Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều

Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp là kết quả của 4 năm miệt mài học tập trên ghế giảng
đường Đại học, cũng là bước khởi đầu để làm quen với công việc nghiên cứu khoa học
thực thụ. Vì vậy, nó vô cùng có ý nghĩa đối với mỗi sinh viên. Tuy nhiên, hoàn thành tốt
Khóa luận là một công việc không hề đơn giản, không chỉ đòi hỏi sự nỗ lực, cố gắng của
bản thân người thực hiện mà còn cần đến sự động viên, cổ vũ của gia đình, bạn bè đặc
biệt là sự giúp đỡ nhiệt thành của các thầy cô và cán bộ hướng dẫn. Qua đây, tôi xin gửi
lời cảm ơn đến những cá nhân đã nhiệt tình ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện Khóa luận.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phan Văn Chi – Phó
viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Hoá Sinh Protein đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi, hướng dẫn và truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa
học trong suốt quá trình thực hiện khoá luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Bùi Phương Thuận, Chủ nhiệm
bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá Sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên Hà Nội đã tận tình truyền thụ và trang bị cho tôi những nền tảng kiến thức vững
chắc trong thời gian học tập tại trường để tôi có thể chủ động tiếp thu tốt hơn những
kiến thức khoa học mới khi làm khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS. Đỗ Quỳnh Hoa, người đã trực
tiếp hướng dẫn và nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Bích Nhi, ThS. Trần Thế Thành vì những
đóng góp quý báu trong quá trình hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hoá sinh Protein, Viện Công nghệ
Sinh học và các thầy cô Bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá sinh đã nhiệt tình hướng dẫn,
giúp đỡ, góp ý và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực tập và hoàn thành khoá luận tốt
nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, những người đã luôn
động viên, khích lệ và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2008

Sinh viên
Vũ Khắc Ngọc
1
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.......................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................................2
1.1. TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI......................................2
1.1.1. Khái niệm về huyết thanh người.....................................................................2
1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người............................2
1.1.3. Chức năng của các protein trong huyết thanh..............................................3
1.1.4. Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam.......................................4
1.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh....................................4
1.1.6. Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh.........................................................6
1.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE)....................................................................7
1.2.1. Giới thiệu chung................................................................................................7
1.2.2. Tiến trình hoạt động của 2-DE........................................................................7
1.2.3. Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE.............................................9
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của điện di 2-DE........................9
1.2.5. Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS)...10
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................15
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.............................................................................................15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................15
2.1.2. Hóa chất...........................................................................................................15
2.1.3. Thiết bị.............................................................................................................16
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................................16
2.2.1. Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh..............................16
2.2.2. Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau...............................16
2
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc

2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford
..........................................................................................................................17
2.2.4. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE)...............18
2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE).......19
2.2.6. Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin.......................................20
2.2.7. Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS.
.....................................................................................................................................20
2.2.8. Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8......
.....................................................................................................................................21
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................23
3.1. Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt...........23
3.2. Điện di SDS–PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được......................24
3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford............25
3.4. Điện di 2-DE protein bền nhiệt.........................................................................27
3.5. Điện di 2-DE protein bền nhiệt trên dải pH hẹp............................................30
3.6. Loại bỏ Tris bằng phương pháp kết tủa protein............................................32
3.7. Kiểm tra hiệu quả loại Tris trên bản điện di 2-DE........................................34
3.8. Nhận dạng các protein bền nhiệt trên gel bằng hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS..
.....................................................................................................................................36
3.9. Tìm hiểu chức năng một số protein bền nhiệt đã được nhận diện...............37
3.9.1. Haptoglobin.....................................................................................................37
3.9.2. Apolipoprotein A (Apo)..................................................................................38
3.9.3. Transthyretin (TTR).......................................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................44
3
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Bảng Trang
Bảng 1. Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân bị ung thư......................5

Bảng 2. Một số hóa chất chính đã sử dụng trong nghiên cứu................................................15
Bảng 3. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE.......................................................18
Bảng 4. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng NanoLC......................................................20
Bảng 5. Kết quả đo OD của các nồng độ BSA chuẩn............................................................26
Bảng 6. Kết quả tính toán nồng độ protein trong mẫu theo phương pháp Bradford.............27
Bảng 7. Sự biến đổi của hiệu điện thế theo thời gian ...........................................................28
Bảng 8. Kết quả tính toán nồng độ protein trước và sau khi kết tủa bằng phương pháp
Bradford...................................................................................................................33
Bảng 9. Kết quả nhận dạng các protein chịu nhiệt bằng phương pháp 2DE-LC-MS/MS....36
4
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Hình Trang
Hình 1. Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh................3
Hình 2. Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE sử dụng thanh IPG Strip........................8
Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ Tris đến quá trình hội tụ đẳng điện của protein................10
Hình 4. Hiệu quả của việc lựa chọn dải pH hẹp gối lên nhau................................................11
Hình 5. Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với các khả năng lắp đặt khác nhau.......................13
Hình 6. Sơ đồ kết hợp 2-DE và khối phổ MS/MS trong xác định protein............................14
Hình 7. Hình minh họa các thông số của phần mềm Mascot v1.8.........................................22
Hình 8. Kết quả thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt............23
Hình 9. Ảnh điện di SDS – PAGE protein bền nhiệt.............................................................24
Hình 10. Đường chuẩn xác định nồng độ protein theo phương pháp Bradford....................26
Hình 11. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ protein huyết thanh bền nhiệt trong mẫu nghiên cứu so với
protein tổng số..........................................................................................................27
Hình 12. Ảnh điện di 2-DE phân đoạn protein bền nhiệt....................................................29
Hình 13. Sự hội tụ của Tris trên bản điện di 2-DE tại pH ứng với pKa của nó...................30
Hình 14. Ảnh điện di phân đoạn protein bền nhiệt trên dải pH 4-7......................................31
Hình 15. Ảnh điện di SDS – PAGE khảo sát các điều kiện kết tủa với TCA.......................33
Hình 16. Ảnh điện di 2-DE so sánh hiệu quả của việc loại Tris bằng phương pháp kết tủa

