Nghiên cứu qui trình phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất Terpenoit và Flavonoit từ cây thuốc Việt Nam

DAI HOC QUÒC
GIÀ HA
NÓI
TRUÒNG
KHOA HOC
TlS
NHIÈN
DE TÀI NGHIÉN CÙU DÀC BIÉT
BÀO CÀO TÓNG HOP
KÉT
QUA
NGHIÉN
ClTU
CÙA
DE
TÀI
rÉNDÈTAI:
NGHIÉN
cùu
QUI TRÌNH PHÀN LÀP
VA
KHÀO SÀT
HOAT TINH SINH HOC
CÙA
CÀC HOP
CHAT
TERPENOIT
VA
FLAVONOIT
TU
CÀY THUÓC VIÉT NAM

VIA
SO:
QG 06-07
:HU
NHIÉM
DE
TAI:
PGS.
TS. Nguyen
Vàn
Dau
HA
NÓI-
2008
MUC LUC
• •
PHÀN
A
BÀO CÀO
TOM
TÀT
1.
Bao cào
tóm
tat 2
2.
BriefReport 7
PHÀNB
BÀO CÀO TÓNG
HO?

l.Mòdàu
12
2.
Noi dung
nghién cùu cùa
de tài 13
2.1
Muc tiéu cùa de tài
2.2 Noi dung nghién
cùu
cùa
de
tài
3.
Thuc
nghiém 15
3.1 Diéu ehé càc can chiét
3.2 Phàn tich thành phàn càc phàn chiét bang SKLM
3.3 Phàn tàch càc phàn chiét bang SKC
3.4 Xàc dinh càu
trùc
phàn
tii'
cita chat
phàn lap
3.5 Khào sàt hoat tinh sinh hoc
4.
Ket qua dat
duoc
20

4.1
Cày xuyén tàm lién
4.2 Cày xa den
4.3 Cày voi
4.4 Co nho noi
5. Ket
luan
26
6. Tài
lieu
tham khào 27
PHÀNC
PHÀN
CUOI
BÀO CÀO
1.
Phu
lue
càc còng trình 28
2.
Tóm tat càc còng trình NCKH cùa cà nhàn 29
3.
Scientific
Project 35
4.
Phiéu dàng ki két qua nghién cùu KH-CN 39
PHAN
A
BÀO CÀO TÓM TÀT
A. TÉN

DE
TÀI
Nghién cùu qui trình phàn lap va khào sàt hoat tinh sinh hoc cùa càc hop
chat terpenoit
va
flavonoit
tu'
cày thuoc Viet Nam
MA SO: QG-06-07
B.
CHÙ TRI
DE
TÀI
PGS.TS.
Nguyén Vàn Dàu
C. CÀC CÀN BO THAM
GIÀ
Càc hoc
vién
cao hoc:
1.
Nguyen
Dinh Chung
2.
Do thj Thanh
3.
Tran thj Hiéu
4.
Tran
Thi

Vàn
Càc
sinh vién khóa luàn tòt nghiép
1.
Le
Duy Hiéu
2.
Pham Huyén Trang
3.
Nguyén thi
Bich
4.
Le
thj Huyén
5.
Hòang
Nhu Trung
Càc càn ho
phói
hop
Ngu\'én
Nghla Thìn
Tran
van
On
Le Mai
Huang
Danu
Vù
LuQ-ne

D.
MUC TIÉU
VA
NÓI DUNG
NGHIÉN CUU
1.
Muc
tiéu
cùa
de tài
Nghién cufu phàn lap càc hoat
chat
chinh
tu
mot
so
cày
thuóc
Viet Nam
va
khào sàt
sa bp hoat tinh sinh hoc cùa càc chat phàn lap.
2.
Noi dung nghién curu cùa de tài
Nói dung nghién cùu bao gòm càc chuyén de sau:
1-
xày
di/ng
qui trinh thich hdp de chiét
càc

hoat chat
co
trong cày thuóc .
2-
tò'i
u'u
hóa qui trình phàn tàch
va
tinh che de thu càc hoat chat ò dang tinh
khiét.
3- xàc dinh cà'u trùc cùa càc chat phàn lap.
4-
khào
sàt sd bo boat
tinh
sinh hoc
cuà
can
chiét
tong
va
cùa càc chat phàn làp.
5- dành già hiéu qua
chCi'a
bénh cùa cày thuóc dua trén két qua nghién
cù'u.
Càc i&p chat quan tàm phàn iap:
1-
Càc
hgp

chat terpenoit
2-
Càc hgp chat flavonoit
Càc
Ioai
hoat tinh sinh hoc dà khào sàt:
Càc chat phàn
lap
sé
du'dc
khào sàt theo càc Ioai hoat
tinh
sinh hoc sau:
1.
Khà nàng chóng oxi hoà
*
phàn
ù'ng cùa indigocarmin vói peroxidaza màu
ngUòi;
* phàn ù'ng vói
2,2-dlphenyl-1-picrylhydrazil
(DPPH))
2.
Khà nàng khàng mot so vi sinh vàt
* vi
khuà'n
Gr(+)
* VI khuan Gr(-)
* nàm moc
* nam men).

