Hóa sinh biochemistry

Trường ĐHKH-Huế
Khoa Sinh Học
Báo cáo

Huế, 11/2010
Bài 1. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ
I. Theo phương pháp Bertrand
Tất cả các nhóm aldehyd hay nhóm ceton tự do trong những điều
kiện xác định có khả nămg khử Cu
2+
thành kết tủa Cu
2
O.
Vì vậy, phương pháp này dùng để định lượng các loại aldose,
cetose, các disaccharide có tính khử.
Khi dùng phương pháp này, muốn có kết quả tốt, cần phải đảm bảo
các điều kiện sau:
Loại Protein và các chất khác ra khỏi dung dịch cần nghiên cứu
bằng cách dùng dung môi thủy ngân, base acetate, hỗn hợp CuSO
4
và
NaOH (1V
CuSO4 8%
1V
NaOH 1.25%
)
THời gian đun 3 phút kể từ khi có bọt khí đầu tiên xuất hiện.
Hàm lượng đường trọng dịch nghiên cứu lấy ước tính khoảng không
quá 160mg tốt nhất 10-90mg. pha loãng mẫu nếu quá đặc.
Phải bảo vệ kết tủa Cu
2

O không bị oxyl hóa bởi lớp không khí bề
mặt.
- Nguyên tắc:
Khi đun sôi dịch kiềm của Cu
2+
với dung dịch đường sẽ tạo thành
kết tủa Cu
2
O, sau khi rửa bằng nước, hòa tan kết tủa Cu
2
O bằng
Fe
2
(SO
4
)
3
, Cu
2+
sẽ chuyển thành Cu
+
và Fe
3+
sẽ chuyển thành Fe
2+
.
Chuẩn độ Fe
2+
bằng dd KMnO
4

0.1N biết lượng KMnO
4
đã dùng để
tích ra lượng đồng. Tử lượng đồng ấy, đối chiếu bảng cho sẵn sẽ tính
được lượng đường trong mẫu.
Các phản ứng như sau:
Cu
2+
Cu
+
Phản ứng Fehling

Phản

ứng kết tủa Cu
2
O:
Cu
2
O + Fe
2
(SO
4
)
3
+ H
2
SO
4
2CuSO

4
+ 2FeSO
4
+ H
2
O
Phản ứng chuẩn độ bằng dd KMnO4 0.1N
10 FeSO
4
+ 2KMnO
4
+ H
2
SO
4
5Fe
2
(SO
4
)
3
2. Đối tượng, hóa chất, thiết bị
2.1 Đối tượng
Quả Hồng
2.2 Hóa chất
Dung dịch Fehling
Fe
2
(SO
4

)
3
: 5g Fe
2
(SO
4
)
3
+ 20ml H
2
SO
4
đậm đặc cho nước cất đến
90ml kiểm tra bằng dd KMnO
4
0.1N khi có màu hòng nhạt bền 30 giây.
Thêm nước cất đủ 100ml.
2.3 Thiết bị
Hệ thống hút lọc chân không
Bình tam giác, phễu, chày và cối sứ.
Giấy lọc, cân (chính xác 0.001g).
II. Tiến hành thí nghiệm
1. Chuẩn bị mẫu
Cân 2gram cho vào cối sứ, thêm ít nước cất ngiền thành dạng chất
đồn thể.
Cho 20ml nước cất vào, tiếp tục ngiền rồi để lắng, lấy phần nước
và rửa sạch cối khoảng 3 lần.
Cho lên phễu lọc có giấy lọc chuyên dụng. Sau đó định mức lên
100ml
2. Phản ứng Fehling:

Cho vào bình tam giác 5ml dịch lọc và 20ml fehling, đậy bình bằng
phễu nhỏ và đun sôi. Khi thấy bọt khí đầu tiên xuất hiện và có kết tủa
đỏ gạch tính thời gian 3 phút, để nguội cho kết tủa lắng.
3. Rửa kết tủa Cu
2
O
Tiến hành rửa trên phễu lọc Bunce
Dồn tủa về một phia. Chiết từ từ dịch Fehling qua phễu lọc. Quá
trình rửa cần cho nước cất ấm vào dần dần, để ngẵn tủa tiếp xúc với
không khí. Mở máy cho dịch Fehling hút nhanh xuống bình, thử pH của
tủa trong bình tam giác khi không còn tính kiềm là kết thúc quá trình
rửa.
4. Hòa tan kết tủa Cu
2
O:
Đặt phễu lọc lên bình nón, cho vào bình kết tủa 15ml Fe
2
(SO
4
)
3

chảy từ từ rồi lắc đều để tủa tan hoàn toàn. nếu kết tủa vẫn chưa tan
hết thì cho thêm. Dùng nước cất nóng rửa bình chứa tủa và phễu lọc
cho đến khi không còn phản ứng acid là kết thúc gian đoạn này.
5. Chuẩn độ bằng dd KMnO
4
0.1N
Cho dd KMnO
4

