Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí ôxy hóa Fe(II), khử nitrate trong một số môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN
ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẮP ĐHQG
Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vi khuẩn kỵ khỉ ôxy hóa Fe(II), khử nitrate
trong một số môi trường sình thái và khả năng ứng dụng của chủng
Mã sổ: QG. 07. 23
Chủ trì đề tài: TS. Đinh Thúy Hằng
Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN
' HỌC Quoc GIA HA NỌI
tNJG TÁM THỎNG TIN THƯ VIỆN
o ự ẹ i u
Hà Nội, tháng ỉ năm 20ỉ 0
BÁO CÁO KÉT QUẢ THỰC H Ệ N ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CÁP DHQG
BÁO CÁO TÓM TẮT
1. Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vỉ khuẩn kỵ khí ôxy hoả Fe(II), khử nitrate trongmột số môi
trường sinh thái và khả nâng ứng dụng của chúng.
2. Mã số: QG.07.23
3. Thời gian thực biện: 2 năm (2007 - 2009)
4. Cấp quản lý: Đại học Quốc gia Hà nội
5. Chủ trì đề tài: TS. Đinh Thuý Hằng
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN
Điện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email:
6 . Cán bộ tham gia: CN. Nguyễn Thị Tuyền
ThS. Nguyễn Minh Giảng
7. Mục tỉêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu:
- Nghiên cứu vả so sánh đa dạng sinh học của vi khuẩn ôxy hoá Fe2+/khử NO3- tại một số môi
trường sinh thái khác nhau.
- Phân lập các nhóm vi khuẩn đại diện, chiếm đa số trong mỗi loại môi trường sinh thái và
nghiên cứu các đặc điểm phân loại, sinh lý, sinh hoá của chúng.
- Nghiên cứu khả năng ứng dụng các chủng vi khuẩn phân lập được vào việc kết hợp loại bỏ

Fe2+, Mn2+, NO3” trong môi trường ô nhiễm.
Nội dung nghiền cửu:
- Mau trầm tích ở đáy hồ, mẫu đất ở ruộng lúa ngập nước và mẫu trầm tích ven biển sẽ được
lấy theo yêu cầu đảm bảo kỵ khí (tránh tiếp xúc với ôxy), đưa về phòng thí nghiệm và giữ ở
4°c cho đến khi tiến hành phân tích vi sinh vật.
- Số lượng vi khuẩn ôxy hoá Fe(II)/khử NO3- sẽ được xác định theo phương pháp MPN (Most
Propable Number) trong môi trường dịch thể chứa Fe(II) làm nguồn điện tử và NO3- là chẩt
nhận điện tử trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn. Thành phần khoáng của môi trường đàm bào
tương ứng với môi trường sinh thái tại địa điểm lấy mẫu.
- Đa dạng về thành phần loài ttong các mẫu khác nhau sẽ được xác định thông qua phương
pháp sinh học phân tử, tách DNA tổng số trục tiếp từ các lô thí nghiệm ở nồng độ pha loãng
khác nhau trong dãy MPN và phân tích tính đa dạng cùa một đoạn gen 16S rARN cùa tập
đoàn vi sinh vật thu được trong mỗi !ô bằng phưomg pháp PCR/DGGE.
- Các chùng vi khuẩn ôxy hoả Fe(ÍI)/khừ NCV đại diện, chiếm đa số tại mỗi địa điểm lấy mẫu
sẽ được phàn lập từ ống pha loãng cao nhất có vi sinh vật phát triển cùa dăy MPN bằng
phương pháp ống thạch bán lòng.
- Các chùng vi khuẩn phân lập sẽ được nghiên cứu về đặc điểm sinh lý sinh hoá và phân loại
dựa trên trình tự 16S rDNA. Ket quả cùa nghiên cứu này sẽ làm cơ sở để tuyển chọn các
chùng cỏ hoạt tính sinh học (khả năng chuyển hóa Fe(II) và NO3- ) cao và nghiên cứu khả
năng ứng dụng của chúng vào việc kết hợp loại bỏ Fe(II), Mn(II), NO3- trong môi trường ô
nhiễm.
8. Các kết quả đạt được
- Ba dạng môi trường khác nhau gồm có ao nước ngọt, ruộng lúa ngập nước và trầm tích ven
biển được chọn để tiến hành nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn ôxy hoá Fe(II) khử NO3
Đây là những dạng môi trường trong đó vi khuẩn tham gia chu trình chuyển hoá sắt và nitơ
đóng vai trò quan trọng. Mầu bùn đáy (dưới 10 cm bề mặt bùn) tại các môi trường sinh thái
kể trên được thu thập và sử dụng để phân tích nhóm vi khuẩn kỵ khí này.
Sổ lượng vi khuẩn ôxy hoá Fe(II), khử NO3- đã được xác định bằng phương pháp MPN trong
môi trường dịch thể nước ngọt (đối với mẫu ao và mẫu ruộng lúa) hoậc nước lợ (đối với mẫu
trầm tích ven biển) chứa Fe(II) làm chất cho điện tử, NO3 ' làm chất nhận điện tử và

acetate/C0 2 làm nguồn cacbon. Sự sinh trưởng của vi khuẩn trong các ống MPN được nhận
biết thông qua thay đổi màu sắc của môi trường nuôi cấy sang màu vàng nâu do Fe(II) bị ôxy
hoá thành Fe(III).
- DNA tổng số từ các ống MPN đại diện có vi sinh vật phát triển được tách chiết và sử dụng
làm khuôn trong phân ứng PCR khuyếch đại đoạn gen I6 S rDNA có độ dài 550 bp. Phân tích
điện đi biến tính đoạn gen trên cho thấy tính đa dạng khá cao của vi khuẩn trong các ống
MPN. Một số băng điện di đại diện được cắt và thôi gel để đọc trình tự, qua đó đã xác định
được các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường nghiên cứu, cụ thể là
Anaeromyxobacter, Pseudomonas và Paracoccus.
- Đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện oxy hoả
Fe(II) khử NO3- trong các dãy MPN thông qua phương pháp lai in situ sử dụng các đầu dò
huỳnh quang (FISH) đặc hiệu cho ba nhóm vi khuẩn a-, 0- và y-Proteobacterỉa.
12 chùng vi khuẩn kỵ khí được phân lập và tinh sạch (4 chùng đối với mỗi dạng môi trường
sinh thái). Tính đa dạng cùa các chủng này về mật di truyền được xác định thông qua phân
tích ARDRA đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA đài 1500 bp sừ dụng hai enzyme Mspỉ và
Haeììl. Các chùng đại diện cho các nhóm ARDRA được giải trình tự để xác định vị trí phân
loại của cá nhóm vi khuẩn mà chúng đại diện.
- Bằng phương pháp xác định lượng Fe(ll) và NO3" trong môi trường nuôi cấy theo then gian,
chùng vi khuẩn IN 12 đã được chứng minh có khả năng chuyển hoá hai hợp chất này khá cao,
như vậy chủng này có tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực môi trường. Bên cạnh đó khả năng sử
dụng Mn(II) thay cho Fe(II) cũng đâ được nghiên cứu, tuy nhiên chùng IN 12 không thể hiện
khả năng ửng dụng để loại bò Mn(IĨ) trong môi trường.
- Các kết quả nghiên cứu đã được công bố trong 02 bài báo khoa học, 01 báo cáo Poster tham
gia hội nghị về sinh thái sinh vật và 02 trình tự gen đăng ký trong GenBank.
- Đã tham gia đào tạo 01 học viên cao học
9. Tình hình sử dụng kỉnh phí
- Tổng kinh phí của đề tài được duyệt: 60.000.000 VNĐ
- Tổng kinh phí của đề tài đã chi: 60.027.400, bao gồm các mục:
+ Chi phí thuê mướn: 24.000.000
+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 29.522.400

