Đoàn Thị Thanh Nga và Phạm Thị Kim Thanh (2000) đã nghiên cứu ảnh
hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình nhân chồi cây keo lai.
Báo cáo cho thấy, chồi mẫu cây keo lai được đưa vào ống nghiệm trong điều
kiện xử lý với HgCl
2
0.1% trong 15 phút với tỷ lệ đạt 5%. Môi trường nhân chồi
hữu hiệu là môi trường M
7274
bổ sung 3% saccharose, CH
500
, PVP, 0.3 mg/l
IAA, 5 mg/l KT và 0.3 mg/l IBA. Môi trường tạo rễ hoàn chỉnh cây keo lai trong
ống nghiệm là môi trường ½ M
7274
bổ sung 0.7 mg/l IBA.
12

Đoàn Thị Mai và cộng sự (2007) đã nhân thành công bằng phương pháp
nuôi cấy mô cho một số dòng keo lai mới chọn tạo như BV71, BV73 và BV75.
Báo cáo cho thấy (i) điều kiện khử trùng mẫu hữu hiệu là HgCl

2
0.1% trong 8
phút với tỷ lệ đạt khoảng 10%, (ii) môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường
MS cải tiến bổ sung BAP 1.5 mg/l và NAA 0.5 mg/l, (iii) môi trường ra rễ thích
hợp là ½ MS cải tiến bổ sung IBA 1.5 mg/l.
Ngoài ra, hiện nay cây keo lai mầm mô các dòng BV10, BV16, BV32 đã
được ứng dụng nhân giống và sản xuất thành công tại nhiều cơ sở trong nước
như Trung tâm Ứng dụng khoa học và sản xuất lâm - nông nghiệp Quảng Ninh,
công ty TNHH Nguyên Hạnh ở Bình Định (quy mô 4 tri
ệu cây/năm), Trung tâm
Ứng dụng - chuyển giao công nghệ Phú Yên
Cây keo lai nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô có những ưu điểm
như các cây con đồng nhất về mặt di truyền, mang đầy đủ những ưu thế lai của
cây mẹ, hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất, trong 1m
2

nền có thể để được 18,000 cây. Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với
các nguồn bệnh nên đảm bảo các cây giống sạch bệnh. Cây keo lai cấy mô sau
khi trồng có tốc độ sinh trưởng nhanh và đồng đều, thân lên thẳng, ít phân
nhánh, không chẻ thân, có rễ cọc chắc chắn, thân không giòn, chịu được gió
mạnh, ít đổ ngã nên có thể trồng thành cây lâu năm lấy gỗ, nâng cao giá trị kinh
tế. Cây Keo lai cấy mô khắc phục được những nhược đi
ểm của Keo lai hom như
dễ đổ (cây mô có dễ cọc), mục ruột (cây mô khử trùng không có mầm bệnh).
1.1.2. Ngoài nước.
Keo lai Acacia hybrid là tên gọi của giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng
(Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Keo lai là cây gỗ
thường xanh, cao 25 - 30 m, đường kính 30 - 40 cm. Thân thẳng, cành nhánh
nhỏ, đoạn thân dưới cành lớn. Vỏ màu xám, hơi nứt dọc. Lá, hoa, quả và hạt đều
có tính trung gian giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm. Lá (giả) đơn, mọc cách 3 -

4 gân song song xuất phát từ gốc lá. Hoa tự
bông đuôi sóc nhỏ, màu trắng vàng.
Quả đậu, mặt cắt ngang hình bầu dục. Quả chín tự khai. Hạt đen, hình elip, dài 4
- 5 mm, rộng 2.5 - 3.5 mm. Sinh trưởng nhanh hơn Keo tai tượng và Keo lá
tràm. Gỗ giác màu xám trắng, gỗ lõi màu nâu nhạt, tỷ trọng gỗ khô tự nhiên 0.56
- 0.63, tỷ trọng gỗ khô kiệt 0.48 - 0.54, hiệu suất bột giấy 0.49 - 0.52. Gỗ keo lai
rất thích hợp để làm giấy, làm ván dăm và ván MDF, có thể làm gỗ xẻ và đồ
mộc. Rễ có nhiều nốt s
ần rất thích hợp để cải tạo đất, hoa dùng để nuôi ong.
Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), hoặc vi nhân
giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in
vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây đang được dùng phổ biến để nhân
giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các bộ phận được dùng để nuôi cấy
có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, phấn hoa, phôi và các bộ
ph
ận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) v.v. Song nuôi cấy mô cho
chồi bên và chồi bất định là những phương pháp chính được dùng trong nhân
giống cây rừng.
13

