Nghiên cứu điều chế chất cộng hợp miễn dịch Lectin - Sepharose dùng trong chẩn đoán kháng thể và kháng nguyên một số bệnh ung thư

ĐAI HỌC QUỐc: (ỈIA HÀ NÓI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
NGHIÊN CỨU ĐIỂU CHẾ CHẤT CỘNG HỢP MIẺN DỈCII
LECTIN-SEPHAROSE DÙNG TRONG CHAN ĐOẢN KHẢN(; 11II;
VÀ KHÁNG NGUYÊN MỘT s ố BỆNH UNG THlỉ
Các cán bộ tì tam gia:
1. NCS. Thạc sĩ. Ngu vẻn Vãn Lợi
2. Tiên sĩ. Nguyễn Hạnh Phúc
3. Thạc sĩ. Nguyễn Thị Thanh Loan
4. Học viên. Thạc sĩ. Trần Thị Phưong Liên
5. Tiến sĩ. Trương Văn Châu
M ã sô
Chủ trì dê tài
: QT.0019
: IHỈS.'1'S. Đỗ Ngọc Liên
IIẢ NỘI. TI1ÁNG 5-2001
LỜI CẢM ƠN
Chúng lỏi xin chán thành cám ơn Ban Giám dốc và Ban Khoa hoe
cr
Còng nuliệ - Đại học Quốc gia Hà Nội. Ban Giám hiệu, Ban Chu nhiệm
Khoa Sinh học, các phòng Khoa học Công nghệ và Đào tạo sau Đại học,
phòng Tài vụ trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
đã xét cluvệt, cung cấp kinh phí. cũng như tạo mọi điểu kiện tốt đê Ihực hiện
đẽ lài nghièn cứu khoa học này.
Chúng tôi cũng xin cảm ơn các ban lãnh đạo của các cơ quan phoi
họp nghiên cứu nhu' Bộ môn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, c 01141
ty Dược phẩm Trung ương I, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Hà Nội. cát'
bệnh viện 108, bệnh viên Bạch Mai và bệnh viện K Hà Nội.
Cuối cùng, chúng tôi xin tướng nhó' và biêì ơn những bệnh nhân dang SOI1U
và đã khuất vì những đóng góp của họ cho các nghiên cứu bước đâu với
muc đích tót dẹp là chân đoán sớm căn bệnh hiếm nghèo đế kéo dài thoi

gian sống hữu ích cho mọi người.
IỈẢNÍỈ CÁC CHỮ VIẾT TẮT VẢ KÝ HIÊU
ADN : Axit Deoxyribo Nucleic
AFP : Alpha Fetoprotein
BSA Bovine Se rum Alburnin
Con A. Con G leclin từ hạt đậu c. ensiíonnis và c. gladiata
11 ?• h\ : Human Se rum Albmnin
kDa : Kilodalton
HLA : Human Leucocyte Antigen
ELiSA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EBV : Epstein Ban Virus
HĐTS : Hoạt độ tổng sô
1IĐR : Hoạt độ riêng
lu : Immunoglobulin, globiilin miễn dịch (IgA, IgG, IgM, IgD, IgE)
OD : Optical Density
PBS : Phosphate Buíícrcd saline
vSDS - PAGE : Sođium Dodecyl Sulíate - Polyacrylamide gel ElectroỊihdrcsis
CìTP : Guanozin Tri Photphat
MHC : Main Hislocompatibility Complex. Phức hệ phù họp ló
chức chủ yêu
TCR : T-Ccll Rcceptor
TNF : Tumour Necrosis Factor. Yếu tố hoại tử ung thu'.
UTBMTBG : Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC)
LỈTNH : Ung thư noãn hoàng (Human Yolk sac Tumom )
MỞ ĐẦU
Ung thư là một căn bệnh hiểm nghèo của loài người. Theo thông kc cua
Parkmg .1. (1998), toàn thế giới có khoảng 7 triệu người được chắn đoán là m;ìe
bènli 1111« tlur. và trong năm đó có trên 5 triệu người đã chết vì bênh này. () Viòl
O ~ . o J
Nam. ngay lừ 1993, theo GS. Phạm Thụy Liên - chuyên gia vế ung lim đã co

