Xử lí tín hiệu thời gian thực sử dụng TMS320C6416T DSK

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ Nộỉ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỤ NHIÊN
• • • •
'k'k'k'k'k'k'k'k'k
NGHIÊN cứụ ĐẶC ĐIÉM SINH HOC CỦA MỘT SÓ XẠ
KHUẢN HIẾM PHÂN LẶP ò VIỆT NAM
MÃ SỐ: QT 07 -30
CHỦ TR Ì ĐẺ TÀI: TS. BÙI THỊ V IỆ T HÀ
CÁC CÁN Bộ THAM GIA: Th.s. Mai Đàm Linh
T h .s . Phạm Đ ức Ngọc
HÀ NỘI - 2007
BÁO CÁO TÓM TẮT ĐÊ TÀI
. Tên đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học cuả một số xạ khuân hiếm phân lập
ỏ Việt Nam
Chủ trì đề tài: TS. Bùi Thị Việt Hà
í. Các cán bộ tham gia: Th.s. Mai Đàm Linh
Th.s. Phạm Đức Nççc
. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Xạ khuẩn hiếm (rare Actinomyces) là thuật ngữ chi các xạ khuẩn khônR thuộc chi
'treptomyces. Mật độ xạ khuẩn hiếm trone tự nhiên ít hơn so với Streptomyces. Vì
ậy, xạ khuẩn hiếm khó phân lập hơn và trước đây ít được quan tâm nshiên cứu hơn.
liện nay, 478 loài đã được công bố thuộc chi Streptomvces, hơn 500 loài thuộc tất cả
ác chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm. Tuy nhiên, ngày càns nhiều xạ
huẩn hiếm được phát hiện nhờ các phương pháp phân lập đặc hiệu. Hai phần ba số
háng sinh dùns trong y học là do xạ khuẩn sinh ra, chủ yếu thuộc chi Streptomyces.
'uy nhiên, hiện nay tình trạng kháng thuốc trone các vi sinh vật aây bệnh ngày càns
hát triển khiến cho các chất kháne sinh truyền thống không còn tác dụne nữa. Điều
ày tạo ra nhu cầu cấp bách cho các nhà khoa học là phải tìm ra các chất kháne sinh
lới. Vì vậy, xạ khuẩn hiếm trở thành nguồn sàne lọc chất kháng sinh mới có triển
ọng nhất. Neoài ra xạ khuẩn còn có khả nãns sinh nhiều chất hoạt độna sinh học
hác như các loại vitamin, enzym, chất ức chế miễn dịch, hoocmon sinh trưởng. Tuv

hiên trong thời gian gần đây, tốc độ phát hiện các chất hoạt độne sinh học mới từ xạ
huân giảm đi đáng kể. Nhưng chúne ta tin rang việc tìm ra loài mới sẽ tăna khả năng
m kiếm các chất hoạt độne sinh học mới. Trone khi đó. Việt Nam đưọc đánh giá là
lột trona các quốc gia có đa dạns sinh học cao nhất thế eiới. Với khí hậu nóne ẩm rất
luận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật nên Việt Nam có khu hệ vi sinh vậi rất
hong phú. Vì thế đa dạna xạ khuẩn hiếm ở Việt Nam rất đána được quan tâm nahiên
ứu và hứa hẹn nhữnơ đóns sóp mới cho khoa học.
Irons khuôn khổ của đề tài này, chúng tôi đã phân lập các chủno xạ khuẩn hiếm
r đất runs nguvên sinh Trùng Khánh, Cao Bang, Nehiên cứu các đặc điểm hình thái,
nh lý. sinh hoá, hoá phân loại. Phân tích trình tự ADNr 16S. xây dựna câý phả hệ
Lia các chủns phân lập dược và nehiên cứu khả năns. sinh hoạt chất sinh học: chất
háne sinh, enzvm
. Các kết quả đạt đuọc
- Từ 20 mẫu đất thu thập từ đấl rừne nguyên sinh Trùne, Khánh - Cao Bằne
Iiúne tôi đã phân lập được 80 chủng, xạ khuẩn lổne, số. Trona số các chúng phân lập
irợc. dựa vào đặc điểm tvp thành tế bào. 43 chủng xạ khuẩn được xác định là xạ
huân hiểm.
- Trong số 43 chủng xạ khuẩn hiếm thì tỷ lệ các chủng có hoạt tính kháng sinh là
81.1%. Đây là một tỷ lệ khá cao so với các nghiên cứu trước. 5 chủng xạ khuẩn trong
đó thể hiện khả năng đổi kháng với các vi khuẩn G(+) và vi nấm gây bệnh khá mạnh.
- Đã nghiên cứu khả năng sinh các enzym ngoại bào mạnh của 16 chủng xạ
khuẩn hiếm. Một đặc điểm dáng lưu ý là 16 chủng này đều có khả năng sinh cả 4 loại
enzym ngoại bào với vòng phân hủy rất mạnh. Đây là các chủng xạ khuẩn hiểm có
nhiều đặc điểm quý nên cần được tiếp tục nghiên cứu để có thể ứng dụng trong thực
tiễn.
- Đã nghiên cứu đặc điểm phân loại bằng sinh học phân tử của chủng xạ khuẩn
hiếm TKllb, chủng nàu có độ tương đồns, với chủng Micromonospora endolithica
AJ560635 là 99%.
- Đã nghiên cứu một số yếu tổ như pH ban đầu, nhiệt độ và động thái quá trình
lên men của chủng TK1 lb.

6. Tình hình kinh phí của đề tài:
Tổng kinh phí đề tài là: 20.000.000 VNĐ
Thanh toán tiền điện, nước, cơ sở vật chất ( 4%): 800.000 VNĐ
Chi phí nghiệp vụ chuyên môn ( vật tư) :
Chi phí nghiệp thuê mướn:
KHOA QUẢN LÝ
(Ký và ghi rõ họ tên)
PHÓ CHỎ NHiỆM KHOA
PGS.TS. tyÁaạ ík ia ẩ fị J fo  k tf
TRUONG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIEN
Wlfu TRưÔnô
11.200.000 VNĐ
8.000.000 VNĐ
CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI
(Ký và ghi rõ họ tên)
f/Ut' ĩầ' tyéM í
SUMMARY
I. Title: Study on biocharacteristics of rare-Streptomyces isolated in Vietnam.
I. Project leader: Ph.D. Bui Thi Viet Ha
Participants: M.Sc. Mai Dam Linh
Be. Pham Due Ngoc
ị. Aims and contents of project:
Vietnam is a tropical country with hot and wet climate so microbial flora is
/ery abundant. Vietnam is recognized as one of the countries having the most
biodiversity in the world. Until now, we have only some researches on Streptomvces,
)ut rare Actinomycetes are not interested in. It's something like an potential land for
;eeking new compounds and new species. Recently, we have isolated many
ỉtreptomycete strains with antibiotic activities against many kind of microorganisms:
>ram positive and gram negative bacteria, fungi and tumor cells. Ratio of antibiotic
)roducinơ strains is very high, about 60 percent. Moreover, typical actinomvcetes are