3. Khà nàng khàng té bào ung thu
* KB: té bào ung
thu"
bieu mò
* FL: té bào ung thu màng
tu'
cung
* RD: té bào ung thu màng tim
* Hep-2: té bào ung
thu"
gan.
* Lu: té bào ung thu' phói
Càc cày thuoc dà
dux>^
khào sàt
1.
Xuyén tàm lién {Andrographis paniculatai Nees.), ho Òro {Acanthaceae)
2.
Cày xa den (Celastrus Hindsu Benth). ho Day rói (Celastraceae)
3.
Cày vói (Cleistocalyx operculatus Roxb.), ho Sim (Myrtaceae)
4.
Co nho nói {Eclipta alba Hassk., ho Cùc, Asteraceae )
E.
CÀC KÉT QUA DAT DU'OC
1. Két qua khoa hoc
1.1 Phàn làp va nhàn dang 9 hap chat terpenoit sau:
a.
Càc hdp chat sesquiterpen
tu'

cày co nho nói
1.
Wedelolacton
2.
Desmetylwedelolacton
b. Càc hdp chat diterpen
tu'
cày xuyén tàm lièn
1.
Andrographolide
2.
Neoandrographolide
3.
14-deoxyandrographolide (DA)
4.
14-deoxy-11,12-didehidroandrographolide
e.
Càc hdp chat triterpen
tu'
cày vói va cày xa den
1.
Axit ursolic
2.
Axit oleanolic
3.
p-Amyhn (5a-olean-12-en-3p-ol)
1-2 Phàn làp va nhàn dang 4 hap chat flavonoit sau:
a.
Hdp chat flavonoit
tu'

co nho nói
1.
Luteolin
b. Càc hdp chat flavonoit
tu'
cày vói
1.
2,4-dihidroxi-6-metoxi-3,5-dimetylchaleon
2.
7-hidroxi-5-metoxi-6,8-dimetylflavanon
3.
3,5,7,4'-tetrahidroxiflavon (kaempferol)
1.3 Càc chat khàc tu cày xa den
1.
6-metoxy-2,2-dimetyl-5-nitro-2H-chromen-7-ol.
2.
p-AmyrJn-3-O-sucxlnat
(dièu ehé tu p-Amyrin),
1.4 Khào sàt hoat tinh sinh hoc
1.
Hoat tinh khàng vi sinh vat dà tién hành
vó-i:
a.
2,4-dihidroxi-6-metoxi-3,5-dimetylehalcon
b. andrographolide
e.
neoandrographolide
2.
Hoat tinh chóng oxi hóa dà tién hành
vó-i:

a.
Wedelolacton
b. Desmetylwedelolacton
3.
Hoat tinh chóng ung
thu-
gan dà tién hành vai:
a.
Wedelolacton
b. Desmetylwedelolacton
e.
5a-olean-12-en-3p-oi (p-Amyrin)
d.
p-Amyrin-3-O-sucxinat
e.
6-metoxy-2,2-dimetyl-5-nitro-2H-chromen-7-ol
4.
Hoat tinh chóng ung thu phói dà tién hành
vó-i:
a.
5a-olean-12-en-3p-ol (p-Amyrin)
b.
p-Amyrin-3-O-sucxinat
e.
6-metoxy-2,2-dimetyl-5-nitro-2H-chromen-7-ol
2.
Két qua dào tao
2.1
Thae sT dà bào ve thành còng: 4
2.

Nguyén Dình Chung
3.
Do thi Thanh
4.
Tran thi Hiéu
5.
TvC\n thi Vàn
1 1
2 Cu nhan tòt nghiép: 5
1.
Le Duy Hiéu
2.
Pham Huyén Trang
3.
Nguyén thi Bieh
4.
Le thi Huvèn
2.
BRIEF
REPORT
a. Project
Title:
Study on the isolation procedure and examination on biological actìvìties of
terpenoids and flavonoids from Vietnamese medicinal plants
Code: QG-06-07
b.
Project Leader
Ass.
Prof.
Dr. Nguyen van Dau

e.
Participants
Graduate students (MS):
1.
Nguyén Dình Chung
2.
Do thi Thanh
3.
Tran thi Hiéu
4.
Tran thi Vàn
Undergraduate
students (BS)
1.
Le
Duy Hiéu
2.
Pham Huyén Trang
3.
Nguyén thi bieh
4.
Le
thi Huyén
5.
Hòang Nhu trung
Co-Operators
Nguyén NghTa Thìn
Tran
vàn
On

Le
Mai
Htrong
Dang Vù
Luang
d. Aim and
Research
Tasks
1.
The Project Aim
Study on the isolation of the prineiple eompounds from se\eral Vietnamese
medicinal plants and preliminarily biological examination of the isolates.
2.
The Research Tasks
Include the followings:
1-
To work-up the convenient procedure for isolating the
prineiple eompounds
from the interested plants.
2-
To work-up the isolation process and purification method for the
prineiple
eompounds.
3-
To elucidate structure of the isolates.
4-
To carry out preliminarily biological examination on the isolates.
5-
To estimate roughly the pharmacologieal property of the medicinal
plant

based on the research resulls.
The famiiy of
eompounds
interested:
Terpenoids and Flavonoitds
Biological examination:
The isolates were examined in the following
bioactivities:
1.
Anti-oxidative
activity
* reaetion of indigocarmine with the human peroxidase;
*
reaetion with
2,2-diphenyl-l-pierylhydrazil
(DPPH))
2.
Anti-bacterial
activity
*
baeteria Gram Negative, Gr(-)
* baeteria Gram Positive,
Gr(+)
* Fungi
* Yeast.
3.
Anti-cancerous
actìvìties
*
human cancer celi

line,
KB
* human cancer
celi
line, FL
*
human cancer
celi
line, RD
*
human cancer
celi
line, Hep-2
* human cancer
celi
line, Lu
Medicinal Plants investìgated:
1.
Andrographis
paniculatai
ì:^e^s,
Family Acanthaceae
2.
Celastrus Hindsu Benth, Family Celastraceae
3.
Cleistocalyx operculatus Roxb., Family Myrtaceae
4.
Eclipta alba Hassk, Family Asteraceae
e. Achieved Results
/.

