Nghiên cứu xây dựng hệ thống qui trình nuôi cấy phôi trong điều kiện Việt Nam

1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay trong lĩnh vực chăn nuôi, một thành tựu đánh dấu sự tiến bộ vượt bậc
của kĩ thuật nuôi cấy tế bào sinh dục là khả năng tạo được hợp tử bên ngoài cơ thể mẹ
thông qua sự kết hợp tinh trùng và noãn trong điều kiện in vitro. Ở động vật, nguồn
phôi dồi dào có thể phục vụ cho các mục đích khác nhau như: tạo động vật chuyển
gen, khai thác nguồn tế bào mầm, nhân bản động vật, tạo đàn thú có điều kiện thí
nghiệm tương đương nhau phục vụ nghiên cứu khoa học… Nhưng dù với mục đích gì,
cũng cần phải qua khâu tạo nguồn noãn chín đồng loạt. Đó là bước căn bản trong thao
tác liên quan đến khoa học về sinh sản.
Ngày 24/04/2005, các nhà khoa học của đại học quốc gia Seoul đã thành công
khi cho sinh sản vô tính một giống chó săn Afganistan (trích báo tuổi trẻ số ra ngày
05/08/2005). Trên thế giới, công nghệ sinh học trong lĩnh vực sinh sản nói chung và
việc tạo noãn chín in vitro nói riêng rất phổ biến, nhưng ở Việt Nam vẫn còn rất hạn
hẹp. Noãn heo là nguồn noãn dồi dào và có thể giúp hoàn thiện thao tác lấy noãn và
nuôi noãn. Trên chó có một số giống quý hiếm nhưng chu kỳ sinh sản của chúng rất
dài và tỉ lệ nuôi thành công rất thấp, do đó chọn nuôi trứng trên chó rất có ý nghĩa.
Vì những lý do trên, đề tài “Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo
và chó” được tiến hành.

1.2. Mục tiêu và yêu cầu
Mục tiêu
Góp phần xây dựng hệ thống qui trình nuôi cấy phôi trong điều kiện Việt Nam.

Yêu cầu
Phân loại nang noãn trên buồng trứng heo và chó.
Áp dụng phương pháp nuôi chín noãn heo và chó.
Áp dụng phương pháp nhuộm nhiễm sắc thể và thể cực của noãn chín.

2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Buồng trứng
2.1.1. Cấu tạo [1]
Buồng trứng phát triển từ miền vỏ của tuyến sinh dục, gồm một đôi
được treo ở cạnh trước dây chằng rộng và nằm trong xoang chậu. Bên ngoài là
lớp màng liên kết sợi chắc như màng bao dịch hoàn. Bên trong buồng trứng
chia làm hai miền: miền vỏ và miền tủy, hai miền được cấu tạo bằng lớp mô
liên kết sợi xốp, tạo một chất đệm cho buồng trứng. Miền tủy có mạch máu
nhiều hơn và lớp mô liên kết cũng dày hơn. Miền vỏ là nơi xảy ra sự chín noãn
và rụng noãn.
Bên dưới lớp màng là noãn nguyên thủy. Khi nang noãn chín, tế bào
nang bao quanh noãn phân chia thành nhiều tầng tế bào hạt. Nang noãn càng
phát triển thì tế bào nang phân hủy tạo ra một xoang chứa dịch. Khi trở nên
chín, nang noãn được bao bọc bởi một lớp màng mỏng.
Tổ chức liên kết ngoài buồng trứng lúc này dày lên để bảo vệ nang noãn
chín, giữa màng liên kết và màng nang noãn là tổ chức mạch quản dày đặc. Lúc
nang noãn đã thành thục thì màng bọc nang và màng bao liên kết của buồng
trứng tách ra, noãn rời buồng trứng cùng với dịch nang để đi vào vòi Fallop.
Màng nang noãn rách rồi liền lại ngay, các tế bào hạt trong xoang phân chia
nhanh thành một khối tế bào lớn để lấp kín xoang nang noãn và trở thành thể
vàng.
2.1.2. Chức năng nội tiết của buồng trứng [1], [2]
Hormon được tiết ra từ nang noãn và thể vàng. Hormon từ nang noãn là
estrogen, từ thể vàng là progesteron. Hàm lượng hormon liên quan đến các giai
đoạn trong chu kì động dục. Hàm lượng progesteron trong thể vàng tăng sau
xuất noãn và thấp khi thoái triển. Có relaxin trong pha thể vàng của chu kì
nhưng pha nang noãn thì không có relaxin. Relaxin cũng không xuất hiện trong
buồng trứng heo cái tơ.

Nang noãn thành thục thì tế bào hạt trong biểu mô tiết ra nhiều estrogen.
Estrogen làm gia súc biểu hiện động dục. Estrogen gồm estradiol và sản phẩm
hóa học của nó là estrol và estriol. Estrogen liên quan đến đặc tính sinh dục thứ
3
cấp của gia súc cái, làm âm đạo tiết nhiều dịch nhầy, sừng tử cung và ống dẫn
trứng được tăng cường dòng máu, tuyến vú phát triển, vỏ não hưng phấn.

Hình 2.1: (a) Estradiol (b) Estriol
Sau khi xuất noãn, nguyên sinh chất bên trong nang noãn tích tụ sắc tố
thể vàng. Thể vàng tiết hormon progesteron. Progesteron vào máu, ức chế phân
tiết gonadotropin từ tuyến yên và ức chế sự chín của nang noãn, kích thích sự
hoạt động của niêm mạc tử cung để trứng được thụ tinh về nơi làm tổ và phát
triển, ức chế co bóp của tử cung, giảm hormon thùy sau của tuyến yên trong
thời gian gia súc có chửa và thúc đẩy tuyến vú phát triển.