iivided into two groups; Streptomyces and non-Streptomyces (rare actinomycetes).
ĩtreptomyces are the dominant bacteria in soil and this genus contains about 500
ipecies. Rare Actinomycetes are divided into 50 genera which are including many
inpublished species, and are generally slow-growine and small colonv-forming
Itrains.
In frame of this project, we were
- Isolated rare-Streptomycete strains from Trung Khanh, Cao Bang soil samples
- Determinated cultural, physiological, biochemical properties and sequenced
J-DNA16S of some strains having bioactive compounds.
- Investigated the antibiotics and extracellular enzymes activities of those
strains.
5. Obtained results
- From 20 soil samples Trung Khanh - Cao Bang, 80 strains of Actynomvcetes
vere isolated. Based on type of peptidoglycan, 43 strains are determined rare-
itreptomyces.
- The ratio o f strains havins antibiotic activity is 81.1%. This is very high ratio
:ompared with former research. Among them. 5 strains are against stronslv bacteria G
+ ) and mold causing plant diseases.
- Investigated extracellular enzymes activities of 16 strains. These are such a
irecious rare-Streptomyces that is necessary to further research.
- Systematic characteristics ol’TK.] lb strain by using molecular biology methods
vere studied. The similarities of T K llb train with Micromonospora endolithica
U560635 are 99%.
- The optimal fermentation conditions were studied.
M u e lu e
• »
Trang
đầu
1
rong 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU

2
'Ạ KHUẨN
2
Xạ khuẩn và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
2
Những khái niệm co bản về xạ khuẩn
2
Streplomyces và xạ khuẩn hiếm
3
l.Thành tế bào typ I
4
2.Thành tế bào typ II
4
3. Thành tế bào typ III
4
4.Thành tế bào typ IV
5
Đăc điểm hình thái của xa khuẩn
• •
5
Đăc điểm của xa khuẩn hiếm
• •
7
Phân loại xạ khuẩn hiếm bằng phương pháp sinh học phân tử
9
ặc điểm hệ sinh thái vùng Trùng Khánh Cao Bằng
11
rong 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
13
NGUYÊN LIỆU

13
1. Chủng giống
13
l. Hóa chắt và dụng cụ
13
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
14
[ Phương pháp phân lập xạ khuẩn tổng số
14
l. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn
15
Ll. Đặc điểm hình thái
15
ì. 2. Đặc điêm sinh /ý sinh hoá
L

—

—

-
—
16
3. Các phuong pháp sinh học phân tử
17
3.1. Tách chiết ADN theo phương pháp của Saito Mura
17
3.2. Pliíin ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
18
3.3. Phân tích trìnlĩ tựADN r 16S theo phương pháp của Sanger

20
rong 3. K É T QUẢ V À T H Ả O LU Ậ N
22
Phân lập xạ khuẩn hiếm
22
Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn hiếm
24
Khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng xạ khuẩn hiếm
25
N G H IÊ N C ỬU CÁC Đ Ặ C Đ IẺ M S IN H H ỌC VÀ Đ ẬC Đ IẺ M PHÂN
\ ỉ C Ủ A C H Ủ N G XA K H U Ẩ N TK11B
• •
27
ỉ Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
27
2 Ảnh hưởng của pH ban đầu
29
3 Ảnh hưởng của nhiệt độ
31
4 Động thái quá trình sinh trưởng của chủng xạ khuẩn T K llb
32
ÉT LUẬ N
33
T À I L IỆ U TH A M K H ẢO
34
Bảng, hình
Trang
g 1. Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes
1 1. Đồ thị về tỷ lệ các chủng vi sinh vật sinh chất kháng sinh
8

1 2. Mục tiêu tuyển chọn các chất ẹó hoạt tính sinh học
9
1 3. Mô hình phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn hiếm
15
£ 2. Sự phân bố của xạ khuẩn ở các mẫu phân lập
22
1 4. Tỷ lệ phần trăm các chủng xạ khuẩn hiếm phân lập được
23
g 3.Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn hiếm có hoạt tính kháng sinh
24
ì 5. Khả năns đối kháng với các vi sinh vật kiểm định
Ị)t Số chủng xạ khuẩn hiếm
24
g 4. Hoạt tính kháne sinh của 5 chủng xạ khuẩn hiếm
25
2, 5. Hoạt tính enzym ngoại bào của một số chủng xạ khuẩn
26
1 6. Khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng xạ khuẩn hiếm
27
2 6. Đặc điêm sinh lý sinh hoá của chủng TK1 lb
27
] 7. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S,
ìiện mối quan hệ siữa chủne xạ khuẩn TK11B và các đại diện có quan hệ
gũi thuộc chi Micromonospora
28
1 7. Anh hưởng của pH ban đâu đên khả năng sinh CKS của chủns TK1 lb
29
1 8. Anh hưởne, của pH ban đâu đên khả năng sinh CKS của chủne TK1 lb
30
1 9. Anh hường của pH ban đâu đên khả năna sinh trưởng của chủne TK11 b

30
Ị 8. Anh hường của nhiệt độ đên khả năng hình thành CKS của chủrm
lb
31
1 10. Anh hưởno của nhiệt độ đên khả năng sinh kháng sinh của chủng
lb
31
ill. Anh hưởng của nhiệt độ đên khả năng sinh trưởng của chủns TK11 b
32
ì 9. Dộnc, thái của trình sinh trường và sinh tône, hợp CKS cùa chùnR
]b
33
MỞ ĐẦU
Côna nehệ sinh học ngày nay đang phát triển như vũ bão, đạt được những thành
to lớn và naày càng chứng tỏ vị thế quan trọne của mình trong nền kinh tế quốc dân.
Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển cùa vi sinh
'VSV) và đây được coi là một kho tàng vô siá về neuồn sen trong tự nhiên. Với mục
tìm kiếm những nguồn gen giá trị có khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh học,
Ìg tôi đã tiến hành bước đầu nghiên cứu sự phân bố của các chủ ne xạ khuẩn hiếm
ị thời tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học (chất kháng sinh và các enzvm naoại
I từ các chủng này để góp phần cho nhừns, nshiên cứu cơ bản và ứna dụng tiếp theo
hu hệ xạ khuẩn hiếm ở Việt Nam.
Việc định tên các loài xạ khuẩn trưóc đây chủ yếu theo phương pháp truyền thống
trên một sổ hữu hạn các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, nên trons một số
ns hợp có thể gặp khó khăn vì v s v là những sinh vật rất dễ bị biến dị, do đó dễ đi
các kết luận thiếu chính xác. Ngày nay, bên cạnh phương pháp phân loại truyền
.g, phương pháp phân loại phân tử dựa trên việc phân tích trình tự gen mã hoá ARN
Kom 16S đã được các nhà khoa học trên thế giới sử dụng phổ biến cho kết quả nhanh
1 2 , chính xác và khắc phục được nhữns; nhược điểm của phương pháp phân loại
ền thốna. Đối với nhữne chủng có ý nehĩa trong nghiên cứu và thực tiễn thì điều này

