Đề tài sản xuất phenylalanine

Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

1

MỤC LỤC
1. TỔNG QUAN VỀ PHENYLALANINE 3
2. NGUYÊN LIỆU VÀ GIỐNG 5
2.1.

Nguyên liệu sản xuất phenylalanine
5
2.2.

Nguyên liệu phụ
7
2.3.

Vi sinh vật
9
2.3.1. Yêu cầu chọn giống 9
2.3.2. Chọn giống vi sinh vật 9
2.3.2.1. Đặc điểm của E. coli 10
2.3.2.2. Nguồn dinh dưỡng E. coli có thể sử dụng được 10
2.3.2.3. Tổng hợp phenylalanine ở E.coli 11
3. QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ 13
4. GIẢI THÍCH QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ 15
4.1.

Chuẩn bị nguyên liệu
15
4.1.1. Làm sạch 15

4.1.2. Nghiền 16
4.2.

Thủy phân
17
4.2.1. Hồ hóa 17
4.2.2. Dịch hóa 17
4.2.3. Đường hóa 17
4.3.

Chuẩn bị môi trường
18
4.4.

Nhân giống
19
4.5.

Lên men
19
4.6.

Tách sinh khối
21
4.7.

Trao đổi ion và nhả hấp phụ
22
4.8.

Cô đặc chân không
24
4.9.

Kết tinh
26
4.10.

Ly tâm tách tinh thể
27
4.11.

Sấy
28
4.12.

Đóng gói
28
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

2

5. SẢN PHẨM 29
6. THÀNH TỰU 31
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Công thức cấu tạo phenylalanine 3
Hình 2: Hạt bắp 5
Hình 3: Cấu tạo của hạt bắp 6
Hình 4: Vi khuẩn E.coli 10

Hình 5: Sơ đồ tổng quan về các phản ứng trong trung tâm trao đổi chất của E. coli 11
Hình 6: Con đường sinh tổng hợp acid amin vòng thơm trong E. coli 12
Hình 7: Sơ đồ khối quy trình lên men tạo phenylalanine 13
Hình 8: Sơ đồ khối quy trình tinh sạch phenylalanine 14
Hình 9: Thiết bị làm sạch 15
Hình 10: Cấu tạo của máy nghiền búa 16
Hình 11: Thiết bị thủy phân ở áp suất cao 18
Hình 12: Bốn giai đoạn trong sản xuất L-phenylalanine có tính chất khác nhau cần kiểm soát khác
nhau để thu được sản lượng cao trong thời gian ngắn nhất 20
Hình 13: Cấu tạo thiết bị lên men 20
Hình 14: Thiết bị lên men 20
Hình 15: Máy ly tâm siêu tốc loại ống 22
Hình 16: Các hạt nhựa trao đổi ion trong thiết bị trao đổi ion 23
Hình 17: Thiết bị trao đổi ion 24
Hình 18: Sơ đồ thiết bị cô đặc nhiều nồi 25
Hình 19: Thiết bị kết tinh bằng phương pháp làm lạnh 27
Hình 20: Thiết bị ly tâm lọc 27
Hình 21: Thiết bị sấy chân không 28
Hình 22: Phenylalanine ở dạng bột 29
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Hàm lượng phenylalanine trong một số thực phẩm (g/100g thực phẩm) 4
Bảng 2: Cấu tạo của hạt bắp so với khối lượng của toàn hạt 6
Bảng 3: Thành phần hóa học của hạt bắp 6
Bảng 4: Thành phần acid amin trong protein bắp (g acid amin/16g N) 7
Bảng 5: Nhiệt độ hồ hóa của bắp và một số tinh bột khác 7
Bảng 6: Thành phần dinh dưỡng trong 100g dịch chiết nấm m e n 7
Bảng 7: Chỉ tiêu sản phẩm phenylalanine 29


Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

3

1. TỔNG QUAN VỀ PHENYLALANINE
L-Phenylalanine (phenylalanine) là acid amin mạch vòng có một nhóm (−NH
2
) và một nhóm
(−COOH) trong phân tử, có công thức cấu tạo:



Hình 1: Công thức cấu tạo phenylalanine
Một số tính chất vật lý của phenylalanine:
- Công thức phân tử: C
9
H
11
NO
2

- Tinh thể màu trắng, bền ở nhiệt độ ở 20 - 25
o
C
- Phổ hấp thu: 280nm
- Điểm đẳng điện pI: 5,5
- Điểm nóng chảy: 270 - 275
o
C
- Tỷ trọng: 0,754
- Hòa tan trong H

2
O, không màu
- Độ hòa tan nước: 1-5g/100 ml ở 25ºC
- Tính ổn định: ổn định trong điều kiện bình thường. Không bền với các tác nhân ôxi
hóa mạnh.
Phenylalanine là một trong tám acid amin không thay thế, cơ thể người và động vật không
thể tự tổng hợp được mà phải lấy từ các nguồn bên ngoài. Đối với cơ thể người nhu cầu là
4,4g/người/ngày.
Từ những năm 1980 đến nay nhu cầu về phenylalanine ngày càng tăng. Trước đây người ta
sản xuất phenylalanine bằng phương pháp enzyme, từ cuối năm 1996 tại Trung Quốc
phenylalanine được sản xuất bằng phương pháp lên men.
Việc sản xuất phenylalanine trên thế giới chủ yếu tập trung ở Mỹ, Nhật, Hàn Quốc, Trung
Quốc, Tây Âu. Nhu cầu phenylalanine trên thế giới 3,06.108kg/năm
Phenylalanine được sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm và sản xuất aspartame.
L-phenylalanine có trong một số loại thực phẩm như thịt bò, cá, đậu nành, sữa, trứng…

Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

4

Bảng 1: Hàm lượng phenylalanine trong một số thực phẩm (g/100g thực phẩm)
Phenylalaninne food sources
Phenylalanine content
(grams/100 gram food)
Soybeans, mature seeds, raw
1,91
Cowpea, catjang, mature seeds, raw
1,39
Lentils, raw
1,38

Peanuts, all types, raw
1,34
Nuts, almonds
1,15
Chickpeas (garbanzo beans, bengal gram), mature seeds, raw
1,03
Flax seed, raw
0,96
Seeds, sesame butter, tahini, from raw and stone ground
kernels
0,94
Salami, Italian, pork
0,94
Beef, round, top round, separable lean and fat, trimmed to
1/8" fat, select, raw
0,88
Beef, top sirloin, separable lean only, trimmed to 1/8" fat,
choice, raw
0,87
Crustaceans, shrimp, mixed species, raw
0,86
Chicken, broilers or fryers, thigh, meat only, raw
0,78
Fish, salmon, pink, raw
0,78
Nuts, walnuts, english
0,71
Chicken, broilers or fryers, wing, meat and skin, raw
0,70
Egg, white, raw, fresh

0,69
Egg, whole, raw, fresh
0,68
Egg, yolk, raw, fresh
0,68
Sausage, Italian, pork, raw
0,48
Milk, sheep, fluid
0,28
Hummus
0,26
Pork, fresh, separable fat, raw
0,22
Milk, goat, fluid
0,16
Soy milk, fluid
0,15
Milk, whole, 3,25% milkfat
0,15
Asparagus
0,08
Snap beans, green, raw
0,07
Milk, human, mature, fluid
0,05
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

5

2. NGUYÊN LIỆU VÀ GIỐNG

2.1. Nguyên liệu sản xuất phenylalanine
Để sản xuất phenylalanine ta có thể sử dụng các nguồn nguyên liệu như: gạo, bắp, mật rĩ…
Trong bài này chúng tôi trình bày phương pháp sản xuất phenylalanine từ bắp.

Hình 2: Hạt bắp
Bắp có nguồn gốc từ Nam Mỹ, những khu vực nóng như Amazon, Peru và được coi như là
một loại cây trồng dùng cho chăn nuôi, sau đó được gieo trồng khắp nơi và trở thành một loại
lương thực thực phẩm chủ yếu ở nhiều nước.
Bắp được chia làm 6 loại:
- Bắp đá: hạt có màu vàng, trắng ngà hoặc có màu tím, hạt rất cứng, dùng để sản xuất bột
bắp.
- Bắp bột: hạt màu vàng, trắng, dùng để sản xuất bột bắp.
- Bắp răng ngựa: hạt có hình dạng giống răng ngựa, vàng, dùng sản xuất bột bắp.
- Bắp đường: vỏ nhăn nheo, màu vàng, trắng, hàm lượng đường, protein rất cao, chủ yếu
để sản xuất dịch đường glucose.
- Bắp rỗ: đầu hơi nhọn, hạt cứng, cũng dùng để sản xuất bột bắp.
- Bắp nếp: trắng đục, dạng đầu tròn, khi nấu chín dẻo dính.
2.1.1. Cấu tạo
Cấu tạo hạt bắp gồm có 5 thành phần chính là: tầng vỏ, lớp biểu bì, phôi, nội nhũ và mũ hạt.
Ngoài ra đầu dưới của hạt còn có gốc hạt liền với lõi.
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

6


Hình 3: Cấu tạo của hạt bắp
Bảng 2: Cấu tạo của hạt bắp so với khối lượng của toàn hạt
Các phần
của hạt bắp
Tỉ lệ về khối lượng

so với toàn hạt (%)
Tầng vỏ hạt
6 – 9
Lớp biểu bì
6 – 8
Nội nhũ
70 – 78
Phôi
8 – 15
2.1.2. Thành phần hóa học
- Vỏ hạt bắp chủ yếu là cellulose.
- Nội nhũ là phần tập trung hầu hết tinh bột bắp.
- Tinh bột là nguồn carbohydrate chính của bắp chứa khoảng 72% amylose, 28%
amylopectin.
- Protein trong bắp bao gồm zein chiếm khoảng 39%, globulin khoảng 10%, glutelin
khoảng 30% và albumin chiếm khoảng 7%.
Bảng 3: Thành phần hóa học của hạt bắp
Thành phần
hóa học
Vỏ hạt
( %)
Nội nhũ
( %)
Phôi
( %)
Protein
3,7
8,00
18,40
Chất béo

1,00
0,80
33,20
Cellulose
86,70
2,70
8,80
Tro
0,80
0,30
10,50
Tinh bột
7,30
87,60
8,30
Đường
0,34
0,62
10,80


Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

7

Bảng 4: Thành phần acid amin trong protein bắp (g acid amin/16g N)
(Theo Rinson và Hartwing 1977)

