Nghiên cứu thích ứng chủng virut cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau

Mở đầu
Virút Cúm là tác nhân quan trọng gây bệnh Cúm cho ngời trên toàn cầu và lây
truyền chủ yếu qua đờng hô hấp.
Trong các dịch Cúm hàng năm, 5-15% dân số bị ảnh hởng do lây nhiễm bằng đ-
ờng hô hấp trên. Các trờng hợp nhập viện và tử vong chủ yếu xảy ra ở những nhóm
có nguy cơ cao , nh ngời cao tuổi và ngời ốm mạn tính. Mặc dù khó có thể đánh giá
đầy đủ, nhng các số liệu thống kê cho thấy những dịch Cúm này gây ra từ 3 đến 5
triệu ca bệnh và khoảng 250.000 đến 500.000 ca tử vong mỗi năm trên toàn cầu.
Nguy cơ mắc bệnh nặng và tử vong cao nhất trong số các bệnh nhân lớn hơn 65
tuổi, trẻ nhỏ dới 2 tuổi, và những ngời có nguy cơ mắc thêm các biến chứng từ Cúm.
Theo số liệu của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và dự phòng (The Center for Disease
Control and Prevention - CDC, Atlanta, Mỹ) mỗi năm ở Mỹ có hơn 200.000 ca nhập
viện vì biến chứng của Cúm và 36.000 trờng hợp chết. Bệnh Cúm lan rộng nhanh
chóng trên toàn thế giới trong những mùa dịch và gây ra gánh nặng đáng kể cho
kinh tế và y học.
Biện pháp phòng chống hữu hiệu nhất đối với dịch Cúm là tiêm phòng vắc xin.
Vắc xin Cúm có hiệu quả bảo vệ 70-90% trên ngời trẻ tuổi mạnh khỏe nếu kháng
nguyên vắc xin phù hợp với chủng virút Cúm đang lu hành.
Dựa trên thông tin thu thập đợc từ mạng lới giám sát bệnh Cúm toàn cầu của
WHO, hàng năm WHO đa ra khuyến cáo thành phần kháng nguyên của vắc xin tập
trung vào 3 chủng phổ biến nhất đang lu hành. Hiện tại các virút Cúm đang lu hành
gây bệnh cho ngời đợc phân chia thành hai nhóm A và B. Cúm A có 2 phân týp quan
trọng nhất đối với ngời là A/H3N2 và A/H1N1, liên quan đến những đại dịch có số
ngời tử vong nhiều nhất.
Hiện nay, tất cả các nhà sản xuất vắc xin Cúm trên thế giới đã và đang sử dụng
công nghệ truyền thống là sản xuất trên trứng gà có phôi không mang các tác nhân
gây bệnh đặc hiệu. Tuy nhiên, đây là một hệ thống cồng kềnh với nhiều điểm bất lợi
1
nh: chi phí cao, có thể lẫn các tạp chất gây dị ứng. Virút Cúm ngời sinh trởng trên
trứng có thể dẫn đến sự chọn lọc những biến đổi trong các kháng nguyên đặc hiệu từ
chủng virút gốc (14) và nguồn cung cấp trứng không đảm bảo đợc thời gian, ảnh h-

ởng đến tính sẵn sàng cho việc đối phó với bệnh dịch (29).
Việc nuôi cấy virút Cúm trên tế bào là rất khả thi trong việc sản xuất vắc xin với
những lợi thế so với trên trứng gà có phôi nh: cho năng suất cao và sạch do không
lẫn những tạp chất nh trên trứng, virút nhân lên trên tế bào vẫn giữ đặc tính kháng
nguyên nh ở chủng virút gốc.
Xuất phát từ thực tế đó, nhằm nghiên cứu sản xuất vắc xin Cúm mùa bất hoạt có
hiệu lực cao với giá thành hạ, chúng tôi tiến hành đề tài:
"Nghiên cứu thích ứng chủng virút Cúm mùa trên các dòng tế bào khác
nhau".
Đề tài đợc thực hiện nhằm 2 mục tiêu:
1. Đánh giá khả năng thích ứng của 3 chủng virút Cúm mùa H1N1, H3N2 và B
trên các dòng tế bào thận khỉ tiên phát (PMKc), thận khỉ xanh châu Phi thờng
trực (Vero) và thận chó Madin-Darby thờng trực (MDCK).
2. Nghiên cứu cấy truyền các chủng virút Cúm mùa trên dòng tế bào thích hợp
nhằm nâng cao hiệu giá.
2
Chơng 1
TổNG QUAN
1.1. Virút Cúm
Năm 1931, Shope và cộng sự đã lần đầu tiên phân lập đợc virút Cúm từ lợn bị
nhiễm bệnh.
Hình 1. Hình ảnh virút Cúm A dới kính hiển vi điện tử truyền qua. Nguồn: Public
Health Image Library (CDC), ID: #8160. Độ phóng đại 100.000 lần
1.1.1. Lịch sử
3
Năm 1918, dịch Cúm Tây Ban Nha đã làm tử vong 50 triệu ngời, do virút phân
nhóm H1N1 gây ra, thờng đợc coi là chủng gây Cúm lợn nhng có khả năng truyền
nhiễm.
Năm 1957 và 1958, H2N2 gây nên dịch Cúm châu á vào đã làm chết khoảng 1
triệu ngời trên thế giới.

Năm 1968, 1969 H3N2 phát triển từ chủng H2N2 do biến đổi di truyền và gây
nên dịch Cúm Hồng Kông đã gây tử vong 750,000 ngời. Đây là đại dịch gây tử vong
lớn nhất thế kỷ 20.
Năm 2002, với sự bùng phát phân nhóm H7N2 trong gia cầm, 44 ngời đã đợc
phát hiện là bị nhiễm virút tại bang Virginia, Mỹ.
Tháng 2 năm 2004, ở Bắc Mỹ, ngời ta đã phát hiện chủng virút Cúm gà H7N3 tại
một số trang trại gia cầm tại British Columbia.
Năm 2003 ở Hà Lan, 89 ngời đã đợc chẩn đoán là nhiễm virút Cúm H7N7 sau
một đợt dịch Cúm gia cầm từ một số trang trại lân cận. Một trờng hợp đã tử vong.
Năm 2005, có 3 trờng hợp phát hiện nhiễm H9N2 ở Trung Quốc và Hồng Kông
cho thấy bị nhiễm virút và tất cả đều đã qua khỏi. Loại virút này đã đợc nghiên cứu
cho thấy chỉ là dạng "gây nhiễm thấp".
Từ năm 1997, sự bùng phát của virút H5N1 đã làm nhiễm bệnh và chết hàng
chục triệu gia cầm. H5N1 đợc coi là tâm điểm của sự chú ý và cảnh báo rằng một
biến chủng từ phân nhóm H5N1 có thể tự biến đổi (hoặc tái tổ hợp) để tạo thành một
chủng virút có khả năng gây đại dịch Cúm toàn cầu.
1.1.2. Tình hình hiện nay
Từ tháng 2 đến tháng 9 - 2008, hoạt động của virút Cúm đợc báo cáo ở châu Phi,
châu Mỹ, châu á, châu Âu và châu Đại Dơng. Nhìn chung, virút Cúm hoạt động ở
mức vừa phải (42).
ở phía Bắc bán cầu, virút Cúm tiếp tục lu hành và gây ra những vụ bùng phát
dịch ở châu á, châu Âu và Bắc Mỹ. Hoạt động của virút Cúm giảm xuống trong
4
tháng 3 ở châu Âu và tháng 4 ở châu á và Bắc Mỹ. Virút Cúm A/H1N1 lu hành
rộng rãi và chiếm u thế ở nhiều quốc gia. Virút Cúm A/H3N2 chiếm u thế ở Mỹ và
lu hành ít hơn ở châu á và Đông Âu. Virút Cúm B lu hành đồng thời và có những vụ
bùng phát ở một vài nớc.
ở phía Nam bán cầu, hoạt động của virút Cúm bắt đầu vào tháng 3 và tăng lên
trong tháng 4 ở Bắc Mỹ, trong khi ở châu Phi và châu Đại Dơng, hoạt động bắt đầu
trong tháng 5 và tăng lên ở tháng 6. Nhìn chung, hoạt động giảm xuống trong tháng