àng được củne cố thêm bởi các đặc điểm truyền thốna.
Việc phân loại chính xác các chủne xạ khuẩn đến tên loài sẽ tạo cơ sỏ' khoa học
việc tuyển chọn định hướns các chủna xạ khuẩn trone nahiên cứu rút nsắn thời eian
ône sức.
Xạ khuẩn hiếm là nhóm xạ khuẩn ít được quan tâm nehiên cứu trona, nước (trừ
số nahiên cứu đã được tiến hành ở nước neoài) do đó trong phần này chúna tôi trình
một số nshiên cứu về khu hệ xạ khuẩn hiếm được phân lập tại Trùnơ Khánh. Cao
0
]
Ạ KHUẨN
Xạ khuẩn và sự phân bổ của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộno rãi và đónẹ vai trò quan trọng
a tự nhiên. Chúna tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá hợp chất trone đất,
2 nước. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu. thành phần đất, mức độ
1 tác và thảm thực vật. Theo Waksman thì trong 1 gam đất có khoảna 29.000-
0.000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9-45 % tổng số vi sinh vật. Nhữns đặc tính quan trọne
của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 60-70% xạ khuẩn được phân lập từ đất
hả năne sinh chất kháng sinh.
Những khái niệm CO’ bản về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn G(+), đặc biệt khác với vi sinh vật nhân sơ
j tỷ lệ G + x cao (>70 %) , trong khi đó ở vi khuẩn là 25- 45 %, đựoc phân biệt với
vi sinh vật khác bởi 2 đặc điểm cơ bản.
❖ Hình thái
Nhiều loại xạ khuẩn có khuẩn ty phân nhánh và tạo thành bào tử. Một số tạo nang
tử và động bào tử.
❖ Sự đa dạng về các chất trao đổi bậc 2
0'
Có khoảng 17.000 chất kháng sinh được phát hiện từ vi sinh vật trona đó 2/3 là do
huẩn sinh ra và chủ yếu là thuộc chi Streptomyces. Theo quan điểm sinh thái học thì
huẩn đón2 vai trò quan trọng trons, chu trình phân hủy các chất và có thể sử dụng

hữu cơ khó phân giải là axit humic.
Gần đây, xạ khuẩn (Actinomycetes) được xác định thuộc bộ Actinomycetales dựa
trình tự ADNr 16S. Taxon này có khoảns 100 chi với 1.000 loài. Một nửa trong số
chi này thuộc vi khuẩn điển hình như dạna cầu. dạna que. khône tạo thành khuẩn ty
» sợi và bào tứ.
Xạ khuẩn điển hình thuộc bộ Actinomycetales gồm Streptomyces, Actinomadurch
noplanes, Dactyỉosporanẹium, Microbispora, Micromonospora,
otosporanỳum Chúng sinh ra rất nhiều chất kháng sinh, kích thước genom dạne
g 8-9 Mbp.
Chương 1. TỐNG QUAN TÀI LIỆU
2
Xạ khuẩn không điển hình thuộc bộ Actinomycetales gồm: Micrococcus,
irobacter, Mycobacterium, Propionibacterium khônẹ sinh ra chất khánạ sinh.
)1H dạng vòng, kích thước 3-4 Mbp.
Streptomyces và xạ khuẩn hiếm
Xạ khuẩn điển hình được phân chia thành 2 nhóm: Streptomyces và xạ khuẩn
1 . Streptomyces là nhóm xạ khuân chiếm ưu thế trong đất, chi này có khoảng 500
Xạ khuẩn hiếm lại được chia thành hơn 50 chi khác nhau và sồm nhiều loài chưa
ị bố, chúng thườne sinh trường chậm, tạo thành khuẩn lạc nhỏ, thường khó bảo quản
uôi cấy tron® môi trường dịch thể. Trong khi đó, Streptomyces lại rất thuận tiện cho
tìm kiếm và sàng lọc chất kháng sinh.
Bảng 1. Các loại typ thành tế bào khác nhau ỏ' Actinomycetes
0 ET ịí
Meso-
DAP
LL-
DAP
Glyxin Arabinoza Gaiactoza
Chi đại diện
+

+ *
Streptomyces
+
Micromonospora,
Áctinoplane
+
Actinomadura,
Mìcrobispora
+
4 . ***
-Ị-* * *
Nocardia,
Mvcobacterium
p. diaminopimelic acid, Alanin và glutamic đều có mặt ờ +
Glyxin là amino axit duy nhất không chứa carbon đối xứns tronc phàn tử của
húng. Do đó. elvcin khône có cấu hình dans D hay L.
* Trong họ Micromonospora thì L-alanin tại vị trí sổ 1 của phần pcptit đòi thành
ịlyxin ( tức là loại mất nhóm -CH3)
** Trone nhóm xạ khuân có chứa axit mycolic như Norcadia và Mycobacterium, thì
hành tể bào có chứa arabinogalactan (cấu tạo bởi arabinoza và galactoza)
Theo Lechevalier và Lechevalier, 1967, dựa vào 5000 chủng phân lập từ 16 mẫu
dã chia ra khu hệ xạ khuẩn trong đất như sau: Chi Streptomvces chiếm 95.43%, chi
3
cadia chiêm 1,98%, Micromonospora chiếm 1.4%. Thermomonospora 0.22%,
noplanes 0,2%, Microbispora 0,18%, Streptosporangium 0.1%, Actinomadura 0,1%.
Năm 1970, Lechevalier và Lechevalier đã đưa ra tiêu chuẩn phân chia thành tế bào
xạ khuẩn điển hình ra làm 4 typ. Vào những năm 1980, cấu trúc hóa học của
ydoalycan đã được làm sáng tỏ và typ thành tế bào lại được xác nhận lại lần nữa.
ì. Thành tế bào íyp I
Có chứa LL-DAP và glyxin. Đại diện của typ này là chi Streptomvces có khoảng

loài. Streptomyces là chi lớn nhất. Hầu hết các chủns thuộc chi này đều sinh trưởng
ìh. tạo thành khuẩn ty khí sinh và tạo bào tử. Chúna sinh ra nhiều chất kháns sinh.
12 chu trình sốne của xạ khuẩn, chúng thể hiện sự biệt hóa về hình dạng rất phức tạp.
1 2 trong đất, chúng thường tồn tại dưới dạn2 bào tử.
?. Thành tế bào typ II
Chứa meso-DAP, glycin và axit N-glycolyl muramic. Một số chủne thuộc họ này
hứa 3’ OH-meso-DAP. Hầu hết các chi này thuộc họ Micromonosporaceae. Họ này
các đại diện: Micromonospora, Actinoplones, Dactylosporangium, Catenulopỉanes
n thay thế DAP). Hầu hết các chủns thuộc họ này đều khôna tạo khuẩn ty khí sinh,
sổ chủns tạo thành nang bào tử và bào tử động.
nh
1
ng
Arabinoza Galaetoza Xyloza Maduroza
Ho
•
+
+
— —
Pseudonocardiaceae
- -
-
+
Streptosporansiaceae
Thermomonosporaceae
-
-
— —
Nocardiopsaceae
+