Scentific
Results
1.1
Isolation and
idetification
of 9 terpenoids as
below:
a. Sesquiterpenoids from Eclipta alba Hassk
1.
Wedelolactone
2.
Desmethylwedelolaetone
b.
Diterpenoids from Andrographis
paniculatai ^:^tts
5.
Andrographolide
6. Neoandrographolide
7.
14-deoxyandrographolide
(DA)
8.
14-deoxy-11,12-®idehidroandrographolide
e. Triterpenoids from Cleistocalyx operculatus Roxb and Celastrus Hindsu Benth
1.
Ursolic acid
2.
Oleanolic acid
3.
P-Amyrin

(5a-olean-12-en-3P-ol)
1.2
Isolation and
ìdentìfication
of 4 flavonoids as below.
a. Flavonoid from Eclipta alba Hassk
1.
Luteolin
b.
Flavonoit from Cleistocalyx operculatus Roxb
1.
2,4-dihydroxy-6-methoxy-3,5-dimetylehaleone
2.
7-hidroxy-5-methoxy-6,8-dimethyltla\anone
3.
3,5,7,4'-tetrahydroxyflavone
(kaempferol)
1.3
Other eompounds
from Celastrus Hindsu Benth
1.
6-methox>-2,2-dimethyL5-nitro-2H-ehromen-7-ol.
2.
p-Amyrin-3-O-suecinate
(prepared from P-Amyrin).
1.4
Biological examinations
1.
Anti-bacterial activity has been examined with:
a, 2,4-dihydroxy-6-methoxi-3,5-dimethylehalcone

b.
andrographolide
e.
neoandrographolide
2.
Anti-oxidative activity has been tested with:
a. Wedelolactone
b.
Desmethylwedelolaetone
3.
Anti-liver
cancerous activity has been examined with:
a. Wedelolactone
b.
Desmethylwedelolaetone
e.
5a-olean-12-en-3P-ol
(P-Amyrin)
d. p-Amyrin-3-O-sueeinate
e. 6-methoxy-2,2-dimethyl-5-nitro-2H-ehromen-7-ol
4.
Anti-lung
cancerous activity has been examined with:
a.
5a-olean-12-en-3p-ol
(P-Amyrin)
b.
P-Amyrin-3-O-suecinate
e.
6-methoxy-2,2-dimethyl-5-nitro-2H-chromen-7-ol

2.
Educational Results
2.1 Graduated Students (MS): 4
1.
Nguyén thj Viét Thanh
2.
Nguyén Dình Chung
3.
Dò
thj Thanh
4.
Tran thi Hiéu
2.2 Undergraduated Students (BS): 5
1.
Nguyén vàn Thuàn
2.
Le
Duy Hiéu
3.
Pham Huyén Trang
4.
Nguyén thi Bich
5.
Le
thi Huyén
PHÀN B
BÀO CÀO TÓNG HOP
I.MÒDÀU
Càc hdp chat thién nhién dóng mot vai trò quan trong trong viéc phàt trien càc thuoc chua
bénh.

Phan
lón
càc
dUdc
pham déu
dUdc
phàt hién
va
phàt
trién
tC/
càc hdp chat phàn lap
tir
càc
dóng,
thUc
vat. Nhiéu hdp chat thién nhién
dUdc sCr
dung
truc tiép
nhu là thành phan hoat chat
chinh cùa thuò'c,
mot
so khàc
dUdc
su' dung làm chat dau hoac chat màu de tong hdp ra càc hdp
chat
co
hoat
tfnh

hdn, hoac
dUdc
dùng làm "chat màu" sinh hóa de nghién
cùu dUdc li va
làm sàng
tò Cd che tàc
dung cùa thuoc,
Viét nam
co
mot he thuc vat rat da dang
va
phong phù vói hdn 12.000
loài,
1200 chi thuóc
hdn 300 ho
thUc
vàt, trong dò
co
khoàng 3.200 loài cày
dUdc su'dung
trong y hoc dàn
toc
[1]. Chinh
vi vày, viéc nghién cùu phàt hién
va
khai thàc tài nguyén vó già này
nhàm
tìm ra càc hdp chat
co
hoat

tinh
sinh hoc cao là mot còng viéc
co
y nghla khoa hoc
va
thuc
tién.
Trong so càc nhóm bénh pho bién
va
nguy
hiém
nén y hoc luón phài dó'i mat vói càc bénh di
gay
nguy
ed
bùng phàt thành dai
djch,
nhu lày nhiem do virus (gan, HIV, cùm, ), càc dang ung
thu,
d|
LTng,
Nhùng chùng bénh này
gay
nén
suton
thàt nàng né cho xà hòi, làm
ành
huòng tram
trong dén nhàn
lue

san xuàt cùa nén kinh
té,
Do vày, viéc tìm kiém càc hoat chat
tu'
càc dUdc liéu truyén thó'ng,
va
tiép theo là phàt trién
thành càc dUdc pham
co
nguón góc thién nhién
vùa
rè lai
co
hiéu qua
va
tfnh an toàn cao là mot
nhiém vu chién
lUdc
quan trong trong viéc phòng
va chij'a
bénh
ma
càc nhà khoa hoc càn phài
quan tàm
va co
tràch nhiém chia sé.
càc bénh gay ra do virus (càc dang viém gan virus A, B, C, E, HIV, cùm, ), càc dang ung
thu,
chiém mot
ti

le khà cao trong
ed
càu càc bénh pho bién trén toàn the
giòi.
Vi
du, d Viet Nam,
héng
so nguòi bi nhiém virus gan chiém
khoàng
20% dàn so; bénh vién
U
buòu
va
bénh vién K d
Ha
Nói
va
tp. Ho
Chi
Minh luón trong trình trang
qua tài
bénh nhàn. Xuàt phàt
tu'thuc
trang cùa xà
hòi,
viéc phàt trién dUdc liéu trén
ed so
tài nguyén
san co
cuà dàt nUóc là mot nhu càu càp bàch

va
co
tfnh khà thi cao. Trong nhùng
nàm
gàn
day
cùng
vói
su lón manh cùa dói ngù càc nhà nghién
cùu khoa hoc, su quan tàm cuà Nhà nuòc trong ITnh vUc dòng dUdc dà dem lai nhùng thành tuu
dàng ké.
DUa trén kinh nghiém làu dòi cùa nén y hoc co truyén ve viéc su' dung càc dUdc liéu
qui
trong
diéu tri càc bénh pho
bién,
de tài nghién cùu này dUdc xày dung
nhàm
dóng góp vào chién
lUdc
phòng
chóng va
chùa tri càc bénh pho bién
va
hiém nghèo d nuòc ta. Su thành cóng cùa de àn
chic
chàn sé làm phong phù thém nguón dUdc
phà'm
cùng nhu làm giàm àp
lUc