8 ngoại trừ ở Australia, Braxin và New Zealand. ở châu Phi, virút Cúm A/H1N1
chiếm u thế và gây ra những vụ bùng phát. ở Nam Mỹ, virút Cúm A/H1N1 và virút
Cúm B cùng lu hành và liên quan đến những vụ dịch. ở châu Đại Dơng, có báo cáo
về những vụ bùng phát do virút Cúm A/H3N2 và Cúm B cùng lu hành gây ra.
Sau 3 năm nghiên cứu về dịch tễ bệnh Cúm tại Hà Nội, từ năm 2001 đến 2003,
các nhà khoa học đã thu thập tổng cộng 4078 mẫu dịch tụy hầu (nasopharyngeal
swab) từ bệnh nhân ốm giống Cúm (ILI) trớc khi dịch Cúm gia cầm A/H5N1 bùng
phát (10). Bằng cách phân lập virút Cúm, đã phát hiện 119 mẫu (2,5%) dơng tính.
Virút Cúm đợc phát hiện thấy ở hầu hết các tháng trong năm với đỉnh là vào tháng 6
đến tháng 8 trong suốt mùa ma, một đỉnh khác rơi vào tháng 12 đến tháng 1 trong
suốt mùa đông ở Hà Nội. Virút Cúm B chiếm u thế trong năm 2001, tiếp theo là
Cúm A/H3N2 trong năm 2002, và trong năm 2003, cả 3 phân nhóm Cúm A/H3N2,
A/H1N1 và B cùng lu hành. Không có trờng hợp nào nhiễm virút Cúm A/H5N1
trong các mẫu bệnh phẩm này.
Theo kết quả của sự giám sát các bệnh truyền nhiễm quốc gia thực hiện bởi Bộ Y
tế Việt Nam, trong giai đoạn 2001-2003, trung bình số trờng hợp mắc bệnh mỗi năm
trên toàn quốc là 2054,2/100.000 dân và là bệnh đợc xếp hạng cao nhất trong 24
bệnh truyền nhiễm. Mỗi vùng có tính mùa và số ca ILI khác nhau. Miền Bắc có
2725,8 ca/100.000 dân mỗi năm, và thể hiện tính mùa với đỉnh cao từ tháng 5 đến
tháng 9. Trung bình số ca ILI cao nhất ở vùng núi Tây Bắc với 3670,6 ca/100.000
dân với mức đỉnh ở tháng 8 và tháng 9. Miền Trung và miền Nam không thể hiện
tính mùa rõ ràng, và các ca ILI cũng thấp hơn các vùng khác.
5
Cũng nh những báo cáo trớc đây ở quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới ở châu á
nh Thái Lan, Indonesia, Myanma, Singapo và một phần miền nam của Trung Quốc
gồm cả Đài Loan (9, 19), những kết quả này chỉ ra rằng virút Cúm lu hành trong cả
năm ở Hà Nội với 2 đỉnh cao, một trong mùa ma và một trong mùa đông lạnh.
Tuy nhiên, thông tin từ những khu vực này vẫn còn hạn chế, có thể do thiếu
những mạng lới giám sát Cúm quốc gia, phơng tiện và nhân viên có đủ kỹ năng
trong các phòng thí nghiệm và nguồn tài chính cần thiết (31).

Theo các báo cáo của WHO và các trung tâm hợp tác về sự hoạt động của virút
Cúm, những týp/phân týp chiếm u thế ở Đông Nam á và châu Đại Dơng là sự trộn
lẫn của A/H1N1, H3N2 và B trong suốt năm 2001 và 2002, đến năm 2003 thì Cúm
A/H3N2 chiếm u thế (38-40). Trong nghiên cứu này, những týp/phân týp virút Cúm
lu hành ở Hà Nội qua thời gian 3 năm có sự khác nhau ít hơn so với ở các khu vực
xung quanh ở châu á, song những đặc tính kháng nguyên là tơng tự (38-41). Kết
quả thu thập đợc cho phép nhóm tác giả kết luận rằng những chủng virút ở Hà Nội
khá phù hợp với những chủng vắc xin toàn cầu.
1.1.3. Phân loại
Các virút Cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là những chủng virút có hệ gen dạng
sợi đơn ARN (-) gồm 8 phân đoạn lần lợt mã hóa cho 8 loại protein khác nhau của
virút (Cúm A, B). Họ Orthomyxoviridae gồm 4 giống: Virút Cúm A, virút Cúm B,
virút Cúm C và Thogovirút. Virút Cúm B và C thờng chỉ gây nhiễm cho ngời trong
khi phần lớn virút Cúm A gây nhiễm trên gia cầm và chỉ có một vài phân týp gây
nhiễm cho ngời và các động vật khác nh lợn, ngựa. Virút Cúm A, B và C khác nhau
về tính kháng nguyên của nucleocapsit và neuramidaza glycoprotein.
Virút Cúm A đợc chia các phân týp dựa trên tính kháng nguyên của các phân tử
HA và NA của chúng. Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra 16 loại HA (H1-H16)
và 9 loại NA (N1-N9). Gia cầm thủy sinh là ổ chứa tự nhiên của tất cả các loại virút
Cúm.
6
Chủng virút Cúm đợc đặt tên theo nguồn gốc phân lập, vùng địa lý phân lập, số
chủng, năm phân lập. Từ năm 1983 đến nay, không có thêm phân týp mới nào đợc
phát hiện, điều này cho thấy có một số giới hạn về sự biến chủng của virút Cúm A.
1.1.4. Hình thái và cấu trúc của virút Cúm
Virút Cúm A và B có cấu trúc giống nhau trong khi virút Cúm C có cấu trúc
khác biệt với các gai glycoprotein sắp xếp theo hình 6 cạnh. Virút Cúm A và B nuôi
cấy trên tế bào hoặc trứng có hình dạng thông thờng đờng kính 80-120nm. Ngợc lại,
virút Cúm phân lập từ ngời và động vật sau đó đợc cấy truyền một lần trên tế bào th-
ờng có hình thái khác biệt và đa dạng. Hình thái virút Cúm A là một kiểu gen riêng