-
+
-
Tliành tế bào typ III
Chứa meso-DAP. Loại này aồm rất nhiều họ như Streplosporansiaceae.
momonosporaceae (thuộc nhóm Actmomadura), Nocadiopsaceae và
donocardiaceae. Xạ khuẩn có dạne mcso-DAP và tạo thành khuân ty khí sinh thườne,
4
ns dễ dàng xá định được. Họ này được phân biệt với các họ khác nhờ thành phần
ng trone toàn bộ tế bảo.
4. Thành tế bào typ IV
Chứa meso-DAP, arabinoza và galactoza. Những vi khuẩn thuộc nhóm này gồm:
'obacterium, Nocardia, Gordonia và Rhodococcus. Chúng đều có axit mycolic,
'inogalactan và axit N-gỉycolyl muramic trone thành tế bào. Một số loài gây bệnh
i. ho gà về hình dạng thì thường hình que hoặc đa hình, có dạne sợi đơn giản hoặc
u thế tạo thành các mành nhỏ hình que.
Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
> Khuẩn lạc
Khác với các vi sinh vật khác, khuẩn lạc xạ khuẩn thườne chắc, xù xì. có dạna da,
ị vôi, dạne, nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc có ba lớp: lớp vỏ ngoài có dạng
3ện chặt, lóp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi
có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như:
ỉ, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế
xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trườne lên men. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sấc
: nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại
t. Các loài xạ khuẩn có thể tạo các loại sắc hoà tố tan trong môi trường nuôi cấy.
na sinh Irưởna của khuẩn ty vào phía trona hoặc ra naoài mặt môi trường tạo thành
in ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh của khuẩn lạc xạ khuẩn. Khuẩn ty khí sinh phát
ra nsoài khôna khí, thườna phần cuối các khuẩn ty này biến thành cuốna sinh bào
> Khuẩn ty

Khuẩn tv của xạ khuẩn trôna siổna hệ sợi của vi nấm, phân nhánh và khône. có
I ngăn. Xạ khuân phát triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh, khoảng 30fim một
ih. Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trons eiai đoạn phát triển là 1 l|im , “nhân" tế bào xạ
in phát triển đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty. Do vậy, mỗi đoạn khuân ty hoặc
bào tử xạ khuẩn Gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên sau l-2h xuất hiện quá trình
hợp ADN. nhân các cen cần thiết từ genom và tiến hành tổns họp protein. Cứ như
khuẩn ty hình thành và phát íriên.
Xạ khuẩn thuộc nhóm cơ thể dị dưỡne,. thường sử dụng neuồn cacbon như đường,
bột. rượu, axil hữu cơ. polysacarit. Nauon nitơ vô cơ thirờnu là nitrat, muối amon.
5
311 nitơ hữu cơ là: pepton, protein, cao ngô, cao nấm men Khả năng đồng hóa các
0 ' các loài xạ khuẩn khác nhau là khác nhau. Phần lớn chúng ưa khí, ưa ẩm, phát
tốt ở môi trường trunẹ tính hoặc hơi kiềm.
> Cấu trúc tế bào
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn G(+). Thành tế bào xạ khuẩn 2 ồm 3 lóp: lóp ngoài
khoảns 60-120A0, khi già có thể là 150A°; lóp giữa rắn và chấc hơn. dày khoảns
°, lớp trone dày 50A° được cấu tạo chủ yếu từ các lớp elycopeptit gồm các sốc N-
vlslucozamin (NAG) liên kết với các axit N-axetylmuramic (NAM) bởi các liên kết
[- glycozit. Khi xử lý bàng lizozim các liên kết này bị phá vỡ, thành tế bào bị phá hủy
ại màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào eọi là thể sinh chất
:oplast). Màng tế bào xạ khuẩn chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi
và quá trình vận chuyển chất qua màng.
Màna sinh chất của xạ khuẩn chủ yếu bao gồm hai thành phần là photpholipit và
ĩin. Một trons những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về
di truyền và thường xảy ra sự tái sắp xếp lại các phần tử ADN. Điều này gây ra một
ện tượng lạ như : tạo ra tính đa hình thái, tính kháng thuốc. Hơn nữa, sự tự nhân lên
:ác đoạn ADN còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền của xạ khuẩn.
> Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn
Hình thái, cuốns, sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọna nhất trona phân
Kạ khuẩn. Cuốna sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóns (RF), dạns

iò so (S), chuồi bào từ khôns phát triển hoặc xoắn đơn giản, có hình móc câu (RA),
tử hình thành đồns thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo hai cách: kết
hay cất khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhằn hoặc xù xì, có sai
eai phát triển dài thành dạna lông. Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết
kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trường ciầu dinh dưỡng
hi quá trình sinh bào tử thườne, bị kìm hãm. Trons nhiều trườna hợp khi kích thích
nh thành bào tử. hiệu suất sinh tông hợp CKS RÍảm đi.
Mặc dù xạ khuẩn có hình thái aần eũi với vi khuẩn thật về một mặt nào đó và về
mặt khác thì lại eiốnc nấm nhưng neười ta vẫn chẳng nghi neờ gì khi đặt chúne vào
phân nhánh dòns, vi khuẩn. Trong quyển hệ thống vi khuẩn học Bergey's 1989,
fi ta dã thực hiện một phân loại trên loài với xạ khuẩn dựa trên cơ sỏ' so sánh rRNA
phương pháp cüa Woese và cộne sự ).
6
Tuy nhiên ngay đầu tiên phần lớn xạ khuân được nẹười ta xác định đặc điếm và
1 loại trên cơ sở hình thái học của chúng và sự không tương đồng trong phân loại phát
loài và kiểu hình đôi khi cũng gây lúng túns, cho các nhà nghiên cứu. Bất chấp sự
: biệt lớn về nhữne dấu vết di truyền, rõ ràng là hình thái học của chúng rất eiống với
I bậc cao. Nhiều xạ khuẩn hình thành bào tử đốt, khuẩn ty cơ chất (sinh dườna) và
ẩn ty khí sinh, conidi, bào tử nang (sporangiospore) eiống như ờ nấm bậc cao.
Đặc điểm của xạ khuẩn hiếm
Xạ khuẩn hiếm (rare Streptomyces) là thuật ngữ chỉ các xạ khuẩn khôna thuộc chi
ptomvces. Mật độ xạ khuẩn hiếm trong tự nhiên ít hơn so với Streptomyces. Vì vậy,
±uẩn hiếm khó phân lập hơn và trước đây ít được quan tâm nghiên cứu hơn. Xạ
In thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales. 10 phụ, 35 họ, 110 chi và 1000
Hiện nay, 478 loài đã được công bổ thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc
ả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm. Tuy nhiên, ngày càng nhiều
huẩn hiếm được phát hiện nhờ các phương pháp phân lập đặc hiệu như phương pháp
(Rehydration and Centrifugation) và các môi trường đặc hiệu như môi trườne HV
mic acid- Vitamin). Hai phần ba sổ kháng sinh dùng trong y học là do xạ khuẩn sinh
hủ yếu thuộc chi Streptomyces. Tuy nhiên, hiện nay tình trạng kháng thuốc trong các