Hiện nay, đã có rất nhiều các loài cây lâm nghiệp được nhân giống thành
công bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào như các loài Acacia, các loài
Eucalyptus, Trong đó, cây keo lai Acacia hybrid là một trong những đối
tượng chính, được nhân giống thành công ở nhiều nước như Malaysia, Ấn Độ
R.Yasodha (2004) đã nghiên cứu tái sinh cây keo lai bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào cho kết quả (i) sử dụng chất khử trùng HgCl
2
, (ii) mùa tốt
nhất để vào mẫu là tháng 5 và tháng 8, (iii) sử dụng môi trường MS bổ sung
IBA 3.0-5.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và IAA 3.0 mg/l là tốt nhất với dòng No.10; sử

dụng môi trường MS bổ sung IBA 2.0-4.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và IAA 2.0 - 3.0
mg/l là tốt nhất với dòng No.32.
S. Mohan Jain, Katsuaki Ishii (2003) tổng hợp các kết quả nghiên cứu
nuôi cấy mô các loài keo trong cuốn “Micropropagation of woody trees and
fruits”. Trong đó có dẫn, keo lai A. mangium x A. auriculiformis được nhân tạo
chồi thành công từ chồi nách cây mẹ 1 tháng tuổi trên môi trường MS bổ sung
2.22 µM BA sau 30-60 ngày, ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh trên môi trường
Seradix 3 bổ sung 0.8% IBA. Những dòng được dẫn về từ cây trưởng thành có
thể được nhân giống thành công trên môi trường MS bổ sung 4.4 µM BA sau 30
- 60 ngày, ra rễ và tạo cây con hoàn chỉnh trên môi trường Seradix 3 bổ sung
0.8% IBA [Darus, 1991].
Christine Le Roux et al. (2009) đã lựa chọn chồi nách từ cây mẹ 1.5 năm
tuổi, các chồi được khử trùng và vào mẫu thành công. Đầu tiên tác giả sử dụng
Tween 20 để rửa mẫu, khử trùng trong cồn 70
0
trong 30s để khử trùng bề mặt.
Sau đó tiến hành khử trùng sâu với HgCl
2
0.1% trong 1-2 phút. Các chồi in vitro
được ra rễ thành công trên môi trường MS giảm ½ nồng độ muối đa lượng, bổ
sung với 0.1 mM NaFe-EDTA, 1.03 µM NAA và 58.4 µM succharose, pH của
môi trường được điều chỉnh ở mức 5.7 và môi trường được ổn định bằng
Phytagel 0.3%. Điều kiện vật lý trong quá trình nuôi cấy là 28
0
C, 16h chiếu sáng
ở cường độ 60 µmol.m
2
.s
1
.

1.2. Cơ sở lý thuyết
Nguyên lý cơ bản của nhân giống in vitro là tính toàn năng của tế bào
thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông
tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genom).
Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời k
ỳ của
quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng
trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác
qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển
thành một cá thể hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ.
• Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi c
ấy mô tế bào thực vật thực chất
là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là
một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó
14

có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Các
mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất định là nhờ vào sự phân hoá.
Phân hoá tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào
của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình
phân hoá có thể biểu diễn như sau:
Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức năng.
Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất
khả năng phân chia của mình. Trong tr
ường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp,
chúng lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện
quá trình phân hóa, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào.
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá
phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một

số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mớ
i, một số gen khác lại bị ức chế
hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong
cấu trúc của phân tử AND của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật,
chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều
kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo
một chương trình đã định sẵn trong AND của tế bào.
15

Chương 2
Thực nghiệm
2.1. Mục tiêu của đề tài.
• Mục tiêu tổng quát.
Ứng dụng quy trình kỹ thuật nuôi cấy mô invitro để nhân nhanh và tạo
thành công cây mầm mô 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 gồm:
- Xác định môi trường dinh dưỡng và điều kiện vật lý thích hợp cho nhân
giống in vitro 3 dòng keo lai nói trên.
- Tạo cây mầm mô keo lai 3 dòng KL2, KL20 và KLTA3 chất lượng cao
phục vụ trồng 2-3ha mô hình.
- Xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro 3 dòng nghiên
cứ
u.
• Mục tiêu năm 2012.
- Xác định được kỹ thuật , điều kiện khử trùng mẫu thích hợp đối với giai
đoạn tạo chồi nuôi cấy mô invitro cho 3 dòng keo lại KL2, KL20 và KLTA3
nhằm đạt tỷ lệ mẫu nảy chồi từ 5-7%.
- Xác định được môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu.
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.
2.2.1. Nội dung nghiên cứu.
Nhằm đạt được mụ

c tiêu chung của đề tài, các nội dung nghiên cứu dự
kiến được thực hiện trong 3 năm từ 2012 đến 2014 như sau:
• Nội dung nghiên cứu năm 2012
1) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng mẫu đối với
ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3.
2) Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy và thời vụ cấy mẫu cho ba dòng keo
lai KL2, KL20 và KLTA3 .
3) Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh và tạo nguồn vật liệu ban đầu cho
ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 .
• Nội dung nghiên cứu từ 2013-2014
1) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường hóa học đến nhân nhanh 3 dòng keo
lai KL2, KL20 và KLTA3.
2) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường vật lý đến nhân nhanh chồi 3 dòng
keo lai KL2, KL20 và KLTA3.
3) Nghiên cứu xác định môi trường tạo rễ 3 dòng keo lai KL2, KL20 và
KLTA3.
16

4) Xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật nuôi cấy mô cho 3 dòng keo lai KL2,
KL20 và KLTA3.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.2.2.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian
khử trùng
Chồi mẫu keo lai được sử dụng là chồi nách và chồi đỉnh của cây mẹ
được trồng tại vườn cấp dòng của đề tài. Chồi mẫu có kích thước dài 3-5cm,
đường kính 1-3mm, có từ 2 nách lá trở lên. Mẫu được cắt vào buổi sáng khi
không còn sương (hay nước)
đọng trên lá (khoảng 8h-9h sáng) và để hạn chế sự
nhiễm khuẩn khi đưa mẫu vào in vitro thì trước khi cắt mẫu trời phải nắng ráo từ
2 ngày trở lên. Mẫu sau khi cắt được đựng trong cốc nước cất.

Thí nghiệm nghiên cứu mẫu cấy từ 25-30 ngày tuổi. Thời gian tiến hành
thí nghiệm từ tháng 4/2012 đến tháng 10/2012.
Chồi được khử trùng bề mặt theo phương pháp khử trùng:
- Rửa nhiều lần qua nướ
c sạch, rửa bằng xà phòng và nước cất;
- Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng và tiến hành thao tác khử trùng, cấy
mẫu;
+ Khử trùng bề mặt bằng cồn 70
0
trong 1 phút. Sau đó, rửa lại bằng nước
cất khử trùng 3-4 lần.
+ Khử trùng sâu bằng một trong các công thức: i) HgCl
2
0.1% hoặc ii)
HgCl
2
0.5% trong các khoảng thời gian khác nhau 2 phút, 5 phút, 8 phút và 10
phút. Sau đó, rửa lại bằng nước cất khử trùng 5-6 lần.
+ Cấy mẫu chồi vào ống nghiệm, 1 chồi/1 ống nghiệm.
- Các chồi sau khi được đưa vào trong ống nghiệm được bảo quản lạnh ở
4
0
C trong 24-48h nhằm mục đích giảm hoạt động trao đổi chất (giảm shock đối
với chồi mới được xử lý), tăng khả năng sống và tái sinh của chồi, giảm tỷ lệ
nhiễm. Sau đó, các chồi được chuyển sang chăm sóc ở điều kiện 27±2
0
C, độ ẩm
50±5%, cường độ ánh sáng 0-500lux.
Mỗi ống nghiệm chứa 10-15ml môi trường dinh dưỡng cơ bản là môi
trường Murashige & Skoog (MS) có bổ sung các chất vitamin, 3% sacrose và

5.0g/l Agar Agar (Hải Long) bổ sung 0.5 mg/l hoocmon BAP để tăng khả năng
tái sinh chồi. Môi trường được khử trùng tại 121
0
C, áp suất 1.4atm trong 20
phút. Điều chỉnh pH môi trường sau khử trùng khoảng 5.8-6.0.
Bố trí thí nghiệm theo dạng 2 nhân tố, khối ngẫu nhiên đầy đủ (bao gồm
18 công thức thí nghiệm). Mỗi công thức thí nghiệm bao gồm 50 mẫu/1 lần lặp
và được lặp lại ít nhất 3 lần.
17

Bảng 01. Công thức khử trùng mẫu cấy.
Ký hiệu
công thức thí nghiệm
Khử trùng sâu
KT1 HgCl
2
0.1% trong 2 phút
KT2 HgCl
2
0.1% trong 5 phút
KT3 HgCl
2
0.1% trong 8 phút
KT4 HgCl
2
0.1% trong 10 phút
KT5 HgCl
2
0.5% trong 2 phút
KT6 HgCl

2
0.5% trong 5 phút
KT7 HgCl
2
0.5% trong 8 phút
KT8 HgCl
2
0.5% trong 10 phút
Thí nghiệm đo đếm và quan sát 4 tuần sau khi cấy. Các chỉ tiêu về tỷ lệ
mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu nảy chồi, số chồi tái sinh, hình thái và màu
sắc mẫu.
2.2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xác định ảnh hưởng của mùa vụ cấy mẫu và
tuổi mẫu cấy
Chồi mẫu keo lai được sử dụng là chồi nách và chồi đỉnh của cây mẹ
được trồ
ng tại vườn cấp dòng của đề tài. Chồi mẫu có kích thước dài 3-5cm,
đường kính 1-3mm, có từ 2 nách lá trở lên. Mẫu được cắt vào buổi sáng khi
không còn sương (hay nước) đọng trên lá (khoảng 8h-9h sáng) và để hạn chế sự
nhiễm khuẩn khi đưa mẫu vào in vitro thì trước khi cắt mẫu trời phải nắng ráo từ
2 ngày trở lên. Mẫu sau khi cắt được đựng trong cốc nước cất.
Thí nghiệm nghiên cứu mẫu cấy ở các tu
ần tuổi 2, 3 và 4 tuổi. Thời vụ
cấy mẫu được được chia làm 2 vụ bao gồm: Vụ hè (từ tháng 4 đến tháng 7/2012)
và vụ thu (từ tháng 8 đến tháng 10 năm 2012).
Chồi được khử trùng như sau:
• Khử trùng bề mặt.
- Rửa nhiều lần qua nước sạch, rửa bằng xà phòng và nước cất;
- Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng và tiến hành thao tác khử trùng, cấy
mẫu;
- Khử

trùng bề mặt bằng cồn 70
0
trong 1 phút. Sau đó, rửa lại bằng nước
cất khử trùng 3-4 lần.
• Khử trùng sâu bằng HgCl
2
cho từng dòng với các nồng độ như sau:
- Dòng KL2: HgCl2 0,5% trong 8 phút.
18

