Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý nitơ trong nước thải

VIEN VI SINH VÄT VA CONG NGHE SINH HOC
BAO CAO TÖNG KET DE TAI
NGHIEN CU*U SAN XUÄT CHE PHÄM SINH HOC
HO TRÖ XU” LY NITÖ TRONG NLÖC THAI "
CNDT: DINH THUY HANG
9774
HA NÖI - 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
VIỆN VI SINH VẬT Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC '

-

-
— -—
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
BÁO CÁO THỐNG KÊ KÉT QUẢ THỰC h iện đề tài
I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý nitơ trong
nước thải
Mã số: KC.04.TN07/11-15
Thuộc: Chương trình nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ sinh
học, mã số KC.04/11-15.
2. Chủ nhiệm đề tài:
Họ và tên: Đinh Thúy Hằng
Ngày, tháng, năm sinh: 01/03/1970 Nam/Nữ: Nữ
Học hàm, học vị: Tiến sỹ
Chức danh khoa học: nghiên cứu viên Chức vụ: trưởng phòng
Điện thoại: Tổ chức: 04 3754 7488 Mobile: 0972 523 466
Fax: 04 3754 7407 E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Phòng sinh thái vi sinh vật, Viện Vi sinh vật

và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN
Địa chỉ tổ chức: Nhà E2, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy - Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: Số 11 ngõ 4/22 Phương Mai, Đống Đa - Hà Nội
3. Tổ chức chủ trì đề tài:
Tên tổ chức: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN
Điện thoại: 04 3754 7407 Fax: 04 3754 7407
E-mail: Website: imbt.vnu.edu.vn
Địa chỉ: Nhà E2, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy - Hà Nội
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS. TS. Dương Văn Hợp
Số tài khoản: 301.01.018 tại Kho bạc Nhà nước Thanh Xuân
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà
nước KC.04/11-15, Bộ Khoa học và Công nghệ.
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 01 năm 2012 đến tháng 12 năm 2012
- Thực tế thực hiện: từ tháng 01 năm 2012 đến tháng 12 năm 2012
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 550 tr.đ, trong đó:
+ Kinh phí hỗ trợ từ SNKH: 550 tr.đ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: không có
+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án: không có
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH
TT
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Ghi chú
(Số đề nghị
quyết toán)
Thời gian
Kinh phí
(Tr. đ)

Thời gian
Kinh phí
(Tr. đ)
1
01/2012 - 12/2012: Thuê
khoán chuyên môn
190 03/2012 -
12/2012
190 190
CĐ1 10 10 10
CĐ2 20 20 20
CĐ3 10 10 10
CĐ4 30 30 30
CĐ5 30 30 30
CĐ6 10 10 10
CĐ7 20 20 20
CĐ8 20 20 20
CĐ9 10 10 10
CĐ10 10 10 10
CĐ11 10 10 10
CĐ12 10 10 10
2 01/2012 - 12/2012:
Nguyên, nhiên vật liệu
260 03/2012 -
12/2012
Nguyên vật liệu
174,85 174,85 174,85
Vật tư tiêu hao
72,55 72,55 72,55
Điện nước 12,6 12,6 12,6

3 01/2012 - 12/2012:
Chi khác
100 03/2012 -
12/2012
88,135 87,685
Công tác phí 30 27,5 27,050
Quản lý chung 15 15 15
Kiểm tra cơ sở
15 9,750 9,750
Hội thảo
12 7,885 7,885
Văn phòng phẩm 2 2 2
Phụ cấp đề tài
12 12 12
Viết thuyết minh
2 2 2
Báo cáo tổng kết
12 12 12
c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi
Đơn vị tính: Triệu đồng
TT Nội dung các khoản
chi
Theo kế hoạch Thực tê đạt được
Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Trả công lao động
(khoa học, phổ thông)
190 190 190 190

2 Nguyên vật liệu, năng
lượng
260 260 260 260
3
Thiết bị, máy móc
4
Xây dựng, sửa chữa
nhỏ
5
Chi khác 100 100 88,135 88,135
Tổng cộng
550 550 538,135 538,135
3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài
(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét
chọn, phê duyệt kinh phí hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu
có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn kiến nghị điều chỉnh nếu có)
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản Ghi chú
1
Quyết định số
1876/QĐ-BKHCN
ngày 27/6/2011
Quyết định về việc thành lập Hội đồng
khoa học và công nghệ tư vấn xét chọn tổ
chức và cá nhân chủ trì đề tài nghiên cứu
khoa học công nghệ tiềm năng thực hiện
năm 2011 thuộc lĩnh vực Công nghệ sinh
học

2
Quyết định số
3856/QĐ-BKHCN
ngày 15/12/2011
Quyết định về việc phê duyệt kinh phí, tổ
chức và cá nhân chủ trì các nhiệm vụ
KH&CN bắt đầu thực hiện trong kế
hoạch năm 2011 thuộc chương trình
Nghiên cứu phát triển và ứng dụng công
nghệ sinh học (Mã số KC.04/11-15)
3 Hợp đồng số
07/2011/HĐ - ĐTTN -
KC.04/11-15.
Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát
triển công nghệ
4
Quyết định số
177A/QĐ-CNSH ngày
11/12/2012
Quyết định về việc thành lập Hội đồng
cấp cơ sở đánh giá quy trình sản xuất chế
phẩm sinh học hỗ trợ xử lý nitơ trong
nước thải
5
Quyết định số 185A
ngày 21/12/2012
Quyết định về việc nghiệm thu cấp cơ sở
Quy trình nghiên cứu khoa học
6 Quyết định số 185/QĐ-
CNSH ngày