70,000 người bị bệnh ung thư trong tổng số 71 triệu dân lúc đó, nghĩa là cứ
khoáng 1 ngàn dân thì có I người bị ung thư. Đó là một tỉ lệ khá cao.
Sang đáu thô kỳ 21, khi nén kinh tê công nghiệp ngày càng phát Irièn. nan
ô nhiễm mòi trường tăng lẻn, các bệnh truyền nhiễm phát triển vẫn là moi ho'
ngại lất lớn đòi với sức khoé cộng đổng, nhất là trong hoàn cánh của nước t;i.
Ung thu là một cán bệnh rất phức tạp về nguyên nhân bệnh sinh và
phương pháp diều trị. Việc kiểm soát và phát hiện sớm đê điều tiị có thô’ làm
giám tỷ lệ tu' vong và kéo dài thời gian sống của bệnh nhân.
Mục đích của đề tài này, trong điều kiện rất hạn chê về kinh phí. ehúiiịi loi
vẩn cô gắng vận dụng những kiến thức và thành tựu tiến bộ của thế giới liong
lình vực này, kếl hợp với những hợp lác trong nước và quốc tế và có thế bước đâu
lưa chọn một sô lectin tinh chê lừ nguồn thực vật của Việt Nam, “nghiên cứu
điều chế chất cộng hợp miễn dịch lectin - Sepharose dùng chắn đoán sớm kliánu
nguyên và kháng thể của một số bệnh ung thư ở người”.
Nội dung của đề tài bao gồm hai phán.
Pììảu thứ Iihàt, lựa chọn phương pháp đê tinh chế một sô leclin co hc;ii
tính ứng dụ nụ quan trọng trong y học miễn dịch.
Pliần thứ hai, nghiên cứu thử nghiệm điều chế chất cộng hợp miễn dịch
lcctin dể nghiên cứu sự biếu hiện bất thường của kháng thể và kháng nguyên (V
một số bệnh ung thư, góp phần chắn đoán sớm đặc biệt là ung thu' gan và ung thu
vòm họng.
Các công việc nghiên cứu mới chi là bước dầu nhưng đã thu được nhứnu
kcì quá hứa hẹn và sẽ được tiêp tục kéo dài trong nhiều năm đế hoàn Ihiện mọt
bộ sinh phẩm trong chẩn đoán một sô bệnh ung thư hiểm nghèo. Chúng loi rai
monu sự giúp đỡ của các cấp lãnh đạo nhà trường, Khoa và các cơ quan hữu
quan.
BẢO CẢO rỏ M TÁT.
1. Tên đẽ tài:
ÍMiHIÊN CỨU ĐIỂU CHÍ: ('HAT CỘNíí HỢP MIẾN DỊCH LECTIN-SKPHAUOSI-
[)1 N(; TRONíỉ chấn đoản KHẢN(Ỉ nguyên vả kh á ní; th ể cùa m oi so

BỆNH UN(; THƯÕ N(ỈƯÒI.
2. Những nguòi thực hiện,
2.1. Cliù trì (lé tài:
1HỈS.TS. Đỗ Ngọc Liên - Bộ môn Hóa Sinh, khoa Sinh học
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2. Các cún bộ tham gia:
NCS. Thạc sĩ. Nguyễn Văn Lợi
i liạc sì. Nguyỏn Thị Thanh Loan
Tiến sì; Nguyền Hạnh Phúc
liên sĩ/'Trương Văn Châu
Cl,cÀ(r
Học viên Thạc su Trần Thị Phương Liên
3. Nội (lung nghiên cứu đã đãng ký:
3 .ỉ. ỉ loàn thiện quy trình tinh chê một sỏ lectỉn có hoạt tính ứng (liuiiỊ
q u a n tr ọ n ẹ tr o n g n g h iê n cứ u m iến d ịc h V h ọc .'
3.2. Nghiên cứu thử nghiêm điều chế chất cộng hợp miễn dịch trong chán
đoán sớm một sô bệnh ung thư, xét nghiệm sự biểu hiện bất thường cua kháng
thè và kháng nguyên chỉ điểm ung thư (Tumor marker antigen).
4. Các két qua chính đã đạt được:
4.1. Đã tinh chê được 5 loại lecỉin có hoạt tính đạc hiệu miễn dịch là Con
A. Con G. 3 loại .lacalin, trong đó đã lựa chọn được 3 loại, có hoại lính mien
dịch đậc hiệu cao đê thiết kế bộ sinh phắm miễn dịch nghiên cứu chắn đoán sớm
úng thư.
4.2. Đã thiết kê được 4 bộ sinh phẩm dạng cột ái lực miễn dịch: Con A.
Sepharosc 4B, Con G-Sephnrose 4B, J 1 -Sepharose 4B và J4- Sepharose 4B. Có
hoại tinh đặc hiệu cao để tóm hắt kháng thể và kháng nguyên chì điếm một so
bệnh ung thư: ung íhư gan, ung thư vòm họng.
Quy trình Ihiẽt kê các cột ái lực miễn dịch này đạt liêu chuẩn cao:
- Có ái lực miễn dịch đặc hiệu
- Kha lìãng dùng và báo quán lâu dài hàng năm ở 4"C

- Giá thành bang một phẩn ba so với sản phẩm phai mun của nước ngoài
- Sử dụng tài nguyên trong nước, có giá trị kinh tê cao.
4.ĩ. Bước đáu đã và đang hoàn thiện quy trình lạo ra bộ sinh phàm ilưới
dang xót nghiệm nhanh miễn dịch hiện đại là (ELiSA: enzyme Linked
ỉmnumosorbent Assav).
4.4. c ác kết quá nghiên cứu đã đăng 3 bài báo trong Tạp chí Dược học v;ì
I báo cáo O' hội nghị Sinh học cơ bán toàn quốc tháng 8/2000.
5. Tóm tát các kết quá nghiên cứu.'3
5.1. Đã thăm dò nghiên cứu tinh chế một số lectin từ một sô loài cà\ họ
đậu và họ dâu tằm và cuối cùng đã hoàn thiện quy trình sác ký ái lực dạc hiện
cao đẽ tinh chế được 4 loài lectin ứng dụng đặc hiệu bắt giữ miễn dịch kháng thò’
IgA và kháng nguyên AFP.
Đó là lectin ConA và ConG lừ hai loài đậu dại trồng ở Việt Nam (Yên Bái.
Lào Cai, Ba Vì - Sơn Tây) tluiộc chi Canavalia ensiformis, Canavalia gl;uli;il;i
Đây là hai loài đậu dại chưa được dùng cho thực phẩm vì ở hạl chứa nhiên
gluco/it và axit Xianhydric (HCN) có độc lính cao.
Sụ' phân loại khoa học đã được xác nhận bằng các phân tích hình thái <;fụ .
hạt và hoa do tiến sĩ phân loại học- chuyên gia đậu đỗ- Nguyễn Đãng Khôi (>■
Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia thực hiện.
Trên co' sớ khoa học đó, chúng tôi đã tiến hành phương pháp tinh chê ;ii
lực có cái biến kỹ thuật của Golstein & cộng sự và đã thành cổng điều chê ilnnu
tinh khiết cao của hai loại lectin này.
Một sô lính chất của lectin ConA và CoitG
+ Tinh khiết chí chứa một băng Protein trong SPS-PAGE.
+ Hàm lượng Protein trong chê phẩm đã đòng khô 90-95%.
+ Hoại động liêng ngưng kòt hổng cầu nhóm máu A: 7,2 X 10 đon vị/mu
(liên Im! piotein chế phẩm) và 6.6 X lOVtưn vị/mg tương ứng (nêu mu.1 chc
phẩm nàv cùa hãng hóa chất SIGMA nổi tiêng Ig phải trả I80USD, dang ctóim
khó). Độ sạch tăng từ 10 đôn I 1,5lần so với dịch chiết PBS.
3

