KHẢO SÁT SỰ LÊN MEN SỮA BÒ TƯƠI BẰNG HAI CHỦNG VI KHUẨN L. APHIDOCILUS VÀ B. BIFIDIUM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
Đề tài:
KHẢO SÁT SỰ LÊN MEN SỮA BÒ TƯƠI
BẰNG HAI CHỦNG VI KHUẨN
L. APHIDOCILUS VÀ B. BIFIDIUM
• GVHD: TS. Đàm Sao Mai
Ths. Lưu Huyền Trang
• Lớp: ĐHTP4
• Nhóm 4- Tổ 5
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2011
DANH SÁCH SINH VIÊN
1. Lương Ngọc Thùy An 08109961
2. Nguyễn Thị Hoài An 08144111
3. Nguyễn Ngọc Thảo 08223351
4. Nguyễn Thị Diệu 08109051
5. Trần Thị Thảo Anh 08108231
6. MỤC LỤC
7.
8. PHẦN 1 – MỞ ĐẦU 4
9. 1.ĐẶT VẤN ĐỀ 4
10. 2.MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 5
11 PHẦ
N 2 – TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 6
12. 1.Sữa bò 6
13. 1.1Giới thiệu 6
14. 1.2Tác dụng phòng và trị bệnh của sữa 7
15. 2.Chủng vi khuẩn L.aphidocilus 7
16. 2.1Giới thiệu 7
17. 2.2Vai trò 9

18. 2.3Tác dụng phụ 9
19. 3.Chủng vi khuẩn B.bifidium 9
20. 3.1Giới thiệu 9
21. 3.2Tác dụng 10
22 PHẦ
N 4 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
23. 1.Xác định số lượng vi sinh vật 11
24. 2.Xác định hàm lượng đạm bằng phương pháp Kjeldahl 11
25. 3.Xác định chất béo trong sữa theo phương pháp Adams Rose-Gottlieb 11
26. 4.Xác định acid trong sữa 12
27. 5.Phương pháp xử lý số liệu 12
28 PHẦ
N 5 – PHƯƠNG PHÁP TIÊN HÀNH THÍ NGHIỆM 13
29. 1. Vật liệu 13
30. 2. Phương pháp tiến hành 13
31 PHẦ
N 6 – KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 20
32 PHẦ
N 7 –KẾT LUẬN……………………………………………………… 29
33 TÀI
LIỆU THAM KHẢO 30
PHẦN 1 - MỞ ĐẦU1. Giới thiệu
1. Đặt vấn đề
− Sữa bò là nguồn nguyên liệu khá phong phú tại Việt Nam. Các nhà sản xuất trong
công nghiệp chế biến sữa không ngừng cung cấp các sản phẩm sữa với nhiều chủng
loại khác nhau, phù hợp với sở thích và lứa tuổi của người tiêu dùng. Các nhà khoa
học dinh dưỡng cũng không ngừng tìm hiểu, nghiên cứu và tư vấn các nhà sản xuất
những thành phần hỗ trợ tích cực cho
những

chức
năng đặc biệt của cơ thể. Từ đó,
ngày càng có nhiều sản phẩm mới từ sữa ra đời như sữa bột, sữa tươi, đặc biệt là sữa
chua (yogurt)
− Yogurt hay sữa chua lên men là một loại thực phẩm mà ai cũng đều biết hết. Đây
là một thức ăn ngon miệng đồng thời cũng là một thực phẩm chức năng đầy tính bổ
dưỡng. Yogurt được làm cho lên men bởi những loại vi khuẩn tốt, đó là những
Probiotics. Đây là những vi khuẩn có ích lợi cho sức khỏe chúng ta. Probiotic là
những vi khuẩn tốt sống trong đường tiêu hóa và ngay cả trong âm hộ. Chúng hỗ trợ
khả năng tiêu hóa và hấp thu, tăng cường hệ vi sinh có lợi trong đường ruột, ức chế
hình thành các độc tố, điều hòa miễn dịch, cải thiện khả năng hấp thu đường lactose…
− Sự hiện diện của probiotic giúp ngăn chận tác hại của các vi khuẩn xấu xâm nhập
vào ruột. Thí dụ điển hình về probiotic là vi khuẩn Bifidobacterium và vi khuẩn
Lactobacillus trích từ hệ vi sinh đường ruột. Hai loại vi khuẩn nầy từ lâu đã được
Nhật bản và Âu châu sử dụng trong kỹ nghệ sản xuất sữa chua lên men. Tại Hoa Kỳ,
trên 60% yogurt có chứa bifidobacterium và lactobacillus. Ở Việt Nam ứng dụng
probiotic đang dần khẳng định, tuy chưa theo kịp sự phát triển của thế giới. Nghiên
cứu tìm hiểu để đa dạng hóa các sản phẩm ứng dụng probiotic không chỉ mang đến lợi
ích cho người tiêu dùng mà còn góp phần phát triển kinh tế.
− Phạm vi ứng dụng của nghiên cứu này dùng chủng Lactobacillus Acidophilus kết
hợp với chủng Bifidobacterium Bifidum trên nguyên liệu sữa bò tươi tiệt trùng. Đây
là các sản phẩm sữa chua chứa thành phần probiotic. Các sản phẩm loại này đang
được chú ý và phát triển rất nhanh vì các sản phẩm này tập trung khả năng có lợi sức
1 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
khỏe cho tất cả các đối tượng tiêu dùng.Hỗ trợ chức năng miễn dịch của cơ thể,
thông qua việc bổ sung các vi sinh vật có lợi trong hệ tiêu hóa phát triển.
2. Mục đích nghiên cứu
Với mong muốn làm phong phú thêm loại thực phẩm chức năng ích lợi cho sức
khỏe, chúng tôi quyết định tiến hành thực hiện đề tài: Lên men sữa bò tươi bằng hai
chủng vi sinh vật B. bifidum và L. acidophilus để sản xuất yogurt. Yogurt là một dạng