Hình 2.2: Progesteron
2.1.3. Buồng trứng heo và chó
2.1.3.1. Buồng trứng heo [6]
Buồng trứng heo hình chùm dâu, có màu hồng vân, nằm hai bên hốc
bụng. Trọng lượng buồng trứng tăng từ ngày thứ 3 đến ngày 12 sau động dục vì
thể vàng phát triển. Đường kính thể vàng đạt tối đa 11 mm vào ngày 15 và giảm
dần do thoái hóa.
Màu và cấu trúc thể vàng thay đổi theo thời gian. Thể vàng có màu đỏ
sậm vào ngày thứ 3, tím tái vào ngày 15 và màu kem hơi vàng và trắng dần vào
ngày 15 – 18. Ngày thứ 3 có cục máu đỏ sậm ở giữa thể vàng, ngày thứ 6 cục
máu được thay thế bởi mô liên kết hoặc bởi dịch hơi vàng, đến ngày 16 – 18 có
nhiều mạch máu. Lúc bắt đầu động dục của chu kỳ tiếp theo thể vàng thoái hóa,
đường kính của thể vàng chỉ còn 50 % và mất đi vào ngày 40.
Số nang tối đa là 2.700.000, số nang lúc sinh 135.000, số nang mất trong
quá trình phát triển là 95 %. Kích thước nang xoang là 8 – 10 mm, kích thước

nang noãn thành thục là 8 – 12 mm.
4
2.1.3.2. Buồng trứng chó [6]
Buồng trứng được bao bởi một túi. Khi lột bỏ túi, kích thước của buồng
trứng là 1,7  0,9  0,4 cm ở chó beagle. Buồng trứng chó già tương tự như bề
mặt bông cải, có kẽ hở sâu để phân chia các thùy với kích cỡ khác nhau. Khi ấy
buồng trứng chứa các nang noãn tịt, mô liên kết dày đặc, vết sẹo của thể vàng,
thành phần của sườn gian bào vùng tủy. Tế bào biểu mô mầm trở nên hình trụ
giả với mảng lồi giống như tiêm mao. Ở chó không mang thai thể vàng thoái
hóa vào ngày 20 sau động dục.
Chó cái có khoảng 700.000 nang noãn lúc mới sinh, còn 350.000 lúc
thành thục, trong số này khoảng 1200 – 1300 nang xoang. Khả năng thụ tinh
không giảm đến khi chó được 5 tuổi.
2.2. Nang noãn
2.2.1. Đặc điểm hình thái [1]
Noãn là tế bào lớn nhất cơ thể, có dạng hình cầu. Thể tích tế bào trứng
lớn hơn tinh trùng nhiều lần và dài gấp 2 lần. Cấu tạo noãn gồm 3 phần:
 Phần nguyên sinh chất gồm các thành phần chủ yếu là nước, vật
chất hữu cơ, muối khoáng và vật chất khác.
 Nhân gồm lưới nhiễm sắc thể và nhiều hạt.
 Màng bao gồm 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong.
Màng ngoài gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp. Những tế bào
này được phân bổ khắp noãn nên còn gọi là màng phóng xạ hay màng tia. Các tế
bào này được gắn với nhau bởi acid hyaluronic. Khi tinh trùng gặp trứng, men
hyaluronidase ở phần acrosom được tiết ra để phân giải acid hyaluronic làm
màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện thụ tinh.
Màng giữa gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ tế bào nang, là lớp nuôi
dưỡng noãn. Màng giữa gọi là màng trong suốt. Màng này đảm bảo dinh dưỡng
cho noãn trong buồng trứng. Trong màng chứa enzym zonalizin – men đặc hiệu
chủng loài có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác loài đi vào nhân noãn trong quá

trình thụ tinh.
Màng trong là lớp màng mỏng bao quanh phần nguyên sinh chất gọi là
màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi
5
dưỡng noãn đã thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng có khoảng
trống dày 14 – 25 µm, pH 3 – 5, chứa dịch có nồng độ ion cao.
2.2.2. Các giai đoạn phát triển của nang noãn và noãn
Quá trình hình thành nang noãn xảy ra ở lớp vỏ buồng trứng, từ những
nang noãn nguyên thủy phân bố ở vùng ngoại biên. Ở thời kì sau thai, nang
noãn không ngừng được hình thành và phát triển từ biểu mô phôi thai.
Quá trình hình thành noãn gồm 7 bước: sinh tế bào mầm nguyên thủy
(PGC – primordial germ cells); di chuyển PGC tới tuyến sinh dục; định vị PGC
trong tuyến sinh dục; biệt hóa PGC thành noãn nguyên bào; tăng số lượng noãn
nguyên bào; bắt đầu giảm phân; dừng ở giai đoạn nhân đôi prophase I [26].
Từ PGC trở thành nang noãn được bọc bằng tế bào dẹt, nó biến thành
nang quá độ. Song song với quá trình giảm phân, nang quá độ nổi lên từ vùng
vỏ và chứa một noãn được bao quanh bởi một lớp tế bào sinh dưỡng, gọi là tiền
tế bào hạt. Tế bào sinh dưỡng miền vỏ có nguồn gốc từ tế bào biểu mô bề mặt
di chuyển ngược vào buồng trứng và tế bào hạt có nguồn gốc từ tế bào trung
thận di chuyển xuyên qua buồng trứng (Sawyer và cs, 2002) [29]. Ở cừu, noãn
quá độ có đường kính 25 – 53 µm, noãn đang biệt hóa là 17 – 22 µm và noãn
nguyên bào 13 – 17 µm, điều đó chứng tỏ tế bào mầm tăng trưởng trước, trong
và sau quá trình tạo nang noãn (Mc Natty và cs, 2000) [20].
Từ nang quá độ phát triển thành nang bậc một. Nang bậc một chỉ chứa
một lớp tế bào hạt bao quanh, giai đoạn chuyển thành nang bậc một chậm hơn
so với quá trình tăng trưởng của nang.
Từ nang bậc một phát triển thành nang bậc hai, có từ 2 lớp tế bào hạt trở
lên. Khi noãn tăng trưởng, tế bào hạt tăng sinh dày, lớp tế bào vỏ hình thành
xung quanh tế bào hạt. Giai đoạn này tăng RNA, protein, ribosom, ti thể và một
số chất hữu cơ khác.