ve tàm
li va
kinh té
dói vói còng
dóng,
dac biét dói càc bénh nhàn nghèo.
12
IL NÓI DUNG NGHIÉN CUU CUA DE TAI
Muc tiéu cùa de tài
là nghién cùu phàn lap càc hoat chat chinh
tu
4 cày thuóc pho bién cùa Viet Nam:
1.
Xuyén tàm lién {Andrographis paniculatai Nees.), ho
Òro
{Acanthaceae)
2.
Cày xa den (Celastrus Hindsu Benth), ho Day rói (Celastraceae)
3. Cày vói (Cleistocalyx operculatus Roxb.), ho Sim (Myrtaceae)
4.
Co nho
nói
{Eclipta alba Hassk., ho Cùc, Asteraceae )
va
khào sàt sa bp hoat tinh sinh hoc cùa càc chat phàn lap.
Noi dung nghién curu
cùa
de tài
bao góm càc phàn sau:
a. Xàv dung qui trinh chiét càc hoat chat

Trong càc cày thuóc
co
mat nhiéu lóp chat sinh hoc khàc nhau. Noi dung nghién cùu
này nhàm tìm ra mot qui trình ddn
giàn,
it
tón kém kinh
té va
eó tfnh khà thi
néu du'dc thi/c
hién
ò
qui mò pilot. Qua qui trinh chiét cùng dành già du'dc hàm
jydng tUdng
dói cùa can
tóng so vói
dUdc
liéu .
Phu'dng
phàp chiét ( tn'ch li) chon loc càc lóp chà't
tu
dói
tuang
thuc vat
dugc
dua
trén do phàn
ci/c va
dac tfnh chat riéng cùa chùng. Theo nói dung nghién cùu cùa de tài
chùng tòi

chi
quan tàm hai
ló'p chat
Terpenoit
va
Flavonoit. Tùy theo cày thuóc chùng tói dà
àp dung qui trinh chiét
vó'i
càc Ioai dung mòi khàc nhau
de
dièu
che
càc phàn chiét hoac
glàu
càc terpenoit hoac giàu càc flavonoit
ma
ft bi làn càc nhóm chat khàc. Càc dung mòi
thuò'ng
duac su dung trong qui trình chiét là
n-hexan,
diclometan,
etyl
axetat, etanol.
b. Khào sàt thành phàn cùa càn
chiét
tóng
Phàn chiét thu
dùdc
se
dùdc

phàn tfch bang phu'dng phàp sac kf lóp mòng nhàm
co
thòng tin ve so
lUdng
càc chat, hàm
lùdng tydng
dói, cùng
nhù
diéu kién phàn tàch sac kf
de thu càc
hgp
chat
ò*
dang tinh khiét. Phu'dng phàp phàn tàch
dùa
trén su' hap phu chon
loc cùa càc chat trén silica gel, poliamit, Muc dich cùa noi dung nghién
cuu
này là de xàc
djnh so lu'dng càc chat
co
hàm
lùdng tUdng
dói lón
va co khà
nàng phàn tàch
dùdc.
e.
Phàn làp càc hop chat terpenoit
va

càc hoat chat khàc
Su'
phàn lap càc chat
tu dUdc
liéu giùp cho chùng ta phàt hién càc hoat chat mdi,
va
hoàn thién qui trình phàn làp càc hdp chat
co
hoat tfnh cao dà biét. Do vày, tói uu qui trinh
phàn làp se c6 y nghla
thi/c tién
cùng
nhu"
dòng góp nhiéu vào nghién cùu
ed
bàn ngành
hoà
thi/c
vat. Noi dung nghién cùu cùa de tài tap trung vào viéc phàn làp càc terpenoit
va
flavonoit. Theo tài liéu dà
du-gc
còng bó càc lap
chat
này eó khà nàng Ioai
trù
(dàp tàt) càc
gòc tu do sinh ra trong qua trình òxi hóa
lipit.
Ò

muc dò khòng kiém soàt dugc, càc góc tu
do
co
the tham
già
vào càc phàn ung day truyén gay nguy hai cho càc té bào,
uc che
càc
enzym,
din dén mot
so
bénh lién quan dén viém, dj ung
va
ung thu. Noi dung cu thè bao
gòm:
(i)-
phàn tàch càc chat trén càc chà't hap phu khàc nhau nhu' silica gel, poliamit
va
rù'a giài nhd càc he dung mòi thfch hdp.
(ii)-
Tinh che bang phu'dng phàp két tinh lai
d. Xàc dinh càu trùc càc chat phàn làp
Nhàn dang cà'u trùc càc hoat chat dóng mot vai trò quan trong, giùp cho chùng ta
khang dinh muc tiéu dà dat dUdc
va
làm
ed so
cho viéc dành già hoat tfnh sinh hoc cùa
chat. Càu trùc cuà càc chat phàn làp
dùdc

xàc djnh
dùa
trén:
(i)-
càc phàn ùng djnh tfnh
(ii)-
àp dung phu'dng phàp phàn tfch vat
If
hién dai nhu phd UV, IR, MS
va
NMR
(iii)-
so sành càc dù liéu pho dà còng bó (néu
co)
(iv)-
do
va
so sành càc hàng so vàt If.
e. Thùhoat tinh sinh hoc
Mot so hdp chat phàn làp sé
óMc
khào sàt hoat tfnh sinh hoc thòng qua càc phép
thù invitro nhu chóng òxi hoà, khàng vi sinh vat gay ra càc bénh pho
bién,
gay dòc té bào
ung thu'. Càc phép thù này giùp cho chùng ta hình dung ra
ed
che tàc dung cùa càc hoat
chat, cùng nhu' hoat do cùa chùng
ò