probiotic đã quen thuộc với người tiêu dùng nên sản phầm này thành công sẽ dễ dàng
được người tiêu dùng chấp thuận. Cùng với nguồn nguyên liệu kết hợp từ hai chủng
vi sinh vật mới sẽ tạo nên một giá trị mới, nguồn lợi mới về kinh tế và sức khỏe.
Viết dài dòng quá, viết ngắn lại phần này để còn chỗ để viết về phần tổng quan tài
liệu
2 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
PHẦN 2 - TỔNG QUAN NGUYÊN LIỆU
Sữa bò
Giới thiệu
Sữa là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, chứa đầy đủ các nhóm chất cần thiết cho
cơ thể như protein, lipit, đường, vitamin và
các khoáng chất.
Protein sữa có thành phần acid amin cân đối
và có độ đồng hóa cao. Protein sữa bao gồm
casein, lactoalbumin và lactoglobulin.
Sữa bò, sữa trâu, sữa dê thuộc loại sữa
casein vì lượng casein chiếm hơn 75% tổng
số protein. Casein có đủ tất cả các acid
amin cần thiết. Đặc biệt là Lysin là một acid
amin cần thiết cho sự phát triển của trẻ em.
Chất béo sữa có trạng thái nhũ tương có độ
phân tán cao, chứa nhiều acid béo chưa no.
Chính vì vậy, chất béo sữa có độ tan chảy
thấp và dễ đồng hóa, có giá trị sinh học cao.
Đường của sữa là lactoza, một loại đường kép, khi thủy phân cho 2 phân tử đường
đơn là galactoza và glucoza. Lactoza trong sữa bò là 2,7-5,5%, sữa mẹ là 7%.
Chất khoáng trong sữa có nhiều: Calci, Kali, Phospho, vì vậy sữa là thức ăn gây
kiềm. Sữa là nguồn thức ăn cung cấp Calci quan trọng cho trẻ em. Sữa cung cấp chủ
yếu Vitamin A, B1, B2, còn các vitamin khác không đáng kể.
Trong sữa non (3 ngày đầu mới sinh) còn có một lượng kháng thể miễn dịch lgA

(Immunoglobulin) rất tốt cho cơ thể trẻ, giúp chống lại các bệnh nhiễm khuẩn.
Hàm lượng vitamin trong sữa không nhiều nhưng có đủ các vitamin cần thiết đối với
sự tồn tại và phát triển của cơ thể. Các vitamin trong sữa được chia làm hai nhóm.
Vitamin tan trong nước: B1, B2, B3, B5, B6, C… và vitamin tan trong chất béo: A, D,
E.
Tác dụng phòng và trị bệnh của sữa
3 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
Bảo vệ sức khoẻ răng miệng: Trong sữa có nhiều
calci giúp răng và xương chắc khỏe. Ăn sữa chua
thường xuyên là cách tốt nhất để phòng ngừa sâu
răng và chứng hôi miệng, vì trong sữa chua có
chứa acid lactic. Loại acid này loại trừ mùi hôi và
vệ sinh, diệt vi khuẩn ra khỏi khoang miệng, và bề
mặt lưỡi.
Phòng ngừa bệnh lý có liên quan đến tim mạch:
Một số chất dinh dưỡng khác hiện hữu trong sữa
như calci và magie còn giúp giảm lượng cholesterol trong máu đồng thời giảm thiểu
nguy cơ tăng huyết áp, ngoại trừ sữa còn nguyên kem.
Kháng ung thư: Do sữa có thể dung nạp được nhiều lactose, đồng thời trong thành
phần của nó cũng chứa khá nhiều các hoạt chất có công dụng kháng ung thư nên việc
uống sữa sẽ giúp ngừa một số bệnh về ung thư đường ruột.
Đặc biệt, sữa có thể giúp ngăn ngừa ung thư buồng trứng đang có khuynh hướng gia
tăng ở nữ giới.
Giảm nguy cơ mắc tiểu đường: Trẻ em luôn được khuyến khích uống sữa cũng như
các chế phẩm từ sữa cùng với việc nuôi con bằng sữa mẹ để giảm nguy cơ mắc bệnh
tiểu đường, căn bệnh đang có xu hướng nhắm sớm hơn vào trẻ em và trẻ vị thành
niên.
Chủng vi khuẩn L.aphidocilus
Giới thiệu
Lactobacillus acidophilus ( L.acidophilus ) là loại probiotic thông dụng nhất, hay là