biệt nhng phụ thuộc rất nhiều vào loại tế bào chủ khi virút nhân lên.
Đặc điểm hình thái nổi bật của virút Cúm A là lớp bao gồm 500 gai (10-14nm)
xòe ra phía ngoài lớp lipit. Có 2 loại gai khác nhau: gai hình gậy là kháng nguyên
HA và gai hình nấm là kháng nguyên NA. Tỷ lệ HA:NA thờng dao động nhng
thông thờng từ 4:1 đến 5:1. Protein matrix M1 đợc cho là nằm dới lớp lipit kép và
liên kết với Ribonucleoprotein (RNP) lõi của virút. M1 là protein có nhiều nhất
trong virion.
Hình 2. Virion của virút Cúm A và các protein. Nguồn: www.influenzareport.com
7
Bằng phơng pháp cắt lớp mỏng tiêu bản có các hạt virút hoặc phá vỡ hạt, cấu
trúc RNP có thể đợc chia thành nhiều lớp có kích thớc khác nhau và chứa 8 đoạn
gen của ARN đơn.
Các RNP có chứa 4 loại protein và ARN. NP là protein tiểu đơn vị nổi trội của
nucleocapsit và bao quanh ARN, có khoảng 20 nucleotit trong 1 tiểu đơn vị NP.
Liên kết với RNP là phức hợp ARN polymeraza phụ thuộc - ARN bao gồm 3
polymeraza protein PB1, PB2, PA và chỉ có mặt từ 20-30 bản sao trong một virion.
Thành phần của các virút trong họ Orthomyxoviridae bao gồm 1% ARN, 70%
protein, 20% lipit và 5 đến 8% carbonhydrat.
Axit nucleic và protein
Virút Cúm chứa 7 đến 8 đoạn ARN sợi đơn, âm. Tổng chiều dài genom là
12000-15000 nucleotit, đoạn lớn nhất dài 2300-2500 nucleotit, nhỏ nhất là 800-900
nucleotit. Trình tự genome có các trình tự lặp tận cùng, ở cả hai đầu. Các trình tự lặp
ở đầu 5 dài 12-13 nucleotit. Trình tự nucleotit của đầu 3 giống hệt đầu 5 ở hầu hết
các đoạn ARN và nh nhau trong cùng một giống của cùng một họ. Những trình tự
lặp lại dài 9-11 nucleotit.
Lipit
Lớp màng lipit của virút Cúm đợc tạo thành từ màng bào tơng của tế bào chủ nơi
virút nhân lên.
1.1.5. ảnh hởng của các tác nhân vật lý và hóa học
Virút Cúm gia cầm vẫn có thể tồn tại trong nớc cất hơn 102 ngày ở 28

O
C và 207
ngày ở 17
O
C và thời gian tồn tại của virút ở 4
O
C đợc ớc lợng là hơn 1300 ngày (32).
Nghiên cứu khác đã chứng minh rằng phân týp của virút Cúm gia cầm H7N3 trong
nớc peptone (pH 7.0) vẫn giữ đợc khả năng lây nhiễm của nó khi ủ ở 4, 30 và 37
O
C
trong 35 ngày. Khả năng lây nhiễm của virút vẫn tồn tại sau khi chịu tác động của
nhiệt độ 56
O
C trong 30 phút nhng sẽ mất khả năng này sau khi chịu tác động ở 56
O
C
trong vòng 60 phút. Virút có thể giữ ở nhiệt độ dới -50
O
C trong vòng nhiều năm.
8
Othomyxoviridae đợc xem là rất dễ bị ảnh hởng bởi độ pH trong acid. Độ pH
thấp tạo ra sự thích nghi và sự thay đổi kháng nguyên trong protein HA, cho phép
liên kết với màng của các tế bào ký sinh.
ở pH 2, nhiệt độ 56
O
C và trong dung dịch 70% etanol hoặc một chất tẩy đặc
hiệu, hoạt tính của virút Cúm bị bất hoạt trong thời gian dới 30 phút (20).
1.1.6. Các loại kháng nguyên
1.1.6.1. HA

Tên gọi của protein HA (hemagglutinin) xuất phát từ khả năng ngng kết hồng
cầu của virút bằng cách gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit sialic. HA có vai
trò quan trọng trong quá trình sao chép virút. Đầu tiên HA gắn với thụ thể có chứa
axit sialic trên bề mặt tế bào và tạo thành sự gắn kết giữa virút và tế bào. Tiếp đó
HA chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập của virút vào tế bào bằng cách gián tiếp tạo
nên sự hòa màng endocytosed của virút và màng nội bào làm cho nucleocapsit virút
giải phóng vào trong bào tơng.
HA là kháng nguyên chính của virút Cúm, bao gồm các vị trí kháng nguyên là
A, B (mang vị trí gắn thụ thể), C, D và E. Các vị trí này nằm ở phần đầu phân tử HA,
trong khi phần cuối đợc gắn vào trong lớp lipid.
Khi bị nhiễm virút Cúm, cơ thể đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên HA bằng
cách sinh ra các kháng thể trung hòa. Những thay đổi ở các vị trí kháng nguyên làm
giảm hay ức chế sự gắn kết của các kháng thể trung hòa, do đó cho phép một phân
týp mới lan rộng trong quần thể không có khả năng miễn dịch. Hiện tợng này gọi là
đột biến kháng nguyên chậm (antigenic drift). Đột biến kháng nguyên nhanh
(antigenic shift) xuất hiện khi HA bị thay đổi trong một virút, chẳng hạn H1 thay
thế bởi H5 dẫn tới sự hình thành một chủng virút Cúm mới. Điều này có thể xảy ra
khi một tế bào nhiễm bởi 2 chủng virút Cúm khác nhau và trao đổi các đoạn genome
của chúng trong quá trình nhân lên.
Nh vậy HA là kháng nguyên chính tạo nên kháng thể trung hòa và các vụ dịch
Cúm đều liên quan đến thay đổi cấu trúc kháng nguyên.
9
1.1.6.2. NP
NP là protein cấu trúc chính phối hợp với các đoạn ARN tạo thành RNP. NP còn
là kháng nguyên đặc hiệu týp, khác nhau giữa virút Cúm A, B và C.
Mặc dù là một protein đặc hiệu týp nhng NP của virút Cúm A vẫn biểu hiện sự
biến đổi kháng nguyên. NP có ít nhất 3 vùng liên kết kháng thể không chồng lên
nhau, một trong số này có tính bảo thủ cao. Kháng thể đơn dòng gắn vào vị trí này
gây ức chế phiên mã ARN virút trong phòng thí nghiệm. NP có một vài quyết định
kháng nguyên đặc hiệu tế bào T đợc bảo tồn trong số các virút Cúm A ở ngời.