+ Có tính đặc hiệu đường glucoza, manno/.a và dẫn xuàl cua dninii. co iln'
linh dặc hiệu cao với kháng nguyên AFP ung thu.
+ So sánh với tiêu chuẩn quốc tế, các chê phẩm lectin ái lực miễn (lịch lì.IV
đã đại được liêu chuẩn cao và đã được chứng minh trong xét nghiệm miỏn tlịcli
bệnh viêm gan và ung thư gan.
+ Ráo quán dạng dung dịch và dạng đông khô hàng năm vẫn có hoại lính
miễn dịch cao (Ứ4°c, có chất chống khuân azide 0,04%).
5.2. Hoàn thiện quy trình điều chế cột ái lực Mucine- Sepharose 4B lại
Việt Nam đế linh chế ái lực lectin một sô loài mít chọn lựa có hoạt lính ái Itk
miẻn dịch đặc hiệu cao. Đó là các lectin mít dai, mít tô nữ, mít dại Táy Nuiivẽn
có tòn phân loại khoa học tưoìig ứng là Arlocarpus helerophyllus l.iimk.
Aitocarpus Champetlen Cìagn và Arlocarpus - masticata Gagn.
Một sô đặc tính của chế phẩm lectin là:
+ Tính khiết đồng nhất chứa 2 tiểu đơn vị 14 và !7kDa trong điện ili
SDSPAGE.
+ Hoạt dộng liêng tương ứng 650,5x10'; 520,2x1(ý và 960x10' don vị
lui/ma, protcin. Và độ sạch sau khi tinh chế trên cột sắc ký ái lực tăng từ 3 đèn 7
làn so với dịch chiết thô lừ hạt.
+ So sánh với tiêu chuẩn lectin quốc tế, chế phẩm có độ tinh sạch cao.
hàm lượng P ro te in tiên 90% (phấn còn lại là muối đệm).
+ Có hoại tính dặc hiệu cao với IgAI được chứng minh bằng kỹ IỈHI.H XÓI
nghiêm miễn dịch ơuchterlony.
5.3. Thiôt kế cột ái lực trong điều kiện tai Việt Nam chứa chât cộnu họ'Ị>
miền dịch lectin- Sepharose: .11- Sepharose 4B; J2- Sepharose 4B; J4 Sephaiosc
4B dùng đế bắt giữ miễn cỉịch IgAI của bệnh nhân ung thư gan và ung thu' vòm
honu.
c
Kết quà phân tích nồng độ IgAl từ huyết thanh bệnh nhân ung thu' gan la
7.85 ± 0,80 (với 11= 30) tăng gấp 2,76 lán so với người bình thường (2.84
±0.28)mg/ml, khác biệt có ý nghĩa (hống kê.

5.4. Thiêt kế CỘI ái lực cliãl cộng hợp miền dịch ConA- Sepharosc 4B \ .1
ConG Sephnrose 4B đè bắt giữ kháng nguyên ung thư gan AFP (ung thư bicu mo
tè bào gan HCC) để tinh chê có hiệu quá AFP ỏ' các ma LI huyêl thanh ung lim.
Các chê phấni kháng nguvên nàv sẽ được sử dụng trong nghiên cứu lạo khánu
4
thỏ (la đòng và đơn dòng liong chươiti; (rình nghiên cứu sau này đế phái hiện stVm
unu thu' b;mg phương pháp xét Iiụhiộm miễn (lích hoàn thiện cao.
5.5. Đang hoàn thiện Cịiiy limlì xét nghiệm ELiSA liên kê( lectin míí dê bál
giữ ái lực kháng thổ IgA 1 từ huyết thanh bệnh nhân ung thu' gan.
Kêì quá cho thấy:
- Sử clune bộ sinh phẩm (lạng ELISA xét nghiệm lìồng độ lgAI luiyét Ihanli
cho kè! quả xét nụhiệm nhanh, chính xác cao và xác định được nồng độ IgAI huyèl
thanh bệnh nhàn ung thu' gan (7.5 ± 0,5)mg/ml (ăng gấp 2,5 lán so với người không
mác bệnh (2,84 ± 0,8)/mg/ml. Và đôi với viêm gan siêu trùng (10,98 ±0,83)mg/ml
(dã nghiên cứu tù' 1998-1999) gấp 3,86 lân so với bình thường.
5.6. Đang nghiên cứu quy trình tao bộ sinh phắm dạng ELISA cho XÓI
nghiệm khánu nguyên ung thu' AFP và bộ sinh phàm xét nghiệm phân biệt khánc
nctiyèn AF:P của bệnh nhàn viêm gan siêu trùng và bệnh nhân ung thư gan.
ít. Tinh hình kinh phi (lề lùi.'
6.1. Kinh phí được câp ngày 15/8/2000: 7.000.000đ (Bảy triệu: gổm ca lièn
quản lý đề lài 300.000(1).
6.2. Các khoán đã chi:
- Mục 1 10: Vật lu' văn phòng
- Mục 1 12: In ấn, mun tài liệu làm chế ban, ảnh tiêu bán
- Mục ỉ 13: Công tác phí và đi thu mua mẫu lại Ihực địa
- Mục I 14: Ticn thuê hợp đồng làm phân (ích và thuê
300.000c1
700.000c1
I .OOO.OOOđ
xác định tên khoa học