protein đối với quá trình điện di 2-DE trên dải pH 3-10.......................................35
Hình 17. Kết quả nhận dạng haptoglobin với số đăng ký gi|4826762 ..................................37
Hình 18. Phổ MS/MS ion peptide (TSTQDWVQK) của Haptoglobin gi|4826762..............38
Hình 19. Trình tự amino acid của protein haptoglobin gi|4826762.......................................38
5
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 20. Kết quả nhận dạng ApoA-I với số đăng ký gi|37499465.......................................39
Hình 21. Phổ MS/MS ion peptide (HLAPYSDELR) của apoA-I gi|37499465....................40
Hình 22. Trình tự amino acid của protein apoA-I gi|37499465.............................................40
Hình 23. Kết quả nhận dạng của transthyretin với số đăng ký gi|1181953...........................41
Hình 24. Phổ MS/MS ion peptide (GSPAINVAVHVFR) của transthyretin gi|1181953....41
Hình 25. Trình tự amino acid của transthyretin với số đăng ký gi|1181953.........................42
6
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
MỞ ĐẦU
Huyết thanh là một hệ protein phức tạp, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng
khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Những
thay đổi về hàm lượng cũng như thành phần các protein trong huyết thanh thường có mối liên
hệ chặt chẽ với các quá trình bệnh lý. Vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu
là một trong những cách tiếp cận đuợc quan tâm nhất trong nghiên cứu proteomics hiện nay.
Tuy nhiên, thách thức lớn nhất trong nghiên cứu protein huyết thanh không chỉ ở số lượng rất
lớn protein có mặt (khoảng 10000 loại), mà còn là tỷ lệ rất khác nhau của chúng. Trong khi một
số protein có nồng độ cao như albumin (50%-70%), immunoglobulin (8%-10%)…, thì ngược
lại, có rất nhiều protein, peptid có nồng độ rất thấp (ng/ml) như cytokin, hormon mà tổng nồng
độ của chúng chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số. Những khác biệt rất lớn về nồng độ này
cùng với sự hạn chế về mặt kỹ thuật của những phương pháp proteomics truyền thống (định
lượng và định tính protein) đã làm cho việc nghiên cứu một số phân đoạn protein có hàm lượng
thấp trong huyết thanh trở nên khó khăn và ít được chú ý trong một thời gian dài. Song gần đây,
sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp nghiên cứu proteomics hiện đại với độ nhạy và độ
chính xác cao đã cho phép các nhà nghiên cứu phân tách, nhận diện được nhiều protein tồn tại

với hàm lượng tới fg/mL. Một số thành phần protein hàm lượng thấp trong huyết thanh đã bắt
đầu được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn.
Một trong những hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực này là nghiên cứu phân đoạn
protein bền nhiệt trong huyết thanh. Mặc dù chưa có được nhiều thành tựu lớn, nhưng những kết
quả mới công bố gần đây cũng đã gợi ý những phương pháp thu nhận, phân tích và nhận dạng
có hiệu quả các protein huyết thanh bền nhiệt, đồng thời cũng chứng minh được có những mối
liên hệ nhất định giữa sự biến đổi tính bền nhiệt của các protein này với các quá trình bệnh lý,
đặc biệt là đái tháo đường và ung thư. Các nghiên cứu trên hệ protein bền nhiệt này hiện còn rất
mới, rất tiềm năng và hứa hẹn sẽ thu được nhiều thành tựu quan trọng và có ý nghĩa trong
nghiên cứu sinh - y học.
Trong khóa luận tốt nghiệp này, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di hai chiều 2-DE
và khảo sát một số điều kiện thực nghiệm có liên quan để thực hiện đề tài “Phân tích protein
huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều” với mục tiêu thu nhận, phân tách và
bước đầu nhận dạng, tiến tới xây dựng cơ sở dữ liệu về hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh
người Việt Nam, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn trên hệ protein này, đặc biệt là trên các
mẫu bệnh lý nhằm phân tích, so sánh và tìm kiếm các ứng viên chỉ thị bệnh đặc hiệu.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
7
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
1.1. TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI
1.1.1. Khái niệm về huyết thanh người
Huyết tương - plasma là một dịch trong, màu vàng nhạt và vị hơi mặn, thu được khi máu
chống đông đã được loại bỏ toàn bộ các thành phần tế bào. Huyết tương là thành phần quan
trọng của máu, là môi trường sống của các tế bào máu và tất cả các tế bào trong cơ thể, chiếm
55-60% thể tích máu[44].
Huyết thanh - serum là phần dịch lỏng, trong suốt còn lại của máu sau khi đã loại bỏ các
thành phần tế bào và các yếu tố đông máu hay là phần còn lại của huyết tương sau khi đã loại bỏ
các yếu tố đông máu. Nó bao gồm nước, muối, lipid, đường, các enzyme, kháng thể và các
protein hòa tan khác.... Như vậy, huyết thanh rất giống huyết tương và các protein của nó thực
hiện các vai trò rất đa dạng như đông máu, đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng và

nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể.
Huyết thanh không chỉ là mẫu xét nghiệm lâm sàng mà còn thể hiện rất nhiều đặc tính
hữu ích cho các nghiên cứu proteomics. Theo phương diện này, nó là mẫu phân tích tiềm năng
cho việc phát hiện ra các chỉ thị sinh học [8].
1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người
Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 - 250 gam
protein. Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất hiện trong
huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ
ng/ml. Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml [9].
Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng
protein tổng số (hình 1), trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin,
lipoprotein, ... [30]. Ngoài ra còn có rất nhiều protein khác tồn tại với hàm lượng thấp hoặc rất
thấp nhưng lại giữ những chức năng quan trọng như các protein làm nhiệm vụ truyền tín hiệu
giữa các mô, cơ quan hay các protein giải phóng vào máu do kết quả của sự phá hủy mô, do
nhiễm vi sinh vật, .... Như vậy, các protein xuất hiện trong huyết thanh do nhiều nguyên nhân
khác nhau và nó cũng gợi ý cho việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau để phát
hiện chúng.
8
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 1. Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh [30]
Protein trong huyết thanh được coi là một trong những hệ protein phức tạp nhất ở người.
Một số protein có hàm lượng cao (mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml
(chiếm từ 50- 70%), do sự tổng hợp hàng ngày ở gan (khoảng 12g) và có thời gian bán hủy là 21
ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng [9, 10]. IgG khoảng
5-7 mg/ml chiếm 10%. Các protein có hàm lượng thấp (ng/ml) chỉ chiếm khoảng 1% hàm lượng
protein tổng số như interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA-125), β
2
-
microglobulin ... thông thường thay đổi từ 0 - 5 pg/ml và được coi là những chất chỉ thị có độ
nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lý [43].