loại vi khuẩn có ích. Thuộc loài Lactobacillus, là vi khuẩn gram dương, lên men
đường thành acid lactic, được phát hiện dễ dàng tại giá trị pH khá thấp (pH dưới 5,0)
và có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu 30°C (86°F). Loại vi khuẩn có lợi này cư trú tại
ruột, âm đạo để bảo vệ chống lại sự xâm nh ập hay gia tăng của các sinh vật “có hại”
có thể gây bệnh. Đây là cơ chế hoạt động hoàn hảo. Ví dụ, sự phân rã của thức ăn do
khuẩn L. acidophilus sản xuất ra axit lactic, hydrogen peroxide… tạo ra sự phản ứng
của môi trường chống lại các sinh vật không ưa thích. L. acidophilus cũng sản xuất ra
lactase, loại enzyme có khả năng phân huỷ đường sữa (lactose) thành các loại đường
4 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
đơn giản. Những người có cơ địa không dung
nạp lactose thì không thể sản xuất ra loại enzyme này.
Vì lý do đó, thực phẩm bổ sung L. acidophilus có thể
có lợi cho những đối tượng này.
Đây là vi khuẩn rất ưa acid. Những giống của loai này thường xuất hiện ở dạng que có
đuôi tròn, nằm đơn lẻ, thành cặp hoặc
cũng có thể thành một chuỗi ngắn.
Đây là vi khuẩn dị thể ( heterogeneous).
Với hình thức trao đổi chất là lên men
đồng hình, chúng có thể chuyển hóa hầu
hết hàm lượng dextrose có trong môi
trường thành acid lactic ( kể cả đồng
phân D và L) (Hammes và Vogel, 1995).
Trong cây phân nhánh thì chúng nằm
trong nhóm Lactobacilus delbruekii
( Fellis và Dellaglio, 2007). Hàm lượng
base nitơ G – C trong hệ gen của chúng
từ 34 – 37 %.
Vai trò Lactobacillus acidophilus
L. acidophilus sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn như lactocidin, ngăn cản sự
xâm nhập và ức chế sự tăng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, giúp cho cơ thể đề kháng

với nhiễm khuẩn đường ruột.
L.acidophilus đóng vai trò sinh lý quan trọng nhờ tổng hợp các vitamin: như tổng hợp
vitamin K, sản xuất các tác nhân kháng khuẩn và lên men chất xơ.
L. acidophilus có khả năng bền vững với 40 loại kháng sinh.
Khi uống vào ống tiêu hoá, L.acidophilus gắn vào thành ruột, phát triển và chống lại
vi khuẩn gây bệnh theo cơ chế: cạnh tranh chỗ trú đóng với vi khuẩn gây hại:
Thay đổi pH đường ruột.
5 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
Tiết các chất có tính kháng khuẩn và có tính kháng sinh.
Tác động kháng enterotoxine.
Kích thích hệ miễn nhiễm.
Giúp chữa táo bón, trướng bụng, rối loạn tiêu hóa .
Các tác dụng phụ
Nhìn chung, uống của L. acidophilus là an toàn. Tuy nhiên, những người có các điều
kiện sau đây được khuyến khích sử dụng L. acidophilus:. Ruột thiệt hại, một suy yếu
hệ thống miễn dịch, hoặc có triển quá mức của vi khuẩn đường ruột.
Một số người phàn nàn về sự khó chịu hoặc khí. Tình trạng này có thể được khắc
phục khi các cá nhân ingests nó liên tục.
Ngoài ra, người lactose nhạy cảm cũng có thể trải nghiệm cảm giác khó chịu ở bụng
từ các sản phẩm sữa có chứa L. acidophilus.
Nhiễm trùng các van tim với L. acidophilus cũng đã được báo cáo. Nhưng người ta tin
rằng những rủi ro có thể lớn hơn ở những người có van tim nhân tạo.
Một số phụ nữ đã thông báo có vấn đề về âm đạo sau khi sử dụng viên nén âm đạo có
chứa L. acidophilus.
Chủng vi khuẩn B. bifidum
Giới thiệu
Bifidobacterium bifidum là một trong những chủng vi
sinh vật đường ruột có ích. Bifidobacterium không di
động, không tạo bào tử, Gram dương, hình que với rất
nhiều dạng, phần lớn là kị khí bắt buộc. Vi khuẩn