Từ nang bậc hai tạo nang xoang, chứa nhiều dịch và nhiều tế bào hạt bao
quanh. Dịch có vai trò điều hòa các chất từ máu hoặc chất tiết trong tế bào nang
như: gonadotropin, steroid, yếu tố tăng trưởng, enzym, proteoglycan,
lipoprotein. Dịch tăng lên nhờ sự phát triển mao quản và dòng máu vận chuyển
trong nang. Noãn lúc này được bọc bởi tế bào hạt tụ (cumulus), tạo phức hợp
COC (cumulus oocyte complex).
6
Sau quá trình tăng trưởng, noãn tồn tại ở giai đoạn tiền kỳ. Sau đỉnh LH,
để hoàn thành giảm phân, các noãn đã tăng trưởng đầy đủ này xuất hiện màng
trong suốt tạo cầu nối giữa noãn và tế bào hạt tụ. Quá trình trưởng thành là
khoảng thời gian sau đỉnh LH và xuất noãn. Quá trình này có hai biến đổi lớn:
trưởng thành nhân và trưởng thành tế bào chất [3].
Trưởng thành nhân là thuật ngữ chỉ sự phục hồi quá trình phân bào giảm
nhiễm và những chuyển biến đến giai đoạn MII (metaphase II).
Trưởng thành tế bào chất là thuật ngữ liên quan đến các sự kiện khác: sự
chuẩn bị cho trứng thụ tinh và phát triển trước làm tổ, định vị lại các tiểu
thể của bào tương và các tế bào hạt.
Trưởng thành nhân kéo dài 44 giờ trên heo, gồm 2 quá trình phân chia
liên tục ở thời kì MI và MII, sau đó noãn dừng lại tại MII chờ thụ tinh. Ở giai
đoạn này, noãn đáp ứng đỉnh LH tạo nhiều hormon steroid từ tế bào hạt, tạo
nhiều hyaluronan từ tế bào hạt tụ, tiết dịch nhầy và tăng kích thước của tế bào
hạt tụ.

Hình 2.3 : Các giai đoạn phát triển của nang noãn [37]

2.2.3. Biến đổi đại thể của nang noãn
2.2.3.1. Nang noãn heo [6]
Đường kính trung bình của nang noãn lớn tăng dần đến ngày thứ 18 của
chu kì, đạt tối đa 9 mm. Nang noãn lớn có thể được thấy vào 18 giờ sau khi bắt
đầu động dục nhưng sau đó sự thay đổi kích thước lại biến động. Kích thước
của nang chưa đủ đánh giá vì đường kính nang khá biến động lúc xuất noãn.
Nang noãn
bậc 3
Nang bậc hai

Nang bậc hai
Nang bậc ba
7
Màu của nang noãn trưởng thành là màu hồng vỏ sò, do mạng mạch máu
nằm dưới bề mặt nang noãn. Vùng trong suốt của đỉnh nang noãn là nơi xuất
noãn. Khi xuất noãn, thành nang noãn vỡ và dịch hơi đỏ xuất hiện ở bề mặt
nang noãn. Điểm vỡ vẫn có thể thấy được vào ngày 12 sau động dục.
Động mạch xung huyết và tràn máu vào nang noãn dẫn tới noãn xuất
huyết, hiện tượng này thường xuất hiện trên heo. Khi xuất noãn, nang nhuộm
đỏ và đứt mạch máu, thành nang xẹp xuống và xuất hiện dịch đỏ trên bề mặt.
Khoảng 2 – 3 ngày trước động dục, nang noãn lớn nhanh, lúc này có sự
triển dưỡng của lớp màng bao trong của nang noãn và hòa tan một phần tế bào
hạt tụ nên noãn ở trạng thái tự do lơ lửng. Noãn tự trải qua giai đoạn giảm
nhiễm đầu tiên, nhân di chuyển về phía ngoại vi của tế bào và thể cực thứ nhất
được tạo ra. Lúc xuất noãn, thể cực thứ nhất được đẩy ra và trục của thể cực thứ
nhì được tạo nên.
2.2.3.2. Nang noãn chó [6]

Nang noãn bậc một có một lớp tế bào hình lập phương còn nang noãn
bậc hai gia tăng kích thước do tăng tế bào hạt và tạo xoang nang. Thông thường
nang noãn bậc hai có 2 noãn hoặc nhiều hơn. Nhiều báo cáo cho thấy nang noãn
đa noãn có 11 noãn, thông thường là 3 – 5 noãn.
Kích thước nang noãn gia tăng vào giai đoạn tiền động dục nên giai đoạn
này được xem là giai đoạn nang noãn trưởng thành. Vì phần lớn nang noãn nhỏ
thoái hóa, chỉ có một số nang noãn có kích thước > 2 mm. Những nang noãn
3 – 4 mm có khoảng 8 – 10 lớp tế bào hạt, lớp màng bao trong tăng mạch quản
và mô liên kết. Nang noãn 4 – 6 mm hơi phồng lên trên bề mặt buồng trứng.
Một đặc tính thống nhất của nang noãn trưởng thành ở chó là nếp gấp
sâu của lớp tế bào hạt, trong đó có cuộn mao quản ăn sâu vào lớp màng bao
trong và chuẩn bị tạo chất vàng.
Vào đầu giai đoạn động dục, nhiều nang noãn xuất noãn. Lúc thú bắt đầu
chịu đực, thể cực thứ nhất chưa được tạo. Noãn được phóng thích qua lỗ nhỏ
như lỗ đinh kim mà không có hiện tượng vỡ bao noãn. Noãn được phóng thích
có kính thước khoảng 77  99 μm, nếu kể cả vùng trong suốt thì khoảng 95 
110 μm, chứa những hạt có tính khúc xạ cao và nhiều hạt mỡ.

8
2.2.4. Nội tiết của nang noãn
Sự tăng trưởng, thành thục, xuất noãn và thể vàng hóa của nang phụ
thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu chế tiết thích hợp, hàm lượng đủ và tỉ lệ phù hợp
của FSH (follicle stimulating hormone) và LH (luteinizing hormone) trong
huyết thanh. FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang
nang, kích thích quá trình nguyên phân của tế bào hạt và quá trình hình thành
dịch nang. Ngoài ra, FSH tăng khả năng cảm ứng của tế bào hạt đối với LH
bằng cách tăng số lượng các thụ thể LH. Ở heo, các thụ thể LH tăng từ 300
(trong các nang bé) và lên 10.000 (trong các nang lớn trước xuất noãn). Tăng
LH chuẩn bị cho quá trình thể vàng hóa của tế bào hạt.
Trong giai đoạn tạo nang bậc hai, sự tăng kích thước, tăng số tế bào hạt

và số nang noãn tịt bị ảnh hưởng bởi lượng kích dục tố. FSH kích thích tạo cầu
nối ở tế bào hạt. LH quan trọng hơn FSH trong phát triển nang bậc hai vì qua
thụ thể LH ở tế bào bao nang, khởi động sinh tổng hợp androgen để kích thích
tạo thụ thể FSH ở tế bào hạt, do đó tăng ảnh hưởng FSH lên nang bậc hai [34].
Ở giai đoạn này, người ta cũng phát hiện GH (growth hormone) làm tăng sự
phát triển in vitro của nang bậc hai trên chuột (Liu và cs, 1998) [14].
Trong giai đoạn tạo nang xoang, nang xoang giai đoạn sớm có thụ thể
FSH ở tế bào hạt nhưng chưa phụ thuộc vào kích dục tố. Ở giai đoạn này tế bào
bao nang tăng tiết steroid, trong khi tế bào hạt mất aromatase (loại enzyme biến
đổi androgen thành estrogen). Điều này chứng tỏ rằng progesteron và androgen
mà không phải estrogen là những hormon steroid được tạo bởi nang xoang giai
đoạn sớm. Trong nang xoang giai đoạn sau, có hiện tượng giảm FSH, nang
noãn tiết nhiều estradiol và inhibin và có khả năng xuất noãn. Những nang còn
lại phát triển bất thường và trở thành nang tịt.
Trong giai đoạn nang noãn trưởng thành, tuyến yên tiết LH tối đa và
nang có khả năng xuất noãn.