+ Văn phòng phẩm: 505.000
+ Chi khác (lệ phí của đơn vị DT): 6.000.000
SUMMARY
1. Project title: Diversity o f anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria in
some ecological environments and their potential use.
2. Code: QG.07.23
3. Duration: 2007 - 2009
4. Organizer: Vietnam National University Hanoi (VNUH)
5. Project leader: Dr. Dinh Thuy Hang
Institute of Microbiology and Biotechnology, VNUH
6 . Key participants: BSc. Nguyen Thi Tuyen
MSc. Nguyen Minh Giang
7. Objectives and study contents
Objectives
- Comparatively study biodiversity of Fe(II) oxidizing - nitrate reducing bacteria in some
ecological environments in Vietnam.
- Isolate representative strains that dominate in each environment and study their physiological,
and phylogenetic characteristics.
- Study the application potential of the isolates in elumination of Fe(II), Mn(II) and NO3- in
contaminated water sources.
Study contents
- Collect anaerobic mud samples from representative environments in Vietnam and keep at 4°c
as the sources for microbiological studies.
- Determine the number of Fe(II) oxidizing-nitrate reducing bacteria in these environments by
using MPN method carried out in anoxic liquid media containing Fe(II) as electron donor,
N 0 3- as electron acceptor and trace acetate as corbo source. Mineral content of the media
would respect to the natural conditions where the samples have been collected.
Species composition of the microbial communities in these environments would be analyzed
via PCR-DGGE method applied for 16S rDNA of the samples of the MPN series.
- Isolate representative strains from the MPN tube of the highest dilution by performing

dilution series in semi-liquid agar tubes.
Study physiology and phylogeny of the isolated strains, afterward select strains for the study
of application potential in elimination of Fe(II), Mn(II) and NO3- in contaminated waters.
8 . The obtained results
- Samples from three ecological environments, namely mud sediment freshwater pond, flooded
paddy soil and sediment from estuarine environment were collected for studying Fe(II)
oxidizing, nitrate reducing bacteria. These environments are known for significant
involvement of bacteria in Fe and nitrogen cycles. Samples at 10 cm depth below the
sediment surface were used for this study.
Number of Fe(II) oxidizing, nitrate reducing bacteria was enumerated via MPN method
earned out in anoxic media with freshwater mineral content (for the samples from freshwater
pond and paddy soil) or brackish water mineral content (for the sample from estuarine
environment). These media contained Fe(II) as electron donor, NO3- as electron acceptor and
trace acetate as carbon source. Growth of bacteria in the MPN series was recognized by
colour changing in the media, from white (Fell precipitation) to dark brown (Felll
precipitation).
Total DNA from representative MPN samples was purified and used in the PCR experiments
to amplify 550 bp fragments of the V3 region of the 16S rDNA and used for analyzing
diversity of bacteria in the communities with DGGE method. Most prominent DGGE bands
were excised, reamlified and sequenced to determine the phylogenetic affiliation of the
respective baterial groups.
Diversity of the bacterial communities in the samples was also analyzed by using in situ
hybridization (FISH) with fluorescent probes specific for the a-, P- and y-Proteobacteria.
12 bacterial strains were isolated and purified (4 strains for each studied environment).
Genetic diversity of these isolates was studied via ARDRA analyzes of Ỉ6 S rDNA with two
endonucleases Mspl and HaelU. 16S rDNA of the strains represented for the RFLP groups
were sequenced and comparatively aligned with the database to identify the phylogenetic
affiliation of the ARDRA groups.
Quantitative analyzes of the amount of Fe(II) and N o r in growth media of the isolated
strains allowed to select strain IN 12 as a candidate for application for simultaneous

elimination of Fe(II) and NO3' in contaminated waters. Besides that, the ability of strain IN12
in oxidation of Mn(II) with nitrate was also studied, however it was revealed that tis strain did
not growth with Mn(II) as electron donor for nitrate reduction.
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn tham gia chu trình Fe 2
1.2. Vi khuẩn oxy boá Fe(II) ở pH trung tính 3
1.2.1. Vi khuẩn hiếu khí oxy hoá Fe(II) 3
1.2.2. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hoá Fe(II) 3
1.2.3. Vi khuẩn khử nitrate oxy hoá Fe(II) 4
1.3. Tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate 4
1.3.1. Ảnh hưởng của nhiễm nitrogen trong các nguồn nước 4
1.3.2. Ảnh hưởng của nhiễm sắt trong các nguồn nước 5
1.3.3. Khả năng ứng dụng của vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate 6
CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u 7
2.1. Nguyên vật liệu 7
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 7
2.1.2. Hoá chẩt 7
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ 7
2.2. Phuxmg pháp nghiên cứu 7
2.2.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate 7
2.2.2. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate 8
2.2.3. Tách DNA tổng sổ từ mẫu quần thể và từ chùng vi sinh vật 9
2.2.4. Phân tích đa dạng vi sinh vật bằng phương pháp ARDRA 9
2.2.5. Phưcmg pháp điện di biến tính DGGE 9
2.2.6. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại 10
2.2.7. Phương pháp FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 11
2.2.8. Định lượng Fe(II), Mn(II) và nitrate 12
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

3.1. Xác định sổ lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại ] 5
các môi trường Dghiên cứu
3.2. Phân tích cấu trúc quần thể bằng điện di biến tính (DGGE) 16
3.3. Mức độ oxy hóa Fe(II), khử nitrate của vi sinh vật trong các mẫu 17
3.4. Phản lập vi khuẩn oxy hóa Fe(ll) khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu 17
và đánh giá tính đa dạng của các chủng phân lập.
3.5. Phân tích đa dạng vi khuẩn trong các môi trường nghiên cứu 21
bằng phương pháp FISH
3.6. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học 22
của các chủng vi khuẩn đại diện
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Các trình tự gen
Phụ lục 2. Tham gia đào tạo khoa học
Phụ lục 3. Các công trình khoa học đã công
DANH MỤC CÁC CHỬVIÉT TẮT
ALF968 Fluorescence probe against a -Proteobacteria
ARDRA Amplified ribosomal DNA restriction analyses
BET42a Fluorescence probe against fi-Proteobacteria
BSA Bovin serum albumin
Cl Chloroform - isoamylalcohol
CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide
DAP1 4’,6-diamino-2-phenylindole
DNA Acid deoxyribonucleic
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate
DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis
EDTA Ethylene-diamine-tetraacetic acid

FISH Fluorescence in situ hybridization
GAM42a Fluorescence probe against y-Proteobacteria
MPN Most probable number
MQ Milli Q water
PBS Phosphate buffered saline
PCI Phenol-chloroform-isoamylalcohol
PCR Polymerase chain reaction
OD Optical density
rDNA Ribosomal DNA
RNA Ribonucleic acid
SDS Sodium dodecy] sulfate
TAE Tris/Acetate/EDTA
TBE Tris/Borate/EDTA
u v Ultraviolet
MỞ ĐẦU
Trong tự nhiên sát là một trong những nguyên tố cỏ mặt với hàm lượng đáng kể, sau
carbon, nitơ, phospho và lưu huỳnh (Ehlich, 1996). Là một nguyên tố kim ioại, sất tồn tại ở các
dạng ion với điện thế oxy hoá khử khác nhau, gồm Fe(II) và Fe(III). Trong hai dạng kể trên chi
có Fe(II) tồn tại ở dạng hoà tan trong nước. Tuy nhiên, do có tính khử cao, Fe(II) nhanh chóng bị
oxy hoá thành Fe(III) trong phản ứng hoá học với oxygen không khí. Do vậy ion Fe(II) thường
chỉ được tìm thấy trong các điều kiện môi trường không có oxygen, ví dụ như ở đáy các thuỷ vực,
các tầng nước ngầm hay môi trường có pH thấp (Konhauser, 1997; Nealson, Saffarini, 1994).
Trong khi oxy hoá Fe(II) bằng oxygen theo con đường sinh học chỉ diễn ra ờ môi trường
có pH thấp thì oxy hoá Fe(II) bằng nitrate là quá trình diễn ra ở điều kiện pH trung tính (Ehrlich,
1996). Trong tự nhiên, quá trình oxy hoá sắt (II) với chất nhận điện từ là nitrate chủ yếu diễn ra ở
ranh giới hiếu khí (có oxygen) và kỵ khí (không có oxygen) trong lớp trầm tích ở đáy các thuỷ
vực. Oxy hoá Fe(II) kết hợp với khử nitrate có thể đóng vai trò quan trọng trong môi trường ô
nhiễm với nồng độ Fe(II) cao (do thiếu oxygen) và NƠ3- cao (đo chất hữu cơ bị phân huỳ tạo
thành) (Weber et aL, 2006b). Các loài vi khuẩn với khả năng tiến hành phàn ứng oxy hoá khử
này có thể cùng một lúc thực hiện được hai nhiệm vụ, thứ nhất là chuyển Fe(II) hoà tan trong