Bifidobacterium sống và hoạt động tối ưu ở pH ≤ 3,5.
Chúng có khả năng ức chế các vi sinh vật có hại trong
hệ thống tiêu hóa. Có khả năng lên men các loại
đường và làm giảm pH môi trường lên men.
Tác dụng
Tác động của vi khuẩn Bifidum trong sữa chua là giúp
giải độc các chất gây ung thư, kích thích sự đáp ứng
miễn dịch và làm giảm cholesterol huyết thanh. Loại vi
sinh vật này giúp thúc đẩy khả năng miễn dịch, điều trị
tiêu chảy và tổng hợp vitamin B phức tạp cho cơ thể.
6 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
Một số nghiên cứu gần đây trên Bifidobacteria nhằm chứng minh tầm quan trọng của
vi khuẩn này trong việc ảnh hưởng đến một số chức năng bình thường của ruột và
khám phá vai trò của chúng đối với sức khỏe con người và bệnh tật.
Ở Nhật bản, ngày nay Bifidobacteria được sử dụng bổ sung trong chế độ ăn kiêng
hoặc trong nuôi cấy khơi mào lên men sữa chua và các sản phẩm sữa khác, với ý nghĩ
là các sản phẩm này có thể giúp tăng cường sức khỏe
Tôi đã nói rồi! nguyên phần tổng quan tài liệu này tóm gọn lại trong nửa-1 trang
và tích hợp ngay trên phần mở đầu. cách bạn viết là của 1 bài luận chứ ko phải
một bài báo!
PHẦN 4 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2. Vật liệu và
phương pháp
2.1 Xác định số lượng vi sinh vật
− Chuẩn bị môi trường, cấy và tăng sinh giống vào đĩa petri
− Công thức tính: Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa từ 25 – 250. ghi nhận kết quả
ở mỗi độ pha loãng.
− Dựa vào số khuẩn lạc đếm được tính mật độ của 2 chủng vi khuẩn theo công thức
sau:
N: tổng số khuẩn lạc đếm được
n

i
: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha loãng
v: dung tích ml cấy vào mỗi đĩa
f
i
: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
7 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
A (CFU/ml) =
N
n
1
vf
1
+ …+ n
i
vf
i
1. Xác định hàm lượng đạm bằng phương pháp Kjeldahl
1.1. Nguyên tắc
Tất cả các dạng nitơ trong cơ thể, hay các mô, các tế bào được gọi là nitơ tổng số.
Nitơ có trong thành phần amino acid của protein được gọi là nitơ protein. Nitơ không
có trong thành phần của protein như của các muối vô cơ, acid nitric, ure, amino acid
tự do… được gọi là nitơ phi protein.
Nitơ tổng số = nitơ protein + nitơ phi protein
1.2. Nguyên lý
− Mẫu được vô cơ hóa bằng H
2S
O
4
đậm đặc ở nhiệt độ cao với chất xúc tác. Phản

ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra theo thứ tự sau:
2H
2
SO
4
 2H
2
O + 2SO
2
+ O
2
Các chất chứa nitơ NH
3
2NH
3
+ H
2
SO
4
 (NH
4
)
2
SO
4
− Dùng dung dịch NaOH đuổi NH
3
ra khỏi dung dịch.Ta có phản ứng sau:
(NH
4

)
2
SO
4
+ 2NaOH  Na
2
SO
4
+ H
2
O + 2NH
3
− NH
3
bay sang bình hứng có chứa dung dịch H
2
SO
4
(đã biết trước nồng độ, thể
tích). Phản ứng xảy ra như sau:
2NH
3
+ H
2
O  2NH
4
OH
2NH
4
OH + H