1.1.6.3. NA
NA là glycoprotein thứ hai đặc hiệu cho phân týp của virút Cúm A, B. NA do
đoạn gen ARN thứ 6 mã hóa và là một homotetramer. NA quan trọng do hoạt tính
sinh học loại bỏ axit sialic từ glycoprotein. NA có thể cho phép vận chuyển virút
qua màng mucin ở trên đờng hô hấp, giúp hỗ trợ virút tấn công tế bào biểu mô đích.
NA của virút Cúm A có 4 vị trí kháng nguyên, mỗi vị trí bao gồm nhiều quyết
định kháng nguyên (epitop). Những cấu trúc kháng nguyên của N9 NA đợc nghiên
cứu nhiều nhất. Phân tích cấu trúc của phức hợp N9 NA từ chủng
A/tern/Australia/G75 với mảnh Fab của kháng thể đơn dòng NC41 (34) cho thấy
rằng kháng thể tiếp xúc NA qua một bề mặt có diện tích 900
2
, bao gồm 19 axit
amin nằm trên 5 vòng polypeptit bao quanh vị trí hoạt động của enzym. Trong số
này, chỉ có một vài axit amin cung cấp những điểm tiếp xúc quyết định cần cho sự
nhận diện của kháng thể (24). Trong sự lây nhiễm tự nhiên, miễn dịch đối với NA
chỉ có vai trò không đáng kể bảo vệ con ngời khỏi nhiễm Cúm. Có thể lấy ví dụ
minh họa từ đại dịch 1968, khi đó tác nhân gây bệnh có NA từ một virút Cúm ngời
lu hành trớc đó, sự miễn dịch đối với NA đã không thể ngăn con ngời khỏi đại dịch
Cúm.
Ngoài các kháng nguyên chủ yếu trên, virút Cúm còn có các kháng nguyên
protein polymeraza (PB1, PB2, PA), M1, M2, NS1 và NS2 đợc nhận diện bởi các tế
bào T trong cơ thể ngời nhiễm virút Cúm.
10
1.1.7. Sự tái tổ hợp của virút Cúm
Virút Cúm A, B, C có thể tái tổ hợp trong tự nhiên giữa các thành viên cùng týp
nhng không xảy ra giữa các týp khác nhau. Sự xuất hiện của chủng đại dịch là hậu
quả của việc tái tổ hợp tạo ra chủng phân týp mới có NA hoặc HA khác hẳn với
chủng lu hành trớc đó.
Virút Cúm B khác với virút Cúm A là không có ổ chứa động vật. Mặc dù virút
Cúm B nguyên thủy thích ứng trên ngời dễ dàng hơn virút Cúm A nhng tỷ lệ đột

biến và thay đổi chỉ bằng một nửa virút Cúm A (43).
Có nhiều bằng chúng cho rằng virút Cúm trong loài thủy cầm lây truyền cho
lợn, ngựa, gia cầm và động vật có vú ở biển; gây nên những vụ dịch nghiêm trọng
(36).
Virút Cúm gia cầm không lan truyền trên quần thể ngời và ngợc lại, virút của
ngời không lây truyền sang quần thể chim, điều này cho thấy hàng rào giữa chim và
ngời rất chặt chẽ. Tuy nhiên, nhiều bằng chứng cho thấy loài lợn có thể cảm nhiễm
dễ dàng với cả hai loại virút Cúm ngời hoặc gia cầm (12) và hàng rào loài giữa lợn
và gia cầm hoặc giữa lợn và ngời lỏng lẻo hơn nhiều, vì vậy lợn có thể đóng vai trò
nh là vật chủ trung gian để tạo ra giống virút Cúm mới trên ngời (6). Virút Cúm
H3N2 đã đợc phân lập trên lợn ở khắp thế giới. Những virút này có đặc tính kháng
nguyên và gen giống nh những chủng đã lu hành trên ngời trớc khi phân lập ở lợn
(23). Sự tái tổ hợp của đoạn ARN virút trong khi nhiễm trùng kép với hai chủng
Cúm ngời và gia cầm là cơ chế để tạo ra chủng mới. Quần thể ngời không có kháng
thể trung hòa với kháng nguyên bề mặt của virút mới tạo ra do đó không đợc bảo vệ.
Virút mới có thể lan truyền dễ dàng gây ra đại dịch.
11
1.1.8. Đáp ứng miễn dịch với virút Cúm
Hình 3. Đáp ứng miễn dịch thể dịch và qua trung gian tế bào khi nhiễm virút Cúm.
Nguồn: www.influenzareport.com
Nhánh thể dịch của hệ thống miễn dịch bao gồm các tế bào lympho B (trái), sau
khi tơng tác với virút Cúm sẽ biệt hoá thành các tế bào plasma sản xuất kháng thể.
Đáp ứng qua trung gian tế bào (phải) bắt đầu với trình diện KN thông qua các phân
tử MHC I (màu đen) và II (màu xanh) bởi các tế bào tua, là tế bào sau đó sẽ dẫn tới
sự hoạt hoá, tăng sinh và biệt hoá các tế bào T đặc hiệu kháng nguyên (CD4 hoặc
12
CD8). Những tế bào này có chức năng giúp tế bào xử lý (effector cell) qua phóng
thích trực tiếp các cytokin hoặc trung gian tính độc tế bào sau khi đã nhận diện
kháng nguyên.
1.1.8.1. Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Các kháng thể đợc các tế bào plasma sản xuất, nằm trong giai đoạn cuối cùng
của sự phát sinh tế bào B, đòi hỏi tế bào B phải nhận diện đợc kháng nguyên và đợc
tế bào T CD4 và các cytokin phát sinh từ tế bào T. Không giống nh tế bào T, tế bào
B có thể nhận ra kháng nguyên dới dạng tự nhiên của chúng. Tính đặc hiệu của
kháng nguyên là do sự tái sắp xếp ngẫu nhiên các gen mã hoá cho vùng siêu biến
của các Ig trong tế bào khi tế bào còn nằm trong tuỷ xơng. Các tế bào B non (naive
B cell) sau đó đi vào hệ tuần hoàn rồi theo máu và hạch bạch huyết đến các mô và
cơ quan lymphô. Tại các hạch lymphô, tế bào B non sẽ nhận diện kháng nguyên, sau
đó tế bào B đợc hoạt hoá, chuyển sản xuất từ Ig M sang IgG, làm tăng tính đặc hiệu
và ái lực của globuline miễn dịch và biệt hoá thành các tế bào plasma hoặc tế bào B
nhớ khi tế bào tiếp tục phân chia dới sự hiện diện của các cytokin. Trong lúc Ig A đ-
ợc vận chuyển xuyên qua lớp biểu mô của đờng hô hấp trên, là nơi IgA sẽ trung hoà
và loại trừ virút gây nhiễm, thì IgG chủ yếu chỉ có vai trò bảo vệ đờng hô hấp dới.
Khi nhiễm virút Cúm, cơ thể sẽ tạo ra các kháng thể đối với cả 2 glycoprotein
HA và NA, cũng nh protein M và NP. Hiệu giá kháng thể cao nhất vào giữa tuần
thứ 4-7 sau khi nhiễm, và sau đó giảm dần. Kháng thể vẫn còn có thể phát hiện đợc
nhiều năm sau đó dù không bị tái phơi nhiễm. Các hiệu giá ức chế HA huyết thanh
từ 1/40 trở lên, hoặc hiệu giá trung hoà huyết thanh từ 1/8 trở lên đợc coi nh có khả
năng bảo vệ. ở ngời già, để đợc bảo vệ hoàn toàn, cần phải có mức kháng thể cao
hơn.
Ngợc lại với kháng thể kháng HA, kháng thể kháng NA không trung hoà đợc
tính gây nhiễm của virút, nhng thay vào đó kháng thể này sẽ ngăn không cho các tế
bào bị nhiễm phóng thích virút ra ngoài. Đó là do tác dụng phân cắt acid sialic của
NA nằm trên thụ thể tế bào. Kháng thể kháng NA có thể bảo vệ cơ thể khỏi tránh
nhiễm bệnh và làm giảm sự thải tiết virút cũng nh mức độ trầm trọng của các triệu
13
chứng. Đáp ứng miễn dịch màng niêm chống lại virút Cúm, căn cứ theo lợng dịch
tiết ở mũi, có sự hiện diện của IgA và IgG
1
chống lại HA. Các nghiên cứu cho thấy