- ỈVIục 1 19: Chi phí hoạt động chuyên mồn,mua hoá chát
và đụng cụ (huỷ linh
Tọng cộng clĩí chi hết
2.900.000c1
7.000.000(1
1.800.000đ
X AC: NH Ạ N (UA BAN CH ú NIIIÊM KIK) A (HÚ TRÌ f)í; TẢI
PGS. TS. Đ ỗ N gọc Liên
t
SUMMARY
StUtỉy OI1 piepniation C)f Lectin - Sepharose Conjugates for tliagnosiic oỉ
anlihociy and anlcgen's Tmnor markers.
The icsulls ohtaincd oí lliis projccl are:
1. Fivc Lectins vvere purified íYom 5 species of Vietnamẹse (Arícx ti/>/>ii\
hclcroỊìììxlliis, A. champedc'II, A. masticata Canavaỉio i‘Ịisifontiis. CaihiYdlhi
ìịIiulidtd) for preparation ()f immunological conjugates to dingnose Tunioi
markers.
2. Sludy on IgAl Concentration from healthy and Tumoui (íICC
1 lepaiocellukư Carcinoma) sera using iinmunological Conjugates basccl ('II
.lacalin - Sepharose 4B affinity column. The results obtained showed thai IgAI
Cdiicentralion íiom liuman Hepalocelltilarcarcinoma (HCC) semm (7,85 ± 0,8
mg/ml), is 2,76 times higher llian thai of healthy human (2,84 ± 0,28 mg/ml).
3. Using modiíied ELISA technique períeeteđ in om laboratorv (En/vm -
L.cclin linketl Immuno Assay) we liave shovved IgAI Concentialion íYom Scra uí
n c c paticnts is same in Comparison vvith Affinity chromatogiaphy techniqtic.
4. Usiim highly puriíied leclins Con A and Con G from seeds ol luo
species Canavalid cnsiỊormis and Canavalia ạlưdiata to make ConA and Con G
- Sepharosc 4B ani 11 ity Columns for tMcctirtịỊỊ serum Tumor markci API’ in
palienls of livei and brcast cancer, we showeci a high speciíic interactiorì
bclxveen lectins Con A or Con G and AFP as well as soine pathologicnl

glvcopioteins. Thai was Ihe nia in base for om later research on leclin alTinity
AF1J markers in carly diagnostic ()f HCC, especially in palients al high risk snch
as cỉironic hcpaíilis and Cirrhosis.
This results was published in 4 papers of national joumals.
IVoịect Co - ordinator
Assoc. Prof Do Ngoe IJeii
6
I. TỔNG QUAN TẢI LIỆU
1. Khái niệm võ ung thư và co chế l>iếu hiện ung thư.
/./. Cieii íỊày ỈỈIIÍỊ th u và ge n k im h ã m u n g thư,
Ung thư (Tiimoui. Canccr) là một biếu hiện tăng sinh vó han ciii) mot
clónu tê bào. lạo nên những khối u có bàn chất đơn dòng. Các dòng tê bào 11,1 V co
bicu hiện hát Ihường vé di truyền là sự hoạt động quá mức của một so ucn. Mí' roi
loan và tốn ihuơng nhiễm sắc thê dẫn đến vi phạm vào quá trình phân chi;i k'
bào. Sụ' bâl thường cúa bộ máy di Iruyổn tê bào, dẫn đến vi phạm vào t|Uíí (lình
hiệt hóa tê bào và, mất khá năng kìm hãm tiêp xúc, vi phạm vào quá trình tu chói
theo chương trình (apoptosis) vốn sán có cùa mọi tê bào sông. Từ đó các lẽ hào
ung thư tăne khá năng di căn (metastasis) đến khu trú ở những mô lê bào dặc
hiệt khác như gan, não, tim, tuy xương
Ngà\ nay, người ta đã chứng minh ung thư là một căn bệnh hiểm nghèo co
ban chài gen và bàn chất tiếp thu di truyền. Thêm vào đó, người la cũng dà
chưnu minh các yêu tô tác động phức lạp bên trong cơ thê và môi Irườnu Mills:
quanh dã tao ra những nguyên nhân gây ra bệnh ung (hư.
Tron" mỗi tô bào luôn luôn tồn tại các gen ung thư gọi là Oncoucn CIIII k'
bào. là nhữnu gcn lạo ra các sán phẩm kiếm soái các tín hiệu hoạt hóa V.I I.mu
sinh lô bào. Đó là các thụ thê (Receptor) của các yếu tô tăng trưởng, các piotein
truyền dẫn tín hiệu nhu' Photpholyrozin Kinaza (PTK), các kina/a cua
SCI Iii/trenonin, protein G, các protein lliam gia vào báo vệ chống oxy hóa (Bcl-2).
hoậc các yếu lô phiên mã (C-myc). Các oncogen này có thế được hoạt hón bãim
một đột hiên. Đột hiến này đã làm rỏi loạn hay đối kháng lại cơ chê đicu hòn