mò hình thù. Noi dung nghién cùu này se cho phép
chùng ta
dùa
ra nhùng két luàn hùu fch trong viéc nén
su
dung chùng nhu the nào cho phù
hdp
(chàng
han,
su
dung vói muc dfch phòng chóng, hay ho trd hay
diéu
tri bénh).
Dành già hoat
tinh
cuà càc chat sé
dùdc thùc
hién cu the nhu sau:
1.
Khà nàng chóng oxi hoà
*
phàn
ùng cùa indigocarmin vói peroxidaza màu
ngu'òi;
* phàn ùng vói
2.2-diphenyl-1-picrylhydrazil
(DPPH)
2.
Khà nàng khàng
mot so

vi sinh vàt
*
vi khuan Gr(+)
14
vi khuan Gr(-
* nàm mòc
*
nàm
men).
3. Khà nàng khàng té bào ung thu
4 dòng ung thu té bào ngu'òi du'dc
su
dung là:
* KB: té bào ung thu biéu mó
* FL: té bào ung
thU
màng
tu
cung
* RD: té bào ung
thU
màng tim
* Hep-2: té bào ung
thir
gan.
* Lu: té bào ung thu phói
III.
THlTC
NGHIÉM
3.1 Dieu che can chiet

Càc mau cày sau khi thu hai dugc nhan dang
va
giù lai tiéu bàn. Bò phan quan
tàm là phàn trén mat dat, sau khi
Ioai
bò càc là già
va
bàn dugc sày khò trong khòng
khi va tiép theo nghién nho thành bgt.
Càc chat trong nguyén liéu thuc vat duac chiét theo nguyén tàc tàng dàn dò phàn
ciré.
Dàu tién, chùng dugc
ngàm
chiét vói etanol à nhiet dò phòng. Tiép theo, dich chiét
etanol + nuae dugc
phàn
bò làn
lugt
vai
«-hexan,
diclometan
va
etyl axetat. Qui trình
chiét va hiéu suàt diéu ehé càc phàn chiét dugc néu ra trong càc bài bào tucmg ung a
phàn/?/7w
lue.
3.2
Phan
tich
thành

phàn càc phàn
chiét bang SKLM
Sac ky lóp mòng (SKLM) dugc thuc hién trén bàn silica gel trang san DC-
Alufolien
60
F254,
day 0,2 mm (Merck). Càc dung mòi
thuòng
dugc dùng
de
trién khai
sac ki là
^-hexan,
aceton,
diclomentan,
CH2CI2,
etyl axetat, EtOAc
va
metanol. Chùng
dugc làm khan
va
chung càt lai truac khi pha theo ty le phù hgp.
Càc vét chat trén lóp mòng dugc phàt hién duói ành sàng tu ngoai
(?^=254
nm)
va
vói
dung dich vanilin/ axit sunfuric dac 1%, tiép theo ha nóng.
3.3
Phàn

tàch
càc
phàn chiét bang SKC
Sàe ky cót àp suàt
tlnròng
(CC) dugc thuc hién duói trong lue eùa dung mòi. Sàc
ky cgt nhanh
(FC)
àp dung khòng khi nén vói àp
lire
tu 0,2 - 0,3 bar
de
day dung mòi
ehay qua
còt
sàc ky.
Chat hap phu dùng cho sàc ki cgt là silica gel (Merck), ed hat 0,063 - 0,200 mm.
Cgt tàch sàe ky là mot òng thùy tinh hinh tru, phia duói eó khoa. Còt eó duóng kinh tuy
theo yéu càu su dung.
So'
dò sàc
ki cót àp
suàt thuòng trong phòng thi nghiém
iffinininininiiiifìini
luuuHunjijniiii
Óng
nghiém
thu phan doan
Pha he dung
nuV

3.4 Xàc djnh cau
trùc phàn
tu'
cùa chat phàn làp
Diém nóng chày dugc xàc dinh trén mày Boetius.
Pho LC-MS dugc ghi trén thiét bj LC-MSD-Trap-SL.
Pho hóng ngoai (IR) dugc ghi trén mày
Impae 410-Nicolet
FT-IR.
Phò tu ngoai (UV) do trén mày GBC 2855.
Phò khói lugng
(EI-MS,
70eV) dugc ghi trén mày Hewlett-Packard HP5890, #
IT
Phò còng huóng tu hat nhàn:
'H-NMR,
''C-NMR,
'-'C-NMR-DEP-135,
'^C-NMR-
DEP-90 dugc ghi trén mày Brueker
Advanee-500
MHz,
ehuàn
noi TMS
(tetramet)'
silan),
dò chuyén djch hóa hoc {5) dugc biéu thi bang ppm, hàng so J tinh theo Hz.
3.5 Khào sàt hoat
tinh
sinh hoc

3.5.1 Hoat tinh khàng vi sinh vàt
Hoat tinh khàng vi sinh vat duac
khào sàt
dua trén
kì
thuat
khuyéch
tàn trong mòi
truò'ng
thach dinh duàng dà tròn vói nhu dich vi sinh vat co
10^'-IO"
te bào
/mi
voi ti le
1%
so vói mòi
truòng.
Hoat
linh
duac xàc dinh thòng qua duòng kinh vùng ùc che su
phàt trien
ciìa
vi sinh
vai
(\'òng
vò khuan) sau mot thòi gian nuòi cay ó
nhicl
dò u
te)i
uu

tL.A^
HOC QUOC
GIÀ
HA
NQI
"RONG TÀW
THÒNG TIN THU VIÉN
[M±3A1
17
dò'i vói mòi chùng vi sinh vàt riéng biét. Nóng dò ùe che tói thieu
(MIC)
dugc xàc dinh
theo phuang phàp Vanden Bergher
va
Vlietlinck. Càc chùng vi sinh
vai dién
hình dugc
thij
góm hai chùng vi khuan Gram(-): Escherichìa coli DT 119 B14
va
Pseudomonas
aeruginosa VM 201; hai chùng vi khuan
Gram(-f-):
Bacillus
subtillis ATCC 6633 \à
Stapìiylococcus
aureus ATTCC
12228;
hai chùng nàm móc:
Aspergillus