9

Hình 2.4: Nội tiết nang [36]

2.2.5. Sự trƣởng thành của noãn
2.2.5.1. Quá trình trƣởng thành
Trên heo, noãn nguyên bào bắt đầu giảm phân tạo noãn bậc hai, noãn
bậc hai tiếp tục phát triển đến giai đoạn nhân đôi nhiễm sắc thể và dừng lại đến
khi thú cái thành thục về tính. Khi heo cái xuất noãn, noãn tiếp tục phát triển
đến MII và chờ thụ tinh. Trên chó, noãn rụng trước khi tạo thể cực thứ nhất. Sự
tạo thể cực thứ nhất hoàn tất khoảng 48 – 60 giờ sau khi xuất noãn. Nếu được

thụ tinh, noãn sẽ hoàn thành giảm phân và phát triển phôi. Quá trình noãn phát
triển đến metaphase gọi là quá trình trưởng thành. Gồm 4 sự kiện xảy ra theo
thứ tự như sau: nhiễm sắc thể (NST) cô đặc, nhân con biến mất, vỡ màng nhân,
hình thành trục.
(1) Cô đặc NST
Đây là bước đầu tiên và quan trọng để phân phối đúng số NST vào noãn
và thể cực. Hirano và cs (1994) phát hiện một protein gọi là condensin liên
quan đến sự cô đặc NST [11]. Condensin làm tăng cấu trúc siêu xoắn của DNA.
Sutani và cs (1999) khẳng định rằng condensin được phosphoryl hóa và được
hoạt hóa bởi MPF (maturation promoting factor) [32]. Tuy nhiên, theo Hong
Thuy Bui và cs (2004), giai đoạn này không liên quan đến MPF mà liên quan
đến histon H3 (Ser 10) kinase [12]. Như ta biết, đơn vị cơ bản của NST là
nucleosome tức một đoạn DNA khoảng 200 bp bao quanh protein histon; histon
gồm 2 trong số 4 phân tử H2A, H2B, H3, H4. Đầu N của histon H3 liên quan
đến khả năng giữ ổn định sợi NST, bị phosphoryl hóa ở vị trí serine 10,
Pha nang noãn
10
sự kiện này cần thiết cho NST cô đặc lại (Wei và cs, 1999; de la Barre và cs,
2000) [35],[7].
(2) Nhân con biến mất
Trong giai đoạn từ MI đến MII nhân không xuất hiện, nhưng xuất hiện
vào giai đoạn tiền nhân ngay sau khi tinh trùng xâm nhập. Chất nhân dạng sợi
được giải phóng vào dịch nhân lúc nhân con biến mất, sau đó vào dịch tế bào
lúc vỡ màng nhân. Quá trình này được điều khiển bởi sự phosphoryl hóa và
dephosphoryl hóa một protein trong nhân. Noãn heo lấy nhân vẫn có hiện tượng
cô đặc NST, màng nhân biến mất và hình thành trục (Fulka và cs, 2003) [10].
Do đó, có thể nhân trong noãn không quan trọng lắm, ít nhất vào giai đoạn
trưởng thành.
(3) Vỡ màng nhân GVBD (germinal vesical breakdown)
Màng nhân là màng đôi gồm 2 lớp lipid, lớp trong tạo bởi 3 mảnh

A,B,C, có ở động vật có xương sống, là vị trí kết hợp của MPF. GVBD xảy ra
khi 3 mảnh này biến mất; MPF hoạt hóa sẽ phosphoryl hóa các phân tử của
mảnh, phá vỡ trạng thái polymer thành dimer. Màng nhân bị vỡ, mạng lưới nội
chất gắn với màng nhân ngoài cũng vỡ.
(4) Tạo trục metaphase
Trong quá trình trưởng thành, trục được tạo hai lần, MI và MII. Trục MI
xuất hiện sau tác dụng của MPF và hoàn thành khi MAP kinase được hoạt hóa.
MPF phosphoryl hóa protein liên kết với vi ống, gồm α và β tubulin, do đó tăng
biến đổi của chúng.
Trong nguyên phân, hai trung thể nhân đôi và đi về hai cực tế bào. Vi sợi
tỏa ra từ hai cực và tìm bắt cặp NST chị em. Cyclin B gắn với vi ống, MAP
kinase gắn với cực. Giảm phân ở noãn khác với nguyên phân ở tế bào sinh
dưỡng: không có trung thể, giống tế bào thực vật. Trên heo, sau GVBD, NST
tạo dạng đám bụi, theo Motlik và Fulka mô tả đây là giai đoạn hướng cực
muộn. Vi ống bị cắt và tỏa xung quanh đám bụi này.
2.2.5.2. Các chất liên quan
(1) MPF
Theo Masui và Markert (1971), progesteron gây trưởng thành noãn khi
được cung cấp bên ngoài noãn, nhưng thất bại khi tiêm vào noãn [19]. Do đó,
11
chỉ tế bào chất gần bề mặt noãn nhận tín hiệu hormon. Noãn sau khi nhận tín
hiệu hormon đã tạo yếu tố thúc đẩy trưởng thành gọi là MPF (maturation
promoting factor hoặc M phase promoting factor).
MPF gồm một đơn vị thủy phân Cdc2 và đơn vị điều hòa cyclin B. MPF
xuất hiện trong giai đoạn cô đặc NST, biến mất nhân con. Trong giai đoạn vỡ
màng nhân, Cdc2 kinase kích hoạt, nhưng theo Kubelka và cs (2002), màng
nhân vẫn vỡ mà không có Cdc2 kinase dưới một số điều kiện đặc biệt, trong khi
đó MAP kinase xuất hiện với hoạt động yếu [13]. Giai đoạn tạo trục chỉ bắt đầu
khi Cdc2 kinase hoạt động và hoàn tất khi xuất hiện MAP kinase.
(2) MAPK (mitogen activated protein kinase)