Amino acid
Tỷ lệ

Arginine
3,7
Histidine
2,4
Lysine
2,6
Tyrosine
3,6
Triptophane
0,6
Phenylalanine
4,1
Threonine
3,0
Methyonine
1,6
Cystine
1,3
Leucine
11,2
Valine
3,9
Glycine
2,9
Glutamic acid
14,1

Bảng 5: Nhiệt độ hồ hóa của bắp và một số tinh bột khác
Tinh bột tự nhiên
Nhiệt độ hồ hóa (t

0
C)
Bắp
62 – 73
Bắp nếp
62 – 72
Lúa miến
68 – 75
Lúa miến nếp
67 – 74
Gạo
68 – 74
Lúa mì
59 – 62
Sắn
52 – 59
Khoai tây
59 – 70

2.2. Nguyên liệu phụ
2.2.1. Dịch chiết nấm men
Bảng 6: Thành phần dinh dưỡng trong 100g dịch chiết nấm men
Thành phần
Hàm lượng
Protein
27,8g
Carbohydrate
11,8g
Nước
37g

Tro
23,4
Vitamin
Khoáng
Thiamin
9,7mg
Ca
86mg
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

8

Riboflavin
14,3mg
Fe
3,7mg
Vitamin B6
1,3mg
Mg
180mg
Folate
1010mcg
Phospho
104mg
Vitamin B12
0,5mcg
K
2600mg
Choline
65,1 mg

Na
3600mg


Zn
2,1mg


Cu
0,3mg


Se
18mcg

2.2.2. Tryptone
Nitơ tổng
11 -12 %
Nitơ a m i n
≥ 3,5%
Protein
≥ 70%
E.Coli
Không có
Samonella
Không có
pH
6,5 – 7,2
2.2.3. Tyrosine
Độ tinh khiết

98,5%
Cl
≤ 0,04%
SO
4

≤ 0,04%
Fe
≤ 30 ppm
Pb
≤ 15ppm
2.2.4. K
2
HPO
4

Màu sắc
Màu trắng
Độ tinh khiết
98%
P
2
O
5

≥ 40%
K
2
O
≥ 53%

pH
8,0 – 9,0
Pb
≤ 0,001%
As
≤ 0,0003%
F
≤0,002%
2.2.5. MnSO
4
.H
2
O
Độ tinh khiết
98%
Mn
≥ 31,8%
Fe
≤ 0,004%
Pb
≤ 15 ppm
As
≤ 5 ppm
Cd
≤ 10 ppm
Cl
≤ 0,005%
pH
5,0 – 6,5
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

9

2.2.6. MgSO
4
.7H
2
O
Độ tinh khiết
99,5%
Fe
≤ 0,0015%
Pb
≤ 0,0005%
Cl
≤ 0,01%
As
≤ 0,0004%
pH
6,5
2.3. Vi sinh vật
2.3.1. Yêu cầu chọn giống
- Khả năng sinh độc tố: không có.
- Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính: sản lượng phenylalanine tạo thành là lớn nhất.
- Khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng : dễ nuôi cấy, thích nghi tốt với môi trường,
tốc độ sinh sản nhanh.
- Điều kiện nuôi cấy: môi trường nuôi cấy dễ kiếm, rẻ tiền.
2.3.2. Chọn giống vi sinh vật
Trong thiên nhiên, có nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp phenylalanine, nhưng số
loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp nhiều phenylalanine để sử dụng trong qui mô sản

xuất công nghiệp là không nhiều. Ở điều kiện sống bình thường, lượng acid amin do chúng tự
tổng hợp được thường đủ đáp ứng yêu cầu bản thân nhưng trong điều kiện không bình thường
nào đó lượng các acid amin này có thể vượt xa nhu cầu bản thân và tích lũy lại trong tế bào
hay thoát ra ngoài môi trường. Hiện tượng này được gọi là siêu tổng hợp acid amin của vi sinh
vật. Để thu nhận phenylalanine từ vi sinh vật ở quy mô công nghiệp, cần phải tiến hành phân
lập giống, tuyển chọn, gây đột biến, chọn điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp. Chọn
loài vi sinh vật tích lũy được nhiều acid amin là khâu quan trọng nhất. Người ta đã xác định
nhiều loài vi sinh vật tổng hợp được phenylalanine với lượng khác nhau. Trong số đó đáng kể
là vi khuẩn và nấm men có thể tổng hợp được một lượng khá lớn phenylalanine, tiêu biểu là
các loài:
•
•


Corynebacterium glutamicum
•
•


Corynebacterium equi
•
•


Brevibacterium flavum
•
•


Escherichia coli

(E. coli)
•
•


Rhodotorula rubra
•
•


Bacillus lactofermentum
•
•


Candida boidinii
Hiện nay, người ta tạo ra được các chủng E.coli tái tổ hợp, đột biến có khả năng tổng
hợp phenylalanine cao. Các tác nhân gây đột biến có thể là tác nhân vật lý như tia bức xạ ion
hóa hay tác nhân hóa học, sử dụng các chất oxy hóa mạnh như etylen hoặc các chất gây đồng
vị phóng xạ mạnh. Qua khâu đột biến ta thu dược những chủng mới có khả năng tổng hợp
phenylalanine cao như là E.coli đột biến dị dưỡng tyrosine. Trong bài này chúng tôi sẽ giới
thiệu việc sử dụng thể E.coli đột biến dị dưỡng tyrosine để sản xuất phenylalanine.
Escherichia coli đột biến dị dưỡng tyrosine (E.coli W3110).
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