nìgcr:
Fusarium
oxysporum\
hai chùng nam men: Candida
alhicans
ATCC
10231 va
Saccharomyces cerevisiae
3,5.2
Hoat tinh chóng oxi hoà
Phép thir vói
2,2-diphenyl-l'picrylhydrazJl
(DPPH)
Hoat tfnh chóng òxi hóa dà duac khào sàt theo phuang phap Patterai
[5].
Phép
thii duac thuc hien
bang
càch
tién
hành ehay sàe ki lóp
mòng-silica
gel vói càc chat can
dành già. Dùng dung dich 0,2% cùa
2,2-diphenyl-l-picrylhydrazil
(DPPH) làm thuóc
thù hien màu bàn móng. Sau 30
phùl
phun
bàn

mòng vói thuóc thù này néu vét chat hien
màu vàng
ihì dugc
coi là
co khà
nàng chóng òxi hoà. Hypophyllanlhin
(H,),
phyllanthin
(H2)
va
5,7,8-lrihidroxi-9,10-peoxi-4-ethoxy
benzo[2,3-d]coumarin (Ej)
cùng vói
quercelin dùng làm dói chùng dà dugc thù trong cùng
mot
diéu kien SKLM.
Phép
thir
vói Peroxydaza
Peroxydaza là
mot
enzym oxi hoà-khù phò bién ròng rài trong
thirc
vat, dóng
vai
va vi sinh vat;
nò
xùc tàc cho phàn ùng oxi hoà càc chat hùu co khi
co
mat cùa

HiO^
hoac càc peroxit khàc. Hoat tinh xùc tàc cùa peroxydaza dugc dành già
bang Ihói
gian
chuyén
màu cùa Indigocarmin
(tu'
màu xanh sang màu vàng). tuy thuóc vào nóng dò
màu
ihù
\'à
co hoal
tinh chon loc dói \ói tùng
Ioai
màu. Thòi gian òxi hoà
hc'l
indigocarmin ó màu dói chùng
dirgc
coi là 100% hoat dò. Peroxydaza trong thi nghiém
này dugc
làch lù
nhóm màu O (màu chóng dòng lày tai Trung
tàm
huyé't hoc \'à truyén
màu, Bcnh vièn Bach Mai, Ha
Nói).
18
3.5,3 Phuang
phàp
thir hoat tinh gay dòc té bào

Càc dòng té bào ung thu gan {Hep-2)
va
ung thu phòi
{Lu),
màng tu cung (FL),
biéu mò (KB)
va
màng tim (RD) dà dugc dùng
de
dành già hoat tinh gay dòc té bào
cùa càc chat
phàn
lap.
Qui trình chung.
Dòng té bào dugc bào quàn trong nita
long,
dành thuc
va
duy
tri
trong mòi truòng dinh
duòng MEME hoac DEME eó bò sung huyét thanh bé tuoi. Khi phàt trién dén phase
log té bào se dugc dùng
de
khào sàt vói màu
thù
gòm
4-10
thang nòng dò khàc nhau,
trén mot phién vi lugng 96 giéng

(lo).
Phién
thù
nghiém gòm té bào ung thu, mòi
truòng nuòi cày
va
màu thù dugc ù a 37 C duói bau khi
CO2
tu 48-72 gió
de
té bào tiép
tue
phàt trién. Tiép theo, lày phién ra, co dinh té bào, rùa, nhugm,
Ioai
thuoc nhugm
thùa
va
bòa lai trong dung dich
ehuàn.
Qui trình thù dugc lap lai ba làn. Két qua dugc
ghi lai trén mày dpe Elìsa a buóc
song 495-515
nm. Nòng dò bàn ùe
che (IC^n)
dugc
tinh theo chuang trinh
Tabi e
curve.
IV. KET QUA DAT DUOC
4,1 Cày xuyén tàm

lién
{Andrographis paniculata Nees, ho Orò, Acanthaceae) phàn
bò'
pho bién
ò
nhiéu nuóc
chàu
A, Trung Quóc, An Dò,
Vièl
Nam,
Nò
dugc dùng lù
làu trong càc bài thuóc co truyén a nhiéu nuóc de
chOa
tri
càm
sót, viém hong, nhiém
trùng, tri ran can, tiéu chày,
.Trong
nhung
nàm gàn
day xuyén tàm lién
con
dugc phàt
hien làm tàng bài
liei
mal, bào ve gan mal
va
ca
lim,

diéu hoà luàn hoàn màu va
huyéì
àp;
dac
biet,
co
khà nàng chóng ung thu
va khàng
HIV
[
1,2],
Hai lóp chat chù yéu là flavonoit va diterpen lacton dà dugc phàn lap tu là va ré.
Càc diterpen lacton nhu andrographolide, neoandrographolide dà dugc chùng minh
co
khà nàng bào ve gan chuòt khói bi tón thuang bòi càc hepatotoxin nhu tetraclocacbon
va
toY-bulylhidropeoxit
(/-BHP)[3];
14-deoxyandrographolid
(DA) va
14-deoxy-
11,12-didehidroandrographolid (DDA)
làm giàm mot càch dàng
ké
huyét àp va mach
tim trén chuòt thù nghiém [4].
Cho dén nay eó rat
it
cóng bó
ve

thành
phàn
hoà hoc cùa xuyén tàm lién Viét
Nam ngoài hai diterpen lacton, neoandrographolid va andropanosid dà dugc phàn lap
tu cày xuyén tàm lién mgc a Nha Trang
[5].
Tiép tue nghién cùu phàn lap càc diterpen
co
hoat
linh
sinh hoc
tu
cày xuyén
tàm lién trong
ò
Viet Nam, trong
de
tài này chùng tòi dà phàn lap bón diterpen lacton
va xàc dinh càu trùc cùa là andrographolide, neoandrographolide, 14-
deoxyandrographolid (DA)
va
14-deoxy-ll,12-didehidroandrographolid (DDA).
HO"
>r-OH
<r-<jH
(1) DM6 (andrographolide)
(2) DM7 (neoandrographolide)
(3) DM4-2 (14-deoxyandrographolid, DA)
20
(4) DM4-1