sinh lí cùa sự biếu hiện các oncogen. Những đột biến của các gen họ ras là mội
ví dụ dược thây rõ ở phần lớn các khối 11 của người, gáy ra sự phong bê (bao váv)
một loại protein là p2lras, làm thay đổi cấu hình hoạt động, chống lại SƯ bãl hoại
quá trình thuy phân CìTP thành GDP. Chính quá trình thủy phAn CÌTÍ’ dã curn:
cáp tín hiệu cho sự hoạt hóa phân chia tê bào. Tác động cua các oncogen co IỈK'
được thực hiện băng sự chuyên đoạn nhiễm sắc thể, liên quan đèn sự tlicu hòa
cua các aen khác. Ví dụ sự chuyên đoạn nhiễm sác thể 14 và 18 liên quan đón
oncogen Bcl-2 nằm trên nhiễm sắc thê 14, vùng DJ của gel IgH (chuỗi nạnLi 1^).
Sự biếu hiện quá mức của gcl Bcl-2 và sự mất di cơ chế chết theo chưưim li inli
cua lê bào (apoptosis) lympho B dần đến ung thu' dòng tế bào B Ironu các Inniịi
lâm tó hào niáin (tuý xirơng). Sự chuyến đoạn giữa các nhiễm sác Ihè (<s. 14) u;i\
7
ra cho đa sô các trường họp II lympho Biukill. liên quan đôn prolo-oncogcn (
myc, làm đột biên các chuỗi nặng cùa các globnlin miễn dịch (Ig). Một VI du nu;i
là MI' c h u y ê n đ o ạ n n h iễ m sá c thể (9 , 2 2 ) tạo ra u n g thư m ã n lín h h ạ c h cá u clo im
tùy (leuce'mies/mye'ioiđes chioniques), gây rn sự dung hợp các gen abl và ba.
San phẩm của gen di mẹ này có hoạt tính tyro/.in kinaza luôn luôn tạo ra lín hiệu
hoạt hóa không thích hợp cho tế bào.
Trái lai. trong lê bào cũng luôn tồn lại các gen kìm hãm ung lim. gọi la
nnti-oncogene. Các gen này đã được phát hiện khi phân tích các đột hiên cua
chú ng ỏ' các dạn g ung thư có liên quan họ hàng (ví CỈỊI các ung Ihir
Retinoblastoma, khối II VVilms ). Các anti-oncogen mã hóa cho các protcii) CIIII
bộ khmm tê bào (cytoskeleton) hoặc các protein điều hòa chu trình tê bào. hn.k
sưu chữa ADN, hoặc trực tièp, hoặc gian tièp qua trung gian các yêu lo phicn m.1
(transcriplion). Những anti-oncogen đó thường xuyên bị biến đổi trong các khoi
li tự phái cua người. Đạc biệt là trường hợp prolein p53 có gen mã hóa cho nt» bi
đột biên có tói hơn 50% tạo ra khối u ở người. Bình thường protein p53 nì! II
biổu hiện trong các tế bào bình thường nhưng rất giàu ở các tế bào bị “Slrcssl"
làm nhạy cám biến đổi cấu trúc của ADN (ví dụ Stresst oxv hóa, bị chiếu xạ. hi
nhiễm các chất gây ung thu' hóa học) sự biểu hiện quá mức của p53 làm phonu

bê (bao vây) pha GI cua chu trình tê bào, lừ đó ngăn cản cơ chế sửa chữa ADN
11 ƯỚC khi phân chia tế bào. Nếu quá trình sửa chữa ADN bị mất đi, protein 53 lạo
điếu kiện dỗ dàng, hay cho phép tế bào chết theo chương trình (bằng t|ii;í tlình
apoptosis). Sụ' dột biên gen p53 có thể đạt lới việc tích luỹ một proíein bâl hoại \ I
protcin này không có kliíi năng giúp cho cơ chế sửa chữa ADN, tù' đó sẽ ci11\ II I
SƯ sòng của các tế bào bị tổn thương tiếp tục có khá Hãng biến dạng ác lính. Vk\
dưa (in vitro) mộ! allen p52 bình thường vào các tê bào ung thư có thc sẽ lam
mất di phenotyp ác tính. Sự bất hoạt chức năng của p53 còn có thê gây ra sự biếu
hiện quá mức của gen mdm-2, là gen mã hóa cho một câu tử gắn của p53.
Sư chuyên dạng ác tính của một tế bào xáy ra theo nhiều giai đoạn iươnu
ứng vói sự hoạt hóa các oncogen và sự bất hoạt đồng thời của các gen kìm hãm
ung thu' (anti-oncogene). Đây là CO' chê đang được giải thích cho một số mỏ hình
ung thu' do các virus gây ra. Cụ thể là, các protein biến dạng Ela và El b cua cát
virus gây ung thu' Adenovirus sẽ tạo phức hệ với protein Rb (anli-oncogen tham
gia trong bệnh retinoplastoma và những loại ung thu' khác) và tạo phức hộ \(Vi
p53. Các prolein E6 và E7 của papillomavirus HPV16 và HPVI8 (tlni phạm u;i\
ung thu cổ tử cung) sẽ kết hợp với p53, sau đó kết hợp với Rb và tù' đó ng;m Ciin
chức nane, chống UI1U thu' của chúiì£.
8
1.2. Các kháng nguyên thài bồ mảnh ghép ung thu và kháníỊ níỊnyên
(lác h iệ u UIIÍỊ thư :
Việc nghiên cứu các kháng nguyên có nguồn gốc thài bỏ các khỏi II Iliur
nuhiệm dã thu được những ticn bộ nhờ phương pháp tách dòng tè bào ung lim' \ .I
các lê bào lympho T. Từ đó đã làm sáng tỏ vai trò cùa các lympho T gáy dọc
(Tc) dặc hiệu cho các (ế bào ung thư ghép vào hạch bạch huyết của các động vát
thái bỏ chíinti.
Tù' một dòng tê bào ung thư cấy ghép (ký hiệu tum(+l) nhiều phònu llií
imhiệm có thê nhận được các dòng tê bào biến dạng (ký hiệu r*) bị thái bó bời
các cá thê’ nhận đổng sinh do tạo ra một đột biến in vitro. Từ hạch bạch hu\êl
cua chuộl thụ nhận mãnh ghép ung thư đã đột biến người ta lây ra các lympho 1