20/12/2012
Quyết định về việc thành lập Hội đồng
nghiệm thu cấp cơ sở đề tài: “Nghiên cứu
sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý
nitơ trong nước thải“ mã số
KC.04.TN07/11-15
4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài
TT
Tên tổ chức
đăng ký theo
thuyết minh
Tên tổ chức đã
tham gia thực
hiện
Nội dung tham
gia chủ yếu
Sản phẩm chủ
yếu đạt được
Ghi
chú*
1 Ong Dương Tấn
Đức, trại lợn CP
tại Tam Dương,
Vĩnh Phúc
Ong Dương Tấn
Đức, trại lợn CP
tại Tam Dương,
Vĩnh Phúc
Phối hợp thực
hiện thử nghiệm

chế phẩm trên hệ
thống xử lý nước
thải sau biogas
Cải tạo hệ thống
xử lý nước thải
sau biogas, áp
dụng chế phẩm
và thu mẫu phân
tích
2 Công ty cổ phần
cồn rượu Hà
Nội (Halico)
Phối hợp thực
hiện thử nghiệm
chế phẩm trên hệ
thống xử lý nước
thải sau biogas tại
KCN Yên Phong,
Bắc Ninh
Khởi động vận
hành và duy trì
ổn định hệ thống
bể TF để loại
nitơ trong nước
thải
5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10
người kể cả chủ nhiệm)
TT Tên cá nhân
đăng ký theo

thuyết minh
Tên cá nhân
đã tham gia
thực hiện
Nội dung tham
gia chính
Sản phẩm chủ
yếu đạt được
Ghi chú*
1
TS. Đinh Thúy
Hằng
TS. Đinh
Thúy Hằng
Xây dựng đề
cương; điều hành
các công việc của
đề tài, viết báo
cáo tổng kết.
Đề cương nghiên
cứu chi tiết, các
báo cáo giữa kỳ
và cuối kỳ.
2
ThS. Thái
Mạnh Hùng
CN. Nguyễn
Thị Hằng,
CN. Dương
Chí Công

Nghiên cứu quy
trình đưa tế bào
lên chất mang và
phát triển sinh
phẩm; Thiết kế
và vận hành mô
hình xử lý nitơ
trong phòng thí
nghiệm để thử
nghiệm chế phẩm.
Lựa chọn chất
mang vô cơ phù
hợp; xây dựng
quy trình phát
triển chế phẩm;
thiết kế mô hình
xử lý nước thải 3
5 lít và vận hành
thử nghiệm chế
phẩm
3 CN. Dương
Chí Công
CN. Dương
Chí Công
Thử nghiệm chế
phẩm tại hệ thống
xử lý nước thải
sau biogas ở Vĩnh
Phúc
Cải tạo hệ thống

xử lý nước thải
sau biogas ở Vĩnh
Phúc; thử nghiệm
áp dụng chế
phẩm, phân tích
mẫu nước thải
4 ThS. Nguyễn
Thị Tuyền
ThS. Nguyễn
Thị Tuyền
Phân lập, tuyển
chọn các chủng vi
khuẩn nitrat hóa
và khử nitrat;
Định danh các
chủng tuyển chọn
và xác định độ an
toàn sinh học.
Bộ chủng vi
khuẩn nitrat hóa
và khử nitrat; giải
trình tự 16S
rDNA và định
danh, sơ tuyển
các chủng theo
hoạt tính sinh học
5 ThS. Nguyễn
Thị Hải
ThS. Nguyễn
Thị Hải

Thực hiện các
phân tích hóa học,
sinh học phân tử
Phân tích các chỉ
tiêu môi trường;
phân tích thành
phần loài vi
khuẩn trong mô
hình bằng điện di
biến tính
6
ThS. Hoàng
Văn Thái
ThS. Hoàng
Văn Thái
Nghiên cứu nuôi
tăng sinh vi khuẩn
trên các thiết bị
lên men
Quy trình lên men
và thu sinh khối
vi khuẩn
- Lý do thay đổi: ThS. Thái Mạnh Hùng chuyển công tác
6. Tình hình hợp tác quốc tế
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn,
số lượng người tham gia )
Thực tế đạt được

(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số
đoàn, số lượng người tham gia )
Ghi chú*
1
2
7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm)
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm)
Ghi chú*
1 - Kinh phí: 12 000 000
- Thời gian: 11/2012
- Nội dung: Xử lý nitơ trong nước
thải ở Việt Nam: Hiện trạng và
vai trò hỗ trợ của ngành công
nghệ sinh học.
- Thời gian: 2/11/2012
- Địa điểm: P601, Viện Vi sinh
vật và Công nghệ sinh học
- Kinh phí: 7 885 000
r _ Ị
8
rri Ả V Ả _A* _1 __ _ A _ _ *A_ _ 1 _ *? A
. Tóm tăt các nội dung công việc chủ yếu
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong

nước và nước ngoài)
TT
Các nội dung công việc chủ yếu
(Các mốc đánh giá chủ yếu)
Thời gian
(Bắt đầu, kết thúc -
tháng năm)
Cá nhân, đơn vị
thực hiện
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
1 Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn nitrat
hóa và khử nitrat từ một số môi
1 - 3/2012 3/2012 Nguyễn Thị Tuyền
Nguyễn Thị Hằng
trường đại diện ở Việt Nam
2 Nội dung 2: Nghiên cứu điều kiện
lên men tối ưu đối với vi khuẩn nitrat
hóa và khử nitrat
3 - 5/2012 7/2012 Hoàng Văn Thái
Nguyễn Thị Hải
3 Nội dung 3: Nghiên cứu hình thức
chế phẩm thích hợp và sản xuất thử
nghiệm
3 - 7/2012 7/2012 Nguyễn Thị Hằng
Hoàng Văn Thái
4 Nội dung 4: Thiết kế mô hình xử lý
và thử nghiệm áp dụng chế phẩm