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein huyết thanh có thể là các chỉ thị sinh
học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 15-3), ung thư tuyến
tiền liệt (PSA), ung thư gan (α-fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-reactive protein) [3].
Tuy nhiên, trải qua nhiều thập kỷ nghiên cứu mới chỉ có một lượng nhỏ các chỉ thị sinh học này
được phát hiện và sử dụng cho mục đích chẩn đoán.
1.1.3. Chức năng của các protein trong huyết thanh
Huyết thanh đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống của cơ thể, là môi
trường trao đổi chất của các mô và cơ quan, đồng thời cũng là môi trường phức tạp, chứa hàng
nghìn loại protein với hàm lượng rất khác nhau. Dựa theo chức năng, có thể phân chia protein
huyết thanh các nhóm sau [4]:
Chức năng miễn dịch: Bao gồm các Ig (đó là IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) và các bổ thể
tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể như: tăng thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên
(peptide, vi khuẩn, virus,…).
9
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Chức năng đông máu: gồm các chất đông máu và các chất chống đông (AT III, protein
C, protein S...) tham gia vào quá trình đông máu và bảo vệ cơ thể.
Duy trì áp suất keo, độ nhớt của máu: trong huyết thanh, protein tạo thành dung dịch
keo để duy trì áp suất thẩm thấu, sức căng bề mặt và tính đệm.
Chức năng xúc tác: enzyme có chức năng xúc tác cho các phản ứng của các quá trình
sinh học từ đơn giản đến phức tạp nhất.
Vận chuyển các chất: vận chuyển chất dinh dưỡng, nước, muối đến các tổ chức và vận
chuyển các chất thải, chất bã qua thận, phổi, mồ hôi, hệ tiêu hoá như: transferrin vận chuyển sắt;
haptoglobin vận chuyển HST tự do; vận chuyển lipid, cholesterol. Vận chuyển các protein cần
thiết để tổng hợp các tổ chức tế bào và mô.
Chức năng điều hoà: những protein này tuy có hàm lượng rất nhỏ (ng/ml) nhưng có vai
trò rất quan trọng trong mọi hoạt động của cơ thể. Chúng bao gồm các hormone, cytokine, các
protein ức chế đặc hiệu enzyme.
1.1.4. Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam
Dựa trên quan điểm về chức năng, Putnam (1975-1987) đã phân loại các protein trong

huyết thanh thành các nhóm chính: Protein tiết từ các mô rắn, các immunoglobulin miễn dịch,
các phối tử trung gian, các phối tử địa phương, các chất tạm thời, sản phẩm giải phóng từ các
mô, các chất tiết bất thường và các protein ngoại lai.
Hệ thống phân loại này được thừa nhận rộng rãi và trích dẫn lại trong các nghiên cứu
của Anderson (2002) [9].
1.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh
Huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn nhất và cũng là một mẫu
nghiên cứu hấp dẫn [1, 9]. Sự hấp dẫn của huyết tương đối với việc chuẩn đoán bệnh được
quyết định bởi hai đặc trưng: (i) mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn, (ii) mẫu không chỉ phản ánh
toàn diện kiểu hình người mà còn cho biết trạng thái của cơ thể ở một thời điểm đặc biệt nào đó.
Trong khi đó, những mẫu khác như nước bọt, nước mắt, nước tiểu, da, tóc chỉ được coi là một
tập con nhỏ của huyết tương hoặc mang tính địa phương và phản ánh hoạt động của tế bào [2].
Huyết thanh là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc
và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong
cơ thể. Chính vì thành phần protein phức tạp của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc mà
việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển
10
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
các công tác nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh trao
đổi chất như đái tháo đường và các bệnh ung thư. Những thay đổi bất thường về thành phần
protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lý (bảng 1). Nói cách khác,
huyết thanh là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin cần thiết cho việc nghiên cứu và
chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp
lý, đã và đang được minh chứng qua những thành tựu thu được trong nhiều thập kỷ qua.
Bảng 1. Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân bị ung thư [11, 43]
Tên bệnh Protein Nồng độ
Bình thường Bị bệnh
Ung thư trực tràng,
ống tiêu hoá
CEA (Carcinoembryonine

antigen)
3-5 ng/ml 10-20 ng/ml
Ung thư gan AFP (α-fetoprotein) 3-5 ng/ml
10-100µg/ml
Ung thư tế bào nuôi
HCG (Human Chrionic
Gonandotrophin)
5 IU/ml 1 triệu IU/ml
Ung thư vú CA15-3 --- Tăng cao
Ung thư tuyến tiền liệt PAP (Prostatic acid phosphatase) 0-0.2 ng/ml Tăng cao
Ung thư dòng lympho β2-M (beta2-Microglobulin) 3.4 ng/ml Tăng cao
Thực tế là nhiều loại protein trong huyết thanh đã được nghiên cứu trước khi chúng ta
biết đến sự tồn tại của gen [9]. Năm 2002 Adkins và cộng sự bằng phương pháp sắc ký lỏng
khối phổ đã phát hiện được 490 loại protein khác nhau trong huyết thanh [6]. Năm 2004, Chan
và cộng sự bằng phương pháp điện di đẳng điện, sắc ký lỏng đa chiều-khối phổ đã phát hiện
được 1444 protein [13] và gần đây nhất năm 2005, theo kết quả xác định và so sánh của 35
phòng thí nghiệm trong dự án proteome huyết tương người của HUPO (Human Proteome
Organization), con số này đã là 3020. Lượng thông tin phong phú do các nghiên cứu về
proteome huyết thanh thu được hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền từ các nghiên
cứu genome. Với những cải tiến nhanh chóng, các kỹ thuật phân tích proteomics đang trở thành
cơ sở cho sự phát triển của genomics chức năng. Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ
đóng vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu về sinh-y học, là nền tảng cho sự phát triển các
sản phẩm chẩn đoán và chữa bệnh trong tương lai.
1.1.6. Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh
Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh là một trong những đối tượng nghiên cứu mới rất
hấp dẫn trong nghiên cứu về huyết thanh. Cho đến nay vẫn chưa có một định nghĩa chính xác và
đầy đủ cho các protein loại này. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, hệ protein bền nhiệt trong
11
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
huyết thanh được xem như là tập hợp các protein có khả năng chịu được nhiệt độ, vẫn giữ được