rằng sự đề kháng tái nhiễm chủ yếu đợc trung gian qua IgA, mặc dù IgG cũng có
phần liên quan. Trong miễn dịch, kháng thể tác động chống lại virút Cúm bằng cách
trung hoà virút hoặc ly giải tế bào bị nhiễm thông qua bổ thể hoặc tính độc tế bào
phụ thuộc vào kháng thể.
1.1.8.2. Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào
Ngời ta đã chứng minh các tế bào tua đóng vai trò trung tâm trong việc khởi đầu
và thúc đẩy các đáp ứng tế bào T. Đây là nhóm bạch cầu phát sinh từ tuỷ xơng, di
động, phân bố tha thớt, chuyên trách việc thu nhận, vận chuyển, xử lý và trình diện
kháng nguyên cho tế bào T. Khuôn mẫu cơ bản cho loại tế bào này là các tế bào tua
nằm ở phổi bắt giữ kháng nguyên từ tác nhân gây bệnh bên ngoài xâm nhập vào,
hoạt hoá và sau đó tập trung về các hạch lymphô. Kháng nguyên sau đó đuợc xử lý
và gắn vào bề mặt tế bào tua dới dạng các peptit, các peptit này đợc các phân tử
MHC. Tại các hạch lymphô, các tế bào tua lúc này sẽ khởi động một đáp ứng miễn
dịch bởi bất cứ tế bào T nào có thụ thể đặc hiệu cho phức hợp MHC nằm trên bề mặt
tế bào tua. Các tế bào T vừa mới đợc kích hoạt sẽ di chuyển tới vị trí bị nhiễm virút
nằm ở phổi, nơi mà các tế bào này sẽ làm trung gian cho các hoạt động chống virút.
Đáp ứng tế bào T ở ngời đạt đến đỉnh vào khoảng ngày 14 sau khi nhiễm và ở
ngời lớn, lợng tế bào T độc đặc trng cho virút Cúm tơng ứng với mức độ sao chép
của virút giảm dần qua thời gian. Các tế bào T nhớ CD8 nhớ có thể đóng vai trò làm
giảm nhẹ mức độ trầm trọng của bệnh và làm cho sự hồi phục nhanh hơn khi bị
nhiễm lại. Điều quan trọng là, những tế bào này có khả năng đáp ứng lại các tín hiệu
đầu tiên khi bị nhiễm với lợng virút xâm nhập ở mức rất thấp. Trong khi không thể
tăng sinh để đáp ứng với tình trạng nhiễm trùng, các tế bào này có thể sản xuất ra
các cytokin để làm kìm hãm không cho virút sao chép và lan rộng trên biểu mô. Giai
đoạn 2 của đáp ứng qua trung gian tế bào T nhớ là các tế bào này tập trung nhanh
chóng ở đờng hô hấp trong một vài ngày đầu tiên của đáp ứng. Giai đoạn 3 là sự mở
14
rộng các tế bào T nhớ dới tác động của kháng nguyên xảy ra ở các cơ quan lymphô
thứ cấp.
1.1.9. Sự nhân lên của virút Cúm

Virút Cúm cũng giống nh các virút khác, nó bắt buộc phải nhân lên trong tế bào
cảm thụ. Trong cơ thể sống, virút Cúm gắn vào bề mặt tế bào biểu mô trong phổi và
cổ họng, tuy nhiên trong nuôi cấy tế bào virút Cúm gây nhiễm và nhân lên không
phải là tế bào biểu mô. Sự lây nhiễm virút Cúm bắt đầu khi HA virút gắn với các thụ
thể đặc biệt có chứa axit sialic trên tế bào chủ (bớc 1). Ngời ta thấy rằng những virút
Cúm phân lập từ ngời và lợn u tiên gắn với vị trí SA-2,6-Gal, trong khi đó những
virút phân lập từ chim và ngựa lại gắn tốt hơn vào vị trí SA-2,3-Gal (2, 5). Sự gắn
đặc hiệu của HA là một trong những yếu tố quyết định đến quá trình xâm nhập vào
vật chủ của virút (16, 18). Để virút có thể xâm nhập đợc vào tế bào, HA
O
phải đợc
phân cắt bởi một serine proteinaza nh trypsin ở một vị trị đặc hiệu, đợc mã hóa bởi
một axit amin đơn cơ bản (thờng là arginin), tạo thành hai tiểu đơn vị HA
1
(khối l-
ợng phân tử 36 kDa) và HA
2
(khối lợng phân tử 27 kDa) gắn với nhau bằng liên kết
cộng hóa trị bởi cầu disulfide. Sự phân cắt HA là điều kiện cần thiết cho sự lây
nhiễm của virút nhằm để lộ ra đầu amin kỵ nớc của HA
2
làm trung gian cho sự hòa
màng của vỏ ngoài virút và màng nội bào (37). Virút đi vào tế bào bằng cơ chế nhập
bào. Trong thể nội bào có tính axit, một phần protein HA hòa tan màng virút với
màng không bào, giải phóng các phân tử vARN, các protein phụ và enzym phiên mã
ARN phụ thuộc ARN vào tế bào chất (bớc 2). Những protein này và vARN tạo
thành một phức hợp đợc vận chuyển vào nhân tế bào, nơi enzym phiên mã ARN phụ
thuộc ARN bắt đầu phiên mã sợi vARN dơng bổ sung (bớc 3a và 3b). vARN hoặc
đợc vận chuyển vào trong tế bào chất và dịch mã (bớc 4), hoặc vẫn ở lại trong nhân.
Các protein virút mới đợc tổng hợp hoặc đợc đa ra bề mặt tế bào thông qua bộ máy

Golgi (trong trờng hợp của HA và NA, bớc 5b) hoặc vận chuyển trở lại vào trong
nhân để gắn với vARN và tạo thành những hạt genome của virút mới. Các protein
khác của virút thực hiện nhiều công việc trong tế bào chủ, bao gồm phân hủy
mARN của tế bào và sử dụng các nucleotit đợc giải phóng để tổng hợp vARN và ức
chế dịch mã mARN của tế bào chủ.
15
vARN âm tạo nên genome của virút tơng lai, cùng với enzym phiên mã ARN
phụ thuộc ARN và các protein khác của virút đợc lắp ráp vào trong một virion. Các
phân tử HA và NA tập hợp lại thành một chỗ lồi ra trong màng tế bào. vARN và các
protein virút chủ yếu rời nhân và đi vào trong phần nhô lên này của màng (bớc 6).
Virút trởng thành nảy chồi ra khỏi tế bào trong một khối cầu của màng photpholipit,
có các phân tử HA và NA trên lớp áo màng này (bớc 7). Sau khi giải phóng virút
Cúm mới, tế bào chủ sẽ chết đi.
Hình 4. Chu trình nhân lên của virút Cúm. Nguồn: en.wikipedia.org
1.1.10.Sự phát triển của virút trên tế bào
Virút cúm đầu tiên đợc nuôi trên trứng gà có phôi. Sau này, các virút cúm có thể
đợc nuôi cấy trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên phát.
Việc nuôi cấy virút trên trứng gà có phôi vẫn đợc lựa chọn làm quy trình sản xuất
vắc xin cúm trên thế giới. Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào nh thận khỉ tiên phát hay
thận chó thờng dùng để phân lập virút cúm từ mẫu bệnh phẩm của ngời.
16
Sự phát triển của virút trên nuôi cấy tế bào gây ra sự hủy hoại tế bào và tạo ra
các đám hoại tử trong một số dòng tế bào nh tế bào thận khỉ, thận bê, thận chuột
đồng, thận gà. Ngoài ra nếu sử dụng các dòng tế bào thờng trực thì trypsin phải đợc
bổ sung để hoạt hóa các phân tử protein HA trong quá trình xâm nhập vào tế bào
chủ của virút.
1.1.11.Sinh bệnh học
Các nghiên cứu đã đa ra những bằng chứng chứng minh rằng sinh bệnh học của
virút Cúm là tính trạng đa gen. Điều này có nghĩa là sản phẩm của tất cả các gen của
virút đều tham gia vào quá trình nhận dạng tế bào vật chủ và gây độc tính trong quá