ính vật gây bệnh ngày càng phát triển khiến cho các chất kháng sinh truyền thống
1 2 , còn tác dụne nữa. Điều này tạo ra nhu cầu cấp bách cho các nhà khoa học là phải
ra các chất kháng sinh mới. Vì đã được nghiên cứu kỹ lường nên khả năne tìm được
chất khána sinh mới từ Streptomyces là rất hiếm. Vì vậy, xạ khuẩn hiếm trở thành
311 sàne lọc chất kháne sinh mới có triển vọng nhất. Nsoài ra xạ khuẩn còn có khả
Ị sinh nhiều chất hoạt động sinh học khác như các loại vitamin, enzym, chất ức chế
1 dịch, hoocmon sinh trưởng. Tuy nhiên trong thời aian 2 ần đây, tốc độ phát hiện các
hoạt độns sinh học mới từ xạ khuẩn eiảm đi đáne kể. Nhưng chúna ta tin rằns việc
ra loài mới sẽ tăns khả năng tìm kiếm các chât hoạt động sinh học mới. Trone khi đó.
nam đưọc đánh giá là một trons các quốc 2.ia có đa dạne sinh học cao nhấl thế giới,
khí hậu nóne ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật nên Việt Nam có khu
i sinh vật rất phone phú. Vì thế đa dạns xạ khuẩn hiếm ở Việt Nam rất đáng được
1 tâm nghiên cứu và hứa hẹn những đóng góp mới cho khoa học. Ở Việt Nam việc
ên cứu xạ khuẩn hiếm là một miền đất trổng chưa dược khai phá . Trừ một vài loài
c chi Micromonospora còn lại tất cả các chi còn lại cho đến nay chưa có ai nghiên
Đây chính là neuồn tài nguyên vô cùng giá trị bị bỏ quên.
7
Năm 1959, theo Pridham, đã có hơn 100 chi và 1500 dưới chi, loài và dưó'i loài,
ne theo Waksman các đặc điêm hình thái đónạ vai trò quan trọns nhất trong phân
ở mức độ chi. Nhưng cho đến nay, có rất nhiều công cụ đáne tin cậy để phân loại xạ
m hiếm đến mức độ loài như trình tự ADNr 16S, lai ADN, tiêu chuẩn hình thái, hoá
1 loại, sinh lý sinh hoá. Vì thế, số lượng chi và loài vẫn đang tăng dần. Tuy nhiên, có
t các nghiên cứu được công bố về đa dạng sinh học của xạ khuẩn hiếm ở vùns nhiệt
Wang và cộng sự cônR bố về đa dạng xạ khuẩn ở các khu rừng nhiệt đới thuộc
;apore. Các nhà khoa học đã xác định được 36 chi sau khi phân loại 5000 chủng phân
ỉược. Neoài ra, đại diện chi mới cũng được tìm thấy. Gần đây. Muramatsu và cộne sự
hành nehiên cứu so sánh đa dạng sinh học của xạ khuẩn ở vùng nhiệt đới và ôn đới.
nhà khoa học đã phân loại được 790 chủns từ Malaysia và 981 chủng từ Nhật Bản.
ehủne từ Nhật Bản thuộc về 9 họ, 22 chi và 207 loài. Chỉ 14% số chi và 50% số loài
Ị nhau giữa 2 nhỏm. Đồng thời có hai chủng được xếp vào một chi mới. Điều đó

Ìg tỏ đa dạng xạ khuẩn ở vùng nhiệt đới là rất phong phú và cần được quan tâm
ên cứu. Khi mà ngày càng nhiều chất kháng sinh được tìm ra thì cơ hội để người ta
lể tìm thấy các kháng sinh lạ trong các chủng xạ khuẩn truyền thốne dường như ngày
; bị thu hẹp lại
90
i—' 82-84 85-87 88-90 91-93 94-96 97-99 năm
Hình 1. Đồ tliị về tỷ lệ các chung vi sinh vật sinh chất kháng sinh
( Japanese patent 1982-1999)
Vì thế người ta đang chuyển sự chú ý đến các chủna thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm
Aciinopìanes, Dactyỉosporangium, Micromonospora, Acỉinomadura, Microbispora,
Oosporangium, Kibdeìosporangium và các chi khác đế phục vụ cho sản xuất kliáne,
8
. Xạ khuẩn vẫn được xem như là một neuồn tiềm năng chính cho các chất có hoạt
sinh học mới
Phần lớn CKS là do xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh ra, song khả năng sinh
; của các chi thuộc “ xạ khuẩn hiếm” ngày càn? được đặc biệt chú ý. Dưới đây là đồ
dểu diễn tỷ lệ các vi sinh vật sinh các chất kháng sinh theo khảo sát năm 1982-1999 ở
t Bản và mục đích tuyển chọn các chất kháng sinh được ứng dụng trone thực tiễn.
Những năm vừa qua, sổ lượng các chất kháng sinh do nấm sinh ra tăng lên nhiều
0%-40% và tỷ lệ các chất kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra giảm đi đáns kể từ 80%
12. 50%.
o
*<■0
Ỏ
O )
c
o
V-
*-<
U )

c
3*
■o
□
n
ư)
JO
o
c
5-
o
* o
‘ CB
JZ
XL
S I
o
c
*3)
>
ơ ì
JZ
c
c
i=
XL
•<«
JC
o
o

‘ <s
o
Cấc chắt được sử dụng trong nóng nghiệp và chân nuói
82-84 85-87 88-90 91-93 94-96 97-99 năm
Các chất kháng khuần
Các chất có hoạt tinh sinh học khác
Hình 2. Mục tiêu tuyển chọn các chất có hoạt tính sinh học
( Japanese patent 1982-1999)
Nhìn vào đồ thị, chúne ta cỏ thể thấy việc sử dụng chất kháne sinh trona nôn a
ệp và thú y không có sự biến độna lớn lắm. Tuy nhiên, vài năm gần đây xu thế này
ỉ giảm đi dôi chút.
Phân loại xạ khuẩn hiếm bằng phưong pháp sinh học phân tử
Tù' nửa cuối thế kỷ 20 trờ lại đây và đặc biệt từ thập niên 80, sự phát triên mạnh
ùa sinh học phân tử đã mở ra một phươne pháp nghiên cứu cho phân loại học. đó là
loại học phân tử. Phân loại học phàn tử là sự phát hiện, mô tả và eiải thích đa dạnc,
học ờ mức độ phân tử eiĩra các loài và trone phạm vi loài. Nó ứns dụne các kỹ thuật
dại của sinh học phân tử và công nghệ gen vào mục đích nghiên cửu đa dạnu, sinh
nghiên cứu mối quan hệ tiến hoá dừa các loài, xây dựng cây cluiim loại phát
9
I Mặc dù mới ra đời nhưng nó đã sớm trở thành một phương pháp nchiên cứu rất có
1 quả. khắc phục được những hạn chế của các phương pháp trước đâv.
Cho đến nay đã có hànç loạt các kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụns trong
iên cứu chủng loại phát sinh ở v s v , nó bao gồm các kỹ thuật như phân tích trình tự
amin, thành phần bazơ nitơ của ADN, lai axit nucleic, phân tích đoạn ADN dựa trên
đa hình về độ dài các đoạn giới hạn (RJFLP) Tuy nhiên phổ biến nhất vẫn là kỹ
it phân tích trình tự een mã hoá ARNr 16S.
Hiện nay phần lớn các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằns mức độ tương đồng
rình tự ARNr phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể v s v . Tất cả các loài
/ trong sinh giới đều sử dụne cùng một cách tone hợp protein nhờ các riboxom. Vi
người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hóa ARNr ờ các v s v