10

2.3.2.1. Đặc điểm của E. coli
Vực (domain): Bacteria
Ngành (phylum): Proteobacteria

Lớp (class): Gamma Proteobacteria
Bộ (ordo): Enterobacteriales
Họ ( familia): Enterobacteriaceae
Chi (genus): Escherichia
Loài (species): E. coli
- Gram âm, kỵ khí tùy tiện, không sinh bào tử.
- Tế bào hình que dài khoảng 2 μm, đường kính
0,5 μm, thể tích tế bào 0,6 – 0,7 μm
3
.
- Là vi sinh vật ưa ấm, có thể sống trong khoảng
nhiệt độ 7
0
C-50
0
C, nhiệt độ gây chết 60
0
C-
65
0
C trong 1 phút
- Topt 37
0
C, pH = 4,4 - 8,5
- Độ ẩm tối thiểu: a
w
= 0,91
- Có thể sử dụng nhiều cơ chất khác nhau.
- Sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí hay kỵ khí dùng nhiều cặp oxy hóa khử khác nhau,
bao gồm s ự oxi hóa pyruvic acid, formic acid, hydroge, amino acids và sự giảm cơ chất

như oxygen, nitrate, dimethyl sulfoxide và trimethylamine N-oxide.
2.3.2.2. Nguồn dinh dưỡng E. coli có thể sử dụng được
 Nguồn cacbon:
Glucose, lactose, mannitol, maltose, fructose, galactose, sorbitol, glycerol, acid cinamic.
 Nguồn nitơ:
 Vô cơ: ammonia, nitrate, NH
4
Cl, (NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
2
-H-citrate
 Hữu cơ: peptone, L-asparagine, adenine, adenosine, agmatine, L- and D-alanine,
allantoin (anaerobically), [gamma]-aminobutyrate, arginine, aspartate, cytidine,
cytosine, glucosamine, glutamine, glutamate, glycine, ornithine, proline, putrescine, L-
and D-serine, threonine.
 Nguồn khoáng:
KH
2
PO
4
, K
2
HPO

4
, Na
2
HPO
4
.12H
2
O, MgSO
4
.7H
2
O, CaCl
2
, FeSO
4
.7H
2
O, ZnCl
2
.7H
2
O,
MnSO
4
, CuSO
4
.5H
2
O, Mo
7

O
2
.4H
2
O, Co(NO
3
)
 Các chất sinh trưởng:
Folic acid, Biotin, Pyridoxine (B6), Riboflavin (B2), Thiamine (B1), Vitamin K,
Vitamin B12, Nicotinic acid, Pantothenic acid, thymine.

Hình 4: Vi khuẩn E.coli
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

11

2.3.2.3. Tổng hợp phenylalanine ở E.coli

Hình 5: Sơ đồ tổng quan về các phản ứng trong trung tâm trao đổi chất của E. coli
Chữ viết tắt được sử dụng:
PTS: phosphoenolpyruvate phosphotransferase system Tkt: transketolase
G6Pdh:glucose-6-phosphate dehydrogenase Tal: transaldolase
Pgi: phosphoglucose isomerase Ppc: PEP-carboxylase
Pyk: pyruvate kinase Pyk: PEP carboxykinase
Pps: PEP synthetase G6P: glucose 6-phosphate
F6P: fructose 6-phosphate GA3P: glyceraldehyde 3-phosphate
PEP: phosphoenolpyruvate OAA: oxaloactetate
6P-Gnt: 6-phosphogluconate Rul5P: ribulose 5-phos-phate
Rib5P: ribose 5-phosphate Xul5P: xylulose 5-phosphate
Sed7P: sedoheptulose 7-phosphate E4P: erythrose 4-phosphate

Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

12


Hình 6: Con đường sinh tổng hợp acid amin vòng thơm trong E. coli
Để chỉ ra các loại quy định, các loại kí hiệu được sử dụng:
– – –,kiểm soát phiên mã và dị lập thể bởi acid amin mạch vòng criptional;
· · · , kiểm soát dị lập thể; —, kiểm soát phiên mã.
Chữ viết tắt được sử dụng: ANTA, anthranilate; aKG, a-ketoglutarate; CDRP, 1-(o-carboxyphenylamino)-1-
deoxyribulose 5-phosphate; CHA, chorismate; DAHP, 3-deoxy-d-arobino-heptulosonate 7-phosphate;
DHQ, 3-dehydroquinate; DHS, 3-dehydroshikimate; EPSP, 5 enolpyruvoylshiki-mate 3-phosphate; E4P,
erythrose 4-phosphate; GA3P, glyceraldehyde 3-phosphate; HPP, 4-hydroxyphenlypyruvate, I3GP, indole
3-glycerol- phosphate; IND, indole; l-Gln, l-glutamine; l-Glu, l-glutamate; l-Phe, l-phenylalanine; l-Ser, l-
serine; l-Trp, l-tryptophan; Tyr, l-tyrosine; PEP, phosphoenolpyruvate; PPA, prephenate; PPY,
phenylpyruvate; PRAA, phosphoribosyl anthranilate; PRPP, 5-phosphoribosyl-a-pyrophosphate; Pyr,
pyruvate; SHIK, shikimate; S3P, shikimate 3-phosphate.