trình xâm nhập phá vỡ tế bào. Trong đó gen HA đóng vai trò trung tâm về tính độc
của virút gồm 2 phân týp H5, H7, có độc tính mạnh nên gây tỷ lệ chết cao. Protein
HA của các virút này khác các HA của các phân nhóm khác là có một trình tự nhiều
axit amin ở đầu carboxyl của HA
1
. Điều này cho phép các enzyme proteaza của tế
bào nhận biết trình tự đó để cắt HA thành HA
1
và HA
2
, là giai đoạn cần thiết cho
virút xâm nhập tế bào và phát triển lan ra. Đây cũng là cơ sở giải thích tính gây độc
của virút Cúm ở ngời.
1.1.12.Dịch tễ học
1.1.12.1. Sự lây truyền và sự thay đổi theo mùa
Bệnh Cúm chủ yếu đợc lây truyền từ ngời sang ngời qua những hạt nhỏ (đờng
kính > 5 àm) từ mũi và họng khi ngời bị nhiễm khi ho và hắt hơi. Các sol khí này
không lơ lửng trong không khí và cần phải có tiếp xúc gần để có thể lan truyền đợc
(từ 1-2 mét). Sự lây truyền cũng có thể xảy ra qua tiếp xúc ngoài da trực tiếp hoặc
tiếp xúc gián tiếp với dịch tiết hô hấp (tay chạm vào các bề mặt bị nhiễm sau đó sờ
lên mắt, mũi hoặc miệng). Ngời nhiễm Cúm có thể phát tán virút từ 2 ngày trớc đến
5 ngày sau khi có triệu chứng. Trẻ em có thể lây lan virút đến 10 ngày hoặc lâu hơn.
Bệnh Cúm lây lan mạnh nhất vào mùa đông và bởi phía Bắc và Nam bán cầu có
mùa đông ở những thời điểm khác nhau trong năm nên trong thực tế có hai mùa
Cúm khác nhau mỗi năm. Điều này giải thích tại sao WHO đa ra những khuyến cáo
17
đối với sản xuất hai loại vắc xin khác nhau mỗi năm, một cho phía Bắc, và một cho
phía Nam bán cầu.
Có nhiều lý do để giải thích tại sao bệnh Cúm thờng bùng phát vào mùa đông
nh độ ẩm và nhiệt độ tơng đối thấp giúp virút Cúm có thể sống lâu hơn, mọi ngời th-

ờng xuyên ở trong nhà dẫn đến sự tiếp xúc gần gũi hơn tạo điều kiện virút lây lan.
Một giả thiết khác là do lợng vitamin D trong cơ thể xuống thấp trong mùa lạnh
cũng làm cho con ngời dễ mắc Cúm hơn. Tuy nhiên, những thay đổi theo mùa trong
cờng độ lây nhiễm virút Cúm cũng xảy ra ở những vùng nhiệt đới, sự lây lan cao
nhất chủ yếu diễn ra trong suốt mùa ma.
1.1.12.2. Dịch và đại dịch
Mỗi năm, các vụ dịch Cúm gây ra 3-5 triệu ca bệnh và từ 300.000-500.000 tử
vong trên toàn cầu. Nguy cơ mắc bệnh nặng và tử vong cao nhất trong số các bệnh
nhân lớn hơn 65 tuổi, trẻ nhỏ dới 2 tuổi, và những ngời có nguy cơ mắc thêm các
biến chứng từ Cúm.
Những virút Cúm mới luôn luôn đợc sinh ra do đột biến hay tái sắp xếp vật liệu
di truyền. Những đột biến có thể gây ra những thay đổi nhỏ trong các kháng nguyên
HA và NA trên bề mặt virút. Đó là đột biến kháng nguyên chậm, tạo ra nhiều chủng
Cúm qua thời gian cho tới khi một trong những biến thể đạt tới sự thích ứng cao hơn
và lây lan nhanh chóng trong cộng đồng, gây ra bệnh dịch. Ngợc lại, khi các virút
Cúm đợc sinh ra có những kháng nguyên mới hoàn toàn, chẳng hạn sự tái sắp xếp
vật liệu di truyền giữa các chủng Cúm gia cầm và các chủng Cúm ngời; đó là đột
biến kháng nguyên nhanh. Nếu một chủng virút Cúm ngời có các kháng nguyên mới
hoàn toàn xuất hiện, tất cả mọi ngời sẽ bị cảm nhiễm và virút Cúm mới sẽ lan tràn
không thể kiểm soát, gây ra đại dịch.
Ngợc lại với vụ dịch, đại dịch là những biến cố ít gặp, xảy ra cứ mỗi 10 hoặc 50
năm. Những đại dịch đã đợc ghi nhận từ thế kỷ thứ 16, và trong vòng 400 năm trở
lại đây, đã có 3 đại dịch Cúm xảy ra (bảng1). Thiệt hại về ngời của các đại dịch này
thay đổi từ mức tàn phá sang vừa hoặc nhẹ.
18
Bảng 1. Đột biến kháng nguyên nhanh và các đại dịch (11, 25)
Năm Tên chủng virút Mức độ Số ngời chết
1889 H3N2 Vừa phải 1 triệu
1918 H1N1 ("Spanish") Nghiêm trọng 40 - 100 triệu
1957 H2N2 ("Asian") Vừa phải 1 - 1,5 triệu