gây độc (Te) làm phân huỷ các lê bào (Tum-) nhưng không có khá năng tiêu lìii\
dòng Tum(+) của cha mẹ. Các lympho Tc kháng lại Tum(-) sẽ được tách dòiii:
bằng cách pha loãng có giới hạn. Sau đó các băng ADN genom cùa tế hào Ttimi-)
sẽ đirợc biếu hiện bằng cách truyền nhiễm vào các tê bào Tum(+) qua lninn man
vecto cosmid. Các tế bào sau khi được nhiễm genom Tum(-) sẽ trớ nên nhay Ciim
đỏi với sự phân hu ỷ và bộc lộ một kháng nguyên được nhận biết bởi các lympho
Te. Chính những tê bào đó sẽ bị thải bỏ in vivo. Người ta tiến hành phân tích
trình tự các mảnh ADN cài đặt và đã xác định được các peptit immunogen liên
kct với các phân (ử lớp I của phức hệ phù hợp tổ chức MHC. Những péplil khánu
nuuyên này có đirợc là do những đột biến điểm trên phân tử ADN genom.
Vậy kháng nguyên đặc hiệu ung thư là gì? Người ta thấy răng từ một số
khói 11 của người, có thể tách ra các dòng tê bào phân chia vô hạn invitro trong
khi vẫn giữ dược những đặc tính chủ yêu về phenotyp của khối Li. Klii nuôi cày
các tế bào lympho của bệnh nhân (lây từ máu hoặc lọc ra từ khối II) cho liêp MIC
với các tế bào khôi u tự ghép (autologous) đã được phân lập, Iigirời la sẽ nhận
dược phán ứng hỗn họp tế bào lympho-khối II. Các tế bào lympho T lăng sinh
trong những điều kiện nói trên nói chung đều là dạng lympho T-CD4*. Tioiìịi
một sô trường hợp, người ta cũng nhận thấy có một sô dạng lympho T-CD8* tãnu
sinh đã tiết ra TNF cx (yếu tố hoại tử ung thư alpha) do sự kích thích của các lò
bào khối 11. Nhờ sử dụng phương pháp trên, Bootn T và các cộng sự đã phái minh
ra một họ các gen mã hóa cho kháng nguyên liên quan đến bệnh ung thư hãe lô
(MAGE: melanoma associated genes). Từ máu của bệnh nhân ung thu’ hác lo
(dạng MZ 2), các nhà nghiên cứu trên đã tách một dòng tê bào lympho Tc CD8’
đặc hiệu với khối 11 này (MZ2-E). Họ đã xác định được các hiên dạng tế bào cua
chính khối u có khá năng đối kháng lại sự phân huỷ tê bào (giống tương (Uronu
9
dòng Tum‘) sau đó các tác giá đã cho nhiểm các mánh ADN bổ sung lây lừ c;íc
lé Kio nhạy cám với SU' phân hủy tê bào (qua trung gian vectơ cosmkl) vào các lé
hào đối khang phân hủy tè hào cùa dòng MZ2-E cho thấy dòng này xiiiìl hiện
mội kháng nguyên và được các tê bào Tc nhận ra. Phân tích trình tự cùa ADN bo