MAPK là kinase khác liên quan đến trưởng thành noãn. Noãn GV chứa
MAPK dạng bất hoạt, được phosphoryl hóa và hoạt hóa ở giai đoạn GVBD.
2.3. IVM (In vitro maturation)
2.3.1 . Lịch sử IVM [23]
Năm 1935, Pincus và Enzmann tách noãn thỏ chưa trưởng thành khỏi sự
ức chế của nang noãn, cho phép noãn đạt tới trưởng thành khi nuôi cấy in vitro.
Năm 1983, Minato và Toyoda (Nhật) và Schroeder và Eppig (Mỹ) cho
rằng noãn chuột được trưởng thành in vitro có khả năng tạo phôi nếu được thụ
tinh.
Năm 1983, Lenz và cs cho rằng 39
o
C là nhiệt độ tối ưu để noãn bò
trưởng thành in vitro.
Năm 1988, Lu và cs cho ra đời con bê từ kỹ thuật chín noãn và thụ tinh
in vitro.
Năm 1996, Eppig và O’Brien cho ra đời chuột con sau khi dùng kỹ thuật
IVM, thụ tinh in vitro và chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ.
2.3.2 . Hệ thống IVM
Hệ thống nang noãn giữ cấu trúc không gian 3 chiều của nang, bảo đảm
hình thái và chức năng của nang để giữ noãn tăng trưởng và trưởng thành.
Bolamba và cs (1998) nuôi noãn chó trong đĩa phủ 0,6 % agar để tránh mất tế
bào hạt. Kết quả là noãn chó đạt MII khoảng 8,7 % ở nang xoang giai đoạn sớm
và 11,5 % ở nang xoang. Điều đó cho thấy rằng, nếu sự trao đổi các yếu tố
trong buồng trứng bị gián đoạn, khả năng giảm phân bị giảm [5].
12
Hệ thống giọt là hệ thống phổ biến nhất, noãn được nuôi trong giọt môi
trường phủ dầu khoáng. Cần quan tâm đến tỉ lệ giữa số noãn nuôi và thể tích
môi trường nuôi cấy. Nếu noãn quá nhiều, giảm phân bị ức chế do tế bào hạt tụ
tiết nhiều yếu tố ảnh hưởng giảm phân và ngăn cản chúng tăng kích thước, từ
đó giảm việc gãy các cầu nối. Sự gãy các cầu nối này sẽ gián đoạn sự truyền

thông tin giữa noãn và tế bào hạt và do đó sẽ tăng giảm phân [28]. Nếu ít noãn,
tỉ lệ giảm phân cũng giảm. Tỉ lệ giữa số noãn nuôi và môi trường nuôi tối ưu là
1:10. Trên chó tỉ lệ giảm phân là 16,2 % nếu nuôi 10 noãn /100 µl, và 4,6 %
nếu 5 noãn/100 µl [25].
Hệ thống tế bào đơn lớp tức là noãn được nuôi với tế bào ống dẫn trứng
đơn lớp. Bogliolo và cs (2002) nuôi noãn chó đạt 23,2 % sau 72 giờ [4].
Hệ thống nuôi với ống dẫn trứng, rất tốt vì gần giống điều kiện in vivo,
có nhiều tế bào hơn so với hệ thống tế bào đơn lớp, có sự tiếp xúc giữa lớp nhầy
và noãn, và một số yếu tố dinh dưỡng cũng như yếu tố tăng trưởng cần cho
trưởng thành. Luvoni và cs (2003) nuôi noãn chó đạt 31,9 % sau 30 giờ nuôi
[15].
2.3.3 . Yếu tố ảnh hƣởng IVM
2.3.2.1. Thời gian
Buồng trứng được thu từ lò mổ là nguồn tế bào trứng cung cấp cho IVM.
Thời gian vận chuyển đến phòng thí nghiệm ảnh hưởng rất lớn đến tế bào trứng.
Buồng trứng giữ ấm 30 – 37
o
C trong nước muối sinh lý vào khoảng 1 – 2 giờ.
Thời gian nuôi trứng rất quan trọng, trên heo nuôi 44 – 48 giờ. Trên chó còn
nhiều tranh cãi, noãn chó nuôi trong hệ thống giọt sau 72 giờ thoái hóa 74,3 %
và sau 96 giờ thoái hóa 94,8 % [16].
2.3.3.2. Nồng độ oxi và nhiệt độ
Oxi ảnh hưởng lớn đến trưởng thành nhân trên chuột và bò, mức oxi 5 %
tốt hơn 20 % trong không khí [9].
Nhiệt độ nuôi cấy dao động 37 – 39
o
C.
2.3.2.2. Môi trƣờng nuôi
Có hai loại môi trường nuôi cấy, môi trường đơn giản và môi trường
phức tạp. Môi trường đơn giản là dung dịch muối bổ sung nguồn năng lượng

13
như pyruvate, lactate, glucose, môi trường phức tạp thêm amino acid, vitamin,
và một số phân tử khác.
Môi trường đơn giản là mKRB (modified Krebs Ringer Bicarbonate),
SOF (synthetic oviductal fluid), môi trường phức tạp là TCM 199 (tissue cell
medium). Trong số các môi trường, TCM 199 là môi trường tốt nhất [31].
2.3.3.4. Sự trƣởng thành của động vật giết mổ
Các trứng thu từ heo trưởng thành có khả năng phát triển trong điều kiện
in vitro hơn so với trứng thu từ thú chưa trưởng thành. Noãn hoàn thành giảm
phân 24,6 % khi thu noãn ở pha nang noãn của chu kỳ động dục, 19,6 % ở thời
kỳ yên tĩnh, 16,4 % thời kỳ không động dục [27].
2.2.3.5. Stress
Yếu tố môi trường gây stress như nhiệt độ quá cao ảnh hưởng sinh sản
cá thể đực và cái. Nhiệt độ cao làm thay đổi tăng trưởng của nang noãn và chất
lượng noãn.
2.3.3.6. Dinh dƣỡng cá thể cái
Noãn nuôi trong môi trường dịch nang noãn thu nhận từ heo cái cho ăn
đầy đủ có tỉ lệ chín nhân cao hơn so với các noãn nuôi trong dịch nang noãn từ
heo cho ăn hạn chế.
2.3.3.7. Dầu khoáng hay dầu parafin
Noãn nuôi trong môi trường có phủ dầu khoáng sẽ bị lớp dầu hút
hormon steroid do tế bào hạt tụ tiết ra, đây là hormon quan trọng cho khả năng
phát triển của noãn. Do đó, sẽ kìm hãm sự trưởng thành nhân. Đối với dầu
silicon, Zn là chất nhiễm độc trong môi trường tạo giọt.
2.3.3.8. Kích thƣớc nang noãn
Kích thước nang ảnh hưởng rất lớn đến tỉ lệ thành công IVM, vì kích
thước khác nhau thì nang noãn ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Theo Mao
và cs (2003), tỉ lệ thành công IVM trên noãn heo là 13,8 %, 26,3 %, 33,4 % trên
các noãn có đường kính lần lượt là 2 – 3 mm, 3,1 – 5 mm, 5,1 – 7 mm [17].
2.3.3.9. Phƣơng pháp lấy noãn