nước về dạng Fe(III) kết tủa, và hai là loại bỏ NO3-, chuyền thành dạng N2 không độc hại.
Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy sự có mặt khá phổ biển của nhóm vi
khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate với mật độ khá cao (106 tể bào/g trầm tích) trong các điều kiện
môi trường khác nhau, bao gồm cả nước ngọt, nước lợ và nước mặn và tại nhiều vị trí địa iý khác
nhau trên thế giới (Straub, Buchholz-Cleven, 1998). Tuy nhiên ờ Việt nam cho đến này chưa có
công trình nghiên cứu nào đề cập đến quá trình sinh học dùng Fe(II) để khử NO3” cũng như các
loài vi khuẩn đảm nhiệm quá trình này. Do vậy, đề tài ' Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí
oxy hoả Fe(IĨ), khử nitrate trong một sổ môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của
chúng ’’ được đặt ra với mục tiêu nghiên cứu tính đa dạng của vi khuẩn khử nitrate sử dụng Fe(II)
là nguồn điện tử duy nhất trong một sổ dạng môi trường sinh thái đặc trung ở Việt Nam, đồng
thời tìm hiểu khả năng ứng dụng của chúng trong việc xử lý các nguồn nước nhiễm ion sắt kim
loại và nitrogen.
1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn tham gia chu trình Fe
Sắt là một trong những kim loại phổ biến nhất và là nguyên tố có mặt trên trái đất với hàm
lượng lớn thứ tư, sau carbon, oxygen và nitrogen. Thông thường sắt tồn tại ờ đạng Fe2Ơ3 ít tan
trong nước và có màu vàng nâu. Trong môi trường pH trung tính, dạng hòa tan trong nước Fe(II)
chi tồn tại ở điều kiện không có oxygen, ví dụ như ở đáy các thủy vực, nơi oxygen hòa tan trong
nước đã bị các vi sinh vật hiếu khí sử đụng đề phân hủy các hợp chất hữu cơ. Quá trình oxy hóa -
khử giữa Fe(II) và Fe(III) có vai trò thiểt yếu trong chu trình sinh địa hóa môi trưởng và là một
trong những quá trình chuyển hoá vật chất quan ưọng có mặt từ rất sớm trên ưái đất. Fe(II) là
thành phần của các dạng khoáng phổ biến như siderite (khoáng chất có chứa FeCƠ3), vivianite
(Fe3(PC>4)2 .8 H2 0 ) hoặc pyrite (Fe$2), trong môi trường kỵ khí có tính acid yểu đến môi trường
trung tính (Straub et ai, 2001). Oxy hóa sắt diễn ra theo cả hai con đường hoá học và sinh học,
trong đó các quá trình sinh học cỏ vai trò đặc biệt quan trọng tại nhiều dạng môi trường sinh thái
khác nhau (hình 1.1). Với thế oxy hóa khử của cặp Fe(II)/Fe(III) là +770 mV đối với môi trường
acid và +200 mV dối với môi truờng trung tính, Fe(II) có thể được sử dụng như chất cho điện tử
để cung cấp đương lượng khử cho các quá trình đồng hóa carbon thành sinh khối nhờ các vi
khuẩn oxy hóa Fe(II) trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí, còn Fe(III) có thể được sử dụng như

là chất nhận điện tử cuối cùng trong điều kiện kỵ khí để oxy hoá các hợp chất hữu cơ (Weber et
ai, 2006a).
Hình 1.1. Chu trình chuyển hoá sắt trong tự nhiên (Ehrlich, Newman, 2008).
1 - Vi sinh vật trong môi trường acid; 2 - Vi sính vật kỵ khỉ ở môi tnxờng trung tính (khừ nitrate, quang hợp kỵ khi)'
3 - Quá trình hóa học trong môi trưcmg trung tinh với nồng độ oxygen cao; 4 - Quá trinh hóa học; 5 - Quá trình sinh
học; 6 - H2S từ vi sinh vật; 7 - + 0 2, quá trình sinh học hoặc hóa học; 8 - -“-CO}2", quá trinh hóa học; 9 - chuyền H+
quá trình sinh học hoặc hỏa học; Í0 - Ọuá trình sinh học hoặc hóa học.
2.3
2
Vi khuẩn oxy hóa Fe(II) bao gồm nhiều nhóm có các đặc điểm sinh lý khác nhau, ví dụ
như tự dưỡng và dị dưỡng, quang dưỡng và hóa dưỡng, ưa acid và trung tính, hiếu khí và ky khí.
Mặc dù vai trò của quá trình chuyển hóa sắt nhờ vi khuẩn trong môi trường là rất lớn nhưng
những hiểu biết hiện nay về sinh lý cũng như sinh hóa của nhóm ví sinh vật này còn nhiều giới
hạn. Hầu hết các nghiên cứu và công bổ về quá trinh oxy hóa Fe(II) đều tập trung vào các vi
khuẩn hiếu khí ưa acid như Thiobacciỉlus ferrooxidans (Temple, Colmer, 1951; Ehrlich, 1996),
phát triển trong môi trường có pH 1-2, nơi có Fe(II) và Fe(III) ờ dạng ion hòa tan. Tuy nhiên, ở
pH trung tính cơ chất và sản phẩm của quá trình chuyển hóa sắt lại ít hòa tan, điều này gây khó
khăn cho việc nghiên cửu sinh ]ý của các vi sinh vật tham gia (Straub et ai, 2001). Mặc dù vậy,
vi khuẩn tham gia chuyển hoá sắt ở điều kiện môi trường trung tính, bao gồm oxy hoá Fe(II) và
khử Fe(III) lại rất đa dạng và đóng vai trò quan trọng hơn trong chu trình vật chất trong tự nhiên.
1.2. Vi khuẩn oxy boá Fe(II) ở pH trung tính
1.2.1. Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II)
Mặc dù quá trình oxy hóa Fe(II) bằng oxygen không khí tại pH trung tính xảy rất nhanh,
nhiều nghiên cứu cho thấy oxy hoá Fe(II) bằng còn đường sinh học hoàn toàn có thể cạnh tranh
với quá trình hoá học. Vi khuẩn hiếu khí oxy hoá Fe(II) ở pH trung tính được mô tả đầu tiên là
các đại điện thuộc ba chi
Gaỉỉionelỉa, Leptothrix và Marinobacier (Kuetzing, 1919; Ehrenberg,
1919). Ngoài ra, theo các nghiên cứu gần đây, một số vi khuẩn oxy hoá Fe(II) hiếu khí mới tìm
thấy được xếp vào các phân lớp a-, p- và Ỵ- Proteobacterìa (Edwards et al, 2003; Emerson,
Weiss, 2004; Dhillon et ai, 2005; Rentz et ai, 2007). Nhu vậy cùng với sự phát triển của các

phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, bức tranh đa dạng của nhóm vi sinh vật này ngày càng trở
nên phong phú hơn.
1.2.2. Vi khuẩn quang họp ky khí oxy hỏa Fe(II)
Trong những khu vực có ánh sáng, Fe(III) có the cũng được tạo thành thông qua hoạt tính
oxy hóa Fe(II) của vi khuẩn quang hợp có khà năng sử dụng Fe(II) như một nguồn điện tử để tạo
các đương lượng khử cho quá trình đồng hóa carbon vô cơ (Weber et aỉ., 2006a). Vi khuẩn quang
hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hỏa Fe(II) kỵ khí được biết đến đầu tiên (Widdel et aỉ., 1993). Hiện
nay nhóm vi khuẩn này đã được mô tà với nhiều đại diện thuộc các chi Chỉorobium, Rhodobacier,
Thiodictyon, Rhodovuỉum, Rhodomicrobium (Ehrenreich, Widdel, 1994; Heising, Schink, 1998;
Heising et aì., 1999; Straub et al, 1999; Kappler, Newman, 2004).
Tuy nhiên quá trình oxy hóa Fe(II) bàng quang hợp trong môi trường tự nhiên bị giới hạn
ở độ sâu 200 um trong đất và trầm tích do hạn chế ánh sáng (Ciani et al, 2005). Hơn nữa, những
nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rầng vi khuẩn quang hợp oxy hóa Fe(II) không có khả năng sử dụng
Fe(II) ờ dạng khoảng mà chi có thể oxy hóa Fe(II) ở dạng hòa tan (Kappler, Newman. 2004), do
đó, chúng không đỏng vai trò đáng kể trong chu trình chuyển hoá sắt trên cạn.
3
1.2.3. Vi khuẩn khử nitrate, oxy hóa Fe(II)
Vi khuẩn oxy hoá Fe(II) kỵ khí đóng vai trò quan trọng trong chu trinh chuyển hoá sắt,
đặc biệt trong các lóp trầm tích nơi vi sinh vật bị hạn chế về oxygen hoà tan (Lack eí al., 2002;
Weber et al., 2001; Senn, Hemond, 2002; Straub et al., 2001; Weber et ai, 2006c). Với hiệu điện
thế oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) tại pH 7 vào khoảng +200 mV, Fe(ll) có thể ừờ thành nguồn điện
tử cho quá ưình hô hấp kỵ khí, khử nitrate thành N2 do một số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Straub
et a i, 1996; Benz et a i, 1998; Weber et ai, 2006c). Quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate được
tóm tát theo phương trình phản ứng như sau:
10 Fe2+ + 2 N 0 3“ + 24 H20 = 10 Fe(OH)3 ị + N2 T + 9 H21
Trong tự nhiên, quá trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử là nitrate chù yểu diễn ra ở
ranh giới hiếu khí (có oxygen) và kỵ khí (không có oxygen) trong lớp trầm tích ờ đáy các thủy
vực. Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate được phân lập đầu tiên từ các
lớp trầm tích ao, hồ nước ngọt tại Bremen (Đức) năm 1996 (Straub et a i, 1996). Một số công
trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy sự có mặt phổ biển của nhóm vi khuẩn này với mật độ khá cao

(1 0 6 tế bào/g trầm tích) trong các điều kiện môi trường khác nhau, bao gồm cà nước ngọt, nước
lợ và nước mặn và tại nhiều vị trí địa lý khác nhau trên thế giới (Straub et al, 1998). Các loài vi
khuẩn phổ biến nhất trong nhóm nảy được biết đến hiện nay lả các loài thuộc chi
Chromobacteríum và Klebsiella (Benz et aỉ.y 1998; Senko eí a i, 2005; Weber etaỉ., 2006b).
Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phần lớn sinh trường dị dưỡng, phụ thuộc vào chất
hữu cơ (vi dụ như acetate) để cung cấp nguồn carbon cho việc tổng hợp thành phần tế bào
(Straub et al., 1996; Benz et al, Ỉ998). Bằng phương pháp MPN, người ta đã xác định được vi
khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate chiếm 0,8% tổng số vi khuẩn khử nitrate nói chung, trong đó
nhóm sinh trưởng dị dưỡng thường gặp hơn nhóm sinh trưởng tự dưỡng (Straub et al, 1998). Vi
khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tự dưỡng mới chỉ được biết điến với hai đại diện là
Ferroglobus pỉacidus, một vi khuẩn cổ ưa nhiệt (Hafenbradl et al, 1996), và một vi khuẩn ưa
ấm thuộc phân lớp p-Proteobacteria (Weber et al, 2006b). Đối với lịch sừ tiến hoá, các sinh vật
sinh trường tự dưỡng vô cơ như nhóm vi khuẩn oxy hoả Fe(II) khử nitrate tự dưỡng đóng một vai
trò quan trọng, góp phần tạo nguồn carbon hữu cơ ban đẩu để duy trì sự sống.
1.3. Tiềm năng ứng dụng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate
1.3.1. Ảnh hưởng của nhiễm nitrogen trong các nguồn nước
Nước thải với nồng độ ammonium hay nitrate cao xả ra ngoài môi truờng có thề gây ra
nhiều vấn đề nghiêm trọng liên quan đến môi trường sinh thái và sức khỏe cộng đồng.
4
Ảnh hưởng tới môi trường sinh thái
- Ảnh hưởng độc hại: Nitrogen ammonia ở dạng ammonia rất độc hại đối vói các loài
thủy sinh, đặc biệt là cá. Ở pH trang tính, 99% N-ammonia tồn tại ở dạng NRị+, trong
khi đó khi pH ở khoảng trên 9, dạng NH3 tăng đảng kể. Do vậy mức độ độc hại của N-
ammonia rất nghiêm trọng khi pH trong môi trường tăng, thường là hậu quả sau khi có
lượng nước thải với độ kiềm cao đổ ra ngoài môi trường.
- Giảm oxygen hòa tan trong các thủy vực: ammonia thường dẫn đến việc tăng nhu cầu
oxygen cho các quá trình sinh hóa ở các thủy vực. Theo tính toán, 1 mg ammonia thải ra
ngoài môi trường đòi hỏi lượng oxygen hòa tan tăng thêm 4,6 mg, chủ yếu do hoạt động
của nhóm vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa. Hậu quả của việc tăng nhu cầu về
oxygen này là làm thiếu oxygen cho các loài thủy sinh khác cùng sống trong môi trường.