(14-Deoxy-11,12-didehidroandrographolid,
DDA)
Càc chat
phàn
lap dà dugc khào sàt
ve
hoat tinh khàng vi sinh vat. Két qua cho
thày
hai chat andrographolide, neoandrographolide
co
mùc khàng rat yéu dòi vói 8
chùng vi sinh vat kiém dinh, 4 chùng Gram (-)
va
Gram(+): {Escherichìa
coli
DT
119
B14,
Pseudomonas aeruginosa VM 201, Bacillus subtillis ATCC 6633 va
Stapìiylococcus aureus ATTCC 12228)
va
4 chùng nàm {Aspergìllus
nìger;
Fusarium
oxysporum.
Candida albìcans ATCC
10231 va
Saccharomyces cerevisiae).
Hoat tinh gay dòc té bào dà dugc khào sàt vói té bào ung thu màng lim nguói
(RD)

va
té bào ung thu gan nguòi (Hep-2). Trong hai chat thù ehi
co
andrographolide
ùc che su phàt trién cùa té bào ung thu gan a mùc dò vùa phài
(/C^o
3,06
|Lig/ml).
Két
qua
nghién cùu này dà dugc
dàng
trén Tap chi Hóa hoc 2007, T. 45(No 1),
tr.l2-
17
(xem toàn vàn bài bào a phàn phu lue).
4.2 Cày xa den {Celastrus Hindsu Benth), ho Day rói (Celastraceae)
Càc triterpenoit eó nhiéu hoat tinh sinh hge dòc dào
va
tiém nàng nhu ùc
che
su
phàt trién khói u va hoat tinh cùa NO; eó tàc dung khàng viém, chòng ung
thir,
viém
loét,
bào ve gan-tim mach, giàm ma màu,
Ichàng
khuàn
va

HIV
[6]
Tuy nhién,
nhuge
diém eùa viéc
su
dung càc
triteipenie
là dòc tinh lién quan
dén su phàn huyét
va
té
liet
té bào. Do vay,
ben canh
su phàn lap
tu
nguyén liéu thién
nhién, viéc diéu ehé càc dàn xuàt eó dòc tinh thàp han
va
tiém nàng diéu tri cao han
cùng dugc tién hành song song.
Cày xa den {Celastrus hìndsii Benth et Hook) là thành phàn chù yéu trong bài
thuoc chùa bénh ung thu cùa càc luang y tinh Hóa
Bình
trong nhiéu nàm nay [7].
Tu
cày Celastrus hìndsì càc nhà khoa hge
Dai
Loan dà phàn lap dugc càc triterpenoit, càc

Celasdin eó hoat tinh dòc té bào khàng vói hepatoma (HEPA-2B),
nasopharynx
carcinoma (KB)
va
ùc che hoat tinh sao bàn ó té bào baeh huyét H9 [8].
Tu
là cày xa den Hòa Bình chùng tói dà phàn làp
va
xàc dinh càu trùc cùa
5a-
olean-12-en-3p-ol
(3-Amyrin) (1),
6-metoxy-2.2-dimetyl-5-nitro-2H-chromen-7-ol
21
(3).
Ngoài ra,
tu
(3-Amyrin chùng tòi dà diéu ehé dàn xuàt 3-Amyrin-3-0-sucxinat (2
vói muc dich làm thay dòi hoat tinh cùa
chat
dàu.
(3)
(1)
(2)
(4)
(5)
(6)
X =
OH R1=CH3
X = Suc,

R1 =CH3
x
=
o
x
=
o
x
=
o
R2
= H
R3
=
CHs
R2
=
H
R3 =
CH3
R1
=COOH
R2
=
Sen.
RS =
CH3
R1=C00H R2 = Ang.
R3
=

CH3
R4 = CH3
R4
=
CH3
R4
=
CH3
R4 = CH20H
R1
=
C00H R2
=
Ang. R3
=
CH2OH R4
=
CH3
Ba hgp
chat tu
là xa den dà dugc khào sàt hoat tinh chòng ung thu. Két
qua
thù
nghiém cho thày cà ba
chat
trén déu
thè
hien
rat
yéu hoat tinh gay dòc càc dòng té bào

ung thu gan
va
ung thu phòi.
TT
1
2
3
4
5
Mau
thù
DMSO
Chat dói
chù'ng
Chàtl
Chat 2
Chat
3
Dòng
té
bào & % song sót
Hep-2
100,0 ±0,0
2,0 ± 0,0
66,99 ±0,5
78,87
± 1,04
73,68
± 1,06
Lu

100,0 ±0,0
4,5 ±0,02
99,6 ± 1,99
99,8,0 ±0,09
100,0 ±0,0
Két
qua
nghién cùu này dà dugc bào cào tai Hòi nghi Hóa hùu ea
va
Cóng nghé
Hòa HC làn thù 4
Ha
Noi
11/2007,
tr. 624-27 (xem toàn vàn bào cào ó phàn phu lue).
4.3 Cày vói {Cleistocalyx operculatus Roxb.), ho Sim (Myrtaceae).
Ngoài vice dùng là
va
nu voi de nàu nuóc uòng,
nuó"c
sàc cùa nò
con
dugc dùng
chùa càc bénh ngoài da nhu choc dàu, ghé
lo, [9].
Khào sàt dugc li cho thày nuóc
sàc là vói eó tàc dung chòng vi khuàn
gay
bénh duóng ruòt, E.
coli,

càc vi khuàn
Gr(+) gay bénh viém da; eó tàc dung trg tim
va
hoat tinh khàng khòi u do khà nàng
Ioai
gòc tu do cao
[10,11].
Ve màt khào sàt hóa hoc, dà xàc dinh su eó mat eùa càc flavonoit, càc axit
hidroeacbon tham (xinnamic,
galic, ) va
càc axit triterpenic (oleanolic, ursolic), Ò
Viet Nam, dà
co
mot so còng bò
ve
phàn tich thành phàn hóa hoc eùa tinh dàu tu là,
nu
va
hoa cày voi mgc a càc vùng eùa Nghé An, su nhàn dang mot so thành phàn hóa
hoc eó trong nu
va
là cày vói
[12].
Vói muc dich nghién cùu càc flavonoit
va
triterpenoit
tu
là
vói
tuoi (là dòi