- Dòng KL20: HgCl
2
0,5% trong 5 phút .
- Dòng KLTA3: HgCl
2
0,1% trong 10 phút .
Sau đó, rửa lại bằng nước cất khử trùng 5-6 lần.
+ Cấy mẫu chồi vào ống nghiệm, 1 chồi/1 ống nghiệm.
- Các chồi sau khi được đưa vào trong ống nghiệm được bảo quản lạnh ở
4
0
C trong 24-48h nhằm mục đích giảm hoạt động trao đổi chất (giảm shock đối
với chồi mới được xử lý), tăng khả năng sống và tái sinh của chồi, giảm tỷ lệ
nhiễm. Sau đó, các chồi được chuyển sang chăm sóc ở điều kiện 27±2
0
C, độ ẩm
50±5%, cường độ ánh sáng 0-500lux.
Mỗi ống nghiệm chứa 10-15ml môi trường dinh dưỡng cơ bản là môi
trường Murashige & Skoog (MS) có bổ sung các chất vitamin, 3% sacrose và
5.0g/l Agar Agar (Hải Long) bổ sung 0.5 mg/l hoocmon BAP để tăng khả năng

tái sinh chồi. Môi trường được khử trùng tại 121
0
C, áp suất 1.4atm trong 20
phút. Điều chỉnh pH môi trường sau khử trùng khoảng 5.8-6.0.
Bố trí thí nghiệm theo dạng 2 nhân tố, khối ngẫu nhiên đầy đủ (bao gồm 6
công thức thí nghiệm). Mỗi công thức thí nghiệm bao gồm 50 mẫu/1 lần lặp và
được lặp lại 3 lần.
Bảng 02. Công thức thí nghiệm tuổi mẫu cấy và thời vụ cấy mẫu
Ký hiệu công thức thí
nghiệm
Thời vụ cấy mẫu Tuổ
i mẫu cấy
KT9 Vụ hè (tháng 4-7/2012) 2 tuần tuổi
KT10 Vụ hè (tháng 4-7/2012) 3 tuần tuổi
KT11 Vụ hè (tháng 4-7/2012) 4 tuần tuổi
KT12 Vụ thu (tháng 8-10/2012) 2 tuần tuổi
KT13 Vụ thu (tháng 8-10/2012) 3 tuần tuổi
KT14 Vụ thu (tháng 8-10/2012) 4 tuần tuổi
Thí nghiệm đo đếm và quan sát 4 tuần sau khi cấy. Các chỉ tiêu về tỷ lệ
mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu nảy chồi, số chồi tái sinh, hình thái và màu
sắc mẫu.
2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo
nguồn vật liệu ban đầu
Những mẫu sống không nhiễm nấm khuẩn và nảy chồi sau 28 ngày nuôi
cấy trong ống nghiệm được cấy chuy
ển sang môi trường chứa trong bình tam
giác 250ml chứa môi trường cơ bản để tiến hành các thí nghiệm về nhân chồi.
19

Các môi trường dinh dưỡng nhân chồi cơ bản được thử nmghiệm là

McCOWN’s Woody Plant (WPM), Schenk & Hildebrandt (SH); Murashige &
Skoog (MS), ½ MS (môi trường MS giảm ½ hàm lượng các chất đa lượng), M4
(môi trường tái sinh chồi cây bạch đàn). Thành phần chi tiết nồng độ các chất đa
lượng, vi lượng, vitamin theo phụ lục 02. Môi trường được khử trùng tại 121
0
C,
áp suất 1.4atm trong 20 phút. Điều chỉnh pH môi trường sau khử trùng khoảng
5.8-6.0.
Bố trí thí nghiệm: các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo
phương pháp thực nghiệm so sánh với 3 lần lặp lại theo thời gian. Mỗi công
thức thử nghiệm 10 bình x 5 mẫu/bình.
Thí nghiệm đo đếm và quan sát sau 4 tuần nuôi cấy. Đo đếm các chỉ tiêu
về hệ số nhân chồi, tỷ lệ chồi hữu hiệu và hình thái chồi. Các công thức nghiên
cứu
được mô tả ở bảng 01.
Bảng 03. Công thức thí nghiệm xác định môi trường tái sinh chồi.
Ký hiệu
công thức thí
nghiệm
Môi trường tái sinh chồi
NC1 McCOWN’s Woody Plant (WPM).