- Gây hiện tượng phủ dưỡng trong các ao hồ: việc tăng hàm lượng nitrogen trong các
ao hồ kéo theo sinh trưởng rầm rộ cùa tảo và các thực vật thủy sinh, dẫn đến tâng nhu
cầu oxygen về đêm và làm ảnh hưởng đến hoạt động sống của các động vật thủy sinh.
- Làm giảm hiệu quả của chỉorỉn: ammonium kết hợp với chlorin tạo hợp chất
chloramin có tác dụng kháng khuẩn kém hom so với chlorin ở dạng tự do.
- Ần mòn: ammonium ở nồng độ trên 1 mg/L có thể gây ăn mòn cho các đường ống dẫn
nước và các công trình kim loại dưới nước.
Ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng
- Gây bệnh thiếu máu: nitrate là nguyên nhân gây bệnh thiếu máu (Methemoglobinemia)
ở người do bị khử thành nitrite trong hệ đường ruột, sau đó liên kết với hemoglobin
dưới dạng methemoglobin, không cỏ khả năng vận chuyển oxygen. Ở người khỏe mạnh,
hàm lượng methemogỉobin trong máu được giữ ổn định ở mức 1 - 2% nhờ enzyme
methemoglobin reductase. Trè em dễ bị ảnh hường cùa bệnh này hơn so với người
trưởng thành vì có độ pH trong dạ dày cao hom, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn
khử nitrate sinh trưởng. Vitamin c được biết đến với khả năng bảo vệ và giữ nồng độ
methemoglobin ở mức thấp.
- Gây bệnh ung thư: nitrite được tạo ra từ nitrate còn có thể kết hợp với các amine thứ
cấp để tạo thành nitrosamine, là tác nhân gây đột biến gen và một số bệnh ung thư như
ung thư dạ dày, ung thư bàng quang (Tricker, Preussmann, 1991; Lundberg, 2004).
Theo quy định quốc tế, giới hạn nitrate trong nước uổng là 10 mg/L.
1.3.2. Ảnh hirởng của nhiễm sắt trong các nguồn nước
Sắt là nguyên tố phổ biến trong tự nhiên, là một thành phần quan trọng trong tồng hợp
hemoglobin (chất vận chuyển oxygen cho các tế bào trong cơ thề) và myoglobin (chất dự trữ
oxygen cho cơ thể). Ngoài ra sắt còn tham gia vào thành phần một số enzyme oxy hoá khử như
cataỉase, peroxydase vả các cytochrome (những chất xúc tác sinh học quan trọng trong cơ thể).
Sắt đóng vai trò quan ưọng trong việc sản xuất ra năng lượng oxy hoá, vận chuyển oxygen, hô
hấp của ty lạp thể và bất hoạt các gốc oxy hóa cỏ hại. Tuy nhiên quá tải sắt trong cơ thể cũng gây
ứ đọng sắt tại các mô như tim, gan, tuyến nội tiết , dẫn đến rối loạn trầm trọng chức năng các cơ
quan này (Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006).
Cơ thể hấp thu sắt ở dạng Fe(II). Pepsin tách sắt khỏi các hợp chất hữu cơ và chuyển

thành dạng gắn với các acid amine hoặc đường. Acid chlohydric khử Fe(III) thành Fe)II) để hấp
thu. Vì vậy nên lượng sắt dư thừa trong nước uống cho dù ở dạng Fe(II) hay Fe(III) đều gây nguy
hiểm cho con người.
Tác hại của thừa sắt trong cơ thể hiện nay vẫn còn đang gây nhiều tranh cãi. Người ta cho
rằng bộ não là mục tiêu chính của sự thừa sắt, sự tích lũy sắt trong mô não là một trong những
nguyên nhân của các bệnh về thần kinh như Parkinson và Alzheimer, sắt còn được coi như là
một chất gây ung thư rất mạnh, thường gặp nhất là ung thư gan. sắt du thừa tích luỹ trong tim và
các động mạch có thể gây nên các bệnh về tim hoặc phá vỡ động mạch, sắt thừa lắng đọng trong
lá lách sẽ phá vỡ sự bài tiết insulin và gây ra bệnh đái tháo đường nghiên trọng.
1.3.3. Khả năng ứng dụng của vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate
Với khả năng hô hấp kỵ khí bằng nitrate, vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate có thể tham
gia vào quả trình loại bỏ nitrogen trong các nguồn nước thài hay nước sinh hoạt có nồng độ
nitrate cao (Straub et ai., 1996). Quá trình này diễn ra khi có mặt các hợp chất hữu cơ làm nguồn
điện tử thích hợp để khử nitrate, ví dụ như lactate, acetate hay methanol, là những sàn phẩm của
quá trình phân giải chất hữu cơ cao phân tử. Bằng các phương pháp sinh học phân tử người ta đã
xác định được tỷ lệ khá cao của vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate trong các hệ thống xử lý
nước thải nhiễm nitrogen (Bitton, 1999). Bên cạnh đó, khả năng sinh trường vô cơ sử dụng Fe(II)
làm nguồn điện tử để khử nitrate là một ưu thế của nhóm vi khuẩn này so với các loài khử nitrate
thông thường. Do tác động của vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate, cùng một lúc ion Fe(II) vả
nitrate dư trong nguồn nước có thể được loại bỏ. Khả năng ứng dụng cùa nhóm vi khuẩn này đặc
biệt có ý nghĩa đối vói việc xừ lý các nguồn nước ngầm dùng cho sinh hoạt bị nhiễm sắt và
nitrogen ngấm xuống từ tầng nước mặt. Ngoài ra, trong một số nghiên cứu gần đây, vai trò cùa vi
khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate còn được tìm thấy trong việc cố định các ion arsen thông qua
khả năng tạo Fe(III) là sàn phẩm cùa quá trình trao đổi chất (Hohmann et ai, 2009).
6
CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Dối tượng nghiên cứu
Mầu bủn vả trầm tích được thu thập ờ ba môi trường sinh thái đại diện khác nhau: mầu
bùn đáy ao nước ngọt và chân ruộng ngập nước được thu ở Từ Liêm, Hà Nội, mẫu trầm tích nước

lợ được thu ở ven biển Vân Đồn, Quảng Ninh. Mâu chân ruộng và ữầm tích ven biển được thu
thập ừong các ống thủy tính nút xoáy cho phép khoan sâu tới 60 cm dưới bề mặt trầm tích (hình
2.1). Mẫu đáy ao được thu thập trong binh thuỷ tinh, sau đó bổ sung nước vào toàn bộ thề tích để
giảm thiểu sự ảnh hường cùa oxygen trong không khí. Mầu được bảo quản ở nhiệt độ 4°c cho
đến khi tiến bành các thí nghỉệm tiếp theo.
Ỉ
Hình 2.1. Mẫu bùn và trầm tích thu thập ngoài
môi trường tự nhiên, được đảm bảo kỵ khí
nghiêm ngặt.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất được sừ đụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều là những hóa chất có tiêu
chuẩn chất lượng cao của các hãng cung cấp lớn nhu Merck (Đức), Sigma (Mỹ). Hoá chất và
một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer (Hàn Quốc), Fermentas
(Đức), Qiagen (Mỹ), ABI (Mỹ), BioRad (Mỹ) cung cấp.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cửu
Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN, sử
dụng các thiết bị chuyên môn dùng ừong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hoá phân tích đạt
tiêu chuẩn quốc tế.
2.2. Phirong pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate
Số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate được xác định thông qua phương pháp MPN
(American Public Health Association, 1969) trong môi trường dịch thể kỵ khí hoàn toàn có thành
phần khoáng tương úmg với nước ngọt (dùng cho mẫu bùn đáy ao và chân ruộng ngập nước) hoặc
nước lợ (dùng cho mẫu trầm tích ven biển) (bàng 2 .1 ).
7
Băng 2.1. Môi trường kboáng kỵ khí nirớc ngọt và nước lợ cho vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử
nitrate (Ratering, 1999).
Thàob phần
Nước ngọt
Nước lợ

Nước cất 1 lít 1 lít
NaCl
1 g
13,7 g
MgCl2 .6H20
0,4 g
5,9 g
CaCl2.2H20 0,15 g
0,81 g
KC1
0,5 g
0,58 g
KBr
-
0,05 g
MgS04 .7H20
0,25 g 0,25 g
NH4CI 0,25 g Hỗn hợp NH4 CI (0,25 g) và
KH2PO4
0 , 2 g
KH2PO4 (0,25 g) được chuẩn
bị trước trong 50 ml nước cất
Khử trùng ờ 121 °c trong 25 phút, lấy ra ờ 80 °c, sục khí N2 trong 5 phút, làm nguội trong
nước máy, sau đó thêm các dung dịch sau (đã khử trùng riêng bằng nhiệt hoặc màng lọc):
Hỗn hợp Vitamin 1 ml 1 ml
Hỗn hợp vi lượng
1 ml
1 ml
Vitamin BI (Thiamin) 1 ml
1 ml