: nhau để xác định mối quan hệ tiến hoá giữa chúng. ARNr là phân tử lý tưởng cho
nshiên cứu về tiến hoá của v s v và mối quan hệ giữa chủng bởi vì chúng là thành
1 cơ bản có trone mọi tế bào v s v . Vai trò và chức nănơ của chúns là eiốns nhau ở
ã các riboxom. Người ta nhận thấy cấu trúc khône gian của phân từ ARNr rất eiốna,
J giữa các loài v s v khác nhau. Nghĩa là cấu trúc của chúng thay đồi rất chậm theo
gian hay nói cách khác các gen mã hóa chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình
hoá. Tốc độ thay đổi của chúng trong quá trình tiến hoá là rất chậm có lẽ là bởi vì sự
tịnh là tính chất quan trọng của chúng . Nói chune các een mã hoá ARNr rất bảo thủ.
nhiên trons bản thân các een bảo thủ cũng chứa nhừns vùna có mức độ bảo thủ cao
hữna vùna có mức độ bảo thủ thấp hơn (vùns biến đổi). Điều nàv có lẽ do các vùng
đó mã hoá cho những vùng khône eian khác nhau của phân tử ARN riboxom. Trona
trình tiến hoá. các vùng een đó có thể bị nhữne đột biến nhất định nhưne chọn lọc tự
n chỉ eiừ lại nhừna đột biến truna tính ít làm thay đổi cấu trúc khôns eian của ARNr.
ih hường đên sự tons hợp protein của sinh vật còn những dột biến tron 2 nhữna vùna
*— • V— • ỉ 1 • ^ w W
1° 2 Ìan quan trọne, làm ảnh hưởna đến quá trình sinh tồng hợp protein cua cơ thể
, lập tức sẽ bị chọn lọc tự nhiên đào thải.
Dựa vào nhữne vùna bảo thủ trons een mã hoá phàn tử ARNr các nhà khoa học đã
kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại các vùng biến đôi. So sánh sự khác
siữa các vùng này người ta có thể chỉ ra được nhừna sự khác biệt siữa các loài Rần
Theo Robert w . Bauman nếu hai loài vi khuẩn có sự khác biệt vè trình tự Ren ARNr
lớn hơn 3° 0 thì có thể xem là hai loài khác nhau.
10
Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23 s là lớn
so với phân tử A R N r 16S. Tuy nhiên trình tự đã được xác định hoàn chỉnh của gen
Nr 23s là rất ít trone khi đó trình tự của gen ARNr 16S là khá phona phú và được
g bố rộng rãi trên ngân hàng gen quốc tế. Chính vì vậy phương pháp giải trình tự gen
hoá ARNr 16S để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh chủng loại của v sv vẫn là lý
Ìg nhất. Lần xuất bản thứ tư của cả “Bergey’s Manual of Systemmatic Bacteriology”
The Prokaryote” đều dựa vào tiêu chuẩn ARNr 16S làm tiêu chuẩn phát sinh loài

Ìg ứng của vsv. Chính vì vậy có thể nói phương pháp xác định trình tự sen A R Nr
ỉà phương pháp phân tử phổ biến nhất được dùng để định loại thuận lợi vi khuẩn .
Cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) được xây dựng dựa trên các khoảne cách đã
toán. Nó đang trở thành một công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân loại ở các cấp độ
hơn chi. Sự tươne đồng giữa phép phân loại dựa trên các đặc điểm kiểu hình
:notypic) và cây phát sinh đã và đang được nghiên cứu một cách rộng rãi. Nhìn chung
đặc điểm hoá phân loại đã đề cập ở trên cho thấy mối tương quan tốt với cây phát
chủng loại
ẶC ĐIẺM HỆ SINH THÁI VÙNG TRÙNG KHÁNH CAO
Khu Trùng Khánh - Cao Bằng nằm ở trung tâm của Tiểu vùng địa lý thực vật (hệ
: vật) Nam Trung Hoa, thuộc Miền địa lý thực vật Đône, Dương, Dưới xứ địa lý thực
4n Độ-Mã Lai, xứ địa lý thực vật cổ nhiệt đới. Vùng nghiên cứu này nằm ở cực đôna
của Việt Nam. sát ngay biên giới với Trung Quốc. Cảnh quan đặc biệt nhất của vùng
ác dãy núi đá vôi cổ, cứng, kiểu đá cẩm thạch, bị bào mòn mạnh, chủ yếu tuổi
ôzôi muộn và Mêzôzôi sớm. Đó là kết quả của sự bào mòn sâu đến hơn 900 m của
bồi tích (lẳne, đọng) phủ lên các khối đá vôi. Cảnh quan này chiếm một diện tích rất
:ủa vùng và về mặt địa lý là phần kéo dài của Cao neuyên Quý Châu. Cành quan hiện
:ủa vùng đã được hình thành bởi nhiều đợt nâne địa chất mạnh mẽ vào kỷ Truna sinh
zôzôi), kết quả đã nâna các lớp bồi tích biển cổ biến chất lên đến độ cao lớn so với
nước biển (Schzeglova, 1957; Fridland, 1961; M. Baker & Ch. Baker, 1990: Fowlie.
I). Khối đá cứns đã bị xẻ do quá trình bào mòn thành nhiều đình và đườne đinh biệt
Những dã)' núi đá vôi đó có nhiều vách dựne, đứng và sườn dốc. Các đỉnh và đường
núi đá vôi cao nhất của vùng nghiên cứu thường có độ cao 800-900 m. Chúng vượt
lên thung lũng sông Quy Sơn ít nhiều bằng phẳng hoặc lên các thềm cổ được nâng
/à được phù sa trẻ lấp đầy.
1 ]
Các khu đất bằng phẳng ỏ' đất thấp của vùng nghiên cứu được sử dụng đế trồng
cây hàns, năm. Đó là các khu đất ở thung lũne sône Quy Sơn và nhiều thềm được
2 lên giữa các dãy núi đá vôi. Ở đó thảm thực vật nsuvên sinh đã bị biến mất từ lâu.
)ài thảm cây trồng là các thảm cỏ dại có nguồn aôc tại chỗ hay di cư. Thường eặp là

trảng cỏ thứ sinh cao trung bình (chủ yếu là Co tranh Imperata cylindrica) và các
e. câv bụi thưa thứ sinh với vài cây aỗ mọc đơn độc.
Thảm thực vật ở sườn và đường đỉnh núi đá vôi chịu ảnh hưởns; xấu của con neười
.2 vài chục năm ơần đây. Rừng nauvên sinh cây lá rộng ở các thune lûnç và sườn núi
nất đi cấu trúc đặc trưne do bị khai thác mạnh mẽ. ở toàn bộ vùng nghiên cứu loại
l này được thay thế bới rừng thứ sinh nghèo kiệt. Mức độ tàn phá cao hơn đổi với
l nguyên sinh của vùng lấy mẫu ghi nhận được ở phần trên của sườn, đặc biệt ở sườn
n. Lửa rừng do khai thác gỗ và các hoạt độne khác của con người là các yếu tố bổ
l cho sự thoái hoá của môi trường sống ở đai núi này. Rừng ở đây thường rất thưa
và m ang nhiều tính thứ sinh .
Trước đây rừng Thông neuyên sinh rậm và giầu đã từng bao phủ toàn bộ đỉnh và
ng đỉnh của vùng nahiên cứu ở độ cao 700-900 m. Ngày nay chúng đã bị tiêu diệt
:1 toàn do bị khai thác gỗ đến cạn kiệt và nạn lửa rừng diễn ra thườna xuyên. Vài
ih nhỏ và nçhèo kiệt của loại rừng này chỉ đôi khi 2ặp ở vách và đường đỉnh hiểm trở
lui tới.
Mùa hè nóng ẩm với các cơn mưa rào nặng hạt từ tháng 5-6 đến 9-10 là đặc trưns
vùng nghiên cứu. Mùa đône khô và khá lạnh từ tháns 10 đến tháns 4 năm sau. Nhiệt
rung bình năm thường thav đổi trons khoảns 25-30° c. vào mùa đôna thườn» 15° c
ộ cao 200-300 m trên mặt biển). Vào những đêm lạnh nhất, ờ độ cao 800-900 m nhiệt
1 chỗ quans có thể xuốns sần 0° c. Mây và sương mù vào ban đêm gặp phổ biến ờ
và thung lũng có độ cao 700-900 m.
Tất cà nhừnc đặc điểm về hệ sinh thái của MÌ ne láy mầu đều có ảnh hườns tới khu
i sinh vật. mà ở đó chúng tôi chỉ tập trune nghiên cứu về xạ khuẩn hiếm.
12
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
NGUYÊN LIỆU
1. Chiing giống
80 chủng xạ khuẩn sinh CKS phân lập từ 20 mẫu đất được lấy ở các địa điểm khác
u tại rừng nguyên sinh Trùng Khánh - Cao Bằng.
- Rhizoctonia solani nhận được từ Bộ môn Bệnh cây và Trung tâm Bệnh cây