5 - 9/2012 9/2012 Dương Chí Công
Đinh Thúy Hằng
5 Nội dung 5: Thử nghiệm áp dụng
chế phẩm vào thực tế
8 -
11/2012
11/2012
Dương Chí Công
Đinh Thúy Hằng
Nguyễn Thị Hằng
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra
a) Sản phẩm Dạng I:
TT Tên sản phẩm và chỉ tiêu
Đơn vị đo
Số lượng
chất lượng chủ yếu
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1
Chủng vi sinh vật nitrat hóa và
khử nitrat
Chủng 7 - 10 10
2
Chế phẩm sinh học xử lý nitơ
trong nước thải có chất lượng
như đã đăng ký:
Lít/kg 5 - 10 kg / lít 5 kg dạng bột
120 lít dạng dịch
- Thành phần vi khuẩn nitrat
hóa và khử nitrat

- Điều kiện hoạt động
Tế bào/g
hoặc ml
Các yếu tố
hóa/lý thích
hợp
109/g hoặc ml
nhiệt độ từ 20 -
37°C, pH từ 6,5
- 8, độ mặn <
109/g hoặc ml
nhiệt độ từ 20 -
37°C, pH từ 6,5 -
8, độ mặn < 1%,
1%, oxy hòa tan
> 5 mg/L
oxy hòa tan > 2
mg/L
- Liều lượng sử dụng
ppm
10 - 50 ppm 10 - 50 ppm
- Thời hạn bảo quản
tháng
6 - 12 6 - 12
- Lý do thay đổi: do nhu cầu phát sinh trong thử nghiệm chế phẩm ở điều kiện
thực tế nên nhóm tác giả đã tăng sản xuất lượng chế phẩm dạng dịch.
b) Sản phẩm Dạng II
TT Tên sản phẩm
Yêu cầu khoa học cần đạt
Ghi chú

Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1 Quy trình sản xuất chế phẩm Quy trình dạng Quy trình dạng sơ CĐ 3.3,
sinh học hỗ trợ xử lý nitơ sơ đồ khôi đồ khôi Báo cáo tổng
trong nước thải đạt tiêu chuẩn kết
kỹ thuật như đã đăng ký
c) Sản phẩm Dạng III:
TT Tên sản phẩm
Yêu cầu khoa học cần đạt
Số lượng,
nơi công bố
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1
Bài báo khoa học
01 bài đăng trên
tạp chí chuyên
ngành.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn
nitrat hóa đạt mật độ tế
bào cao trên thiết bị lên
men.
Tạp chí Công
nghệ sinh
học, đã nhận
đăng.
d) Kết quả đào tạo
TT
Câp đào tạo, chuyên ngành
Số lượng Ghi chú
(Thời gian
kết thúc)

Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Không đăng ký
đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống vi
sinh vật
TT Tên sản phẩm đăng ký Số lượng Ghi chú
(Thời gian
kết thúc)
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Không đăng ký
e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
TT
Tên kết quả đã
được ứng dụng
Thời gian Địa điểm
(Ghi rõ tên, địa chỉ
nới ứng dụng)
Kết quả sơ bộ
1
Chế phẩm STN
hỗ trợ xử lý nitơ
trong nước thải
8 - 10/2012 Trại nuôi lợn CP
tại huyện Tam
Dương, tỉnh Vĩnh
Phúc
Tăng hiệu quả loại nitơ
trong nước thải sau biogas
từ 12% lên trên 65%
9 - 11/2012
Nhà máy rượu Hà

Nội tại KCN Yên
Phong, Bắc Ninh
Khởi động tôt và ổn định
hệ thông TF với công suất
700 - 1000 m3 nước
thải/ngày, đảm bảo hàm
lượng nitơ ở đầu ra đạt
tiêu chuẩn quy định
2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh trình độ công nghệ với
khu vực và thế giới )
Công nghệ xử lý nitơ trong nước thải theo phương pháp nitrat hóa/khử
nitrat là công nghệ chủ yếu được áp dụng thành công tại nhiều nước trên thế
giới. Ở các nước phát triển như châu Âu, Mỹ, Nhật, công nghệ này đã được
nghiên cứu rộng rãi, các bước vận hành của công nghệ cũng đã được tối ưu hóa,
đặc biệt các nhóm vi khuẩn tham gia quá trình xử lý là nitrat hóa và khử nitrat
đã được nghiên cứu rất sâu sắc. Ở nước ta những nghiên cứu về vi khuẩn nitrat
hóa và khử nitrat còn chưa nhiều, chủ yếu do quy trình phân lập và nuôi cấy các
nhóm vi khuẩn này khá phức tạp. Trong bảo tàng giống quốc gia (VTCC) còn
vắng bóng các chủng vi khuẩn thuộc hai nhóm này để làm nguyên liệu cho
nghiên cứu vàứng dụng. Hơn thế, việc nuôi tăng sinh các loài vi khuẩn trên, đặc
biệt là nhóm nitrat hóa, trong hệ thống lên men để đạt mật độ tế bào cao cũng
chưa được thực hiện. Đó là những kiến thức về khoa học hiện đang còn thiếu mà
nhóm tác giả khi thực hiện đề tài muốn đóng góp.
Về mặt công nghệ, tuyệt đại đa số các hệ thống xử lý nước thải tập trung
(hoặc bán tập trung) ở nước ta đều thực hiện quy trình loại nitơ theo công nghệ
nitrat hóa/khử nitrat, tuy nhiên hiệu quả xử lý không cao do nhiều lý do, trước
nhất phải kể đến (i) thiết kế và vận hành chưa phù hợp (thường do hạn chế về
diện tích và kinh phí), (ii) nguồn thải không ổn định do nhiều công nghệ sản