NC2

Schenk & Hildebrandt (SH).

NC3

Murashige & Skoog (MS).

NC4

½ MS (môi trường MS giảm ½ hàm lượng các chất đa
lượng).

NC5

M4 (môi trường tái sinh chồi cây bạch đàn).

2.2.2.4. Thu thập và xử lý số liệu
• Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được thiết kế theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ, mỗi công
thức thí nghiệm lặp lại 3 lần. Các yếu tố không tham gia thử nghiệm được đồng
nhất ở mọi công thức thí nghiệm.
• Thu thập số liệu.
∑ Số mẫu chết
Tỷ lệ mẫu chết (%) = x100%
∑ Số mẫu đưa vào



20

∑ Số mẫu bị nhiễm
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x100%
∑ Số mẫu đưa vào

∑ Số mẫu sạch không này chồi
Tỷ lệ mẫu sạch không nảy chồi (%) = x100%
∑ Số mẫu đưa vào

∑ Số mẫu nảy chồi
Tỷ lệ mẫu nảy chồi (%) = x100%
∑ Số mẫu đưa vào

∑
Số chồi tạo thành
Hệ số nhân chồi (lần) =
∑ Số chồi ban đầu

∑ Số chồi hữu hiệu
Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) = x 100
∑ Số chồi tạo thành
Chồi hữu hiệu là những chồi có chiều cao từ 1,0 cm trở lên, thân, lá và
ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus. Thu thập tình trạng phát
triển của chồi g
ồm: hình thái của chồi, màu sắc chồi và mức độ sinh trưởng của
chồi.
• Xử lý số liệu.
Số liệu được xử lý bằng mềm Ecell và chương trình SPSS. Trong đó, để
kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp
so sánh K mẫu độc lập.
Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm ảnh hưởng của các nhân tố đến
kết quả nghiên cứu. Trong bảng phân nhóm Duncan, chỉ tiêu so sánh được chia
thành các nhóm khác nhau. Giữa các nhóm có sự sai khác nhau rõ rệt, trong
cùng một nhóm sự sai khác không có ý nghĩa.
Khi sử
dụng phương pháp phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan có thể có
nhiều đối tượng so sánh ở cùng một cấp, điều này có nghĩa chỉ tiêu so sánh nằm
ở giữa 2 cấp. Nếu có nhiều đối tượng có giá trị so sánh cùng ở 2 cấp chứng tỏ

chỉ tiêu so sánh phân cấp không nhiều (nói các khác là ảnh hưởng của các nhân
tố kiểm tra không lớn).
2.3.Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu.
- Panh, kéo nuôi cấy mô.
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô và các trang thiết bị phụ trợ khác.
21

Chương 3
Kết quả và bình luận
1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng.
3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử
trùng đối với dòng KL2
Kết quả nghiên cứu về chất khử trùng và thời gian khử trùng mẫu của
dòng KL2 được tổng hợp ở bảng 04.
Bảng 04. Kết quả nghiên cứu ả
nh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử
trùng đối với dòng KL2.
CTTN Mẫu
chết
Mẫu
nhiễm
khuẩn
Mẫu sạch
và không
nảy chồi
Mẫu
sạchvà có
nảy chồi
Tổng
Số mẫu 2 129 4 15 150 HgCl

2
0.1% trong
2 phút
Tỷ lệ % 1.3% 86.0% 2.7% 10.0% 100.0%
Số mẫu 2 136 2 10 150 HgCl
2
0.1% trong
5 phút
Tỷ lệ % 1.3% 90.7% 1.3% 6.7% 100.0%
Số mẫu 2 128 3 17 150 HgCl
2
0.1% trong
8 phút
Tỷ lệ % 1.3% 85.3% 2.0% 11.3% 100.0%
Số mẫu 33 108 0 9 150 HgCl
2
0.1% trong
10 phút
Tỷ lệ % 22.0% 72.0% .0% 6.0% 100.0%
Số mẫu 8 120 2 20 150 HgCl
2
0.5% trong
2 phút
Tỷ lệ % 5.3% 80.0% 1.3% 13.3% 100.0%
Số mẫu 15 123 3 9 150 HgCl
2
0.5% trong
5 phút
Tỷ lệ % 10.0% 82.0% 2.0% 6.0% 100.0%
Số mẫu 27 91 6 26 150 HgCl

2
0.5% trong
8 phút
Tỷ lệ % 18.0% 60.7% 4.0% 17.3% 100.0%
Số mẫu 84 61 5 0 150 HgCl
2
0.5% trong
10 phút
Tỷ lệ % 56.0% 40.7% 3.3% .0% 100.0%
Số mẫu 173 896 25 106 1200 Tổng
Tỷ lệ % 14.4% 74.7% 2.1% 8.8% 100.0%
22