Ẹ't đới, trườne Đại học Nônơ Nghiệp I Hà Nội.
- Bacillus subtilis A T C C 6633, Bacillus pirimidis ATCC 9341, Sarcina lutea
c c 1228, Klebsiella pneumoniae ATCC 31488, Ralstonia solanacearum ATCC
96, Candida albicans ATCC 10231, Scỉerotium rolfsii ATCC201126, Pyricuỉaria
zae, Staphylococus aureus ATCC 9347, Fusarium oxysporum ATCC 695, nhận được
ìảo tàng giốns chuẩn Truns tâm Công nehệ Sinh học, ĐH Quốc eia Hà Nội và Viện
liễu, Bộ Y Tế.
2. Hóa chất và dụng cụ
Hóa chất: Các hóa chất làm môi trường: pepton, tinh bột tan, thạch, cao nấm men,
ỉ, CMC (Sigma).
Dụne cụ: Máy lắc ổn nhiệt, nồi lên men, máy li tâm, máy ly tâm ỉạnh, máy đo pH,
m.
Môi trường: Môi trường HV (Humic acid - Vitamin agar), ISP4. ISP6, ISP9.
pek, Gause ỉ.
i trường HV (Humic acid-vitamin agar) Tlìànlt phần (g/ỉ)
d humic
1 2
Na2H P04
0,5 g
:o 3
1 2
Hồn họp vitamin nhóm B* 5 ml
0 4.7H20
0.01 g Cvcloheximide
500 ma
1.71 g Thạch
18 g
S04.7H20
0.05 s
Nước cat

1 L
pH 7.2
hỉ hợp vitantin nhóm B
imine-HCI
10 mg Inositol
10 mg
13
0 flavin
10 mg
10 mg
10 me
Ca-Pantothenate
Acid p-Aminobenzoic
Biotin
10 me
10 mg
10 mg
10 ml
cm
idoxin-HCl
Nước cat
i truòng ISP4 (g/1)
Tinh bột tan
K2H P04
2 Thạch 15
1 Nước cất 1000 ml
1 Dịch vi lượns 1 ml
10 CaC03 2
15
M gS04.7H20

NaCl
(NH4)2S04
2 pH
7,0
Môi trườnơ ISP4 để giữ giống cần có thêm pepton 5g/l.
[ trường ISP6 (g/1) : Pepton - 10, cao nấm men - 1, xitrat sẳt - 0,5, thạch -18. nước -
pH 7 - 7.2,
trường ISP-9 ( g/l): (NH4)2S 0 4- 2,64; KH2P 04- 2,38; K2HP04 - 5,65: M gS04- 1:
2 dịch muối B - 1 ml; nơuồn cacbon - 10; thạch - 20; nước - 1 lit; pH 6.8 - 7.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
1 Phuong pháp phân lập xạ khuẩn tổng số.
ơn g pháp SDS-YE (Sodium dodecyl sulfate - Yeast extract method)
- Mầu đất được nghiền nhỏ, phơi khô tự nhiên trone 3 đến 5 neày.
- Lấy 1 sam mẫu đã được phơi khô cho vào 10 ml nước cất vô trùrm (bắt đầu tính
ĩ độ pha loans là 10'1)
- Trộn đều rồi lấy 1 ml dịch trên cho vào 9 ml duna dịch SDS-YE trona đệm
;phat (10 ) (bao £ồm SDS 0.05%. cao nấm men 6%. đệm phosphat 5mM, pH 7.0).
- Cho ổna nshiệm chứa mẫu ở nồng độ 10'2 vào bể ổn nhiệt, sốc nhiệt ớ 40°c
V. w • • •
ạ 20 phút.
- Pha loãnc. bảng nước cất vô trùna tới các nồna độ 10‘\ 10'4, 10‘5.
- Trải trên môi trườne HV.
- Nuôi cầy ở 28 - 30 ° c trong 14 đến 21 ngày.
14
Mẩu đất
V
Sàng ( ộ 2 mm) và để
khô tư nhiên
Nồng độ 10'
1 g mẫu

đắt
CR2
mix for 2 min.
stand for 1 min.
10 ml nước vô trùng
1 ml
9 ml dung
dịch
SDS-YE
Môi trường thạch HV
(2 plates/suspension)
Pha loãng bằng nước vô trùng
ÎO '^IO '5
SDS-YE
Hình 3. M ô hình phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn hiếm
2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn
2.1. Đặc điểm hình thải
a) Quan sát hình thái cuống sinh bào tủ'
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trườns Gauze 1 có săm lamen nahiêne 45° trên
nặt môi trường. Sau 7-9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòne lấy ra quan sát hình dạns chuồi
) bào tử trên lamen dirói kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có các dạne thẳng
hơi lượn sóne, kí hiệu là RF (Rectiýỉexibiles). hình móc câu hav hình xoan khône
11 toàn ký hiệu là RA {Retinoculiaperti) và xoấn hoàn toàn ký hiệu là s (Spirales).
15
Bề mặt bào tử
Dùne màng cacbon.đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào từ, sau đó
n sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét.
) tử có hình dạng: tròn, ovan. elip, hình que
mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: Nhằn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn cóc ký
1 là Wa (Warty), dạng gai kỷ hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu là Ha (Hairv).

2.2. Đặc điểm sinh lý sinh hoá
a) Nhiệt độ tối ưu
Xạ khuẩn cấy trên môi trường thạch nehiêne Gauze I và nuôi ờ các nhiệt độ:
2. 28°c, 37°c. Khả năng sinh trưởng được xác định sau 7-10 neày nuôi.
b) Khả năng sinh enzym ngoại bào
định hoạt tính các enzym ngoại bào bàng cách nuôi xạ khuẩn trên môi trường chứa
:hất dùng để xác định hoạt tính enzym.
- Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylaza).
- Cazein (xác định hoạt tính proteaza ).
- CMC (xác định hoạt tính endoglucanaza).
- Gelatin (xác định hoạt tính selatinaza ).
c) Khả năng chịu muối
xạ khuẩn trên môi trườrm thạch nghiêne ISP-1 có bổ suns thêm NaCI với các nồng
; 3; 5; 7 (%), sau 7-10 neày lấy ra quan sát sự sinh trưởna.
d) Khả năng sử dụng các nguồn cacbon
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trườne ISP-9 có bổ suns 1% các neuồn đườne,:
coza, manitol, maltoza, raffinoza, arabinoza. inostol. fructoza. lactoza. sacaroza.
)za, xitrat natri, rhamnoza.
h lùm: cân la đường, thanh trùn2, bằng đèn u v rồi bổ sung vào 100 ml môi trườn ỉi
-9 còn nóns. Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa Petri và nuôi cấy xạ khuẩn, sau 14
y quan sát sự sinh trường.
ne đó môi trường có glucoza được coi là đối chứng dương (+) và môi trườna không
lường được coi là đối chứng âm (-).
16
eu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kém hơn đối chứng dươne một ít: có khả
IS sử dụns loại đường đó, kí hiệu là (+).
ếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứne dương, kí hiệu là (++).
ếu xạ khuân sinh trưởng bane đổi chứng âm hoặc không mọc: khône; có khả năns sử
1° loại đườnơ đó , kí hiệu là (-).
íếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm một ít nhưng kém hơn đối chứns