xuất lỗi thời. Trong khi các chế phẩm dùng cho mục đích xử lý nước thải sản
xuất trong nước chưa đáp ứng được yêu cầu, các chế phẩm nhập ngoại có chất
lượng tốt thì giá thành lại quá cao, đề tài nghiên cứu này được đề xuất nhằm đưa
ra một loại chế phẩm sinh học phù hợp về chất lượng và giá thành để khắc phục
tình trạng kém hiệu quả của các hệ thống xử lý nước thải hiện nay trong việc
loại nitơ.
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài tạo ra so với các sản phẩm cùng loại
trên thị trường)
Theo kết quả thử nghiệm thực tế của đề tài, chế phẩm STN có giá thành
thấp hơn so với sản phẩm tương tự nhập từ Mỹ khoảng 5 - 7 lần và có chất
lượng tương đương. Đối tượng áp dụng của chế phẩm cũng rất rộng rãi, mục
tiêu hàng đầu là các hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt và công nghiệp tập trung,
đang hoạt động kém hiệu quả và các hệ thống mới đưa vào vận hành cần hỗ trợ
pha khởi động.
3. Tình hình thưc hiên chế đô báo cáo, kiểm tra của đề tài
• • • '
TT
Nôi dung
Thời gian
Ghi chú (Tóm tắt kết quả, kết luận chính,
người chủ trì)
1 Kiếm tra định kỳ
Lần 1 16/8/2012
- Thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu
theo tiến độ đăng ký.
- Xác nhận khối lượng công việc qua 9
chuyên đề, phân bố trong cả 5 nội dung
nghiên cứu đã đăng ký
Lần 2 20/12/2012

- Hoàn thành nốt 3 chuyên đề còn lại thuộc
nội dung nghiên cứu 4 và 5
2
Họp mặt chương
trình KC.04/11-15
18 -
19/12/2012
- Báo cáo tóm tắt kết quả nghiên cứu và triến
khai thực tế của đề tài
3
Nghiệm thu cấp cơ
sở Quy trình sản
xuất chế phẩm
17/12/2012
Đạt yêu cầu
4
Nghiệm thu cấp cơ
sở đề tài
26/12/2012
Đạt yêu cầu, đề nghị tiếp tục triến khai
5
Bảng kê xác nhận
chứng từ đã thanh
toán
15/1/2013
Đầy đủ, hợp lệ
6
VPCT kiếm tra
thanh toán
21/1/2013

Đầy đủ, hợp lệ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chương I. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ĐỀ TÀI 1
1.1. Cơ sở xây dựng đề tài 1
1.2. Mục tiêu, đối tượng, tính cấp thiết, phạm vi nghiên cứu, ý nghĩa 2
khoa học và thực tiễn của đề tài
1.2.1. Mục tiêu 2
1.2.2. Đối tượng 2
1.2.3. Tính cấp thiết của đề tài 3
1.2.4. Phạm vi nghiên cứu 4
1.2.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4
Chương II. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG 6
VÀ NGOÀI NƯỚC
2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6
2.1.1. Ảnh hưởng của ô nhiễm nitơ trong môi trường 6
2.1.2. Chu trình chuyển hóa nitơ và các vi sinh vật tham gia 7
2.1.3. Xử lý nitơ bằng công nghệ nitrat hóa/khử nitrat 11
2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 13
2.3. Những vấn đề cần giải quyết 14
Chương III. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16
3.1. Phương pháp vi sinh vật học 16
3.1.1. Làm giàu và phân lập vi khuẩn nitrat hóa 16
3.1.2. Làm giàu và phân lập vi khuẩn khử nitrat 17
3.1.3. Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý của các chủng phân lập 18
3.1.4. Nhuộm tế bào và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang 19
3.2. Các phương pháp phân tích hóa học 19
3.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng ammonium 19
3.2.2. Phương pháp xác định nitrit/nitrat 20
3.2.3. Phương pháp xác định nitrat 21