Vitamin B12 0 , 1 ml 0 ,1 ml
Vitamin B2
1 ml 1 ml
Na-Acetate 1 M
I ml
1 ml
NaNƠ3 I M (chất nhận điện tử) 5 ml (5 mM)
5 ml (5 mM)
FeS04 1 M (chất cho điện tử) 10 ml (10 mM)
1 0 ml (10 mM)
NaHC03 1 M 30 ml
30 ml
Chuẩn pH ở 7-7,2, sau đó chia môi trường sang các bình serum và ống nghiệm rồi sục khí N2)
đậy bình và ống nghiệm bầng nút
cao su có kẹp nhôm hay nút vặn có lỗ hở.
Mẩu được bổ sung vào ống MPN đầu tiên với tỷ lệ 10% thể tích. Thí nghiệm được ủ tại
28 °c trong 8 tuần, sự phát triển của vi khuẩn trong ống MPN được ghi nhận thông qua đổi màu
môi trường từ trắng đục (màu của Fell) sang vàng nâu (màu cùa Felll).
2.2.2. Phân lập vỉ khuẩn kỵ khíoxy hoả Fe(IỈ) khử nitrate
Ống MPN ờ nồng độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phát triển
được sử đụng để làm nguồn phân lập các khuẩn lạc đơn. Việc phân lập được tiến hành theo
phương pháp pha loãng trên dãy ổng thạch bán lỏng ( 1%) với môi trường có thành phần tương tự
như môi trường dùng trong phương pháp MPN (Widdel, Bak, 1992). Ống thạch bán lòng sau khi
bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ ống MPN (nguồn phân lập) được sục khí N2 và ủ ở tư thế đảo
8
ngược đầu tại 28°c trong bóng tối. Khuẩn lạc đom phát triển trong các ổng pha loãng được tách
bằng pipet Pasteur và chuyển sang môi trường dịch thể thích hợp (nước ngọt hay nước lợ).
2.2.3. Tách DNA tồng sổ từ mẫu quần thể và chủng vi sinh vật
DNA tổng số của quẩn thể vi sinh vật từ các ống MPN được tách chiết theo phương pháp
do Zhou và cộng sự (1996) mô tà với cải biến về nồng độ đệm phosphate là 120 mM thay cho

100 mM và nồng độ proteinase K là 14 mg/ml thay cho 10 mg/ml. DNA genome của các chủng
đom được tách theo phương pháp cùa Marmur (1961). Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được
hoà tan trong nước và bảo quản tại - 2 0 °c.
2.2.4. Phân tích đa dạng vi sinh vật bằng phương pháp AKDRA
ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses) đuợc sử dụng để nghiên cứu
mức độ đa dạng về di truyền của vi sinh vật dựa trên phân tích kết quả xử lý gen 16S rDNA bằng
enzyme giới hạn (Ravenschlag et ai, 1999). Gen 16S rDNA của các chủng đơn được khuếch đại
trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27 F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) và 1492R
(GGT TAC CTT GTT ACG ACT T), sau đó được xử lý bàng hai enzyme giới hạn Mspỉ và
HaeIII (Fermentas) (bảng 2.2). Sản phẩm DNA sau khi đã xử lý enzyme được phân tách bằng
điện đi trên gel agarose 2% tại 100 V trong thời gian 30 phút. Các chủng vi khuẩn sẽ được xếp
nhỏm đựa trên sự tương đồng về phổ các băng điện di.
Bảng 22. Phản ứng cắt gen Ỉ6 S rDNA bằng các enzyme giói hạn Mspl và Haeìll
Nước cắt vô trùng 18 ụl
1 Ox đệm R (hoặc đệm Tango) 2 p.1
Trộn đều và ly tâm nhanh, sau đó ủ hỗn hợp phản ứng tại 37 °c trong 3 giờ
2.2.5. Phương pháp điện di biến tính DGGE
Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA: Vùng V3-V5 của gen I6 S rDNA với độ dài 550 bp (hình 2.2)
được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCT ACG GGA GGC AGC AG)
và 907R (CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT) (Muyzer et ai, 1993). “Touch-down” PCR được
sừ dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sàn phẩm phụ trong phản ứng khuyeechs
đại. Đẻ tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên gel điện di biến tính, kẹp GC
khoảng 40 bp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GCC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G)
được gắn vào đầu 5’ cùa mồi GM5F.
Sản phầm PCR
Enzyme Hae III (hoặc Msp I)
10^1 (0,1 -0,5 p.g ADN)
1 |il (1 0 u/|il)
9
6 U 5 f

£<*># T uel Ec1f *
“ . / A.
___
^ mi
16S rDNA 0
VI V2 V3 , V4 j V5
i. ♦
+ E c S 1BrL a c ĩ W IAB2 WBAC7 £*1 406
HÕA2 ♦
itw
Hình 2.2. Vùng V3-V5 và vị trí các mồi trên gen 16S rDNA ở Lactobacillusplantarum
Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR khuyếch đại đoạn V3-V5 ờ vi khuẩn như sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR khuyếch đại vùng V3-V5 của
gen 16S rĐNA
Thành phần phản ứng
Thể tích (jil)
Chu kỳ nhiệt (touch-down PCR)
h 20 m q 27
Taq polymerase được đưa vào phàn ứng sau
IOx Taq buffer 5
bước biến tính đầu tiên ờ 94 °c trong 1 phút
BSA
5
khi nhiệt độ đạt 80 °c. Nhiệt độ gắn mồi
MgCl2(20 mM)
4
được đặt cao hon 1 0 °c so với nhiệt độ lý
dNTP (2,5 mM mỗi loại)
4
thuyết (tức là 65 °C). Sau mỗi chu kỳ nhiệt

Mồi GM5F-GC (50 pmol/nl)
1
độ gắn mồi giảm đi 0,5 °c cho tới khi đạt
Mồi 907R (50 pmol/fi.l)
1
tới 55 °c, ờ nhiệt độ này phản ứng tiến hành
ADN khuôn 2
thêm 15 chu kỳ. Thời gian kéo dài chuỗi
Taq polymerase
1
cùa môi là 3 phút.
Tổng thể tích phản ứng 50
DGGE: Điện di được tiến hành trên gel polyacrylamide 6 % với dải biến tính
urea/formamid từ 30% đến 60%. Quá trình điện di được thực hiện bằng bộ điện di Dcode™
System (BioRad) ở nhiệt độ 60 °c tại 200 V trong 3,5 h. Sau khi điện di, gel polyacrylamide
được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nước và
chụp ảnh duới tia u v trên máy GelDoc (BioRad). Băng điện di được cắt và thôi trong nước qua
đêm tại 4 °c. Dịch thôi DNA được dùng lảm khuôn để thục hiện phản ứng PCR như chu trình
nhiệt của phản ứng PCR cho DGGE với cặp mồi GM5F (không có kẹp GC) và 907R. Sàn phẩm
PCR tiếp theo được tinh sạch và giải trình tự.
2.2.6. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại
Gen 16S rDNA cùa các chủng đơn (1500 bp) hoặc sản phẩm PCR từ các bãng điện di
biến tính (550 bp) sau khi tinh sạch bằng kít (Bioneer - Hàn Quốc) được tiến hành phản ửng đọc
trình tự với ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing kit và đọc trình tự trên máy tự động
10
3110 Avant Appied Biosystems. Trinh tự gen sau đó được phân tích so sánh với trình tự 16S
rDNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng
phần mềm BLAST Search. Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbour-joining
(Saítou, Nei, 1987), trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều
(Felsenstein, 1985).