Kết quả nghiên cứu trong bảng 04 cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm
khuẩn, mẫu sạch nảy chồi và không nảy chồi có sự dao động rất lớn giữa các
công thức thí nghiệm.
Chất khử trùng và thời gian khử trùng khác nhau có hiệu quả khử trùng
(diệt khuẩn) khác nhau. Chuyên đề tiến hành phân tích và so sánh theo các nhóm
chỉ tiêu sau nhằm xác định rõ hơn hiệu quả của chất khử trùng và thời gian kh
ử
trùng đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời
gian khác nhau, hiệu quả diệt khuẩn của chất khử trùng ở từng công thức thí
nghiệm và tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi.
Đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời
gian khác nhau, qua bảng 01 chúng ta nhận thấy nồng độ chất khử trùng càng
tăng, th
ời gian khử trùng càng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết càng cao. Công thức
khử trùng với HgCl
2
0.5% trong 10 phút có tỷ lệ mẫu chết cao nhất đạt 56%, các

công thức khử trùng với HgCl
2
0.1% trong 2 phút, 5 phút và 8 phút có tỷ lệ mẫu
chết thấp nhất là 1.3%.
Khi thời gian khử trùng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết tăng theo tương ứng.
Như chúng ta đã biết, Hg
++
có tác động lên màng tế bào thông qua liên kết với
các protein màng (Walsh et al., 1988). Khi thời gian khử trùng kéo dài thì lượng
Hg
++
thẩm thấu vào các mô và tế bào càng lớn dẫn đến khả năng gây chết đối với
mẫu cần xử lý càng cao.
Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu chết tăng rõ rệt khi nồng độ chất khử trùng và thời
gian khử trùng cùng tăng và khi thời gian khử trùng thay đổi từ 8 phút lên 10
phút thì ta nhận thấy tỷ lệ mẫu chết tăng rõ rệt ở các nồng độ chất khử trùng
khác nhau (đối với công thức HgCl
2
0.1% thì tỷ lệ này tăng từ 1.3% lên 22% và
đối với công thức HgCl
2
0.5% thì tỷ lệ này tăng từ 18% lên 56%).
Đối với khả năng diệt khuẩn của chất khử trùng trong các khoảng thời
gian khác nhau, ta nhận thấy tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn càng thấp thì tỷ lệ mẫu chết
do chất khử trùng càng cao. Tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn thấp nhất ở công thức
HgCl
2
0.5% trong 10 phút là 40.7% tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết lại là cao nhất là
56% và tỷ lệ mẫu sạch đạt thấp nhất là 3.3%.
Đối với hiệu quả tạo mẫu sạch vô trùng có nảy chồi của chất khử trùng

qua các khoảng thời gian khác nhau: Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch
có nảy chồi cao nhất là công thức khử trùng với HgCl
2
0.5% trong 8 phút đạt tỷ
lệ 17.3%. Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi thấp nhất là
công thức khử trùng với HgCl
2
0.5% trong 10 phút đạt tỷ lệ 0.0%.
Kết quả cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn và đặt biệt là tỷ
lệ mẫu sạch có nảy chồi phụ thuộc vào các công thức thí nghiệm các chất khử
trùng trong các khoảng thời gian khác nhau. Công thức khử trùng với HgCl
2

0.5% trong 8 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất đối với dòng keo lai KL2 với
tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi là 17.3%. Kết quả phân tích thống kê cho các chỉ tiêu
được tổng hợp trong phụ lục 03.
23

3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử
trùng đối với dòng KL20
Bảng 05. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử
trùng đối với dòng KL20.
CTTN Mẫu
chết
Mẫu
nhiễm
khuẩn
Mẫu sạch
và không
nảy chồi

Mẫu
sạchvà có
nảy chồi
Tổng
Số mẫu 0 146 3 1 150HgCl
2
0.1% trong
2 phút
Tỷ lệ % .0% 97.3% 2.0% .7% 100.0%
Số mẫu 19 125 1 5 150HgCl
2
0.1% trong
5 phút
Tỷ lệ % 12.7% 83.3% .7% 3.3% 100.0%
Số mẫu 35 106 4 5 150HgCl
2
0.1% trong
8 phút
Tỷ lệ % 23.3% 70.7% 2.7% 3.3% 100.0%
Số mẫu 40 101 2 7 150HgCl
2
0.1% trong
10 phút
Tỷ lệ % 26.7% 67.3% 1.3% 4.7% 100.0%
Số mẫu 5 134 5 6 150HgCl
2
0.5% trong
2 phút
Tỷ lệ % 3.3% 89.3% 3.3% 4.0% 100.0%
Số mẫu 28 108 1 13 150HgCl