tugng chua dugc nghién cùu) chùng tòi dà phàn làp
va
xàc dinh càu trùc cùa ba
flavonoit: 2,4-dihidroxi-6-metoxi-3,5-dimetylchaleon (1), 7-hidroxi-5-metoxi-6,8-
dimetylflavanon (2)
va
3,5,7,4'-tetrahidroxiflavon
(kaempferol) (4),
va
mot
triterpenoit, axit oleanolic (axit
3P-hidroxi-olean-12-en-28-oic)
(3).
H3C
OH
Hoat tinh khàng càc vi sinh vàt kiém dinh dà dugc tién hành vói 2,4-dihidroxi-
6-metoxi-3,5-dimetylehalcon
va
nhàn thày nò khàng vói E. coli
(gay
ra bénh duóng
ruòt)
va
càc vi khuàn Gr(+) (gay bénh viém da) vói MIC 25
).tg/ml.
(xem toàn
vàn
bào
cào
a

phàn phu lue).
4.4 Co nho nói {Eclipta alba Hassk., ho Cùc, Asteraceae ) dugc dùng ròng rài trong
nhàn dàn làm thuoc chùa càc bénh ngoài da, ròi loan chùc nàng gan, [13]. Ve mal
23
hóa hge dà phàt hién su eó mal eùa càc chat nhu wedelolacton and its desmethyl
derivatives, luteolin, apigenin, 4-hydroxybenzoie acid,
protocateuic
acid, thiophene
derivatives,
terthienylmethanol,
a terthienylandehyde (eeliptal), oleanene glycosides
and
steroidal
alkaloids, [14, 15]. Tuy nhién, cho dén
thói
diém dàng ki
de
tài van
chua eó mot thòng bào nào
ve
khào sàt thành phàn hóa hge cày eò
mire
Viet Nam.
Theo huóng phàn làp càc hgp
chat
bào ve gan chùng tòi dà phàn làp
va
xàc dinh
càu trùc eùa ba hgp chat là wedelolactone, desmethylwedelolaetone and luteolin tu là
co nhg nói mgc ò tinh Ha Tày.

6'
5'
nò
«o
Luteolin
R=CH3
Wedelolacton
R=
H Desmethylvvedelolacton
Càc
chat
phàn làp dà dugc khào sàt hoat tinh chòng òxi hóa dua trén khà nàng
Ioai
gòc tu do sinh ra
tu
2,2-diphenyl-l-pierylhydrazyl
(DPPH). Màu dòi chùng àm
chùa DPPH trong etanol; màu dòi chùng duang chùa DPPH
va
mot flavonoit hoac
axit aseorbie trong etanol; Khà nàng
Ioai
gòc tu do (Scavenging
capacity,
SC). Nói
chung, cà ba
chat
phàn lap
thè
hién hoat tinh chòng òxi yéu trén mò hình thù (xem két

qua
a
bang
duói
day).
TT
1
2
3
4
5
Mau
thù
Màu dòi chùng duang
Màu dòi chùng àm
Luteolin
Wedelolacton
DesmetN'l
fi
Wedelolacton
Nòng do
màu
44
|.tg/mL
5%
50
|.ig/mL
50
|Lig/mL
%SC

68.20 i
0.1
0.00
±0.0
44.71 ±0.1
37.86±0.1
50|.ig/mL 125.55
±0.1
Dành già
Duang
tinh
Am
tinh
Hoat tinh
yéu
Hoat tinh
yéu
Hoat tinh
yéu
24
Hoat tinh chòng ung thu gan trén dòng té bào Hep-2 cùng the hién rat yéu dòi
vói hai chat dugc coi là hoat
chat
chinh (Wedelolacton
va
Desmetyl Wedelolacton)
cùa cày co muc (cung eó a cày sài dàt). Két
qua
thù nghiém dugc dàn ra ó
bang

sau:
TT
1
2
3
4
Màu
thù
DMSO
Màu dòi chùng duang
Wedelolacton
Desmetyl Wedelolacton
%
Té
bào song
100.0 ±0.0
2.05
±0.0
92.6± 1.1
94.2
± 1.8
Dành già
Am tinh
Am tinh
25
V. KET LUÀN
Tu
càc két
qua
nghién cùu thu dugc, chùng tòi xin dua ra mot so két luàn sau:

1.
Dà xày dung qui trình chiét càc lóp hoat
chat tu bón
cày thuòe quan tàm.
2.
Dà phàn lap dugc càc terpenoit
va
flavonoit yéu càu nghién cùu, bao gom:
1.
Wedelolacton
2.
Desmetylwedelolacton
3.
Andrographolide
4.
Neoandrographolide
5.
14-deoxyandrographolide (DA)
6.
14-deoxy-11,12-didehidroandrographolide
7.
Axit ursolic
8. Axit oleanolic
9. (3-Amyrin
(5a-olean-12-en-3p-ol)
10.
6-metoxy-2,2-dimetyl-5-nitro-2H-chromen-7-ol
11.
|3-Amynn-3-0-suexinat (diéu ehé
tu

P-Amyrin).
12.
Luteolin
13.
2,4-dihidroxi-6"metoxi-3,5-dimetylehalcon
14.
7-hidroxi-5-metoxi-6,8-dimetyltlavanon
15.
3,5,7,4'-tetrahidroxiflavon
(kaempferol)
3.
Dà khào sàt càc hoat tinh chòng oxi hóa, khàng vi sinh vàt
va
chòng ung thu.
4.
Két
qua
nghién cùu
co
thè giùp cho chùng ta dành già dùng mùc tàc dung chùa
bénh eùa càc cày thuòe dang
su
dung trong nhàn dàn.
5.
Hy vong, de tài nghién cùu này sé hùu ich cho mot dinh huóng dùng de hình
thành mot bài thuòe eó hiéu
qua
han
tu
càc cày thuòe dà khào sàt.

26