sung cho nhiễm vào tê bào đối kháng, người la đã xác định được mót UCI1
MAGE-1 ịiiòng với gen bình thường nằm ở nhiễm sắc thê X. Sán phám CII.I lì en
nà\ khỏnu bộc lô ỏ'các mô lê bào bình thường, trù' mô tinh hoàn, đăc biòi bột’ li’
lói 40% ỏ' ung thư hắc tô da và biếu hiện cao ở Ling thư vú, ung thư phổi. DÒIIU ló
hào lympho Tc MZ2-E gây độc cho các tế hào có biếu hiện gen MAGE-I liên
kết với phấn tử HLA-A1. Người ta đã xác định được cấu trúc cua sán phàm UCI)
miịi í hư MAGE-1 là một nonapeptit, có epitop T liên kết với HLA-AI.
Gcn MAGE-I thuộc về một họ bao gồm 14 gen giỏng nhau hì 85-9(1'/.
San phẩm cua chúng hầu như chí bộc lộ ở các tế bào ung thư (khôi li). Tuy vặ\
các gen này ở (rạng thái "yên lặng" trong các tế bào hình thường. Phái minh cùn
các nhà khoa học tiên tạo nên một giá trị áp dụng phán ứng hỗn hợp các lê bào
Ivmpho - khối 11 để nghiên cứu các kháng nguyên ung thư. Tuy nhiên kỹ thun!
này cho phép sàn xuất ra các dòng Tc nhận biêt các peplit kháng nguyên cua đ;i
số các mô tè bào bình thường, nghĩa là không đặc hiệu.
Những kháng nguyên ung thư khác có giá trị cũng có thế được xác (.lịnh ro
nhờ các phương pháp miễn clịcli, nhưng cần được (hực hiện bầng lìluìng xéi
nghiệm miễn dịch đặc hiệu.
1 J . Các cơ chê trốn ílioát hệ miễn dịch của các tê bào ung thu:
Các công trình nghiên cứu trong những năm gần đây trên các mỏ hình
động vật và trên các nghiên cứu Ĩ11 vitro ở người đã cho ta những lí giái vé cơ chè
trốn thoát của các tê bào ung thư đối với hệ miễn dịch. Các nhà khoa học đã tổng
kèt và đua ra 3 khá năng cho cơ chè này là:
/ ỉ./. Các co'ché cua hán thân vật clni và tác dộiiiỊ cua môi ỊníờiiiỊ.
- Sư thiêu hụt miễn dịch của cơ th ể do xử lý các thuốc kìm hâm micn (tu li
(Ironụ trườim hợp cày ghép mô chẳng hạn), bị nhiễm các virus, trong dó dạc hiẹi
là các virus gáy ung thư như: EBV (gây ra khối u lympho Buikitt, ung llui VIII11
họng), các virus HBV gây ung thư gan, HPV (papilloma virus ở người íiây IIIIU
thư cổ tử cung) Ngoài ra khi bị nhiễm xạ, người và loài vật cũng dể mắc bệnh
ung thư.
10

- Yêu ló thứ hai là sự bất thường của cơ chè đi truyền hoặc do mắc phái SƯ
lôi loạn các gcn chống ung thư (anti-oncogenes) như: RB, p53, WT-I,NP-I
APC'
- Do sự bât thường của hệ (hống sửa chữa ADN
- Sụ hộc lộ vượt trội quá mức của các chất gây ung thư hóa học và các t;íc
nhân vậl lí (tin xạ Ỵ hoặc UV).
- Thiêu hụt khá năng nhận biết các kháng nguyên ung thư của các lê bào
khôi II (cua phức hệ MliC. kho dự trữ TCR).
1.3.2. Co'chê vé MI'thiêu hụt tính sinh miên (Ìịcỉì cùa khôi II ( ó thê hiên liiộn:
- Không biểu hiện các peptit kháng nguyên của khối u hoặc các phân lử M1IC.
- Tiết ra các phân tử kìm hãm miễn dịch như TGF p, IL-10, PGE-2.
- Biếu hiện kháng nguyên không có khá năng gây đáp ứng của Tc
- Tạo ra sự dung nạp bằng cách tiết ra các kháng nguyên hòa (an.
.ỉ. Sự Hối kìiá/ìiị cín/ hàn thân khôi II được thê h iện:
- Vắng mạt các phân lử kết dính (chẳng hạn CD80 hay B7) do (tổ khóng
làm hoạt hóa các Tc và NK của hệ miễn dịch vật chủ.
- Tạo sự đột biên peptit "đích" cho sụ' đáp ứng miễn dịch cua Tc (cliãim
hạn sư biên dổi lum' ' —> lum(f>).
- Tao ra sự điều biên kháng nguyên.
- Gây cản trở đối với các chất gây hiệu quá miễn dịch (như kháng thè và Tc)
- Biểu hiện quá mức các thành phần cấu trúc tế bào (trường hợp các tò hào
thán kinh) hoặc tạo ra cơ chê đối kháng apoptosis hoặc những "stresst oxy hóa",
ví dụ Bcl-2
- Bộc lộ các phân tử MDR làm giái thoát nhanh chóng các thuốc chỏng
ung thư ra khỏi tế bào II (cho phép exocytosis nhanh thuốc chống ung thư).
1.4. S ự biếu hiện h ội chứ ĩỉíỉ m iền d ịch t ế b ào và th ế d ịc h íroiiỉỊ IIIIIỊ lim .
Hội chứng biểu hiện trong ung thư là sự tăng sinh quá mức và vỏ hạn đọ
cùa các dòng tê bào ung thư. Người ta gọi đó là hội chứng tăiìiì sinh miễn (.lịch
(Immimoproliíerative synđrom) cua các tế bào lympho T hoặc dòng B.
Su' lãnẹ sinh cua các dòng tê bào được thê hiện ớ tính châì don (lòn*:,