1968 H3N2("Hong kong") Nhẹ 0,75 - 1 triệu
?
Các đại dịch Cúm luân chuyển trên toàn cầu theo nhiều đợt kế tiếp nhau, và
không có cách nào để ngăn ngừa sự lan rộng của một virút gây đại dịch Cúm mới.
Một đặc điểm của Cúm trong đại dịch là số tử vong chuyển sang nhóm tuổi trẻ hơn.
Một nửa số tử vong có liên quan đến Cúm trong đại dịch 1968 và phần lớn những ca
tử vong liên quan đến Cúm trong các đại dịch 1957 và 1918, đều xảy ra ở ngời
< 65 tuổi.
Kinh nghiệm trong quá khứ chỉ ra rằng không có quy tắc chung cho các đại dịch
và cũng không có cơ sở tin cậy nào để dự đoán thời gian và nơi đại dịch có thể xuất
hiện. Trong suốt thế kỷ 20, các đại dịch xảy ra ở những khoảng thời gian tơng đối
dài và không thể dự đoán trớc đợc, từ 9 đến 39 năm trong suốt các đại dịch 1918
(H1N1), 1957 (H2H2), 1968 (H3N2) và 1977 với quy mô nhỏ hơn. Trong năm
1957, virút H2N2 đã thay thế hoàn toàn virút H1N1 trớc đó, và trong năm 1968,
H3N2 thay thế H2N2. Sự tái xuất hiện của H1N1 năm 1977 không gây ra một đại
dịch thật sự, bởi nhiều ngời sinh trớc năm 1957 đã đợc miễn nhiễm một phần. Hơn
thế nữa, virút H1N1 không thay thế H3N2. Từ năm 1968, cả hai phân týp H1N1 và
H3N2 lu hành đồng thời với virút Cúm B gây ra những vụ dịch bùng phát trên ngời
trong giai đoạn tiền đại dịch.
19
1.1.13.Dự phòng và kiểm soát
Biện pháp phòng chống hữu hiệu nhất đối với dịch Cúm là tiêm phòng vắc xin.
Vắc xin Cúm có hiệu quả bảo vệ 70-90% trên ngời trẻ tuổi mạnh khỏe nếu kháng
nguyên vắc xin phù hợp với chủng virút Cúm đang lu hành. Tuy nhiên, hiệu quả
phòng bệnh của vắc xin không cao đối với trẻ em và ngời già. Với những giới hạn
của vắc xin hiện có, đã có nhiều nghiên cứu phát triển những tá chất tốt hơn để tăng
cờng đáp ứng miễn dịch của vắc xin Cúm cũng nh phát triển vắc xin sống giảm độc
lực. Một trong những bớc tiến hứa hẹn là phát triển vắc xin sống giảm độc lực bằng
thích ứng nhiệt độ lạnh. Tuy nhiên, mặc dù vắc xin này có hiệu quả ở trẻ em và ngời
trẻ tuổi thì lại quá giảm độc lực để kích thích sinh kháng thể bảo vệ ở ngời già (8).

Sự phát triển của kỹ thuật di truyền ngợc sử dụng hệ thống chuyển nhiễm
ribonucleoprotein (RNP) cho phép thay thế các gen của virút Cúm và tạo thành phân
tử ARN tái tổ hợp in vitro. Một số tá chất khác nhau cũng đã đợc sử dụng để tăng c-
ờng khả năng đáp ứng miễn dịch của vắc xin Cúm.
Vắc xin Cúm bất hoạt bằng formaldehyt hoặc vắc xin chứa glycoprotein bề mặt
tinh khiết đợc sản xuất trên trứng gà có phôi phải thay đổi chủng sản xuất hàng năm
để đáp ứng với tính đa dạng của virút. Chủng virút là một trong những thành phần
quan trọng nhất của sản xuất vắc xin Cúm. Chủng virút phải không có các yếu tố
ngoại lai, có chứa thành phần HA và NA phù hợp với chủng gây dịch trong năm và
phải có khả năng nhân lên tốt. Dựa trên thông tin từ mạng lới giám sát Cúm toàn
cầu, hàng năm vào tháng Hai, Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) đã xem xét 2 lần trong
một năm tình hình dịch tễ về Cúm trên toàn thế giới, khuyến cáo sử dụng các chủng
virút Cúm mới. Theo khuyến cáo của WHO thì thờng xuyên cần thiết phải phát triển
các chủng virút vắc xin chuẩn có các tính chất kháng nguyên của loài chủng mà
WHO khuyến cáo, và có khả năng nhân lên tốt để việc sản xuất vắc xin có hiệu quả.
Hiện tại, đối với Cúm mùa, vắc xin đợc cấp phép trên toàn thế giới phải chứa 2 phân
týp Cúm A đang lu hành là H3N2, H1N1 và một chủng Cúm B (42).
Hiện nay trên thế giới cũng đã rất nhiều nớc nh Mỹ, Pháp, Nhật Bản, Trung
Quốc, Hungaria với các hớng công nghệ đang đợc các nhà sản xuất lựa chọn hiện
20
nay bao gồm: 1/ Từ trứng gà có phôi SPF (Specific Pathogen Free); 2/ Trên các dòng
tế bào động vật (MDCK); 3/ Sống giảm độc lực và 4/ Trên tế bào Vero (dùng chủng
độc lực hoang dại).
1.2.Thích ứng của chủng Cúm mùa trên các dòng tế bào
khác nhau
1.2.1. Tế bào Vero
Một trong những dòng tế bào đã đợc nghiên cứu khá kĩ là dòng tế bào Vero,
thích hợp cho việc sản xuất các vắc xin virút ở ngời, nh các vắc xin phòng bệnh bại
liệt và bệnh dại (21).
Trớc đây, chỉ có dòng tế bào tiên phát và tế bào lỡng bội đợc sử dụng sản xuất

các loại vắc xin cho ngời là đợc cấp phép. Dòng tế bào thờng trực không đợc sử
dụng bởi những lo ngại liên quan đến khả năng làm xuất hiện các khối u và sự lây
nhiễm virút của những dòng tế bào này. Tế bào Vero, dòng tế bào thận khỉ xanh
châu Phi thờng trực, đã đợc kiểm nghiệm trong khía cạnh này và ngời ta cũng đã
xây dựng một ngân hàng tế bào Vero đợc chấp thuận bởi WHO (21). Điều này
chứng minh không có tác nhân của virút và không có khả năng gây khối u ở những
đời cấy truyền trên dòng tế bào này (4, 13, 35). Tế bào Vero mẫn cảm với một phổ
virút rộng nhng ở những lần thử nghiệm đầu tiên, virút Cúm không phát triển thành
công trên tế bào này (17, 22).
Tuy nhiên, những nghiên cứu sau đó đã chứng minh rằng thêm trypsin nhiều lân
vào môi trờng nuôi cấy của tế bào Vero đã nhiễm virút Cúm phục hồi kiểu nhân lên
nhiều lần của virút Cúm A và B (7, 15).
Nghiên cứu của Govorkova và cộng sự cho thấy dòng tế bào Vero là một hệ
thống vật chủ thích hợp để phân lập và nuôi cấy các virút Cúm A (7). Hiệu quả phân
lập những chủng đang lu hành hiện nay A/H3N2 là tơng tự ở tế bào Vero và MDCK.
Trong 72 chủng thích ứng trên trứng, 90,3% đợc phát hiện có hiệu giá HA trên tế
bào Vero sau lần cấy truyền đầu tiên và 51,4% sau lần thứ hai. Những trình tự axit
amin của vùng HA
1
của các virút Cúm A đợc phân lập và cấy truyền trên tế bào
21
Vero giống hệt nh các virút sinh trởng trên tế bào MDCK. ở nồng độ gây nhiễm
thấp, ngời ta thu đợc sản lợng virút cao bằng cách thêm nhiều lần trypsin vào môi tr-
ờng. Sau 20 lần cấy truyền chủng A/H1N1, ngời ta thu đợc lợng protein của virút
cao nh trên tế bào MDCK. Những nghiên cứu ban đầu với một số lợng chủng giới
hạn đã cho thấy tế bào Vero hỗ trợ tốt cho sự phân lập và nhân lên của các chủng
virút Cúm A .
Nhóm tác giả này cũng đã chỉ ra Vero là một tế bào chủ thích hợp để phân lập
và nuôi cấy các chủng virút Cúm B và xác định những đặc điểm sinh học và di
truyền học của cả virút Cúm A và B trên tế bào Vero. Đồng thời mô tả đặc điểm các