2
SO
4
 (NH
4
)
2
SO
4
+ 2H
2
O
− Định phân lượng H
2
SO
4
dư bằng dung dịch NaOH, từ đó ta được hàm lượng nitơ
tổng có trong mẫu.
2. Xác định hàm lượng chất béo trong sữa theo phương pháp Adam–
Rose-Gottlieb
− Xử lý mẫu với amoniac và cồn để kết tủa protein. Hòa tan kết tủa chất béo được
chiết bằng Petrolium eter và Dietyl eter làm bay hơi hỗn hợp ete rồi cân lại lượng dư.
− Trong môi trường amoniac và cồn, lipid được chiết xuất dưới tác dụng của
Petrolium eter và Dietyl eter.
− Amoniac có nhiệm vụ hòa tan protein, làm thay đổi sức căng bề mặt của các chất
béo; cắt mối liên kết giữa chất béo và protein.
8 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
H
2
SO

4
− Cồn có khả năng hút nước khiến lipid dễ hòa tan trong ete hơn; giúp cho việc cắt
mối nối giữa chất béo và protein.
− Dietyl eter ngoài khả năng hòa tan lipid, còn có thể hòa tan một số tạp chất khác,
do đó ta sử dụng thêm Petrolium eter (Ete dầu hỏa).
− Ete dầu hỏa mang tính đẩy nước cao. Do đó có khả năng đẩy các tạp chất tan trong
nước bị lẫn trong eter thường. Tuy nhiên ete dầu hỏa không có khả năng hòa tan các
chất béo có chứa nước. Do vậy phải dùng kết hợp cả ete và ete dầu hỏa.
3. Xác định acid trong sữa
Chuẩn độ theo phương pháp acid bazơ
4. Phương pháp xử lý số liệu
Bài nghiên cứu xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê, tập hợp, so sánh.
9 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
PHẦN 5 – PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
1. Vật liệu
1.1. Nguyên liệu : sữa bò
Sử dụng sữa bò tươi tiệt trùng nguyên chất vinamilk 1 lít
1.2. Chủng L.acidofilus và B.bifidium:
Giống gốc được lấy từ bộ sưu tập giống Trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM.
1.3. Hóa chất và thiết bị cho phân tích :
Hóa chất và thiết bị được cung cấp từ trường Đại Học Công Nghiệp Tp.HCM.
 Bài đếm vi sinh vật
− Môi trường MRS
− Nước muối sinh lý
 Bài protein
− H2SO4 0.1N
− Methyl red 1%
− NaOH 0.1N
− Hỗn hợp xúc tác CuSO4:K2SO4 (1:10)
 Bài lipid

− Dd cồn ammoniac (cồn 90 150ml: ammoniac 50mL)
− Ete
− Chỉ thị phenolphthalein
 Bài acid
− NaOH 0,1N
2. Phương pháp tiến hành
2.1. Tăng sinh vi sinh
Vòng que trang chứa đầy vi sinh vật cho vào erlen có chứa 50ml môi trường MRS
broth đã hấp khử trùng, ủ ở 30
0
C, trong 24h sau đó đem đi để làm sữa chua.
2.2. Sơ đồ qui trình
10 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
Thanh trùng
75-80
0
C
Để nguội
40-45
0
C
Cấy giống 2%
Ủ
8-12h,30
0
C
Thu sản phẩm chia
ra nhiều hủ đựng
Trữ lạnh
Sữa bò tươi

vinamilk
Chủng
L.acidofilus và
B.bifidium
Tăng sinh giống
Phân tích vi sinh Phân tích hóa lý Cảm quan
2.3.
2.3. Thuyết minh quy trình
2.3.1. Chuẩn bị nguyên liệu
− 500ml sữa bò nành thanh trùng ở 90
0
C trong 30 phút sau đó để nguội ở 45
0
C, cấy
2% chủng vi sinh vật vào (8 ml dịch tăng sinh), khuấy điều rót ra 21 hủ đã được rữa
sạch và sấy khô, đem ủ 30
0
C trong 12 giờ.
− Lấy 4 mẫu để vào tủ mát để kiểm tra vi sinh vật và mô tả sản phẩm.
− Mẫu còn lại cho
vào tủ đông ở
-20
0
C để chuẩn bị
phân tích hóa lý.
11 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
2.3.2. Phân tích vi sinh (đếm số vi sinh vật)
 Phương pháp pha loãng mẫu
- Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 1/10, 1/100,
1/1000… 1/10