3.3. Các phương pháp sinh học phân tử 22
3.3.1. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại 22
3.3.2. Điện di biến tính DGGE 22
Chương IV. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 24
5.1. NỘI DUNG 1: Phân lập vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat từ một 24
số môi trường đại diện ở Việt Nam
5.1.1. Làm giàu và phân lập vi khuẩn nitrat hóa 24
5.1.2. Làm giàu và phân lập vi khuẩn khử nitrat 26
5.1.3. Định danh các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn sơ bộ 28
5.1.4. Nghiên cứu hoạt tính trao đổi chất của các chủng vi khuẩn 29
đã sơ tuyển
5.1.4.1. Hoạt tính trao đổi chất của các chủng vi khuẩn AOB 29
5.1.4.2. Hoạt tính trao đổi chất của các chủng vi khuẩn NOB 30
5.1.4.3. Hoạt tính trao đổi chất của các chủng vi khuẩn NRB 32
5.1.5. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới sinh trưởng của các 33
chủng vi khuẩn quan tâm
5.1.5.1. Điều kiện sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nitrat 33
hóa
5.1.5.2. Điều kiện sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khử 35
nitrat
5.2. NỘI DUNG 2: Nghiên cứu điều kiện lên men tối ưu đối với vi 39
khuẩn nitrat hóa và khử nitrat
5.2.1. Nghiên cứu điều kiện lên men tối ưu cho vi khuẩn nitrat 39
hóa
5.2.1.1. Xác định điều kiện tối ưu cho vi khuẩn nitrat hóa ở 39
thiết bị lên men
5.2.1.2. Nuôi tăng sinh đồng thời hai chủng vi khuẩn nitrat 41
hóa
5.2.2. Nghiên cứu điều kiện lên men tối ưu đối với vi khuẩn khử 43
nitrat

5.3. NỘI DUNG 3: Nghiên cứu hình thức chế phẩm thích hợp và sản 46
xuất thử nghiệm
5.3.1. Nghiên cứu tạo chế phẩm dạng bột 46
5.3.1.1. Tìm kiếm giá thể để nghiên cứu thử nghiệm 46
5.3.1.2. Đánh giá mức độ bán dính của vi khuẩn lên giá thể 47
5.3.2. Nghiên cứu tạo chế phẩm dạng bột và dạng dịch thể 49
5.3.2.1. Tạo chế phẩm dạng dịch 49
5.3.2.2. Tạo chế phẩm dạng bột 51
5.3.2.3. Kiểm tra tính ổn định của chế phẩm theo thời gian 52
5.4. NỘI DUNG 4: Thiết kế mô hình xử lý và thử nghiệm áp dụng chế 54
phẩm
5.4.1. Thiết kế mô hình xử lý trong phòng thí nghiệm 54
5.4.2. Thử nghiệm áp dụng chế phẩm trên mô hình phòng thí 55
nghiệm
5.5. NỘI DUNG 5: Thử nghiệm áp dụng chế phẩm vào thực tế 60
5.5.1. Thử nghiệm chế phẩm tại trại nuôi lợn ở Vĩnh Phúc 60
5.5.1.1. Cải tạo hệ thống xử lý nước thải sau biogas 60
5.5.1.2. Áp dụng chế phẩm để xử lý nước thải 63
5.5.2. Thử nghiệm chế phẩm tại NMR Hà Nội (KCN Yên Phong) 65
KẾT LUẬN 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO 70
PHỤ LỤC 75
amoA:
DANH MUC CÁC KÝ HIÊU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
gen mã hóa tiểu phần a của enzyme ammonia-monooxygenase
AOB:
Ammonia oxidizing bacteria
bp: Base pair
BSA: Bovin Serum Albumin
BOD:

Biological Oxygen Demand
COD: Chemical Oxygen Demand
DAPI:
4',6-diamidino-2-phenylindole
DNA:
Deoxyribonucleic acid
16S rDNA: gen mã hóa cho RNA ribosom 16S
ĐHXD:
Đại học xây dựng
CTAB: Cetyl Trimethyl Ammoniumum Bromide
dNTP: Di-deoxyribonucleotide Triphosphate
DGGE:
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
EDTA: Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid
FISH:
In situ Fluorescence Hybridization
KCN:
Khu công nghiệp
MQ: Mili - Q
NOB: Nitrite Oxidizing Bacteria
NRB:
Nitrate Oxidizing Bacteria
OD:
Optical Density
PBS: Phosphate - Buffered Saline
PCI: Phenol - Chloroform - Isoamyl alcohol
PCR:
Polymerase Chain Reaction
rDNA:
Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

SDS: Sodium Dodecyl Sulfate
TAE:
Tris - Acetic - EDTA (đệm)
TE: Tris - EDTA (đệm)
Taq: Thermus aquaticus DNA polymerase
TKN : T otal Kj eldahl Nitrogen
T-RFLP: Terminal Restriction Fragment Lenghth Polymorphism
TSS: Total Suspended Solid
UV: Ultra Violet
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng Trang
Bảng 2.1
Các chế phẩm sinh học dùng trong xử lý nước thải hiện có tại
Việt Nam
14
Bảng 3.1
Môi trường làm giàu và nuôi cấy vi khuẩn nitrat hóa
16
Bảng 3.2
Môi trường làm giàu và nuôi cấy vi khuẩn khử nitrat
17
Bảng 5.1 Phân lập vi khuẩn nitrat hóa 25
Bảng 5.2 Phân lập vi khuẩn khử nitrat 27
Bảng 5.3
Kết quả so sánh 16S rDNA của các chủng vi khuẩn quan tâm
với các loài có độ tương đồng cao nhất
28
Bảng 5.4 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tới mức sinh trưởng
của các chủng vi khuẩn nitrat hóa
34