2
0.5% trong
5 phút
Tỷ lệ % 18.7% 72.0% .7% 8.7% 100.0%
Số mẫu 37 104 3 6 150HgCl
2
0.5% trong
8 phút
Tỷ lệ % 24.7% 69.3% 2.0% 4.0% 100.0%
Số mẫu 55 86 4 5 150HgCl
2
0.5% trong
10 phút
Tỷ lệ % 36.7% 57.3% 2.7% 3.3% 100.0%
Số mẫu 219 910 23 48 1200Tổng
Tỷ lệ % 18.2% 75.8% 1.9% 4.0% 100.0%
Kết quả nghiên cứu trong bảng 05 cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm
khuẩn, mẫu sạch nảy chồi và không nảy chồi đối với dòng keo lai KL20 cũng
tương tự như đối với dòng KL2, các chỉ tiêu theo dõi có sự dao động rất lớn giữa
các công thức thí nghiệm.
Chất khử trùng và thời gian khử trùng khác nhau có hiệu quả khử trùng
(diệt khuẩn) khác nhau. Chuyên đề tiến hành phân tích và so sánh theo các nhóm
24

chỉ tiêu sau nhằm xác định rõ hơn hiệu quả của chất khử trùng và thời gian khử
trùng đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời
gian khác nhau, hiệu quả diệt khuẩn của chất khử trùng ở từng công thức thí
nghiệm và tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi.
Đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử
trùng trong các khoảng thời

gian khác nhau, qua bảng 05 chúng ta nhận thấy nồng độ chất khử trùng càng
tăng, thời gian khử trùng càng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết càng cao. Công thức
khử trùng với HgCl
2
0.5% trong 10 phút có tỷ lệ mẫu chết cao nhất đạt 36.7%,
các công thức khử trùng với HgCl
2
0.1% trong 2 phút có tỷ lệ mẫu chết thấp
nhất là 0.0%.
Khi thời gian khử trùng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết tăng theo tương ứng.
Như chúng ta đã biết, Hg
++
có tác động lên màng tế bào thông qua liên kết với
các protein màng (Walsh et al., 1988). Khi thời gian khử trùng kéo dài thì lượng
Hg
++
thẩm thấu vào các mô và tế bào càng lớn dẫn đến khả năng gây chết đối với
mẫu cần xử lý càng cao.
Đối với khả năng diệt khuẩn của chất khử trùng trong các khoảng thời
gian khác nhau, ta nhận thấy tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn càng thấp thì tỷ lệ mẫu chết
do chất khử trùng càng cao. Tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn thấp nhất ở công thức
HgCl
2
0.5% trong 10 phút là 57.3% tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết lại là cao nhất là
36.7%.
Đối với hiệu quả tạo mẫu sạch vô trùng có nảy chồi của chất khử trùng
qua các khoảng thời gian khác nhau: Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch
có nảy chồi cao nhất là công thức khử trùng với HgCl
2
0.5% trong 5 phút đạt tỷ

lệ 8.7%. Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi thấp nhất là công
thức khử trùng với HgCl
2
0.1% trong 2 phút đạt tỷ lệ 0.7%.
Kết quả cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn và đặt biệt là tỷ
lệ mẫu sạch có nảy chồi phụ thuộc vào các công thức thí nghiệm các chất khử
trùng trong các khoảng thời gian khác nhau. Công thức khử trùng với HgCl
2

0.5% trong 5 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất đối với dòng keo lai KL20
với tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi là 8.7%. Kết quả phân tích thống kê cho các chỉ tiêu
được tổng hợp trong phụ lục 03.
3.1.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử
trùng đối với dòng KLTA3
Kết quả nghiên cứu trong bảng 06 cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm
khuẩn, m
ẫu sạch nảy chồi và không nảy chồi đối với dòng keo lai KLTA3 cũng
tương tự như đối với dòng KL2, các chỉ tiêu theo dõi có sự dao động rất lớn giữa
các công thức thí nghiệm. Chất khử trùng và thời gian khử trùng khác nhau có
hiệu quả khử trùng (diệt khuẩn) khác nhau. Chuyên đề tiến hành phân tích và so
sánh theo các nhóm chỉ tiêu sau nhằm xác định rõ hơn hiệu quả của chất khử
trùng và thời gian khử trùng đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng
trong các khoảng thời gian khác nhau, hiệu quả diệt khuẩn của chất khử trùng ở
từng công thức thí nghiệm và tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi.
25

Bảng 06. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử
trùng đối với dòng KLTA3.
CTTN Mẫu
chết

Mẫu
nhiễm
khuẩn
Mẫu sạch
và không
nảy chồi
Mẫu
sạchvà có
nảy chồi
Tổng
Số mẫu 3 137 10 0 150HgCl
2
0.1% trong
2 phút
Tỷ lệ % 2.0% 91.3% 6.7% .0% 100.0%
Số mẫu 6 118 6 20 150HgCl
2
0.1% trong
5 phút
Tỷ lệ % 4.0% 78.7% 4.0% 13.3% 100.0%
Số mẫu 16 107 6 21 150HgCl
2
0.1% trong
8 phút
Tỷ lệ % 10.7% 71.3% 4.0% 14.0% 100.0%
Số mẫu 33 96 9 12 150HgCl
2
0.1% trong
10 phút
Tỷ lệ % 22.0% 64.0% 6.0% 8.0% 100.0%