hoạt tính sau khi đã được xử lý ở nhiệt độ 98
o
C trong 10 phút theo phương pháp của Goufman
và có thể nhận ra được bằng một số phương pháp proteomics như điện di hai chiều và khối phổ
[22]. Các protein bền nhiệt trong huyết thanh thường là những protein có nồng độ thấp và rất
thấp (có thể < 1 pmol), vượt quá giới hạn độ nhạy của các phương pháp nghiên cứu protein
truyền thống. Do đó, trong suốt một thời gian dài, các nghiên cứu về hệ protein bền nhiệt không
được phổ biến và không theo kịp với sự tiến bộ nhanh chóng trong các nghiên cứu về hệ protein
khác ở người. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chóng và vượt bậc
về mặt kỹ thuật, các phương pháp nghiên cứu protein mới như hệ sắc ký Nano đa chiều, phương
pháp nhận diện và định lượng protein bằng khối phổ đã cho phép nhà nghiên cứu thao tác trên
các protein có hàm lượng nhỏ hơn 1pg nhiều lần. Các phương pháp này đã mở ra triển vọng mới
cho việc nghiên cứu các hệ protein hàm lượng thấp, trong đó có hệ protein bền nhiệt trong huyết
thanh.
Tính bền nhiệt của các protein có mối quan hệ chặt chẽ với các cấu trúc tương ứng của
chúng. Ngoài ra, nó còn liên quan đến những cải biến và những biến đổi sinh hóa của protein
như các quá trình glycosyl hóa [31], ..... Do đó, sự thay đổi tính bền nhiệt của protein chắc chắn
có những mối liên hệ nhất định với các biểu hiện bệnh lý. Nghiên cứu các protein bền nhiệt có
thể giúp tìm ra những ứng viên chỉ thị bệnh hiệu quả và có độ nhạy cao.
1.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE)
1.2.1. Giới thiệu chung
Kỹ thuật điện di hai chiều (Two Dimensional Electrophoresis, 2-DE) là một trong những
công cụ phân tách protein truyền thống và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về hệ protein
[20, 36, 25]. Đây là phương pháp có độ phân giải cao hơn hẳn các phương pháp phân tách
protein khác hiện có như sắc ký, điện di một chiều, .... Hiện nay, sự phát triển của kỹ thuật 2-DE
cho phép phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0,1 đơn vị pI, 1kDa về khối lượng phân tử và
có thể phát hiện vệt protein có hàm lượng < 1ng. Tùy thuộc vào kích thước lỗ gel và giải
gradient pH sử dụng, điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein có mặt trong mẫu cùng
một lúc, đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của các mẫu phân tích [7]. Nhờ đó mà
nó ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp

protein trong tế bào, mô và các dịch cơ thể [23] và là kỹ thuật mạnh, không thể thay thế trong so
sánh các mẫu có liên quan như mô bệnh so với mô thường [2].
Mặc dù kỹ thuật điện di hai chiều 2-DE đã ra đời và giới thiệu rộng rãi từ đầu những
năm 1970 nhưng phải mất một thời gian dài sau đó kỹ thuật này mới trở nên phổ biến. Lý do là
12
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
những khó khăn trong quá trình thực hiện IEF và đưa các protein đã được hội tụ lên gel SDS-
PAGE. Khi mới ra đời, kỹ thuật IEF được tiến hành trên các ống gel, rất khó thiết lập gradient
pH. Thêm vào đó, việc sử dụng ống gel cũng làm cho quá trình điện di chiều thứ hai trên gel
SDS-PAGE khó thực hiện. Khó khăn này chỉ giải quyết được khi có sự ra đời của thanh gel IPG
(immobilized pH gradient). Các thanh IPG này được làm từ dẫn xuất của acrylamide, chứa một
nhóm acid carboxylic tự do hoặc một nhóm amin bậc ba và là sản phẩm đồng trùng hợp với
acrylamide và bis-acrylamide [39]. Thanh gel IPG tạo ra một giải gradient pH cố định, liên tục
và tăng dần với chiều dài khác nhau (7 cm, 11 cm, 18 cm, 24 cm) đã hạn chế sự di chuyển, trôi
dạt của các hóa chất (vì chúng được gắn trên gel polyacrylamid) và sự biến thiên pH, làm cho
quá trình phân tách ổn định hơn [32, 39]. Ngoài ra, các thành gel này cũng có độ cứng tương đối
giúp cho việc đưa các protein từ thanh IPG vào trong gel SDS-PAGE trở nên dễ dàng hơn [32].
1.2.2. Tiến trình hoạt động của 2-DE
Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau.
Theo chiều thứ nhất, các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI bằng một
trong các phương pháp sau: điện di gradien pH cố định (immobilized pH gradient
electrophoresis, IPGE), điện di hội tụ theo điểm đẳng điện (isoelectric focusing, IEF) hoặc điện
di gradien pH không cân bằng (non-equilibrium pH gradient electrophoresis, NEPHGE), trong
đó phổ biến nhất là điện di IEF [2, 14]. Chiều thứ hai, các phân tử protein được phân tách bằng
phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamid (như điện di SDS-PAGE) (hình 2). Do đó,
thực chất 2-DE là phương pháp phân tách protein theo 2 chiều, (i) chiều thứ nhất theo điện tích
và (ii) chiều thứ hai theo trọng lượng phân tử.
13
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 2. Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE sử dụng thanh IPG Strip [2]