Bảng 5.5 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tới mức sinh trưởng
của các chủng vi khuẩn khử nitrat
35
Bảng 5.6
Điều kiện tối ưu nuôi tăng sinh cho vi khuẩn nitrat hóa ở thiết
bị lên men
40
Bảng 5.7
Điều kiện tối ưu nuôi tăng sinh vi khuẩn khử nitrat ở thiết bị
lên men
43
Bảng 5.8
So sánh đặc tính lý/hóa của ba chất mang quan tâm
46
Bảng 5.9 Áp dụng chế phẩm trên mô hình xử lý trong phòng thí nghiệm 55
Bảng 5.10
Áp dụng chế phẩm để xử lý nước thải sau biogas tại Tam
Dương, Vĩnh Phúc
63
Bảng 5.11 Áp dụng chế phẩm để khởi động vận hành hệ thống TF tại
Nhà máy rượu Hà Nội
66
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình Trang
Hình 1.1 Chu trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên 8
Hình 5.1
Nhận biết nhanh hoạt tính của vi khuẩn nitrat hóa
24
Hình 5.2 Mức sinh trưởng và hoạt tính sinh học của ba chủng AOB đã
sơ tuyển trong môi trường có NH4+ là chất cho điện tử duy

nhất
30
Hình 5.3 Mức sinh trưởng và hoạt tính sinh học của ba chủng NOB đã
sơ tuyển trong môi trường có NO2”là chất cho điện tử duy
nhất
31
Hình 5.4 Mức sinh trưởng của 4 chủng NRB đã sơ tuyển trong môi
trường có NO3” là chất nhận điện tử duy nhất.
32
Hình 5.5 Hình thái tế bào của 3 chủng vi khuẩn tuyển chọn làm chế
phẩm
37
Hình 5.6 Vị trí phân loại của ba chủng vi khuẩn tuyển chọn làm chế
phẩm dựa trên trình tự gen 16S rDNA.
38
Hình 5.7
Thiết bị lên men để nuôi tăng sinh vi khuẩn nitrat hóa và khử
nitrat
39
Hình 5.8 Nuôi tăng sinh vi khuẩn AOB và NOB trên thiết bị lên men 41
Hình 5.9 Tăng sinh của vi khuẩn trong thiết bị lên men hỗn hợp DVA1
và DVN1
42
Hình 5.10 Mật độ tế bào trong dịch lên men hỗn hợp vi khuẩn AOB và
NOB so với lên men chủng đơn
42
Hình 5.11 Nuôi tăng sinh vi khuẩn khử nitrat trên thiết bị lên men 44
Hình 5.12
Hỗn hợp vi khuẩn và chất mang sau khi phơi khô
48

Hình 5.13
Mức bám dính của tế bào vi khuẩn trên ba loại giá thể nghiên
cứu
49
Hình 5.14
Các bước tạo chế phẩm xử lý nitơ dạng dịch thể (STN-L)
50
51
52
53
54
56
57
58
61
62
64
65
66
67
Các bước tạo chế phẩm xử lý nitơ dạng bột (STN-S)
Xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat trong chế
phẩm bằng phương pháp MPN
Chế phẩm xử lý nitơ dạng dịch (STN-L) và dạng bột (STN-S)
Mô hình xử lý nước thải trong phòng thí nghiệm quy mô 1-
3L/ngày
Xử lý nước thải trên mô hình phòng thí nghiệm
Loại ammonia trong nước thải trên mô hình xử lý phòng thí
nghiệm
Phân tích biến động của thành phần vi khuẩn trong mô hình

xử lý bằng DGGE gen 16S rDNA và gen amoA
Hệ thống xử lý nước thải sau biogas tại trang trại trước khi tối
ưu
Hệ thống xử lý nước thải sau biogas tại trang trại sau khi sửa
chữa và tối ưu
Tăng hiệu suất của hệ thống xử lý nước thải sau biogas của
trại lợn ở Tam Dương, Vĩnh Phúc sau khi cải tạo hệ thống và
áp dụng chế phẩm STN
Sơ đồ hệ thống xử lý nước thải của nhà máy rượu Hà Nội tại
khu CN Yên Phong, Bắc Ninh
Bể TF (với chức năng chủ hiếu là nitrat hóa) tại NMR Hà Nội
ở khu CN Yên Phong, Bắc Ninh.
Oxy hóa ammonia tại bể TF trong quá trình khởi động
MỞ ĐẦU
Chương I. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ĐỀ TÀI
1.1. Cơ sở xây dựng đề tài
Xử lý nitơ là một trong các khâu then chốt của quá trình xử lý nước thải.
Phương pháp nitrat hóa/khử nitrat đã được áp dụng từ lâu và đem lại hiệu quả
cao ở nhiều nước trên thế giới. Phương pháp này dựa trên bước hiếu khí nitrat
hóa (NH4+ ^ NO2” ^ NO3”) và kỵ khí khử nitrat (NO3_ ^ N2) do một số nhóm
vi khuẩn đảm nhiệm [8, 29].
Trong các hệ thống xử lý nước thải đã hoạt động tốt với nguồn thải ổn
định về thành phần và lưu lượng, hệ vi sinh vật của hệ thống hoàn toàn có thể
đảm nhiệm được chức năng chuyển hóa nitơ ammonia thành khí nitơ qua các
bước nitrat hóa và khử nitrat [8]. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp như hệ
thống mới hoạt động, nước thải không ổn định về thành phần và lưu lượng, hay
các hệ thống xử lý phải làm việc với tải trọng thủy lực cao, việc bổ sung nguồn
vi khuẩn hỗ trợ quá trình chuyển hóa nitơ dưới dạng chế phẩm sinh học là cần
thiết [8].
Để giải quyết tình hình ô nhiễm nitơ trong các nguồn nước hiện nay,