Ở thể E.coli bình thường tyrosine được tổng hợp đồng thời với phenylalanine. Ở thể đột
biến dị dưỡng tyrosine con đường tổng hợp tyrosine sẽ không có.
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

13

3. QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ

Chuẩn bị nguyên liệu
Thủy phân
Chuẩn bị môi trường
Lên men
Dịch sau
lên men
Nguyên liệu

Giống
Enzyme
amylase
Glucose,
tyrosine
Nhân giống
Hình 7: Sơ đồ khối quy trình lên men tạo phenylalanine
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

14

Tách sinh khối
Trao đổi ion
Cô đặc chân không
Kết tinh
Dịch sau lên
m e n

NH
3

H
2
SO
4

Ly tâm
Sấy
Đóng gói
Phenylalanine
Hình 8: Sơ đồ khối quy trình tinh sạch phenylalanine
Sinh khối
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

15

4. GIẢI THÍCH QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ
4.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình thủy phân. Bắp được đem l à m s ạch và nghiền để tạo
kích thước nhỏ giúp cho quá trình thủy phân xảy ra dễ dàng.
4.1.1. Làm sạch

 Mục đích:
Chuẩn bị: tách tạp chất ra khỏi nguyên liệu, tạo nguồn nguyên liệu sạch để đưa vào sản
xuất.
 Các biến đổi:
 Vật lý:
- Có sự thay đổi về tỉ trọng.
- Khối lượng nguyên liệu giảm do tạp chất được tách ra.
 Thiết bị:
 Phương pháp thực hiện: bắp được đưa qua hệ thống làm sạch để lọai bỏ tạp chất.
 Cấu tạo:
- Cơ cấu nạp liệu.
- Quạt hút: hút các tạp chất nhẹ, rác nhuyễn.
- Sàng: loại bỏ các tạp chất nặng như đá, sỏi bị lẫn vào.

Hình 9: Thiết bị làm sạch
 Nguyên tắc hoạt động: nguyên liệu được đưa vào từ cửa cấp liệu đi xuống hệ thống sàng.
Trên đường đi, các tạp chất nhẹ như mạt bắp, bụi, rác nhuyễn… được quạt hút hút ra
ngoài. Hệ thống sàng bao gồm các sàng có kích thước khác nhau được sắp xếp thứ tự từ
trên xuống theo kích thước lỗ giảm d ần để phân riêng tạp chất lớn (đá, sỏi, cùi bắp ), các
hạt chính và tạp chất bé (đất, cát…).
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

16

4.1.2. Nghiền
 Mục đích:
Quá trình nghiền nhằm mục đích phá vỡ màng tế bào, đồng thời giải phóng tinh bột ra
khỏi tế bào. Chuẩn bị cho quá trình thủy phân tinh bột.
 Các biến đổi:
 Vật lý:

- Thay đổi kích thước của nguyên liệu.
- Tế bào tinh bột bị phá vỡ, giải phóng tinh bột dưới dạng hạt có kích thước nhỏ.
 Hoá sinh:
- Khi vỏ tế bào bị phá vỡ, các enzyme trong tế bào cũng được giải phóng và có điều
kiện hoạt động, nhất là các enzyme thủy phân tinh bột.
 Thiết bị:
Bắp ở dạng nguyên hạt khó bị thủy phân để tạo thành dịch đường, do vậy bắp cần phải
được nghiền thật nhỏ, để phá vỡ cấu trúc tinh bột tạo điều kiện cho sự hút nước, trương nở hạt
tinh bột, tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc với hạt tinh bột, thủy phân tinh bột thành dịch
đường, có thể chọn thiết bị nghiền búa, nghiền trục…để thực hiện quá trình này. Trong khuôn
khổ bài này giới thiệu máy nghiền búa. Dưới đây là hình ảnh và cấu tạo đơn giản của thiết bị
nghiền búa.

Hình 10: Cấu tạo của máy nghiền búa
 Nguyên tắc hoạt động: vật liệu trong máy nghiền búa được nghiền nhỏ, do sự va đập của
búa vào vật liệu và chà xát vật liệu giữa búa và thành máy. Các hạt vật liệu sau khi nghiền
có kích thước nhỏ hơn lỗ lưới phân loại sẽ đi ra ngoài, các hạt có kích thước lớn hơn lỗ
lưới phân loại sẽ được tiếp tục nghiền.
 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nghiền:
- Tính chất nguyên liệu: kích thước của nguyên liệu, độ cứng, độ ma sát, cấu trúc,
độ ẩm, tính mẫn cảm nhiệt của nguyên liệu.
- Thiết bị: lực tác dụng lớn thì quá trình nghiền nhanh, kích thước lỗ sàng càng bé
thì mức độ nghiền càng mịn.
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