7
. Mỗi bậc pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1ml mẫu
cho vào 9ml nước muối sinh lý. Sau đó lắc kỹ sẽ được độ pha loãng 1/10. Cứ tiếp tục,
sẽ có các dung dịch với độ pha loãng tăng thêm 10 lần cho đến khi đạt được độ pha
loãng 1/10. Mẫu nồng độ trải 4 đĩa.
 Trải đĩa:
Hút 0,1 ml mẫu ở mỗi nồng độ tương ứng từ 10
-4
đến 10
-7
cho vào đĩa petri có
chứa môi trường, trải đều bằng que trang ( ba mẫu còn lại thực hiện tương tự ).
Sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 48h. (tổng cộng 16 đĩa)
12 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
 Phương pháp cấy bề mặt
− Môi trường phải được chuẩn bị
trên đĩa trước 1-2 ngày để khô mặt
− Cấy 0.1 – 0,3ml vào đĩa môi
trường
− Trải đều trên mặt bằng que trang
tam giác
− Để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút
cho khô mặt
 Đếm khuẩn lạc
− Đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường
− Thường chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 30 – 250
− Dùng bút để đếm các khuẩn lạc đã đếm
− Tính toán kết quả (dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính ra số
khuẩn lạc vsv trong dung dịch ban đầu)
2.3.3. Phân tích hóa lý

2.3.3.1. Phân tích acide
• Tiến hành
−
Tiến hành thử nghiệm cho 2 mẫu thử song song và 1 mẫu trắng như sau:
−
Cân 10g mẫu hòa tan với 50ml nước. Dùng đủa thủy tinh khuấy kỹ để mẫu hòa tan
vào trong nước.
−
Sau đó, hút 25 ml mẫu đã pha loãng cho vào 2 bình elen 250 ml.Thêm vào 3 giot
phenolphtalein 1% vào, lắc đều.
−
Sau đó đem chuẩn độ với dung dịch NaOH 0.1N cho đến khi dung dịch xuất hiên
màu hồng nhạt trong 30s. Đọc thể tích dung dịch NaOH 0.1 N tiêu tốn.
•
Tính kết quả:
−
Hàm lượng acid chuyển ra acid lactic (X) được tính bằng g/l theo công thức
(1)
Với:
V
1
(ml): thể tích dung dịch NaOH dùng để chuẩn mẫu thử
V
2
(ml): thể tích dung dịch NaOH dùng để chuẩn mẫu trắng
13 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
g/litaxitlactic =
(V
1
– V

2
) x 0,089 x N x 1000
V
0.089: khối lượng của một mdlg acid lactic
N: nồng độ NaOH dùng để chuẩn mẫu
1000: hệ số chuyển đổi từ g/l
V (ml): thể tích mẫu dùng ban đầu
Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 mẫu thử song song
2.3.3.2. Hàm lượng đạm tổng
 Tiến hành vô cơ hóa mẫu:
Cân 1g mẫu, cho thêm 4g xúc tác
CuSO
4
:K
2
SO
4
tỉ lệ (1: 10), cuối cùng là cho
vào 10ml H
2
SO
4
đậm đặc, lắc đếu (cẩn thận),
cho vào hệ thống khoáng mẫu Gerhardt
Kjeldatherm. Nâng nhiệt lên 280
0
C trọng 30
phút, tiếp tục nâng lên 370
0
C trong 30 phút,

cuối cùng là nâng lên 400
0
C để trong vòng 2
giờ. Kết thúc quá trình dung dịch có màu
xanh trong suốt, để nguội dung dịch sau đó
đem đi chưng cất đạm.
 Tiến hành chưng cất đạm:
• Chuẩn bị :
− Chuẩn bị bình đun: bình cầu chứa khoảng
2/3 nước cất.
− Chuẩn bị bình hứng: 50ml H
2
SO
4
0,1N, thêm vào 3 giọt MR 1%, lắc đều.
− Chuẩn bị dịch chưng cất: cho dịch đã vô cơ hóa mẫu vào bình chưng, tráng bằng
nước cất, cho thêm 3 giọt PP 1%, sau đó trung hòa bằng NaOH 30%, cho đến khi
dung dịch xuất hiện kết tủa xanh đen,
cho thêm 2ml NaOH 30%, sau đó
khóa phểu lại.
• Tiến hành:
− Bật lò bình đun, mở nước hệ
thống sinh hàn.
− Chưng cất liên tục trong 30 phút
14 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
− Hạ bình hứng, rửa ống sinh hàn bằng nước cất.
− Đặt giấy pH sát miệng ống sinh hàn, nếu giấy pH không đổi màu thì chưng cất
hoàn tất, còn pH đổi sang màu xanh thì tiếp tục chưng cất cho đến khi giấy pH không
đổi màu.
− Kết thúc quá trình ta đêm chuẩn độ bình hứng bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung

dịch xuất hiện màu vàng nhạt. Ghi nhận thể tích
NaOH 0.1N. Thực hiện mẫu trắng với lượng
thuốc thử và trình tự như trên, ghi nhận NaOH
0,1N của mãu trắng.
• Lưu ý:
− Ống sinh hàn phải ngập trong dung dịch bình
hứng, và trong suốt quá trình chưng bình hứng
phải không đổi màu, nếu đổi màu làm lại từ đầu
và tăng thêm lượng thể tích H
2
SO
4
0,1N.
− Lúc chuẩn bị dịch chưng cất phải để bình
hứng vào hệ thống trước, để tránh mất mẫu.
15 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
•
Xử lý kết quả: Hàm lượng đạm có trong
100g mẫu
(1)
N : Nồng độ dung dịch chuẩn NaOH = 0,1N.
V
b
:Thể tích ddNaOH chuẩn mẫu trắng, ml.
V
s
: Thể tích dd NaOH chuẩn mẫu thử, ml.
W: Khối lượng mẫu thử, g.
K: Hệ số chuyển đổi Nito sang dạng tương ứng.
X: Hàm lượng đạm , %.

2.3.3.3. Phân tích lipid
•
Tiến hành
− Đầu tiên, rữa becker 250 ml thật sạch, đem sậy ở 105
0
C đến khối lựợng không đổi
và cân. Xác định khối lượng (m
1
).
− Cân 5g mẩu cho vào bình chiết.
− Hòa tan mẫu với một ít nước cất.
− Sau đó, thêm 4 ml amoniac vào, lắc cẩn thận.
Thêm 25ml cồn 95 vào và lắc đều.
− Thêm 60 ml dyetyl ete, lắc nhẹ, xả hơi và sau
đó lắc mạnh.
− Tiếp tục thêm 60 ml ete dầu hỏa và tiếp tục
lắc thêm 30(s).
− Để yên cho đến khi dung dịch tách lớp. Tách
bỏ phần protein phía dưới bỏ đi.
− Tiếp tục cho vào 10 ml dietyl ete và 10 ml ete
dầu hỏa, lắc nhẹ và để yên cho dung dịch tách
lớp. Loại bỏ phần lớp dưới này.
− Cho dung dịch có chứa lipid này vào becker
đã biết trước khối lượng. Để cho bay hoi ete. Sau đó đem sấy ở 105
0
C và thu được
lipid.
16 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
X(%) =
(V

b
– V
s
).N.0,014.100.K
W
− Đem cân becker chứa lipid .Xác định khối lượng (m
2
).
•
Kết quả
Hàm lượng chất béo có trong 100g mẫu là
(1)
% chất béo = [(P-P’)x100]/W
Trong đó:
P: trọng lượng chén + lipid (g).
P’: trọng lượng chén (g).
W: trọng lượng mẫu thử (g).
2.3.4. Chỉ tiêu cảm quan
Phương pháp tiến hành:
− Chụp ảnh
− Nhận xét về mùi, màu , vị và trạng thái của sản phẩm
− So sánh với kết quả của các loại sữa chua làm từ nguyên liệu khác và loại vi sinh
vật khác nhau giữa các tổ.
− Đánh giá cho điểm
17 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
PHẦN 6 – KẾT QUẢ & NHẬN XÉT
1. Phân tích vi sinh
Độ pha loãng
Số lượng khuẩn
lạc

Thể tích sử
dụng mẫu
Số đĩa đếm
10
-4
>250
>250
Bị nhiễm
243
0.1 ml 4
10
-5
>250
184
11
1
0.1 ml 4
59
18 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
10
-6
11
8
3
0.1 ml 4
10
-7
26
12
3

1
0.1 ml 4
Tính lượng vi sinh vật:
Nhận xét:
Chủng vi khuẩn L.acidophilus và B. bifidum có khả năng lên men trên môi trường là
nguyên liệu sữa bò, làm đông tụ dịch.
Tuy nhiên, so với 100% L.acidophilus hoặc 100% B. bifidum số lượng vi sinh vật ít
hơn.
2. Phân tích acid
2.1. Kết quả
• Mẫu sữa chua (lần 1):
• Mẫu sữa chua (lần 2):
• Lấy trung bình:
2.2. Nhận xét
- Có gây sai số do quá trình pha hóa chất và chuẩn độ
− Nồng độ acid trong nước cất cũng ảnh hưởng đến quá trình chuẩn độ
− Cần xác định lại nồng độ các chất trước khi sử dụng để đảm bảo an toàn và sự
chính xác của phép chuẩn độ. Cụ thể trong bài này ta cần chuẩn lại nồng độ NaOH vì
19 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
= 11.52x10^6 (CFU/ml)
(CFU/ml)
243+ 184+ 59+ 26
4.0,1.10
-4
+4.0,1.10
-5
+4.0,1.10
-6
+4.0,1.10
-7