Sự khác biệt về điểm đẳng điện pI (Isoelectric point) của các protein chính là cơ sở của
IEF. pI là giá trị pH tại đó điện tích bề mặt tổng số của protein bằng 0 (protein không di chuyển
trong điện trường). Mỗi protein có một giá trị pI xác định, do đó dưới tác dụng của điện trường
trong quá trình điện di IEF, các protein sẽ di chuyển và dừng lại tại vị trí có pH tương ứng với
pI của chúng.
1.2.3. Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE
Điện di 2-DE là một trong những công cụ mạnh trong phân tích các hỗn hợp protein
phức tạp và là phương pháp không thể thay thế trong so sánh các mẫu có liên quan như mô bệnh
so với mô thường [2, 32]. Đây là phương pháp cổ điển nhưng vẫn được áp dụng rộng rãi và
thường gắn liền với proteomics vì nó có khả năng phân tách cao, hiển thị hình ảnh so sánh
tương quan, đem lại bức tranh toàn cảnh về mức độ biểu hiện khác nhau của các protein [20].
Khả năng tập hợp dữ liệu và số hóa dữ liệu cũng là một trong những yếu tố quan trọng
cho phép 2-DE trở thành một phương pháp thực nghiệm có nhiều ý nghĩa trong việc xây dựng
các tập hợp thông tin về một hệ proteome. Nó cho phép so sánh khách quan các kết quả nghiên
14
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
cứu, điều chỉnh sự sai khác trong kết quả nghiên cứu giữa các nhóm nghiên cứu khác nhau và
phân loại được một số lượng khổng lồ các dữ liệu protein đã được phân tích [14].
Một trong những ưu điểm nữa của phương pháp điện di 2-DE là khả năng kết nối với
các hệ thống phân tích hình ảnh gel hoàn toàn tự động. Các phần mềm phân tích và xử lý hình
ảnh gel như PDQuest, Proteom Weaver, Z3, Delta2D, Decyder 2D, ... cho phép phân tích, so
sánh, định lượng , chú thích, chú giải và phân loại dữ liệu cho các protein phát hiện được. Ngoài
ra, các phần mềm này còn có khả năng kết nối đến các hệ thống nhặt điểm và cắt gel tự động và
thủy phân các điểm protein này để phục vụ cho việc phân tích trên hệ thống khối phổ [15, 45].
Tuy nhiên, điện di 2-DE cũng gặp phải một số vấn đề trong đó phổ biến nhất là tính lặp
lại tương đối của thí nghiệm điện di. Kết quả điện di của cùng một mẫu có thể có những sai lệch
giữa các lần chạy khác nhau [32, 35]. Vấn đề này càng trở nên nghiêm trọng khi sử dụng 2-DE
cho mục đích so sánh sự khác biệt giữa hai mẫu khác nhau [32].
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của điện di 2-DE
Sự thành công của điện di 2-DE phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: phương pháp chuẩn bị

mẫu, kích thước của thanh strip, lượng protein tải lên strip, độ nhạy của phương pháp nhuộm, ...
trong đó quan trọng nhất là phương pháp chuẩn bị mẫu.
Ảnh hưởng của phương pháp chuẩn bị mẫu:
Phương pháp chuẩn bị mẫu được lựa chọn phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu và là
chìa khóa thành công của thí nghiệm. Các thông số như tính tan, kích thước, điện tích và điểm
đẳng điện của các protein được quan tâm nhiều nhất trong quá trình chuẩn bị mẫu [37, 38].
Phạm vi của phương pháp chuẩn bị mẫu bắt đầu từ sự chiết ra protein với các giải pháp hòa tan
đơn giản đến những hỗn hợp phức tạp của các chất gây biến tính, chất tẩy rửa và các tác nhân
khử. Sự chuẩn bị mẫu có thể bao gồm những chiến lược làm giàu hoặc làm đơn giản hóa mẫu
protein bằng cách chia chúng thành các phân đoạn nhỏ có tính lặp lại.
15
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ Tris đến quá trình hội tụ đẳng điện của protein [17].
Hầu hết các thí nghiệm điện di 2-DE đều phải xác định một phương pháp chuẩn bị mẫu
tối ưu. Sự thay đổi nồng độ của các chất biến tính, chất tẩy rửa, các chất lưỡng tính và các tác
nhân khử điển hình có thể ảnh hưởng đáng kể đến kết quả điện di 2-DE [37, 38]. Một ví dụ điển
hình là ảnh hưởng của Tris ở nồng độ cao đến quá trình điện di IEF (hình 3)[17].
Ảnh hưởng của kích thước và dải pH của thanh Strip:
Thông thường việc tăng kích thước của thanh Strip và lựa chọn dải pH hẹp sẽ cho phép
tăng cường sự phân tách của các protein mà điểm đẳng điện của chúng có độ tương đồng cao
[39]. Người ta thường sử dụng pH 3-10 trên một bản gel trước, sau đó sử dụng các dải pH hẹp
gối lên nhau (sole nhau) để tăng cường độ phân giải của bản gel thu được.
16
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 4. Hiệu quả của việc lựa chọn dải pH hẹp gối lên nhau [39].
Khi lựa chọn dải pH hẹp, các protein nằm ngoài vùng pH đã chọn sẽ không được tải lên
thanh Strip, lượng protein quan tâm được tải lên thanh Strip nhiều hơn và do đó cho phép phát
hiện được nhiều điểm protein hơn [39] (hình 4).
Ảnh hưởng của việc lựa chọn phương pháp nhuộm
Protein phân tách được bằng kỹ thuật 2-DE có thể được nhuộm màu bằng các phương