nhiều đơn vị nghiên cứu trong lĩnh vực môi trường đã đưa ra các giải pháp công
nghệ xử lý nước thải với qui mô tập trung (trạm xử lý nước thải Kim Liên, Trúc
Bạch) và bán tập trung (như mô hình BASTAFAT của Viện Khoa học Kỹ thuật
Môi trường - ĐHXD Hà Nội, mô hình Johkasou của công ty Xanh và Xanh).
Thực trạng hoạt động của các hệ thống xử lý hiện có cho thấy nhu cầu bổ sung
vi sinh vật chuyển hóa nitơ để tăng hiệu suất và rút ngắn thời gian xử lý là rất
lớn [39]. Các dạng chế phẩm sinh học khác nhau chứa vi khuẩn nitrat hóa và
khử nitrat đang được tiêu thụ trên thị trường phần lớn có xuất xứ từ các nước có
ngành công nghiệp sinh học phát triển như Mỹ, Úc, Canada [42]. Hiện tại chưa
có một chế phẩm sinh học nào sản xuất trong nước với mục đích hỗ trợ quá trình
loại nitơ trong nước thải theo công nghệ nitrat hóa - khử nitrat cho các hệ thống
xử lý tập trung. Do vậy, việc nghiên cứu phát triển chế phẩm này dựa trên nguồn
vi sinh vật trong nước là điều cấp thiết. Trên cơ sở nhu cầu thực tế chúng tôi đề
xuất thực hiện đề tài „Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý
nitơ trong nước thải".
1.2. Mục tiêu, đối tượng, tính cấp thiết, phạm vi nghiên cứu, ý nghĩa khoa
học và thực tiễn của đề tài
1.2.1. Mục tiêu
Mục tiêu tống quát: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ nguồn
vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat phân lập tại Việt Nam nhằm cung cấp chế phẩm
sinh học hỗ trợ quá trình xử lý nitơ trong nước thải.
Mục tiêu cụ the: Thiết lập bộ chủng vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat phân lập
từ các môi trường ô nhiễm ở Việt Nam, trên cơ sở đó tuyển chọn các chủng có
hoạt tính cao để ứng dụng làm chế phẩm. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩ m
từ các chủng tuyển chọn, bao gồm lên men thu sinh khối, phối trộn với giá thể
và đánh giá tác dụng của chế phẩm trong việc xử lý nitơ.
1.2.2. Đối tượng
- Vi khuẩn nitrat hóa (oxy hóa ammonia và oxy hóa nitrit) và vi khuẩn khử
nitrat phân lập từ một số nguồn tự nhiên ở Việt Nam như đất vườn, nước
và bùn từ hệ thống xử lý nước thải.

- Ứng dụng các chủng có hoạt tính cao để bổ sung vào các hệ thống xử lý
nước thải dưới dạng chế phẩm sinh học, tăng hiệu quả xử lý nitơ.
1.2.3. Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam hiện nay, tình trạng ô nhiễm nitơ trong các nguồn nước đang ở mức
báo động và ngày càng có xu hướng gia tăng. Phần lớn nước ngầm ở vùng đồng
bằng Bắc Bộ như Hà Nội, Hà Tây, Ninh Bình, Hải Dương đều bị nhiễm
amonium nặng, vượt tiêu chuẩn cho phép (3 mg/l) nhiều lần [19]. Nước ngầm ở
tầng trên cách mặt đất từ 25 m - 40 m thường được người dân khai thác bằng
giếng khoan tại nhiều nơi đã bị ô nhiễm nặng, ví dụ như Pháp Vân (31,6 mg/l),
Tương Mai (13,5 mg/l), Yên Sở (37,2 mg/l) [40]. Nước mặt (sông, hồ, ao) tại
nhiều vùng trong cả nước cũng đã được phát hiện có hàm lượng ammonia cao,
đặc biệt các đoạn sông chảy qua các khu công nghiệp [41]. Theo một số nghiên
cứu, nước sinh hoạt tại các vùng kể trên có hàm lượng ammonia cao hơn mức
cho phép 10 - 20 lần [1]. Ở các sông thoát nước của Hà Nội như sông Tô Lịch
và sông Kim Ngưu, hàm lượng ammonia tại rất nhiều vị trí ở mức cao, hơn tiêu
chuẩn cho phép từ 5 - 8 lần [1].
Nguyên nhân chính của tình trạng nhiễm ammonia và hợp chất hữu cơ
trong các nguồn nước ở đồng bằng Bắc Bộ là việc sử dụng không có kiểm soát
phân bón hữu cơ, thuốc trừ sâu, hoá chất bảo vệ thực vật, chất thải sinh hoạt và
chăn nuôi chưa qua xử lý [19]. Là một trong các nguồn thải có lưu lượng lớn và
hàm lượng nitơ cao, nước thải sinh hoạt tại nhiều đô thị hiện nay vẫn được xả
trực tiếp vào hệ thống thoát nước, không qua xử lý sơ bộ dẫn đến tình trạng ô
nhiễm kéo dài [1]. Nước thải sinh hoạt thường có hàm lượng nitơ hữu cơ và
ammonia vào khoảng 15 đến 20 % của nồng độ BOD5, trong đó NH3/NH4+ là
dạng nitơ vô cơ chủ yếu. Bên cạnh đó, các loại nước thải khác cũng chứa hàm
lượng ammonia cao là nước thải thủy sản, nước rỉ rác, nước thải chăn nuôi gia
súc [19]. Việc sử dụng không hợp lý các loại phân bón cũng làm cho nitrat tồn
đọng trong nước tự nhiên với hàm lượng tăng cao [19]. Ngoài ra, hoạt động sản
xuất qui mô nhỏ không có hệ thống xử lý nước thải đi kèm như ở các làng nghề
đã góp phần không nhỏ trong việc gây ô nhiễm nitơ trầm trọng cho nguồn nước