Để lấy noãn ra khỏi nang, có nhiều cách, trong đó cắt và hút là hai cách
phổ biến nhất. Hút là dùng kim và syringe đâm vào nang và dùng lực hút để
14
hút noãn. Cách này thu noãn nhanh nhưng tỉ lệ noãn loại A và tỉ lệ thành công
thấp, vì làm mất lực liên kết giữa noãn và tế bào hạt tụ.
Cắt là dùng dao xẻ nang noãn và vuốt nhẹ để noãn tách ra khỏi liên kết
với tế bào của nang. Cách này chậm nhưng tỉ lệ noãn loại A và tỉ lệ thành công
cao. Nếu thu noãn heo bằng phương pháp hút, tỉ lệ trứng ở GVI thấp hơn
(45 %) so với cách cắt (78 %) [33].
2.3.4. Thành phần môi trƣờng IVM
2.3.4.1. Thành phần chính
(1) Nƣớc
Nước là thành phần chính cho mọi môi trường. Chất lượng của nước rất
quan trọng, nước có chất lượng tốt phải qua hệ thống chưng cất, siêu lọc nhằm
loại bỏ các chất khoáng và ion tồn tại trong nước. Hấp khử trùng để tiệt trùng.
(2) Nguồn năng lƣợng
Thực nghiệm cho thấy glucose, lactate, pyruvate là nguồn cơ chất năng
lượng ngoại sinh quan trọng nhất cho trứng và phôi. Tuy nhiên, tùy giai đoạn
phát triển mà trứng hay phôi có nhu cầu năng lượng với từng cơ chất khác nhau.
Thêm glucose vào môi trường chứa pyruvate (tỉ lệ 5,5 Mm : 1 mM) làm
tăng tỉ lệ MII trên noãn chuột [8]. Thêm 11 mM glucose vào môi trường nuôi
cấy không tăng tỷ lệ thành công IVM trên chó. Glucose không đủ cung cấp
năng lượng cho noãn chó cũng như noãn chuột, hoặc nồng độ glucose cao
(20 %) ảnh hưởng xấu lên phát triển nhân của noãn chó. Glucose tăng kích cỡ
tế bào hạt và trưởng thành nhân trên noãn bò.
Pyruvate cũng có vai trò thúc đẩy giảm phân, noãn chuột đạt MII
(71,9 %) khi nuôi với pyruvate cao hơn đối chứng (19,6 %) [18].
(3) Nguồn protein
Vai trò protein trong môi trường không chỉ là nguồn đạm có sẵn mà còn
là chất hấp thụ ion kim loại độc.

Huyết thanh
Một số loại huyết thanh thường được sử dụng là huyết thanh thai bò
(FCS - fetal calf serum), huyết thanh bò lên giống (ECS - estrus cow serum),
huyết thanh bò trưởng thành (BAS - bovine adult serum). FCS tăng khả năng
sống của noãn chó in vitro khi thêm > 10 % mà không có tác dụng gây trưởng
15
thành. Noãn trưởng thành với tỉ lệ cao (16,3 %) khi thêm huyết thanh chó lên
giống so với thêm huyết thanh chó không lên giống (11,1 %) [24].
Albumin huyết thanh
Nếu không bổ sung huyết thanh, ta có thể bổ sung protein dưới dạng
albumin. Albumin huyết thanh bò (BSA - bovine serum albumin) là loại thường
được sử dụng nhất. Vai trò BSA thể hiện ở số lượng yếu tố tăng trưởng liên kết
với protein và khả năng kìm hãm chất độc do oxy tự do gây ra và BSA không
kết hợp các yếu tố như steroid, vitamin, acid, cholesterol trong đáp ứng kích
thích hay ức chế. Do đó, BSA chỉ giúp noãn phát triển tới MI, không có khả
năng làm noãn phát triển hơn nữa.
Hai nguồn protein trên được sử dụng tùy vào mục đích. Theo kết quả
nghiên cứu của Zhang và Sirard, việc bố sung BSA trong môi trường nuôi noãn
không cung cấp khả năng tăng kích thước các tế bào hạt tụ và sự chín của noãn
so với khi bổ sung FCS. Những kết quả tương tự cũng được ghi nhận trên noãn
bò, chuột và thỏ. Qua đó cho thấy, trong FCS hiện diện một số yếu tố có khả
năng tái lập lại quá trình phân bào giảm nhiễm và cung cấp khả năng chín của
trứng ở điều kiện in vitro.
Theo nghiên cứu trên chuột, nếu bổ sung huyết thanh trong môi trường
nuôi noãn sẽ ngăn cản màng trong suốt khỏi sự cứng hóa. Ngược lại, trong môi
trường có bổ sung BSA, sự cứng hóa màng xảy ra và sự xâm nhập tinh trùng bị
cản trở. Do đó, BSA được sử dụng như biện pháp ngăn chặn sự xâm nhập đa
tinh trùng trong các qui trình thụ tinh in vitro.
(4) Muối
Đây là thành phần rất quan trọng trong môi trường nuôi noãn và phôi

nhằm bảo đảm áp suất thẩm thấu. Có nhiều ion chịu trách nhiệm cho sự điều
hòa này, nhưng chủ yếu là Na
+
, K
+
. Hàm lượng ion trong môi trường dựa trên
thành phần các chất khoáng trong huyết tương của máu.
(5) Hệ đệm
Hệ đệm thông dụng nhất là bicarbonate dưới 5 % CO
2
. Cơ chế đệm của
hệ này giống với hệ đệm sinh lý máu.