pháp nhuộm truyền thống để dễ quan sát, bao gồm nhuộm bạc, Coomasie và amido đen, ...
Trong đó, phương pháp nhuộm bạc và nhuộm huỳnh quang kiểu mới cho độ phân giải cao nhất
[32].
Mặc dù có nhiều phương pháp nhuộm khác nhau, nhưng không phải tất cả các phương
pháp này đều phù hợp với những thí nghiệm phân tích tiếp theo. Ví dụ phương pháp nhuộm bạc
17
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
và cố định bằng formalin sẽ cố định các protein trong gel và ngăn cản sự thủy phân chúng bằng
enzyme khi phân tích bằng khối phổ [32].
1.2.5. Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS)
Nguyên lý chung của khối phổ
Khối phổ (Mass spectrometry-MS) là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các
phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân
tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu phổ khối
được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học.
Cấu tạo chung của máy khối phổ
Máy khối phổ thường được cấu tạo từ các bộ phận chính sau đây: (1) bộ phận đưa mẫu;
(2) nguồn ion hóa; (3) hệ thống bơm chân không; (4) bộ phận phân tích khối (mass analyzer) đo
tỷ lệ m/z; (5) bộ phận đo tín hiệu (detector) xác định số lượng các ion ở mỗi giá trị m/z; (6) hệ
thống phân tích dữ liệu, bao gồm máy tính cấu hình cao với các phần mềm chuyên dụng [2].
Hình 5. Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với các khả năng lắp đặt khác nhau [2]
Kết hợp điện di 2 chiều - khối phổ (2DE-MS)
Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối
phổ đang là một trong những cách tiếp cận thường được sử dụng nhất trong nghiên cứu
proteomics [20, 22].
18
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 6. Sơ đồ kết hợp 2-DE và khối phổ MS/MS trong xác định protein [2]
Quá trình này có thể chia thành 5 giai đoạn (hình 6). Ở giai đoạn (1), hỗn hợp protein
được phân tách và tinh sạch trên gel nhờ kỹ thuật 2-DE. Sau quá trình điện di là sự phân tích

hình ảnh các điểm protein trên gel bằng các phần mềm đặc biệt. Vì phổ khối của toàn bộ protein
có độ nhạy kém hơn phổ khối của peptide và chỉ riêng thông tin về khối lượng của protein là
không đủ để xác định nên ở giai đoạn (2), các điểm và vệt protein quan tâm được lựa chọn, cắt
và thủy phân bằng enzyme Tripsin. Sự thủy phân này tạo ra các peptide được ion hóa ở đầu C,
cung cấp một lợi thế để xác định trình tự các peptide. Trong giai đoạn (3), các peptide được
phân tách bởi phương pháp sắc ký lỏng nano hoặc sắc ký lỏng cao áp trong các ống vi mao quản
và được thôi ra rất tinh tế vào trong một nguồn ESI, nơi chúng được bốc hơi, tạo thành những
giọt nhỏ tích điện. Ở giai đoạn (4), những peptide sau khi ion hóa được chuyển vào phổ kế và
phổ khối được xác định. Máy tính sẽ thiết lập một danh sách những peptide được lựa chọn cho
sự phân mảnh tiếp theo bằng năng lượng thích hợp và các phép đo MS/MS sẽ được thực hiện ở
giai đoạn (5). MS và hình ảnh MS/MS tiêu biểu được thu nhận để so sánh với những cơ sở dữ
liệu mà kết quả là sự nhận biết các peptide/protein [2].
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
19
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Máu được thu từ những người tình nguyện tại bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội. Các mẫu
được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chặt chẽ về lâm sàng, có hồ sơ, bệnh án rõ ràng và có kết
luận là mẫu bình thường từ các bác sỹ chuyên khoa của bệnh viện. Máu toàn phần sau khi xử lý,
thu huyết thanh và chia nhỏ lượng mẫu vào các eppendorf, được bảo quản ở -20
o
C cho đến khi
sử dụng.
2.1.2. Hóa chất
Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết, đảm bảo các tiêu chuẩn dành cho hóa
chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử và được sử dụng đúng theo những hướng dẫn và
khuyến cáo của nhà sản xuất. Một số hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở
bảng 2.
Bảng 2. Một số hóa chất chính đã sử dụng trong nghiên cứu

Hãng Vật liệu
Fisher Scientific Methanol (HPLC grade), Acetonitrile (HPLC grade)
Bio-Rad
Hoá chất điện di SDS-PAGE (Bio-Rad, USA), hóa chất điện di 2
chiều (strip, đệm cân bằng 1, đệm cân bằng 2…)
Merck Acetonitrile, muối NaCl...
New England Biolab Thang protein chuẩn (Protein Marker)
Promega Trypsin
Sigma
TriChloroAcetic (TCA), acrylamide, bis- acrylamide,
N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendiamine (TEMED), Ammonium
persulfate (APS), Sodium dodecyl sulfate (SDS), TriFlourAcetic
(TFA), Formic acid (FA), Dithiothreitol (DTT), Amonium
bicarbonate (NH
4
HCO
3
)
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị điện di 1 chiều SDS-PAGE và hai chiều 2-DE mua từ Bio-Rad (Hercules,
CA, Mỹ).
20
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hệ sắc ký lỏng nanoLC đa chiều từ LC Packings (LC Packings, Amsterdam, Hà Lan)
được sử dụng để phân tách. Hệ sắc ký gồm một microautosampler FAMOS, bơm Ultimate
micro HPLC, và thiết bị chuyển cột Swichos.
Hệ máy khối phổ QSTAR® XL, sử dụng nguồn ESI (AplliedBiosystems, MDS SCIEX,
Canada). Cột sắc ký ngược pha C18 (Vydac, Mỹ), đầu đưa mẫu Sillica PicoTip (New Objective,
Mỹ).
Phần mềm Mascot v1.8 (MatrixScience, London, Anh). Phần mềm BioAnalyst QS v1.1