0.1N lên buret rồi chuẩn độ dịch đã hoàn thành
xong, đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 20-30 giây, kết thúc
quá trình chuẩn độ.
Ghi lại số ml dd KMnO
4
0.1N đã dùng.
6. Tính kết quả.
cứ 1ml KMnO
4
0.1N tương đương 1mg Cu. như vậy mCu có trong
dịch là:
36.6
1
xVg
c
=
V
c
là số ml KMnO
4
0.1N dùng chuẩn độ.
Tra bảng ta sẽ có kết quả:

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG LIPID THÔ BẰNG MÁY SOXHLET
1.1. Mục đích yêu cầu
- Mục đích: giúp sinh viên nắm vững phương pháp xác định hàm
lượng lipid thô bằng phương pháp dùng máy so màu.
- Yêu cầu: phải nắm vững kiến thức lý thuyết về phương pháp xác
định hàm lượng lipid thô, các thao tác tiến hành thí nghiệm phải hết sức
cẩn thận.

1.2. Nguyên tắc
Trong tế bào, lipid ở dạng tự do và liên kết. Lipid tự do tập trung
chủ yếu ở các cơ quan dự trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở
động vật). Chính vì vậy để xác định hàm lượng lipid, ta chiết rút lipid ra
khỏi nguyên liệu bằng dung môi hữu cơ. Ở đây ta dùng petrol ether để
trích lipid ra khỏi một lượng mẫu biết trước (mẫu đã được sấy khô) trên
máy soxhlet.
Khi đã trích li hết lipid ra khỏi mẫu, ta tiến hành sấy mẫu khô lại
đến khôi lượng không đổi. Từ đó xác định hàm lượng lipid thô có trong
100g mẫu theo công thức:

100%
21
x
m
mm
X
−
=
Trong đó: X là hàm lượng lipid tính theo %
m: là trọng lượng mẫu đem chiết rút lipid
m
1
: trọng lượng gói mẫu trước khi chiết rút lipid (kể cả khối lượng
giấy lọc)
m
2
: trọng lượng gói mẫu đã được sấy khô tuyết đối sau khi chiết
rút lipid
1.3. Hóa chất dụng cụ

- Hóa chất: ethylic
- Dụng cụ: cối chày sứ, giấy lọc, bếp điện, tủ sấy,
bộ soxlet...
1.4. Tiến hành thí nghiệm
- Bước 1: chuẩn bị mẫu
Đối tượng thí nghiệm: đậu lạc
+ Đem mẫu cho vào cối chầy sứ nghiền mịn. Sau đó
đem sấy khô ở nhiệt độ 100 – 105
0
C đến khi khối lượng
không đổi.
+ Mẫu sau khi được sấy khô ta cân 5g cho vào giấy
lọc (đã được sấy khô tuyệt đối) gói lại ba gói, đây chính
là trọng lượng m
1
- Bước 2: chiết rút lipid
+ Rửa sạch và làm khô bộ soxlet sau đó cho mẫu
vào ống hình trụ sao cho mẫu chiếm khoảng 1/3 thể tích
của ống.
+ Đổ ethylic vào ngập mẫu ở phía trên ống hình trụ còn ở dưới bình
cầu ta đổ ethylic khoảng 2/3 bình. Lắp kính bình cầu với ống hình trụ.
+ Cho nước chảy vào ở vòi dưới và chảy ra ở vòi trên của ống sinh
hàn đồng thời bật bếp điện đun bình cầu chứa ethylic, khi đó hơi ethylic
bốc lên gặp lạnh ở ống sinh hàn sẽ ngưng tụ lại và rơi vào ống hình trụ
để hòa tan lipid tự do có trong mẫu. Ta điều chỉnh nhiệt độ của bếp
điện khoảng 40 – 50
0
C sao cho cứ sao khoảng 10 phút thì dung môi
ethylic chảy qua eo của ống hình trụ và tràn xuống bình hình cầu. Ta
đun trong vòng 10 -12 giờ cho đến khi tách chiết hết lipid ra khỏi mẫu.