m2 nhiều, kí hiệu là (±).
e) Xác định axit diaminopimelic (DAP) của xạ khuẩn
uyên tắc: Ninhydrin phản ứng với nhóm -NH2 của axit diaminopimelic ơ 100°c tạo ra
phẩm là các vệt mầu tím đỏ.
n hành'. Cho khoảng 50mg tế bào ướt vào ống íhuỷ tinh có nút vặn (cỡ
mxlOOmm). Thuỷ phân tế bào bằng lml 6N HC1 ở 100°c trong 16 aiờ tại nồi ổn nhiệt
». Làm lạnh dịch thuỷ phân tới nhiệt độ phòng.
sung 2ml nước cất vô trùng. Loại bỏ phần cặn cùng giấy lọc. Chấm chừna 3 (li dung
1 lên giấy sắc ký bản mỏng. Dùng lfil của 0,01M LL- diaminopimelic acid (Siama
ỉmical Co., St. Louis, MO. USA) làm dung dịch chuẩn. Đặt giấy sắc ký bản mỏne
Ig bồn thuỷ tinh chứa 50ml hỗn hợp metanol - nước - 6N HC1 - pyridine (80:26:4:10,
) irons 3 eiờ hoặc lâu hơn. Phun dung dịch 0,2% ninhydrin (tronc nước bão hoà n -
anoỉ) lên giấv sắc ký bản mỏng, đặt trone tủ sấy ở nhiệt độ 100°c trona 5 phút), vết
DAP tách rời. xuất hiện từ TLC như là các vết màu tím đỏ. LL-DAP (Rf 0.29),
;o-DAP (Rf 0.24).
3. Các phuong pháp sinh học phân tử
3.1. Tách chiết A D N theo phương pháp của Saito Mura
lyên tắc: Thảnh tể bào của vi sinh vật được phá vỡ nhờ lyzozvm và các chất tẩy
ill như SDS-Tris-HCl giúp ADN được giải phóng. Protein và ARN được lách ra khỏi
N nhờ các enzym ARN-aza, proteaza K và các duns, môi Chloroform: isoamyl
)hol (24:1). Cuối cùne ADN được tủa bane etanol tuyệt đối (lạnh -22) và xác định
a độ ADN trong dịch mẫu.
'ĩ liànlĩ. ADN được chiết xuất và tách từ sinh khối ướt Iheo phưone pháp cua Sailo và
ira. Lay 3 vòne que cấy sinh khối tế bào sau 14 giờ nuôi, ly tâm lạnh ỡ 4"c với tốc dộ
)() vòng tronc 15 phút và rửa 2 lần bằna 300|il dune dịch muối EDTA pỉ l 8.0 (0.5M
ÚẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRUNG TÂM THÔNG TIN THƯ VIỆN
, J tL / .?i6 3
.
ịEDTA, 0,15M NaCl). Sau đó tạo dịch huyền phù trở lại trong 200f.ll đệm lOxTE

mM Tris-HCl, lmM EDTA, pH 8,0, tỷ lệ mẫu:đệm, 1: 2). Bổ sung 1 Op.1 lysozym
ìina. lmg/ml lysozyme), giữ ờ 37°c trong nồi cách thuỷ trona 15 phúl. Bô sung dung
1 Tris-SDS (0.1M Tris-HCl pH 9,0 và 1% SDS) với thể tích bans thể tích mẫu. Dịch
1 được giữ ở 60° c trons nồi cách thuỷ khoảng 10-30 phút. Sự tan tế bào được xác
li bằne độ trone của dung dịch cùne với sự tăng độ nhót tươna ứne. Dịch tan tế bào
>'C làm lạnh trons đá 10 phút, bổ sung 150fj.l cloroform-isoamyl alcohol (24:1, siữ ở
) với thể tích bằnơ 1 / 3 thể tích mẫu. Ly tâm lạnh ở 4°c với tốc độ 10.000 vòng trona
phút để phân lóp. Sau đó chuyển phần nhớt ở pha đầu sang eppendorf mới và ADN
ic tách nhờ bổ suns etanoỉ lạnh (etanol 95,5% giữ Ở-22°C) với thể tích gấp đôi thể tích
J và 2|il của 3M axetat-natri (pH=4.5). Ngâm ADN trong 100|il etanol 70% trong 30
t và sau đó ngâm liên tiếp trong etanol 80. 90, 95% cho mỗi nồng độ trons 5 phút. Sợi
N làm khô ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và được làm tan trờ lại trong 20fil đệm
<TE (lOxTE) ở 4°c qua đêm. Dịch đem phân tích bàng máy quang phổ kế ở các bước
2, 230, 260 và 280nm. ADN hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260nm. Ở bước sóng
nm chứng tỏ sự cỏ mặt của prôtêin. Bước sóng 230nm biểu hiện sự có mặt của chất
1, các muối như EDTA và của ARN. Các tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của ADN ở các bước
g 230 : 260 : 280nm là 1,0: 0,45: 0,515. Hàm lượn» ADN được tính như sau: 1 đơn vị
(mật độ quang. Optical Durity) ở 260nm tương đương với 50|ig/ml ADN.
Cách tính: Đơn vị mẫu X độ loãng X chỉ số/1000 = ADN |ig/|il.
Neu ADN chưa sạch cần khử protein và ARN bang enzym proteaza K và ARNaza
3.2. Plíản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
tyên lắc: Phươns pháp này sử dụng ADN polymeraza và các oligonucleotit tổng hợp
n tạo. một đoạn ADN dùns làm khuôn được nhân lên nhanh chóng với số bản sao eấp
2 tỷ lần mà khôns cần đến nhiều tế bào vi khuẩn. Nhờ phản ứne này một đọan sen bất
sẽ được khuyếch đại khi biết được trình tự nucleotit ỏ' hai đầu. ta đã tone hợp được
mồi bổ suns với trình tự của hai điểm từ đầu 5' tới đầu 3' của sợi bổ suns và nhờ cỏ
ym ADN polymeraza mà ADN khuôn được tổne hợp khi đã có sẵn dNTP.
7 hành: Mỗi chu kỳ của phản ứng đòi hỏi 3 bước:
n tính (dénaturation) sợi ADN bang nhiệt độ ADN được tách thành hai sợi đơn. Nhiệt
giảm xuổne. cho phép mồi bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuôn. Hỗn hợp

N và mồi dược ủ với enzym Taq polymeraza và dNTP giúp cho việc tông hợp ADN
18