Số mẫu 25 122 0 3 150HgCl
2
0.5% trong
2 phút
Tỷ lệ % 16.7% 81.3% .0% 2.0% 100.0%
Số mẫu 61 82 2 5 150HgCl
2
0.5% trong
5 phút
Tỷ lệ % 40.7% 54.7% 1.3% 3.3% 100.0%
Số mẫu 76 67 4 3 150HgCl
2
0.5% trong
8 phút
Tỷ lệ % 50.7% 44.7% 2.7% 2.0% 100.0%
Số mẫu 83 63 4 0 150HgCl
2
0.5% trong
10 phút
Tỷ lệ % 55.3% 42.0% 2.7% .0% 100.0%
Số mẫu 303 792 41 64 1200Tổng
Tỷ lệ % 25.2% 66.0% 3.4% 5.3% 100.0%
Đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời
gian khác nhau, qua bảng 03 chúng ta nhận thấy nồng độ chất khử trùng càng
tăng, thời gian khử trùng càng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết càng cao. Công thức
khử trùng với HgCl
2
0.5% trong 10 phút có tỷ lệ mẫu chết cao nhất đạt 55.3%,
các công thức khử trùng với HgCl
2

0.1% trong 2 phútcó tỷ lệ mẫu chết thấp nhất
là 2.0%. Khi thời gian khử trùng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết tăng theo tương ứng.
Như chúng ta đã biết, Hg
++
có tác động lên màng tế bào thông qua liên kết với
các protein màng (Walsh et al., 1988). Khi thời gian khử trùng kéo dài thì lượng
Hg
++
thẩm thấu vào các mô và tế bào càng lớn dẫn đến khả năng gây chết đối với
26

mẫu cần xử lý càng cao.
Đối với khả năng diệt khuẩn của chất khử trùng trong các khoảng thời
gian khác nhau, ta nhận thấy tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn càng thấp thì tỷ lệ mẫu chết
do chất khử trùng càng cao. Tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn thấp nhất ở công thức
HgCl
2
0.5% trong 10 phút là 42.0% tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết lại là cao nhất là
55.3%.
Đối với hiệu quả tạo mẫu sạch vô trùng có nảy chồi của chất khử trùng
qua các khoảng thời gian khác nhau: Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch
có nảy chồi cao nhất là công thức khử trùng với HgCl
2
0.1% trong 8 phút đạt tỷ
lệ 14.0%. Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi thấp nhất là
công thức khử trùng với HgCl
2
0.5% trong 10 phút đạt tỷ lệ 0.0%.
Kết quả cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn và đặt biệt là tỷ
lệ mẫu sạch có nảy chồi phụ thuộc vào các công thức thí nghiệm các chất khử

trùng trong các khoảng thời gian khác nhau. Công thức khử trùng với HgCl
2

0.1% trong 8 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất đối với dòng keo lai KLTA3
với tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi là 14.0%. Kết quả phân tích thống kê cho các chỉ
tiêu được tổng hợp trong phụ lục 03.
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy.
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đố
i với
dòng KL2
Kết quả tổng hợp về ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy
được thể hiện ở bảng 07. Bảng 07 cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm khuẩn,
mẫu sạch nảy chồi và không nảy chồi giữa các công thức thí nghiệm có sự khác
nhau giữa các công thức.
Trong bốn chỉ tiêu nghiên cứu nêu trên thì chỉ tiêu mẫu mẫu sạch và nảy
chồi là chỉ tiêu đánh giá hiệu quả của quá trình vào mẫu tạo vật liệu ban đầu.
Bảng 07 cho thấy, tỷ lệ mẫu sạch khuẩn và nảy chồi biến động từ 12% đến 18%
ở các công thức thí nghiệm.
Công thức cho tỷ lệ mẫu sạch khuẩn và nảy chồi tốt nhất là công thức
KT9 (vụ hè + 2 tuần tuổi) ở công thức này tỷ lệ mẫu s
ống và nảy chồi bình quân
là 18%. Tiếp đến là công thức KT10 và KT11 cho tỷ lệ mẫu sạch và nảy chồi
bình quân là 16%. Điều này cho thấy khi vào mẫu ở mùa hè tốt nhất là tuổi mẫu
ở 2 tuần tuổi sau đó là 3 và 4 tuần tuổi cho tỷ lệ mẫu sạch khuẩn và nảy chồi là
như nhau. Tiếp đến tỷ lệ mẫu sạch và nảy chồi lần lượt là các công thức KT12,
KT13 và KT14 với tỷ lệ
mẫu sạch và nảy chồi lần lượt là 14%, 14% và 12%. Tỷ
lệ mẫu sạch và nảy chồi này là tương đối cao so với các nghiên cưu về nuôi cấy
mô cây keo lai.
Để xem xét sự sai khác giữa các kết quả nghiên cứu có ý nghĩa về mặt

thống kê hay không, đề tài tiến hành phân tích thống kê cho các chỉ tiêu nghiên
cứu. Kết quả phân tích thống kê cho thấy (phụ lục 04), tỷ lệ mẫu chết, mẫu
nhiễm khuẩn, mẫ
u sạch nảy chồi và không nảy chồi giữa các công thức thí