17

4.2. Thủy phân
Gồm 3 quá trình: hồ hóa, dịch hóa, đường hóa.
4.2.1. Hồ hóa

 Mục đích:
Tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình dịch hóa tiếp theo.
 Các biến đổi:
 Vật lý:
- Dưới tác dụng của nhiệt, độ nhớt của dung dịch tăng và đạt giá trị cực đại .
- Hạt tinh bột trương nở cực đại.
- Thể tích hạt tinh bột cực đại.
 Hóa lý:
- Khả năng hòa tan tăng.
- Dung dịch trở nên đồng nhất.
- Ở nhiệt độ cao, khả năng hút nước của hạt tinh bột càng mạnh.
 Sinh học: không có những biến đổi quan trọng, một số vi sinh vật bị ức chế.
 Hóa học: có sự tạo thành liên kết hydro với nước.
4.2.2. Dịch hóa
 Mục đích:
Phá vỡ cấu trúc của các hạt tinh bột giải phóng ra các sợi tinh bột dạng riêng lẻ.
 Các biến đổi:
 Vật lý:
- Giảm độ nhớt.
- Tăng diện tích tiếp xúc cho hạt tinh bột.
 Hóa lý: tăng khả năng hòa tan cho hạt tinh bột.
 Hóa học: liên kết hydro với nưóc bị phá vỡ.
 Sinh học: vi sinh vật có thể bị ức chế hay tiêu diệt.
4.2.3. Đường hóa
 Mục đích:
Tạo hỗn hợp gồm các đường đơn giản (glucose) thuận lợi cho quá trình lên men.
 Các biến đổi:
 Vật lý:
- Tăng hàm lượng chất khô.
- Tăng khả năng truyền nhiệt.

- Giảm độ nhớt.
 Hóa lý: tăng khả năng hòa tan.
 Hóa sinh: có sự tác dụng của α-amylase và gluco-amylase lên các mạch amylose và
amylopectin tạo thành hỗn hợp sản phẩm chủ yếu là glucose và các dextrin mạch ngắn.
 Hoá học: có thể xảy ra phản ứng Maillard tạo thành các hợp chất làm sậm màu dung dịch.
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

18

 Phương pháp thực hiện và thiết bị:
Sử dụng phương pháp hồ hóa và dịch hóa ở áp suất cao
- Phối trộn nguyên liệu và nước theo tỷ lệ 1/3(m/m), chỉnh pH thích hợp.
- Gia nhiệt đến 140-160
o
C (4,5-6 bar), thời gian gia nhiệt 30-45 phút. Thời gian dừng
40-60 phút.
- Làm nguội đến 90
o
C bổ sung chế phẩm α-amylase chịu nhiệt.
- Làm nguội đến 60
o
C, đường hóa bằng chế phẩm enzyme thích hợp.

Hình 11: Thiết bị thủy phân ở áp suất cao
4.3. Chuẩn bị môi trường
- Mục đích: bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật, chỉnh pH.
- Môi trường lên men:
Glucose
20 g/l
Tyrosine

0,3g/l
Mg
2
SO
4
.7H
2
O
20 mg/l
K
2
HPO
4

0,25 g/l
MnSO
4

0,05 g/l
Tryptone
5 g/l
Dịch chiết nấm m e n
7 g/l
- Môi trường sau khi được phối trộn sẽ được tiệt trùng.

Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

19

4.4. Nhân giống

 Mục đích: tăng số lượng vi sinh vật, chuẩn bị cho quá trình lên men.
 Biến đổi:
- Sinh học: Số lượng tế bào tăng lên (tăng sinh khối).
- Hóa sinh: Các phản ứng trao đổi chất của vi sinh vật.
 Phương pháp thực hiện: Chọn môi trường lên men có thành phần chính là glucose.
Thành phần môi trường:
- Glucose: 15 g/l
- Mg
2
SO
4
.7H
2
O: 20 mg/l
- K
2
HPO
4
: 0,25 g/l
- MnSO
4
: 0,05 g/l
- Tyrosine: 0,3 g/l
- Dịch chiết nấm men: 10 g/l
- Tryptone: 5 g/l
 Thông số công nghệ:
Điều kiện nhân giống: hiếu khí
- pH: 6,5 (dùng dung dịch NH
3
để điều chỉnh)

- Nhiệt độ: 37
o
C
- Thời gian: 35 - 45h
- Tỷ lệ giống cấy: 10%
Sau khi nhân giống xong cho toàn bộ canh trường vào bồn lên men.
4.5. Lên men
 Mục đích:
Chế biến: tạo điều kiện cho vi sinh vật sinh tổng hợp phenylalanine.
 Biến đổi:
 Vật lý: nhiệt độ lên men tăng do quá trình trao đổi chất sinh năng lượng.
 Hóa lý: thay đổi độ nhớt, tạo những hợp chất keo.
 Hóa học: hà m l ư ợng cơ chất và thành phần dinh dưỡng giảm x u ống, hàm lượng
phenylalanine tăng lên.
 Vi sinh: lượng sinh khối tăng lên, vi sinh vật sinh tổng hợp phenylalanine.
 Phương pháp thực hiện: lên men tĩnh có bổ sung cơ chất.
Thực hiện lên men hiếu khí, trong quá trình lên men có bổ sung glucose và tyrosine.
Bổ sung glucose vào khi hàm lượng glucose trong môi trường giảm xuống tới mức 5g/l,
dùng dung dịch có hàm lượng glucose 700 g/l bổ sung vào để giữ nồng độ glucose trong
dung dịch ở mức 5g/l . Trong quá trình trao đổi chất, E. coli sẽ sử dụng nguồn cacbon để
tạo ra 4 sản phẩm chính là: sinh khối, phenylalanine, acid acetic và CO
2
. E.coli sẽ có xu
hướng sản xuất ra nhiều acid acetic khi môi trường lên men có hàm lượng đường cao. Tuy
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

20

nhiên nếu như lượng đường mà quá thấp thì tỷ lệ đường chuyển thành CO
2

sẽ lớn. Do đó
trong quá trình lên men ta chỉ giữ nồng độ đường glucose tối thích là 5 g/l.