[19].
Mặc dù Nhà nước đã có quy chế quy định đối với hàm lượng nitơ trong
nước thải khi đưa ra ngoài môi trường (40 mg/l, QCVN 40:2011), đồng thời có
những chế tài áp dụng cho việc xử phạt các trường hợp vi phạm, tuy nhiên trên
phạm vi cả nước số cơ sở xử lý nước thải đạt yêu cầu trên là rất nhỏ [19]. Phần
lớn các hệ thống xử lý tập trung hoạt động chưa thực sự hiệu quả do thiết kế,
vận hành không phù hợp [39]. Chế phẩm sinh học với thành phần vi sinh có hoạt
tính cao có thể cải thiện được hiệu quả xử lý của các hệ thống đang hoạt động và
rút ngắn thời gian khởi động đối với các hệ thống mới. Các chế phẩm sản xuất
trong nước cho mục đích xử lý môi trường hiện có chưa đáp ứng được yêu cầu
trên, trong khi đó các chế phẩm nhập ngoại lại có giá thành quá cao. Chính vì
vậy việc tiến hành Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý nitơ
trong nước thải là cần thiết cấp bách.
1.2.4. Phạm vi nghiên cứu
Các hệ thống xử lý tập trung nước thải có hàm lượng nitơ cao, tiêu biểu là nước
thải sau biogas của các trang trại chăn nuôi gia súc, các cơ sở sản xuất và chế
biến thực phẩm.
1.2.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Hiện nay ở nước ta, nguồn vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat để làm nguyên liệu
cho các nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng về vấn đề chuyển hóa nitơ còn
thiếu, do vậy tập hợp các chủng vi khuẩn tạo ra trong đề tài có thể sẽ đáp ứng
được phần nào nhu cầu này.
Vi khuẩn nitrat hóa (oxy hóa ammonia và oxy hóa nitrit) là các loài sinh
trưởng tự dưỡng vô cơ, do vậy quy trình lên men thu sinh khối đối với chúng là
bài toán không đơn giản. Việc nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi tăng sinh các
loài vi khuẩn này trên thiết bị lên men sẽ làm cơ sở tham khảo cho các nghiên
cứu tương tự sau này.
Chế phẩm sinh học chứa các loài nitrat hóa và khử nitrat có hoạt tính cao
đang có nhu cầu rất lớn từ thực tế ở Việt Nam, phục vụ cho mục đích tăng hiệu
quả xử lý của các hệ thống đang hoạt động, ổn định và rút ngắn thời gian khởi

động của các hệ thống mới, khắc phục sự cố khi xảy ra đối với hệ thống xử lý.
Chương II. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ
NGOÀI NƯỚC
2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
2.1.1. Ảnh hưởng của ô nhiễm nitơ trong môi trường
Nitơ là yếu tố dinh dưỡng quan trọng đối với mọi cơ thể sống. Tuy nhiên, nước
với hàm lượng nitơ cao thải ra ngoài môi trường sẽ gây những hậu quả nghiêm
trọng, làm ảnh hưởng đến môi trường sống và sức khỏe của con người [17].
Ảnh hưởng đến môi trường sinh thái
Ammonia phân tử rất độc cho cá và các động vật thủy sinh khác. Ở pH trung
tính, 99% ammonia tồn tại ở dạng NH4+, tuy nhiên ở pH kiềm (>9) thì dạng
phân tử NH3 chiếm ưu thế: NH4+ + OH” ±7 NH3 + H2O. Vì vậy ảnh hưởng độc
hại của ammonia tăng đáng kể tại các thủy vực nhận nguồn nước thải có độ pH
cao [8].
Ammonia là nguyên nhân gây ra tình trạng thiếu oxy trong nước do hoạt
động của vi khuẩn nitrat hóa (1 mg ammonia đòi hỏi 4,6 mg O2), ảnh hưởng đến
các loài sinh vật nước [8]. Dư lượng ammonia trong các thủy vực còn dẫn đến
hiện tượng phú dưỡng của nước, tạo điều kiện cho các thực vật nước, đặc biệt là
vi tảo phát triển nhanh, làm chết các động vật thủy sinh do thiếu oxy (hiện tượng
tảo nở hoa) [8].
Nitrat trong môi trường nước không có ảnh hưởng trực tiếp đến động
thực vật thủy sinh, có thể độc hại ở nồng độ rất cao khoảng 1000 ppm. Tuy
nhiên, nitrat tích tụ trong nước lâu ngày sẽ tạo ra axit nitric, làm ảnh hưởng đến
tính chất hóa học của nước và độ pH không ổn định [17].