(Applied Biosystems, MDS SCIEX, Canada).
Ngân hàng Dữ liệu Protein NCBI (Mỹ) với hơn 4,8 triệu trình tự protein khác nhau được
cài trên hệ thống máy chủ Workstation XW6200 BASE UNIT.
Các trang thiết bị thực nghiệm cơ bản khác thuộc phòng Hóa sinh Protein, Phòng Thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen Quốc gia, Viện Công nghệ Sinh học.
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh
Các protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh được thu nhận lại theo phương pháp của
Goufman và cộng sự năm 2006 [19].
Một thể tích (1V) huyết thanh tổng số được trộn đều với 1V đệm ETP (20 mM EDTA
pH 8.1, 0.2 M Tris-HCl pH 8.9, 7% (w/v) PEG 6000). Hỗn hợp được ủ 10 phút ở 98
o
C, 10 phút
tiếp theo ở nhiệt độ phòng, sau đó được ly tâm tách pha ở điều kiện 12000 vòng/phút trong 15
phút. Phần dịch nổi chứa các protein huyết thanh bền nhiệt được thu nhận lại và sử dụng cho các
thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2. Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau
Protein bền nhiệt thu nhận được theo phương pháp trình bày ở phần 2.2.1 được hòa tan
trong đệm ETP có nồng độ Tris cao (~ 200mM) làm ảnh hưởng đến kết quả phân tách bằng kỹ
thuật 2-DE. Để loại bỏ Tris, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp kết tủa
protein trong đệm chứa Tris bằng trichloroacetic acid (TCA) ở nồng độ và thời gian ủ thích hợp.
Protein trong dung dịch thu được sau khi biến tính nhiệt được kết tủa bằng TCA. Quy
trình thí nghiệm cụ thể như sau: (i) Bổ sung TCA vào dung dịch protein bền nhiệt với nồng độ
cuối của TCA lần lượt là 15%, 20%, 25% và 30%; (ii) Hỗn hợp phản ứng trên đây được chia
thành 2 nhóm không ủ và có ủ 10 phút tại 4
o
C; (iii) Sau thời gian đó, các hỗn hợp được ly tâm
thu tủa với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút; (iv) Loại bỏ phần dịch nổi, rửa lại phần kết
tủa bằng aceton lạnh, bước thí nghiệm này được lặp lại 3 lần; (v) Làm khô kết tủa protein bằng
21

Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
máy biến tính nhiệt tại nhiệt độ 100
o
C trong 5 phút; (vi) Hòa tan lại protein trong đệm (8M ure,
2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte). Dung dịch protein bền nhiệt
được bảo quản ở -80
o
C.
2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford
Hàm lượng protein trong mẫu được xác định bằng phương pháp Bradford với thuốc
nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x của hãng Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, Mỹ). Cơ sở
của phương pháp là định lượng protein dựa vào đặc điểm liên kết của thuốc nhuộm Coomassie
Brilliant Blue G-250 với protein [12]. Trong môi trường axit, Coomassie Brilliant Blue G-250
tồn tại chủ yếu ở dạng cation màu đỏ, hấp thụ hai proton (A
max
= 470 nm), còn khi thuốc nhuộm
liên kết với các gốc axit amin kiềm (arginine) hoặc thơm của protein, chúng chuyển sang dạng
màu xanh và không hấp thụ proton (A
max
= 595 nm). Dạng liên kết thuốc nhuộm - protein được
phát hiện ở bước sóng 595 nm bằng máy quang phổ. Protein chuẩn được sử dụng để định lượng
protein trong nghiên cứu này là albumin huyết thanh bò (BSA - Bovine Serum Albumin). Các
bước thí nghiệm được tiến hành như sau:
Dựng đường chuẩn bằng cách đo OD tại các nồng độ chuẩn khác nhau của BSA
• Chuẩn bị 7 ống eppendorf với các nồng độ protein chuẩn BSA như sau: 0,125
mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,75 mg/ml; 1 mg/ml; 1,5 mg/ml; 2 mg/ml.
• Rút 20 µl dung dịch BSA ở từng nồng độ kể trên trộn đều với 1ml dung dịch
Bradford 1x. Để phản ứng trong hỗn hợp xảy ra tổi thiểu 5 phút (tối đa không quá 1h) ở nhiệt độ
phòng trước khi đem đo trên máy quang phổ, tại bước sóng 595 nm. Lặp lại thí nghiệm từ 2-3
lần cho mỗi nồng độ BSA kể trên.

• Đặt máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, đo độ hấp thụ của các dung dịch BSA và
mẫu protein, ghi kết quả và dựng đường chuẩn BSA bằng phần mềm Exel của hãng Microsoft.
Xác định nồng độ protein bền nhiệt
• Bổ sung 20 µl protein bền nhiệt thu được ở phần 2.2.1 hoặc 2.2.2 vào 1 ml dung dịch
Bradford 1x. Trộn đều hỗn hợp, để tổi thiểu 5 phút (tối đa không quá 1h) ở nhiệt độ phòng để
phản ứng xảy ra trước khi đem đo trên máy quang phổ. Lặp lại thí nghiệm từ 2-3 lần cho mỗi
mẫu protein bền nhiệt.
• Đặt máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, đo độ hấp thụ của các dung dịch protein
bền nhiệt, ghi kết quả hấp phụ protein tại bước sóng 595, tính toán nồng độ protein dựa trên
đường chuẩn BSA bằng phần mềm Exel của hãng Microsoft.
22
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
2.2.4. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE)
Trong khóa luận này, kỹ thuật SDS-PAGE được thực hiện theo LaemLi, 1970 [27]. Các
thiết bị, hóa chất được sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp.
Protein được phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau. Đối với
các protein có trọng lượng phân tử từ 6 kDa-160 kDa, gel 10%, 12.6% và 15% (w/v) thường
được sử dụng. Trong nghiên cứu này, SDS-PAGE được tiến hành trên gel 12.6% với các thành
phần cơ bản như ở bảng 3 cho 3 mẫu: (i) huyết thanh pha loãng 40 lần (ii) dịch nổi protein bền
nhiệt (iii) dịch hòa tan của protein bền nhiệt sau khi kết tủa.
Bảng 3. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE
Thành phần
Gel cô
5%
2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 µl 10% (w/v) SDS, 0,35 ml
acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H
2
O, 20 µl 10% (w/v) APS, 2 µl TEMED
Gel tách
12,6%