2.2.7. Phương pháp FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) (Amann et al., 1992)
Nguyên lý: FISH là phương pháp lai sử dụng các đầu dò thích hợp bắt cặp với rRNA nhàm xác
định phả hệ cùa vi sinh vật trong quần thể một cách trực tiếp, không qua bước phân lập và nuôi
Chuẩn bị bóa chất:
Formaldehyde 37% PBS I Ox
5 M NaCl I M Tris-HCl
0,5 M EDTA SDSỈ0%
Formamide DAPI (0,02 mg/ml)
Đầu dò: là các đoạn oligonucleotide đài 18-20 nucleotide gán chất huỳnh quang
sulphoindocyonide (CY3, hấp phụ bước sóng 552 nm). Các đầu dò đã sử dụng trong nghiên
cứu này được liệt kê trong bảng dưới đây (nồng độ 2 ng/^1).
Bảng 2.4. Các đầu dò sử dụng trong nghiên cứu
Tên đầu dò Đối tượng bắt cặp
Trình tự (5’-> 3’)
Formamide (%)
ALF968 a -Proteobacteria
GGTAAGGTTCTGCGCGTT 2 0
BET42a p -Proteobacíeria
GCCTTCCCACTTCGTTT 35
GAM42a y-Proteobacteria AAACGATGTGGGAAGGC
35
Bảng 2.5. Chuẩn bị đệm lai và đệm rửa
Dung dịch gổc
Thê tích
2 ml đệm lai 50 mi đệm rửa
5 M NaCl 360
9 ml 900 mM
1 M Tris/HCl
40 ụ\
1 ml 20 mM

Form amide % phụ thuộc từng đâu dò
0,5 M EDTA 0,5 ml 5 mM
Nước cât vô trùng dân tới 2 ml dân tới 50 mi
SDS 10% (bô sung cuối
cùng để tránh kết tủa)
2ịil 50 ịiị 0 ,0 1 %
Các bước tiến hành:
Cố đinh mẫu:
- Hoà 0,5 g mẫu đất/bùn ưong 1,5 ml PBS lx
- Bổ sung formaldehyde vào mẫu tới nồng độ 2 - 4% và cố định ở 4°c trong thời gian ít nhất
ỉà 30 phút nhưng không quá 24 h.
- Ly tâm, loại phần dịch và rửa lại cặn tế bào bàng PBS IX
- Ly tâm, loại PBS lx và bổ sung 1,5 ml hồn hợp dung dịch etanol/PBS (1:1)
- Bảo quản tế bào đã cố định tại -20°c.
Lai với đầu dò:
- Lấy 15 - 20 mẫu hoà vớí 2 ml nước cất vô trùng vả đưa lên màng polycarbonate (0 ,2 ịim).
- Để khô mẫu trong không khí và bảo quản trong hộp kín tại -20°c cho đến khi sử dụng.
- Chia màng thành các phần nhỏ để tiến hành lai (một màng có đường kính 25 mm có thể chia
làm 6 - 8 phần sử dụng cho các đầu dò khác nhau). Dùng bút chì đánh dấu mẫu (bằng số).
- Chuẩn bị 2 ml đệm lai trong ổng eppendorf (bảng 2.5)
- Chuẩn bị dung dịch đầu dò: trộn 2 fil đầu dò (2 ng/|il) với 18 jnl đệm lai trong ống eppendorf
0,5 ml, giữ trong đá, tránh ánh sảng.
- Đặt một miếng giấy thẩm vào ống Falcone 50 ml, đổ phần đệm lai còn lại vào ống.
- Đặt mảnh màng polycarbonate lên lam kính, mặt có mẫu lên trên. Các mẫu lai với cùng một
đẩu dò có thể đặt cùng trẽn một lam kính.
- Nhỏ hỗn hợp đầu dò lên các mẫu và đặt toàn bộ lam kính vào ổng falcon có miếng giấy lọc
thấm đệm lai đã chuẩn bị trước (ở tư thế nằm ngang) và lai ờ 46°c trong thời gian ít nhất là
90 phút (nhưng không quá 3 h).
- Chuẩn bị 50 ml đệm rửa trong ống falcon 50 ml
- Chuyển nhanh mẫu sau khi lai vào đệm rửa đã được làm nóng trước đó trong bể ổn nhiệt tại

48 °c trong 15 phút. Gạn bớt đệm và đổ mẫu ra đĩa Petri. Dùng kẹp gắp mẫu, nhúng qua
nước cất vô trùng trong vài giây và đặt lên giấy thấm cho khô (mật có mẫu ở trên).
Nhuôm đối chửng và quan sát:
- Đe nhuộm đối chứng, nhỏ 50 nl dung dịch DAPI lên mồi mẫu, giữ 3 phút trong tối, sau đó
rửa nhanh trong nước cất và rửa trong cồn 80% trong vài giây rồi để khô trong không khí (đặt
trong hộp tối). Mầu có thể được bảo quản trong -20°c trong vài ngày mà tín hiệu huỳnh
quang không bị thay đổi.
- Phủ một lớp Citifluor/Vecta shield (4:1 v/v) và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
2.2.9. Định lượng Fe(II), Mn(II) và nitrate
Định Iưựng Fe(II) bằng thuổc thử phenanthroiin {DIN 38406 E1-], 1983)
Nguyên lý: O- phenanthrolin phản ứng với Fe(II) tạo phức có màu tím đỏ trong khoảng pH 3 -9,
đo được ở bước sóng 510 run. Nồng độ Fe(II) cho phép là 0,01 - 5 mg/L. Ket quà của phép đo có
thể bị ảnh hưởng bời ion Mn và Cu.
12
Chuẩn bị:
Dung dịch HC1 25% (rửa dụng cụ): dụng cụ thủy tinh thí nghiệm phải được rửa qua dung
dịch HC125% sau đó tráng bằng nước cất trước khi sử dụng.
Dung dịch H2SO4 loãng (hạ pH): H2 SO4 đặc : nước =1:4
Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm):
CH3COONH4 40 g
CH3COOH 50 mi
Nước cất đủ 100 ml
Dung dịch phenanthrolin 21 mM (tạo phức):
C12H9C1N2.H20 0,5 g
Nước cất đủ 100 ml
(Bảo quản trong lọ tối, hạn sử dụng trong 1 tuần)
Dung dịch chuẩn:
FeS04.7H20 2,78 mg
HC1 25% 6,25 ml
Nước cất đù 100 ml

Tiến hành:
- Sau khi thu mẫu, ngay lập tức hạ pH tới 1 bàng dung dịch H2SO4 loãng (1% thể tích)
- Thêm vào 50 ml mẫu 5 ml dung dịch ammonium acetate, trộn đều bàng vortex. Hỗn hợp
phải có pH nàm trong khoảng 3,4 - 5,5 (tối ưu là 4,5).
- Thêm 2 ml dung dịch phenanthrolin, trộn đều.
- Thêm nước cho tới 100 ml, trộn đều. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
- Đo OD tại bước sóng 510 nm.
- Đường cong chuẩn được tiến hành với nồng độ Fe(C) trong khoảng từ 5 - 50 ỊiM.
Định Iưọng nitrate bằng tbuổc thử acid disulfofemic (Lê Đức, 2004)
Nguyên lý: ĩon NƠ3~ tác dụng với acid disulfofemic tạo thành nitrodisulfofemic, phàn ứng với
ammonia (NH3) đặc tạo thảnh phức có màu vàng, xác định được ở bước sóng 410 nm. Nồng độ
NO3- cho phép là 0,5 - 5 mg/L.
Chuẩn bị:
Dung dịch acid disulfofemic:
Phenol tinh khiết không màu 25g
H2SO4 đặc (tinh khiết) 150 ml
H2 SO4 bốc khói (oleum) 75 ml
Trộn đều, đun sôi cách thủy trong bình cầu gắn ống sinh hàn hồi lun trong 2 giờ.
Dung dịch chuẩn:
KN03(đãsấykhôờ 105 °C) 0,1631g
Nước cất 500 mỉ
13
CHClj lml
Nước cất dẫn đủ 1000 ml
Tiến bành:
- Mầu nước (chúa không quá 5 mg/L NO3) lấy vảo ống nghiệm, trung hòa đến pH 7.
- Chuyển mẫu sang chén sứ, cô cạn bằng đun cách thủy.
- Thêm 2 ml dung dịch acid disulfofemic, hòa tan phần cặn bằng đũa thủy tinh.
- Thêm 20 ml nước cất, 6 ml NH3 đặc hoặc 6 ml KOH 12N.
- Thêm nước cất cho đủ 50 ml (trong bình định mức).