Hình 12: Bốn giai đoạn trong sản xuất L-phenylalanine có tính chất khác nhau
cần kiểm soát khác nhau để thu được sản lượng cao trong thời gian ngắn nhất
- Tyrosine được bổ sung ở mức 150 mg/h bằng cách hòa dung dịch 25 g/l tyrosine vào
dung dịch 5% NH
3
(pH =11) để tránh hiện tượng tyrosine kết tinh. Do E. coli dị dưỡng
tyrosine là không thể tự tổng hợp được tyrosine nên ta cần bổ sung tyrosine vào môi
trường lên men. Tuy nhiên chỉ cần bổ sung ở lượng tối thiểu để vi sinh vật đủ sử dụng.
 Thiết bị: Sử dụng thùng lên men có cánh khuấy.

Hình 13: Cấu tạo thiết bị lên men

Hình 14: Thiết bị lên men
Thiết bị lên men có dạng hình trụ đứng, bên trong có các cánh khuấy để đảo trộn môi
trường và cung cấp O
2
cho quá trình lên men, có lớp vỏ áo bên ngoài để điều chỉnh nhiệt độ
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

21

trong quá trình lên men, có ống dẫn và thoát khí, có đường dẫn để bổ sung cơ chất, cửa nhập
liệu, các cảm biến để đo nhiệt độ, pH trong quá trình lên men, đường tháo sản phẩm ở đáy
thiết bị.
 Thông số công nghệ:
- Thời gian lên men: 60h/mẻ hoặc lượng tế bào trong dịch lên men lên tới OD
620

= 80
- pH: 6,5
- Nhiệt độ: 37
o
C
- Hàm lượng phenylalanine tạo thành: 20,8 g/l
- Tỷ lệ giống cấy: 10triệu TB/ml
4.6. Tách sinh khối
Dịch sau lên men có chứa phenylalanine, sinh khối E. coli, cơ chất sót, các chất khoáng và
một số sản phẩm phụ trong quá trình lên men.
 Mục đích:
Khai thác làm giàu cấu tử phenylalanine trong dịch sau lên men. Quá trình được thực hiện
nhằm tách bỏ xác vi sinh vật và một phần tạp chất khỏi dung dịch sau lên men. Chuẩn bị
cho quá trình trao đổi ion thu nhận phenylalanine.
 Các biến đổi:
 Vật lý: nhiệt độ dung dịch tăng, độ nhớt giảm .
 Hóa lí: có sự tách pha (pha lỏng và pha rắn).
 Hóa học: hầu như không thay đổi gì về thành phần hóa học nhưng nồng độ các chất bị
thay đổi. Phenylalanine cũng bị tổn thất trong quá trình này.
 Vi sinh: 99% vi sinh vật bị tách.
 Phương pháp thực hiện:
Ta có thể sử dụng nhiều phương pháp để tách sinh khối như: lọc, ly tâm, ly tâm lọc, ly
tâm lắng. Trong bài sẽ sử dụng phương pháp tách sinh khối bằng thiết bị ly tâm lắng.
 Thiết bị:
 Cấu tạo: Máy ly tâm siêu tốc loại ống
Ðây là loại máy có rotor nhỏ và dài để phân riêng các huyền phù và nhũ tương. Ðường
kính của roto vào khoảng 200 mm, tỉ lệ giữa chiều dài roto với đường kính khoảng 5-7. Đầu
trên của roto (nắp rotor) có một lỗ để nước trong đi ra, còn bã được giữ lại trong thành rotor
và được tháo ra bằng tay.
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

22


Hình 15: Máy ly tâm siêu tốc loại ống
 Nguyên lý hoạt động:
Khi rotor quay với tốc độ cao tạo ra lực li tâm làm dung dịch trong ống ép sát vào vách
ống. Phần lỏng cùng với các cấu tử hòa tan sẽ ra ngoài qua ống dẫn còn chất rắn là xác vi
sinh vật bị giữ lại bên trong ống và được tháo ra sau.

 Các yếu tố ảnh hưởng:
- Độ nhớt: cao thì hiệu suất quá trình giảm.
- Nhiệt độ: nhiệt độ cao làm giảm độ nhớt, hiệu suất của quá trình tăng.
 Thông số công nghệ:
Tốc độ vòng quay 1000 vòng /phút.

4.7. Trao đổi ion và nhả hấp phụ
 Mục đích:
Khai thác: thu nhận phenylalanine bằng cột trao đổi ion.
 Các biến đổi:
 Vật lý: các phân tử dung môi và chất tan dịch chuyển vào bên trong cấu trúc vi xốp của
các hạt nhựa theo nguyên tắc thẩm thấu, có lực hút tĩnh điện giữa các hạt tích điện âm
trong cột và các ion dương trong dịch lên men.
 Hóa học: thay đổi thành phần hóa học của mẫu nguyên liệu trước và sau khi xử lý.
 Hóa lý: các cation bị hấp phụ vào cột trao đổi ion, một số cấu tử không tích điện cũng có
thể bị hấp phụ trong mao dẫn của các hạt nhựa.

Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

23

 Phương pháp thực hiện:
Acid hóa dịch lên men bằng H
2
SO
4
về pH 4,0 , khi đó phenylalanine sẽ chuyển sang
dạng cation hóa trị I. Cho dịch sau khi acid hóa qua cột nhựa trao đổi ion sulfo cationit. Dùng
nước tách rửa các tạp chất khỏi cột sau đó tiến hành nhả hấp phụ tách phenylalanine bằng
dung dịch amoniac 0,5- 5%.
 Thiết bị:
 Nguyên lý hoạt động:
Thiết bị trao đổi ion được hoạt động dựa trên nguyên tắc mẫu lỏng tiếp xúc với một pha
rắn. Trên bề mặt của pha rắn có chứa sẵn các ion. Một số ion trong mẫu lỏng sẽ thế chỗ các
ion của pha rắn và ngược lại. Như vậy các ion của mẫu lỏng và của pha rắn đã hoán đổi vị trí
cho nhau.
 Cấu tạo:
Thiết bị có dạng hình trụ đứng, đáy cầu được chế tạo bằng thép không rỉ, phía trên đáy là
tấm l ư ới đỡ, cho các hạt nhựa trao đổi ion lên tấm lưới này. Dưới cùng tại cửa thoát là một
tấm lưới lọc để ngăn cản sự cuốn trôi các hạt nhựa ra khỏi thiết bị. Phía bên trên các hạt nhựa
là ống phân phối nguyên liệu. Sản phẩm được lấy ra tại cửa đáy.

Hình 16: Các hạt nhựa trao đổi ion trong thiết bị trao đổi ion
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

24


Hình 17: Thiết bị trao đổi ion
 Các yếu tố ảnh hưởng

- Bản chất của ionit: các tương tác của các hạt nhựa với ion sẽ càng cao khi hóa trị
của ion càng lớn.
- Bản chất của mẫu nguyên liệu: thành phần và hàm lượng các cấu tử tích điện và
không tích điện có trong mẫu, giá trị của các điện tích, pH, lực ion…
- Nhiệt độ: khi tăng nhiệt độ thì sự khuếch tán của các cấu tử trong dung dịch sẽ
nhanh hơn. Tuy nhiên nhiệt độ cao có thể gây ra những phản ứng phụ không mong
muốn, đồng thời làm tăng chi năng lượng cho quá trình xử lý.
- Thời gian: lưu lượng dòng thực phẩm đi qua cột ionit quá ngắn thì phản ứng trao
đổi ion không hoàn toàn.
 Thông số công nghệ:
- Nhiệt độ: 45
0
C
- Thời gian: 30 – 45 phút
- Tổn thất phenylalanine: 14 – 16%
- pH: 4,0
4.8. Cô đặc chân không
 Mục đích:
Khai thác: làm giàu cấu tử phenylalanine trong dung dịch.
Chuẩn bị: chuẩn bị cho quá trình kết tinh phenylalanine.
 Các biến đổi:
 Vật lý :có nhiều biển đổi xảy ra trong nguyên liệu như hàm lượng chất khô tăng, nhiệt độ
tăng, độ nhớt tăng, tỉ trọng tăng, nhiệt độ sôi dung dịch tăng…
 Hóa học: lượng nhỏ phenylalanine bị oxi hóa.
Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

25

 Hóa lý: nước bốc hơi.
 Vi sinh: vi sinh vật còn sót trong dung dịch sau quá trình trao đổi ion có thể bị ức chế

hoặc bị tiêu diệt.
 Phương pháp thực hiện:
Tiến hành cô đặc dung dịch trong nồi chân không ở nhiệt độ thấp, áp suất thấp (áp suất
chân không)
Ưu điểm :
- Dùng hệ thống cô đặc chân không sẽ làm giảm nhiệt độ sôi của dung dịch.
- Dùng hệ thống nhiều cấp sẽ tiết kiệm đ ược nhiên liệu do tận dụng được hơi thứ từ nồi
trước để gia nhiệt cho nồi sau.
 Thiết bị:
 Cấu tạo: Sử dụng thiết bị cô đặc chân không nhiều cấp.
Cấu tạo của nồi cô đặc: thiết bị có dạng hình trụ, đáy cầu. Phía trên đỉnh là cửa thoát hơi
thứ, xung quanh thiết bị có lớp vỏ áo để gia nhiệt. Hệ thống tạo áp suất chân không đuợc kết
nối với thiết bị tại đỉnh nồi. Quá trình cô đặc được thực hiện trong điều kiện áp suất chân
không.
 Nguyên lý hoạt động:
- Cô đặc bằng nhiệt ở áp suất chân không là quá trình làm bay hơi nước trong thực
phẩm ở điều kiện áp suất chân không dưới tác dụng của nhiệt.
- Dung dịch được cho vào buồng đốt để gia nhiệt, sau đó được chuyển sang buồng
bốc có áp suất chân không để bốc hơi nước. Áp suất chân không trong buồng bốc
được hình thành bằng 1 bơm chân không.

Hình 18: Sơ đồ thiết bị cô đặc nhiều nồi