4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45µl 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50%
glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H
2
O, 30 µl 10% (w/v)
APS, 3 µl TEMED
Đệm hòa mẫu
5x
25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1
(w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8
Đệm điện di 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3
Quá trình điện di được thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30 phút và (ii) 150V
cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel. Kết thúc quá trình điện di, bản
gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1%
(w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản
gel được tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có
thể quan sát thấy các băng protein.
2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE)
2-DE là kỹ thuật phân tách các protein dựa trên sự khác nhau về điểm đẳng điện và khối
lượng phân tử trên gel polyacrylamide. Ở chiều điện di thứ nhất (điện di đẳng điện, isoelectric
focusing - IEF), dưới tác dụng của điện trường, các protein di chuyển đến các vị trí pH mà tại đó
điện tích tổng số của protein bằng 0, nói cách khác là di chuyển tới điểm đẳng điện pI của
chúng. Ở chiều điện di thứ hai (điện di biến tính SDS-PAGE), các protein tại những giá trị pH
nhất định tiếp tục được phân tách theo khối lượng phân tử.
23
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Điện di chiều thứ nhất (điện di đẳng điện)
Protein huyết thanh sau khi xử lí nhiệt và loại Tris bằng phương pháp kết tủa được hòa
trong đệm (8M urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte và 0.001%
Bromophenol Blue). Hỗn hợp mẫu được thấm vào thanh gel dài 7cm, chứa dải pH từ 3 đến 10
hoặc 17cm, chứa dải pH từ 4 đến 7 (do hãng Bio-Rad, Mỹ cung cấp) trong thời gian từ 12 giờ

đến 16 giờ. Sau đó, các protein trên thanh gel được phân tách theo điểm đẳng điện trên hệ
PROTEAN IEF (Bio-Rad). Thể tích mẫu sử dụng, thời gian thấm mẫu lên các thanh gel và các
bước biến đổi hiệu điện thế trong quá trình điện di được cài đặt theo theo chương trình được
khuyến cáo trong hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Bio-Rad).
Cân bằng gel
Sau quá trình điện di đẳng điện, protein trên gel được khử bằng dung dịch chứa 6 M
urea, 20% glycerol 2% SDS, 37,5 mM Tris-HCl pH 8.8, 2% DTT w/v và alkyl hóa bằng dung
dịch chứa 6 M urea, 2% SDS 37.5 mM Tris-HCl pH 8.8, glycerol 20% and 40 mM IAA.
Điện di chiều hai
Các protein trong thanh gel sau khi được phân tách theo điểm đẳng điện và được cân
bằng trong các dung dịch trên sẽ tiếp tục được phân tách trên gel polyarcrylamid 12.5% theo
kích thước phân tử của chúng với hiệu điện thế không đổi 150 V. Bản gel 2-DE được nhuộm
bằng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250 rồi tẩy màu tương tự như với bản gel SDS –
PAGE ở mục 2.2.4.
2.2.6. Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin
Các vùng protein đã đánh dấu trên bản gel điện di 2-DE được cắt ra và chuyển vào ống
eppendof 1,5 ml. Gel được rửa, loại thuốc nhuộm bằng dung dịch rửa (50 mM NH4HCO3, pH
8.0, 50% ACN). Sau đó, các mảnh gel được làm khô bằng 100% ACN và khử bằng DTT với
dung dịch khử chứa 5 mM DTT ở 56
0
C trong 1h. Sau khi khử, gel được alkyl hóa bằng IAA với
dung dịch alkylation chứa 5 mM IAA trong tối, 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Enzym trypsin (loại sử
dụng cho đọc trình tự, Sigma-Aldrich) được thêm vào với tỷ lệ enzym : cơ chất là 1 : 50, ở 37
0
C qua đêm. Sau khi thủy phân, các peptide được chiết ra khỏi gel bằng dung dịch chiết (50%
ACN, 0,1% FA) và siêu âm 20 phút. Quá trình chiết peptid khỏi gel được lặp lại 3 lần.
2.2.7. Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS
Phương pháp sắc ký lỏng nhiều chiều kết hợp với khối phổ được sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu các mẫu protein phức tạp. Phương pháp này giúp làm giảm độ phức tạp của mẫu khi
24

Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
đi vào phân tích bằng khối phổ MS/MS và do đó làm tăng khả năng phát hiện các thành phần
protein có nồng độ thấp trong mẫu.
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng sắc ký một chiều kết nối khối
phổ 1D nanoLC-ESI-MS/MS để phân tích và nhận dạng protein do các protein đã được phân
tách trước đó nhờ kỹ thuật 2-DE. Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân được cô đặc muối trên cột
Trap, sau đó sẽ được phân tách trên cột sắc ký ngược pha C18. Cuối cùng hỗn hợp sẽ đưa vào
hệ thống khối phổ để phân tích. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng nanoLC được tổng kết
trong bảng 4.
Bảng 4. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng NanoLC
Sắc ký lỏng nano
UltiMate™ / FAMOS/ Switchos™
(LC Packings/Dionex)
Cột ngược pha
300µl x 5 mm C18 PepMap100, LC Parking, Nertherland)
Cột C18
75µl ID. x 15 cm, Grace Vydac, Hesperia, CA, USA
Tốc độ dòng 200 nl/phút
Tốc độ dòng Switchos
30 µl /phút
Thể tích mẫu
20 µl (mẫu và muối)
Các loại đệm
A: 0,1% FA
B: 85% ACN trong 0,1% FA
Thời gian
90 phút, phút 10 bắt đầu tạo gradient với nồng độ đệm B
tăng từ 0-100% trong 65 phút.
Ghi phổ NanoLC-ESI- MS/MS
Máy khối phổ QSTAR


XL được vận hành ở chế độ IDA (Information Dependent
Acquisition) để thực hiện việc chuyển từ quét phổ TOF MS đơn đối với các ion nằm trong dải
khối từ 400 amu đến 1200 amu sang khối phổ liên tiếp (MS/MS) trên 3 ion phân tử có mật độ
cao nhất và lớn hơn 20 được xác định tự động nhờ phần mềm BioAnalyst QS v1.1 (Applied
Biosystems) (Hình 7). Sai số về khối (mass tolerance) được đặt ở mức ± 0,5 Da, thời gian không
thực hiện lại MS/MS đối với một mảnh là 90 giây. Hiệu điện thế được đặt ở nguồn để ion hoá
mẫu là 2200V.
2.2.8. Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8
25