A (CFU/ml) =
bản thân NaOH là một chất hút ẩm nên khi tiếp xúc với không khí sẽ tác dụng với hơi
nước và CO
2
làm ảnh hưởng đến nồng độ.
− Việc thực hiện các thao tác chuẩn độ đều bằng tay nên không an toàn đối với
người thực hiện. Điểm tương đương được xác định nhờ vào sự đổi màu chất chỉ thị,
mỗi người có sinh lý khác nhau nên khả năng quan sát sự đổi màu chất chỉ thị là khác
nhau dẫn đến sai số thô cho quá trình
− Vì vậy để đảm bảo độ chính xác của phản ứng chuẩn độ ta có thể sử dụng phương
pháp chuẩn độ điện thế với điện cực chỉ thị là điện cực Hydro, điện cực so sánh là
Calomen hay điện cực Ag.AgCl|Cl
-
.
2.3. Đo pH
- Lần 1: 4.4
- Lần 2: 4.7
 Sai số không nhiều lắm  độ pH khá ổn định
3. Phân tích hàm lượng đạm tổng
3.1. Kết quả
− T: thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn mẫu trắng (mẫu ko có đạm): 51.5 ml
− B: thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn mẫu thực (mẫu có đạm  lượng H2SO4
còn lại sau khi đã hấp phụ NH3): 45 ml
− N: nồng độ đương lượng dd NaOH dùng chuẩn độ (0.1N)
− m: khối lượng mẫu ban đầu: 0.85g = 850 mg (~9ml)
 Hàm lượng protein thô trong 100g mẫu là:
Lượng protein thô (%) = N toàn phần x k = 1.071% x 6.83 = 7.315
3.2. Nhận xét
 Ưu điểm
− Phương pháp Kjeldahl thì được dùng phổ biến do nguyên lý của phương pháp

và việc xử lý số liệu đơn giản, dễ hiểu.
− Có thể dùng để xác định hàm lượng đạm trong một số sản phẩm như nước
mắm…
 Khuyết điểm
− Quá trình thực hiện lâu, qua nhiều bước trung gian từ vô cơ hóa mẫu, chưng cất
đạm đến chuẩn độ mới thu và tính toán nên cho kết quả lâu và phát sinh nhiều sai
số khi xác định theo phương pháp này
− Khi dung dịch trong suốt có màu xanh lơ của CuSO
4
không nên đun quá lâu tạo
thành kết tủa trắng trong bình kjedahl.
20 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm
− Đây là phương pháp gián tiếp xác định protein đều dựa trên cơ sở xác định
lượng nitơ nên độ chính xác không cao do trong thực phẩm còn có một lượng nitơ
phi protein.
− Thiết bị cồng kềnh, phức tạp có nhiều chi tiết ghép nối với nhau như bình đun
nối với bình chưng cất, nối với bình đựng dung dịch thải; bình chưng cất nối với hệ
thống ống sinh hàn rồi nối với bình hứng Nếu các khớp ghép không kín, khí NH
3
thoát ra ngoài có thể gây ngộ độc.
− Phải theo dõi trong suốt quá trình thực hiện để kiểm soát nhiệt độ đun, kiểm tra
lượng NH
3
sinh ra cũng như lượng H
2
SO
4
hấp phụ nên tốn nhiều công sức.
− Phương pháp này dùng để xác định trong các mẫu chứa hàm lượng protein cao,
nếu hàm lượng ít thì khó xác định.

− Trong quá trình chuẩn độ do NaOH là chất dễ hút ẩm, hấp thu CO
2
nên trong
NaOH thường có lẫn NaCO
3
, nồng độ không chính xác. Chính vì vậy khi thực hiện
chuẩn độ ta phải kiểm tra lại nồng độ NaOH dùng để chuẩn độ lượng acid H
2
SO
4
dư.
4. Phân tích lipid
4.1. Kết quả :
Áp dụng công thức : %chất béo = [(P-P’).100]/G ta tính được kết quả như sau
Becker1 52.08g
% fat = 2.896 %
% chất béo trung bình là:
Mẫu 1 6.56g (~8ml)
Lipid +
Becker
52.27g
Becker2 58.8g
% fat = 2.653 %
Mẫu 2 4.9g (~5ml)
Lipid +
Becker
58.93g
4.2. Nhận xét
Phương pháp Adam- Rose - Gottlieb
 Ưu điểm:

− Dụng cụ chiết đơn giản.
21 |Báo cáo thực hành: Công nghệ sinh học thực phẩm