Cần chú ý trong quá trình đun nếu nghĩ giữa chừng thì phải cho dung
môi ngập mẫu mới tắt bếp.
+ Để thử lipid đã được chiết hết hay chưa, ta lấy vài giọt dung môi
từ ống hình trụ nhỏ vào miếng giấy lọc, để khô mà nếu thấy vết loang
của dung môi không phân biệt được với nền giấy trắng thì xem như đã
chiết hết lipid và ta kết thúc quá trình chiết rút.
+ Sau khi chiết rút xong ta lấy các gói mẫu ra và cho bay hết dung
môi, đem sấy khô ở nhiệt độ 100 – 105
0
C trong vòng 1 – 1,5h, sau đó
tiếp tục sấy khô ở nhiệt độ thấp hơn cho đến khối lượng không đổi.
Đem mẫu đã được sấy khô đến khối lượng không đổi ra cân ta thu được
trong lượng m
2
1.5. Kết quả và nhận xét:
- Kết quả:
Qua quá trình chiết rút lipid từ mẫu ta thu được kết quả như sau:
Mẫu (m=5g) m
1
(g) m
2
(g)
100%
21
x
m
mm
X
−
=

Đậu lạc
6.185 3.960 44.5%
Nhận xét: Qua bảng kết quả trên cho ta thấy hàm lượng lipid trong
đậu lạc khá cao. Hàm lượng lipid chiếm gần một nữa lượng chất có
trong củ.
Qua bài thí nghiệm này giúp cho sinh viên nắm được các bước cơ
bản của phương pháp chiết rút lipid bằng máy soxlet, và rèn luyện được
kỹ năng làm thí nghiệm.
BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY
4.1.Mục đích yêu cầu
- Mục đích: Giúp sinh viên nắm được phương pháp xây dưng đồ thị
chuẩn protein và phương pháp xác định hàm lượng potein trong mẫu.
- Yêu cầu: nắm vững kiên thức lý thuyết, trong quá trình tiến hành
thí nghiệm phải cẩn thận.
4.2. Nguyên tắc
Dựa vào phản ứng màu giữa protein với thuốc thử Folin. Do trong
môi trường kiềm với sự có mặt của một lượng nhỏ Cu
2+
protein sẽ tạo
thành phức chất màu xanh. Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với
hàm lượng protein có trong mẫu (có nghĩa là hàm lượng protein trong
mẫu cao thi phức chất bắt màu đậm). Sau đó dùng máy so màu để xây
dựng đồ thị chuẩn, và thông qua đồ thị chuẩn ta tính được hàm lượng
protein có trong mẫu.
4.3. Dụng cụ hóa chất
- Dụng cụ:
Máy so màu, ống nghiệm, pipet, Micropiet, bình định mức...
- Hóa chất: Albumin
+ Dung dịch đệm phosphat 0.1M, pH = 7

+ Dung dịch Na
2
CO
3
2% tan trong NaOH 0.1N (dung dịch A)
+ Dung dịch CuSO
4
1% (dung dịch B
1
)
+ Dung dịch Seignett 2% (dung dịch B
2
)
+ Dung dịch C: hỗn hợp 0.5ml dung dịch B
1
, 0.5ml dung dịch B
2
và
50ml dung dịch A (dung dịch C chuẩn bị trước khi dùng 30 phút)
+ Thuốc thử Folin 0.5N. Chú ý thuốc thử Folin được đựng trong chai
màu và bảo quản lạnh, thuốc thử này có màu vàng, khi dùng nếu thấy
có màu xanh thì cho vài giọt brom đun trong 15 phút thì sẽ có màu
vàng trở lại và dùng được.
4.4. Tiến hành thí nghiệm
4.4.1. Cách xây dựng đồ thị chuẩn protein
- Pha dung dịch chuẩn Albumin (1%): cân chính xác 1g albumin
hòa tan trong nước cất và định mức đến 100ml.
- Chuẩn bị dãy gồm 6 ống nghiệm khô sạch, sau đó cho vào các
ống nghiệm những chất như bảng sau:
TT

Hóa chất
MT 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 1 0.995 0.99 0.98 0.97 0.96
Albumin (ml) 0 0.005 0.01 0.02 0.03 0.04
Dung dịch C (ml) 4 4 4 4 4 4
Folin (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Hàm lượng
albumin (µg/ml)
0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
Khi cho dung dịch C vào các ống nghiệm ta lắc đều và để trong 10
phút, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 0.5ml dung dịch Folin để yên
trong 30 phút. Sau đó đem so màu ở bước sóng 620nm ta thu được kết
quả như sau:
Hàm lượng
Albumin(µg/ml)
0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
OD 0.175 0.29 0.40 0.515 0.623
Sử dụng phần mềm oringin 7.5 xây dựng đồ thị chuẩn protein:
Linear Regression for Data1_B:
Y = A + B * X = 0.0643 + 1.121X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0.0643 0.00219
B 1.121 0.00661
------------------------------------------------------------
RSD N P
------------------------------------------------------------
0.99995 0.00209 5 <0.0001
------------------------------------------------------------
Đồ thị chuẩn protein