16
(6) Kháng sinh
Kháng sinh được sử dụng với mục tiêu hạn chế sự nhiễm khuẩn. Các loại
thường sử dụng là penicillin, streptomycin, gentamycin.
2.3.4.2. Các thành phần khác
(1) Hormon
Nhìn chung hầu hết các môi trường đều được bổ sung hormon, đặc biệt
LH/FSH. Có nhiều báo cáo cho rằng hormon trong môi trường nuôi noãn chín
không chỉ tạo thuận lợi cho quá trình phân bào giảm nhiễm mà còn ảnh hưởng
đến quá trình chín tế bào chất của noãn heo ở điều kiện in vitro. Ngược lại, một
số báo cáo cho rằng noãn heo có thể trải qua giai đoạn GVBD trong môi trường
không có hormon. Vì thế hormon cần được bổ sung hay không vào môi trường
nuôi trứng chín vẫn còn là vấn đề tranh luận.
Môi trường không có FSH giúp noãn vượt qua chướng ngại trong giảm
phân, nhưng không giúp trưởng thành hơn được. FSH giúp trưởng thành bằng
cách điều hòa cAMP, FSH giúp hạt tụ dãn nở.

Ngoài ra còn thêm estradiol và progesterone vào môi trường. Tỉ lệ MII
khi thêm estradiol (14,7 %) cao hơn so với đối chứng(1,5 - 8,2 %), khi thêm
progesterone cao hơn (10 %) so với đối chứng (4,8 %) [22].
(2) Chất chống oxy hóa
Các chất thêm vào môi trường có thể bị oxy hóa và tạo một số chất độc
ảnh hưởng noãn. Chất chống oxy hóa thường được thêm vào môi trường là β-
mercaptoethanol, chất này làm tăng glutathione trong tế bào. Tỉ lệ MII khi thêm
50 μM là 20 % so với đối chứng 0 % [21].
(3) Yếu tố tăng trƣởng
Yếu tố tăng trưởng thường được thêm vào môi trường nuôi, tăng tỉ lệ
MII (13,3 %) khi thêm 20 ng/ml EGF (epidermal growth factor), cao hơn so với
đối chứng (2,7 %) [21].
2.3.5. Vấn đề và triển vọng IVM [23]
Hiện nay một phương pháp mới kinh tế hơn để lấy noãn là dùng siêu âm,
có thể lấy từ bò thụ tinh và chưa thụ tinh. Kỹ thuật này thực hiện hàng tuần, có
thể thu hoạch trên một năm, mỗi lần thu 4 – 5 noãn. Vấn đề là dù thu hoạch
17
trứng bằng phương pháp gì đi nữa và mặc dù tỉ lệ phôi sau thụ tinh phân chia
cao, nhưng ít phôi phát triển tới phôi dâu.
Vấn đề của việc lấy noãn chưa trưởng thành từ buồng trứng không chỉ ở
việc tỉ lệ noãn chín, mà còn tuỳ thuộc vào chính noãn đó được qui định thành tế
bào chết (apoptosis) hay thành nang noãn tịt. Apoptosis bắt đầu trong nang và
sau đó ảnh hưởng đến noãn. Có bằng chứng cho thấy ngay cả noãn tốt lấy từ
nang noãn bò với tỉ lệ cao apoptosis, noãn vẫn mất khả năng trưởng thành
(Hendriksen và cs, 2000). Ứng dụng kiến thức này ta có thể dễ dàng tìm noãn
apoptosis bằng cách nhuộm sống trong trường hợp sớm, nhờ vậy có thể đảo
ngược tình thế. Trong một vài tế bào, hoạt hóa protein kinase C có thể ức chế
apoptosis sớm và do đó tăng tỉ lệ noãn chín (Zhiang và cs, 1998).
Một chất nữa ảnh hưởng đến quá trình trưởng thành là sterol. Chất này
ảnh hưởng giảm phân, chúng có thể có vai trò gián tiếp trong tác động của kích

dục tố lên việc trưởng thành của noãn (Byskov và cs, 2002 và Trafriri và cs,
2002).
Nếu IVM được ứng dụng trên vật nuôi thì có tiềm năng thật sự, nhưng
tình hình hiện nay trên chuột tỉ lệ thành công còn thấp, chủ yếu phát triển tới
giai đoạn phôi dâu rồi dừng (Smitz và Cortvrindt, 2002).
Gần đây (24/04/2005), cùng với việc cho ra đời thành công chú chó
Snuppy bằng kỹ thuật sinh sản vô tính, các nhà khoa học của Đại học quốc gia
Seoul hy vọng đây là bước khởi đầu của kỹ thuật tạo một số nội tạng thay thế
cho người để tránh phản ứng loại thải. Đây là bước đột phá lớn trong khoa học,
thao tác trên chó khó hơn các loài khác vì noãn chó chỉ trưởng thành 2 – 3 ngày
sau khi được xuất noãn (trích báo tuổi trẻ số ra ngày 05/08/2005).








18
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: từ 15/3/2005 đến 15/8/2005.
Địa điểm: phòng Sinh lý Sinh hóa và phòng Nuôi cấy tế bào, khoa Chăn nuôi Thú y,
trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
3.2. Nội dung khảo sát

Nội dung Chi tiết
Khảo sát buồng trứng heo - Trung bình số lượng hoàng thể, nang noãn ở các
mức đường kính nang (< 4 mm; 4 – 6 mm; > 6 mm)

trên một buồng trứng.
- Liên quan giữa chất lượng noãn thu được với
phương pháp lấy và kích thước nang noãn.
Khảo sát buồng trứng chó - Trung bình số lượng hoàng thể, số lượng nang
noãn ở các mức đường kính nang (< 2 mm; ≥ 2
mm) trên một buồng trứng.
- Liên quan giữa chất lượng noãn thu được với
chiều dài buồng trứng (< 2 cm; ≥ 2 cm) và với
đường kính nang noãn (< 2 mm; ≥ 2 mm).
- Tỉ lệ nang đa noãn trên một buồng trứng.
- So sánh chất lượng các loại trứng trong nang đơn
noãn và nang đa noãn.
Áp dụng IVM Trên chó nuôi trong môi trường giọt, trên heo nuôi
trong môi trường đĩa.
Nhuộm nhiễm sắc thể và thể
cực
Sử dụng thuốc nhuộm orcein.





19
3.3. Vật liệu
3.3.1. Vật liệu
Buồng trứng heo thịt thu tại lò mổ Nam Phong, quận Bình Thạnh, TP.Hồ Chí
Minh.
Buồng trứng chó ta thu tại lò mổ anh Phước, quận Thủ Đức, TP.Hồ Chí Minh.