- Đo OD tại bước sóng 410 tun.
- Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung dịch chuẩn trong khoảng từ 0-10 mM.
Định lượng Mn(n) bằng thuốc thử formaldoxime (Brewer and Spencer, 1971)
Nguyên lý: Mangan phản ứng màu với formaldoxime (formaldehyde oxime) trong môi trường
kiềm tạo thành phức có màu cam đò đậm, xác định ờ bước sóng 450 nm. Để không hình thành
các kết tủa hydroxiđ, pH tối ưu cùa phương pháp này lả 8 ,8 - 8,9.
Chuẩn bị:
Dung dịch formaldoxime:
20g Hydroxygenlamine hydrochloride hòa tan trong 450 ml nước cất, thêm 10 ml dung
dịch formaldehyde 37% và thêm nước đến 500m].
Dung dịch ammonia (NH3)
Hỗn hợp formalđoxime:ammonia theo ti lệ 5:2 (thể tích)
Dung dịch chuẩn (100 )ag mangan/ml):
Hòa tan 0,2876 g permanganate kali (KMn04) trong 100 ml nước cất, thêm 3 ml dung
dịch H2 SO4 đầm đặc, dẫn acid sunfurous (SO2 trong nước) cho đán khi dung dịch mất
màu. Đun sôi dung dịch để loại bỏ SO2 thừa sau đó iàm lạnh. Bổ sung nuớc cho đù 1 lít.
Tiến hành:
- Đưa 35 mi mẫu về pH = 8 , 8 - 8,9
- Thêm 3 ml hỗn hợp Formaldoxime/Ammonia vào lắc xoay tròn, đều.
- Sau 2 - 30 phút đo quang phổ hấp thụ ờ bước sóng 450 nm.
- Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung địch chuẩn trong khoảng từ 0 - 10 mM.
14
CHƯƠNG IU. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xấc định số lưọng vi ldraẩn oxy hỏa Fe(]I), khử N O 3' tại các mỏi trưừng nghiên cứu
Ba môi trường đại diện được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu gồm có bủn đáy ao nước
ngọt, chân ruộng lúa ngâp nước và trầm tích nước lợ ven biển. Đây là những môi trường có hoạt
động vi sinh vật trong chu trình chuyển hoá sắt và nitrogen cao (Ratering, Schnell, 2000). số
lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3" trong các mẫu thu thập được xác định thông qua
pbưcmg pháp MPN sử dụng môi trường địch thể chứa FeSC>4 làm chất cho điện tử và NaNƠ3 làm
chất nhận điện tử cuối cùng. Thành phần khoáng trong môi tnrờng tương ứng với điều kiện nước

ngọt (đối với mẫu bùn đáy ao và chân ruộng ngập nước) hoặc nước lợ (đối với mẫu bùn ven biển).
Sự phát triển của vi sinh vật sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(n) trong các ống MPN được nhận biết
thông qua biến đổi màu sắc của môi trưởng từ ừấng xanh (màu của Fe(II)) sang màu vàng nâu
(màu của Fe(ni)) (hình 3.la).
Hình 3.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử N O 3 - trong các môi trưởng
sinh thái khác nhau, (a) - Nhận biết sự có mặt của vĩ khuẩn trong các ống MPN
thông qua biến đổi màu sắc của môi trường từ trắng xanh (Fell) sang vàng nâu
(Felll). (b) - Sổ lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(n), khử N (V xác định thÔDg qua
phương pháp MPN.
Kết quả cùa thí nghiệm MPN (hình 3.1b) cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử
NO3 cao nhất trong mẫu bùn chân ruộng ngập nước (9,3 X 103 tế bào/g bùn), cao hcm hẳn so với
mẫu trầm tích nước lợ ven biển (4,3 X 103 tế bào/g trầm tích) và mẫu bùn đáy ao nước ngọt (1,5 X
1 0 3 tế bào/g bùn). Mật độ và mối tương quan giữa số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NCV
với các điều kiện môi trường tại mỗi vùng sinh thái như trên cũng đã được tìm thấy ữong một số
nghiên cứu trước đây (Weber et al., 2006b,c; Ratering, Schnell, 2000; Hauck et al., 2001;
Ratering, 1999; Straub et a i, 1996).
15
3.2. Phân tích cấu trúc quần thể bằng điện di biến tính DGGE
Để Xác định các nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II)/khử NO3- chiếm ưu thế tại các môi trường
nghiên cứu, chúng tôi tiến hành phân tích cấu trúc quần thể trong các ống MPN ở độ pha loãng
10" 3 (là nồng độ gần tới hạn cùa dãy MPN đối với cả 3 mẫu) bẳng phương pháp PCR-DGGE
đoạn gen 16S rDNA (hình 3.2). Các băng điện di đuợc cắt từ gel và sử dụng lảm khuôn cho phản
ứng PCR tiếp sau để xác định trình tự và so sánh với các trình tự 16S rDNA đã công bố trong
ngân hàng đữ liệu GenBank.
R lì
•+• Pseudomonas sp.
Paracoccus SD. -►
Anaeromvxobơcter SV.+-
Hình 3.2. Phổ điện di biến tính (DGGE) phân tích đoạn gen Ỉ6 S rDNA của quần thể vi
sinh vật trong các ống MPN của các mẫu nghiên cứu. A - Bùn ao nước ngọt; R

- Bùn chân ruộng ngập nước; B - Bùn trầm tích ven biển.
Cỏ thể thấy rằng các loài Anaeromyxobacter có mặt trong cả 3 dạng môi trường nghiên
cứu. Đây là nhóm vi khuẩn nằm trong phân lớp h-Proteobacteria, hiện mới chi có một loài duy
nhất được công bố là A. dehaỉogenans cùng với một sổ đại diện chưa định đanh đến loài. Các
chủng Anaeromyxobacter đã công bố đều sinh trường kỵ khí khử Fe(III), chưa có chùng nào 4
được nghiên cứu về khả năng sinh trưởng khừ NO3”, sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Treude
et ai., 2003; Straub, Buchholz-Cleven, 1998; Straub et al., 1996). Trong môi trường nuôi cấy sử
dụng ờ đây (cũng như trong điều kiện tự nhiên), Fe(III) đồng thời tồn tại với Fe(II) đo kết quả
chuyển hoá Fe(II) bằng con đường hoá học (phàn ứng với lượng nhò oxygen trong môi trường)
và con đường sinh học (đo các vi sinh vật oxy hoá Fe(II) khử NC>3_). Do vậy, sự có mặt cùa các
loài sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) như Anaeromyxobacter trong điều kiện môi trường nghiên
cứu trên (cũng như trong tự nhiên) là mắt xích khép kín chu trình chuyển hoá sẳt tại đây.
Hai nhóm vi khuẩn Paracoccus và Pseudomonas tương ứng chiếm ưu thế trong các mẫu
bùn ao nước ngọt và chân ruộng ngập nước. Đây là hai chi thuộc lófp Proíeobacteria, có nhiều đại
diện sinh trưởng kỵ khí khử NOj", bao gồm cả các loài có khả nãng sử dụng Fe(II) làm chất cho
điện tử (Weber et aỉ., 2006b,c; Ratering, Schnell, 2000). Như vậy có thề kết luận ràng trong môi
trường nước ngọt tại Việt Nam (đại diện là ao nước ngọt và ruộng ngập nước), Paracoccus và
16