thụ thể trên tế bào Vero so với những thụ thể này trên tế bào MDCK. Phân tích trình
tự đã khẳng định HA của virút Cúm B trên tế bào Vero giống hệt với HA trên tế bào
MDCK, nhng khác với virút sinh trởng trên trứng ở các vị trí axit amin 196 đến 198.
1.2.2. Tế bào MDCK
Tế bào thận chó Madin Darby đợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1958 và đã đ-
ợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất vắc xin thú y. Chúng có thể sản sinh ra khối lợng
lớn virút Cúm (33). Cũng nh tế bào Vero, MDCK là dòng tế bào bám dính và có thể
nuôi cấy trong môi trờng không có serum.
MDCK là dòng tế bào đợc WHO khuyến cáo sử dụng để phân lập virút Cúm A
từ mẫu bệnh phẩm của các trờng nghi ngờ mắc Cúm.
Reina và cộng sự báo cáo một bản nghiên cứu so sánh của các dòng tế bào
MDCK, Vero và MRC-5 trong sự phân lập virút Cúm A. Trong 746 mẫu nghiên cứu
mẫu có 60 virút Cúm A đợc phân lập. Dòng tế bào MDCK thể hiện sự nhạy cảm với
virút Cúm là 100%, dòng tế bào Vero là 71,4% và dòng tế bào MRC-5 là 57,1%
(26). Qua thống kê, tế bào MDCK đã tỏ rõ sự khác nhau đáng kể đối với Vero và
MRC-5. Phân tích định lợng chỉ ra dòng tế bào MDCK nhạy cảm hơn hẳn những
dòng tế bào khác. Có vẻ nh dòng tế bào MDCK vẫn là một trong những dòng tế bào
tốt nhất đợc khuyến cáo để phân lập virút Cúm A từ các mẫu bệnh phẩm đờng hô
hấp.
22
Một nghiên cứu khác về trình tự axit amin và những đặc điểm sinh học của HA
của ba biến thể của chủng virút Cúm X-31 (H3N2) khi nuôi cấy trên tế bào MDCK.
Trong hai biến thể, có 2 vị trí axit amin thay đổi ở HA
1
là các axit amin ở vị trí thứ 8
và 144 lần lợt tơng ứng với mất vị trí glycosin hóa và những thay đổi đặc biệt trong
tính kháng nguyên. Nh các virút thích ứng trên trứng khác của phân týp H3, virút
Cúm X-31 cũng nhân lên kém trên tế bào. Khi không có trypsin, các đám hoại tử
hầu nh không thể nhìn thấy và rất khó có thể đếm đợc. Khi có trypsin, các đám hoại
tử thấy đợc rõ ràng có đờng kính từ 1 đến 2 mm. Trong điều kiện này, số lợng đám

hoại tử đã tăng lên ít nhất 100 lần (27).
1.2.3. Tế bào PMKc
Việc sử dụng tế bào thận khỉ tiên phát để trong sản xuất vắc xin phòng virút
Cúm là một công nghệ mới với cả thế giới, Việt Nam cũng không phải ngoại lệ.
Hiện nay, thế giới chủ yếu đang sử dụng công nghệ vắc xin truyền thống là sản
xuất trên trứng gà có phôi. Tuy nhiên các nhà khoa học của Công ty Vắc xin và Sinh
phẩm só 1 đã sản xuất vắc xin Cúm A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát. Quá
trình thích ứng chủng rgH5N1 có hiệu quả trên tế bào PMKc và nghiên cứu phát
triển vắc xin Cúm A/H5N1 trên dòng tế bào này đã có những thành công nhất định
(1).
Kết quả này cũng đồng thời cũng hứa hẹn khả năng thích ứng tốt những chủng
virút Cúm mùa trên dòng tế bào này.
23
Chơng 2
VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU
2.1. VậT LIệU CHUNG
- Phiến 24 giếng (Nunc - Đan Mạch)
- Chai 25cm
2
và 75cm
2
(Nunc - Đan Mạch)
- Tủ ấm 37
o
C (Memmert - Đức)
- Tủ ấm CO
2
(Sanyo - Nhật)
- Hốt vô trùng (Biosyt - Pháp)
- Kính hiển vi lộn ngợc (Olympus - Nhật)

2.2. Tế bào
- Tế bào thận khỉ tiên phát một lớp (Do Trung tâm khoa học sản xuất vắc xin
và sinh phẩm y tế cung cấp. Tế bào này đợc chuẩn bị từ nguồn khỉ sạch đã đ-
ợc kiểm tra không có các tác nhân ngoại lai nh: SV40, SFV, SIV, virút B, M.
tuberculosis)
- Tế bào MDCK (Do Ngân hàng tế bào Châu âu cung cấp)
- Tế bào Vero (Do Ngân hàng tế bào Châu âu cung cấp)
2.3. Chủng virút
- Chủng virút Cúm A H1N1 A/New Caledonia 20/99 (Do Viện Quốc gia sinh
phẩm chuẩn, UK cung cấp)
- Chủng virút Cúm A H3N2 A/Wisconsin/ 67/2005 (Do Viện Quốc gia sinh
phẩm chuẩn, UK cung cấp)
24
- Chủng virút Cúm B B/Malaysia/ 2506/2004 (Do Viện Quốc gia sinh phẩm
chuẩn, UK cung cấp)
2.4. Môi trờng và hóa chất
- MEM (Gibco)
- FBS (Gibco)
- PBS (-) (Gibco)
- Trypsin-EDTA 0,25% (Gibco)
- Trypsin-TPCK (Sigma)
- Hanks (Gibco)
2.5. Phơng pháp chuẩn bị tế bào
2.5.1. Lấy tế bào từ nitơ lỏng
- Chuẩn bị chai nuôi tế bào 75 cm
2
hoặc 25 cm
2
(tuỳ mục đích sử dụng) đã có
sẵn môi trờng nuôi (ví dụ: MEM 10% FBS) ở 37

o
C hoặc ở nhiệt độ phòng.
- Tiến hành lấy ống tế bào khỏi nitơ lỏng, làm đông tan.
- Vô trùng ống tế bào trớc khi mở nắp ống.
- Hút dịch tế bào từ ống (còn lạnh) chuyển sang chai nuôi đã có sẵn môi trờng.
- Láng nhẹ để tế bào phân bố đều trong dịch môi trờng.
- Nuôi tế bào trong 37
o
C trong 6-8h hoặc qua đêm để tế bào bám vào bề mặt
chai.
- Thay môi trờng cho tế bào bằng môi trờng nuôi sau 24h (tuỳ thuộc dòng tế
bào và mục đích thí nghiệm, ví dụ: MEM 5% FBS cho tế bào MDCK ).
2.5.2. Tách tế bào
- Nuôi tế bào kín một lớp.
- Hút bỏ môi trờng trong chai nuôi tế bào.
25