Hình 3.1: Buồng trứng heo

(a) Buồng trứng dài 1 cm (b) Buồng trứng dài 1,5 cm (c) Buồng trứng dài 2 cm
Hình 3.2: Buồng trứng chó

3.3.2. Hóa chất (xem thêm mục pha môi trường)
Dung dịch NaCl 0.9%
Cồn 70
o

Môi trường DBPS
Môi trường HEPES
Môi trường TCM 199
Dầu khoáng
Một số chất phụ thêm vào môi trường nuôi trứng chín.
Một số hóa chất dùng để nhuộm.

3.3.3. Thiết bị
Kính hiển vi đảo ngược (Olympus)
Kính hiển vi soi nổi (Nikon SMZ800)

20
Tủ ấm CO
2

Tủ thao tác vô trùng

Hình 3.3: Tủ ấm CO
2


3.3.4. Dụng cụ
Bình giữ nhiệt
Kéo các loại
Khay
Becher 500 ml
Găng tay
Lọ cồn
Kẹp
Đầu tip các loại
Pipette Pasteur vô trùng
Micropipette
Phin lọc (0,2µm)
Đĩa petri nhựa (35 10 mm)
Đĩa petri thủy tinh
Lame và lamel



21
3.4. Phƣơng pháp

Qui trình chung cho quá trình nuôi noãn chín

Thu nhận buồng trứng
Cắt nang noãn
Tìm và rửa noãn
Nuôi noãn
Thu nhận noãn sau khi nuôi

Đánh giá bước 1
Nhuộm và đánh giá bước 2
22
3.4.1. Thu nhận buồng trứng tại lò mổ
Tiến hành thu nhận trực tiếp bộ phận sinh dục của thú cái ngay sau khi vừa
được mổ.
















3.4.2. Đánh giá buồng trứng heo

Bước đầu đánh giá số hoàng thể,
số nang noãn ở các mức kích
thước
Thực hiện cắt nang noãn
Lấy noãn bằng phương pháp xé
Phân loại noãn
Dùng kim và syringe hút noãn
Dùng kéo cắt 2 buồng
trứng ở 2 bên sừng tử cung
Rửa bằng cồn 90
o

Rửa bằng nước muối
0.9 %
Trữ trong nước muối sinh
lý ở 30 – 37
o
C
Vận chuyển nhanh về
phòng thí nghiệm
23
3.4.3. Đánh giá buồng trứng chó

Hình 3.4: Nang đa noãn trên chó

3.4.4. Phƣơng pháp chuẩn bị môi trƣờng
3.4.4.1. Trên heo
Chuẩn bị 7 đĩa petri nhựa đánh số thứ tự.
Đĩa 1 chứa 2 ml môi trường HEPES để rửa noãn
Đĩa 2, 3, 4, 5, 6, 7 mỗi đĩa chứa 200 μl FCS; 200 μl pyruvic acid; 200 μl
hMG; 1400 μl môi trường căn bản TCM199. Đĩa 2 và 3 để rửa noãn, đĩa 4
rửa vỏ nang noãn. Đĩa 5, 6, 7 mỗi đĩa chứa thêm 2 vỏ nang noãn, phủ dầu
khoáng kín bề mặt, cho vào tủ ấm trước 30 phút và nuôi một loại noãn có
đường kính nang khác nhau: < 0,4 mm; 0,4 – 0,6 mm; > 0,6 mm.





Đo kích thước buồng trứng
Cắt tách nang noãn, phân loại kích
thước
Thu noãn, phân loại A, B, C, và đánh
giá nang một noãn, nang đa noãn
24
3.4.4.2. Trên chó

Chuẩn bị 4 đĩa petri nhựa đánh số thứ tự.
Đĩa 1 chứa 500 μl ECS; 50 μl pyruvic acid; 50 μl estradiol; 50 μl FSH; 50
μl hCG; 4300 μl môi trường căn bản TCM 199. Hút 2ml dung dịch ở đĩa 1
cho vào đĩa 2. Đĩa 1 và 2 dùng để rửa noãn.
Các đĩa 3 và 4 dùng để nuôi noãn trong hệ thống giọt, mỗi đĩa chứa 100 μl
dung dịch từ đĩa 1 và phủ dầu khoáng. Để tránh giọt môi trường vỡ, hút 50
μl, phủ dầu khoáng, sau đó thêm 50 μl còn lại. Hai đĩa này dùng để nuôi 2
loại noãn có đường kính nang noãn < 2 mm và > 2 mm.
3.4.5. Tìm và rửa noãn






3.4.6. Chuyển noãn vào môi trƣờng nuôi
Chuyển các noãn sau khi rửa vào môi trường nuôi noãn chín tương ứng từng
mức đường kính nang. Trên heo mỗi đĩa chứa khoảng 30 – 50 noãn, chuyển thành
từng nhóm tránh phân tán, nuôi ở điều kiện 38,5
o
C, 5 % CO
2
, 40 – 44 giờ. Trên chó
mỗi đĩa chứa khoảng 10 noãn, nuôi ở điều kiện 37
o
C, 5 % CO
2
, 72 giờ.

Sau khi tách nang trong DPBS, đưa lên kính hiển vi độ phóng đại 40
lần
Tìm noãn loại A,B, dùng pipette Pasteur hút qua đĩa rửa đến khi
không còn mảnh vỡ tế bào
25
3.4.7. Thu nhận noãn sau khi nuôi

Hình 3.5: Noãn trƣớc và sau khi tách tế bào hạt tụ
3.4.8. Đánh giá phân loại noãn
Ta đánh giá và phân loại noãn trước khi nuôi và sau khi nuôi. Chất lượng noãn
trước khi nuôi khác nhau là do bản chất noãn hoặc do cách thu nhận noãn. Noãn được
thu hoạch phải có hình dạng tròn đều, noãn được phân làm 3 loại:
Loại A có nhiều lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh.
Loại B có một lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh.
Loại C không có hạt tụ bao quanh.

Chuyển noãn sau khi nuôi vào đĩa chứa DPBS
Thêm hyaluronidase 0,1 % vào để trong 15 phút
Dùng pipette Pasteur làm bong lớp tế bào hạt tụ xung quanh noãn
Đánh giá phân loại noãn
Chuyển noãn qua lame thực hiện bước nhuộm nhiễm sắc thể
(a) Noãn trước khi nuôi (a) Noãn sau khi nuôi