nghía là ch 1 một dòng lê hào lăng sinh vô hạn. Có thê nêu ra nhũng ví du vê MI
táim sinh đon dòng của các tê bào B và T.
1.4 .1. Bệnh (1(1 II lnỲ (mnltiplc Myeloma)
Đó là sự tăng sinh ác lính của dòng tẽ bào B dưới dạng plnsma ứ mo luv
\ ươn Si. Bệnh này gây tổn thương xương và loãng xương nghiêm Irọim. Các
imhiên cứu đã chứng minh các tế bào plasnia (B) đã thẩm lọt qua tuy xương ó'
các dang hình thái khác nhau: 11 plasma tuỷ xương đơn độc và các II plasma thoái
bên ngoài xương. Các biến chứng chủ yêu là gây tổn thương các ông thân vi
mạch và tổn (hương tiểu cấu thận, tạo ra các đóng cặn của các mành khiíim thê
bất Ihường (amyloidosis) và giảm tổng hợp các Ig bình thường. Từ đó làm lanii
quá mức trao đổi chất của IgG, làm biến đổi dòng tế bào neutro phile. gâ\ nhiem
trùng nghiêm trọng.
ỈA . Bệnh iuií> thư bạch cầu mãn tính dòiHỊ B.
Đó là bệnh tăng sinh dòng tế bào B có mật độ thấp các IgM và IgD trên màng.
Ị .
4
. Bệnh 11/iíỊ rim' MturoíỊÌohiilin W(il(leiì stroni.
Biếu hiện của bệnh cũng là tàng sinh dòng tế bào B, tạo ra IgM do'11 dòng
trong huyết thanh, làm tăng độ nhớt của máu.
ì .4. . Cóc hệnh u ìympììo (lồng B, dụng Barkitt liên quan đèn YÌHIS
Epslcin -Ban (EBV), các II lympho không Hodkin và Hodkin.
ỈA., . Lhìi> rlitf<lòiii> lỵniỊỉho I' bệnh này cũng thường xáy ra và được uọi ỉ;'i
ung ihu' bạch cáu dòng T (T. Cell leukemia). Bệnh cũng có thể do các vims
HTLV-I (Human T-Cell leukemia virus) gAy ra. Biểu hiện của bệnh là do lác
động tại chỗ của các xitokin do dòng tế bào ung thư tiết ra (GM, CSF, IFN Ỵ,
TNFa) vào các lớp da biểu bì hay chân bì.
1.5. Các biểu hiện đon dỏng rà bát thuồng của kháng thế trong ung thu:
Biểu hiện rõ nhất trong ung thư là hàm lượng các kháng thể đơn dòng
trong huyết thanh tăng lên nhanh chóng ở nhiều bệnh ung thư. Các kháng thè
dơn dòng biểu hiện thường là IgG và IgM, nhưng cũng có thê là IgA (ví tiu bệnh

đa 11 tủv, bệnh ung thu' cổ tử cung). Đôi khi sự lãng các kháng thể đơn dòns cũn ị!
dược lliấv đối với các lóp kháng thè IgD và IgE, nhưng rất hiêm. Đối với C.IC
dưới lớp IgG Ihì các đơn dòng tăng ưu thê là lgGI> IgG2> IgG3> igG4.
12
Biêu hiện táng dơn dòng cùa các kháng thê còn thấy rõ ớ tính bất Ihườni:
Iroiiíi cấu trúc cua kháng the. Đó là sụ' (ổng hợp quá mức các mảnh prolein chuoi
nhẹ. (V (lạng ciime là protcin Bence -Jones (B.IP), có thế đirợc phát hiện đễ d;nm
tro n g d iệ n d i lớ p m ỏ n g a g a r o s c .
Tính bát thường trong câu trúc hóa học cua các kháng thế còn biếu hiọii ru
ớ những thay đối sau dây:
Biểu hiện bất thường thứ hai là sự thay đổi câu trúc đường cua phân III
kháng, thể. Viện nghiên cứu cấu trúc phán tử kháng thể trong bệnh ung thư (lànu
sinh miễn dịch) cho phép hiểu được sự thay đổi cấu trúc đường của các đơn đòn*:
ỉ Si A và IgCi. Bệnh thè hiện rõ nhất là chuỗi nặng cx (của IgA). đoìi dòng bị tluoim
hóa rất cao. nghĩa là ỏ' chuỗi nặng được gắn thêm các gốc đường (Aucouturier et
al, 1996). Hậu quá của bệnh chuỗi nặng « của IgA trong, ung thư II tuy dã lạo ra
sư đóng cặn nhiều chuỗi nặng hoặc các chuỗi nhẹ bất thường ỏ' mức độ liêu cáu
thận, gây tốn thương thận nghiêm trọng. Sụ' Ihay đổi cấu trúc đường cũn mộl so
UA. ỉgG làm biên đổi đặc tính ái lực hóa học cùn kháng thể đôi với một sò hoai
chất tự nhiên, dặc biệt là các leclin có nguồn gốc từ động vật hoặc thực vãi. Đo
là những nghiên cứu mới đây của Hiki và các cộng sự (1999) về sự thay doi càn
trúc đường cùa phân tủ' kháng thế IgAI trong bệnh viêm cáu thận (Hiki.Y 01 al.
.1. Am. Soc of Nephrology. 4/1999; Vol 10 (4). 40.45).
Sự thay đổi cấu trúc đường của các IgCì II tủy cũng đã được chứng minh
HÀU hết những người bị bệnh ung thư II tủy đều gắn thêm 2 phân tử đường trên
chuồi nặng nhung thiêu hụt axit Sialic và không có nhóm Glc NAc(3l. Sụ' hiên
đổi các chuồi đường này xáy ra ở protein Bence-Jone (BJP) bắt nguồn từ phân lử
IgG.
Nhu' vậy. nhờ những biểu hiện của các kháng thể đơn dòng người la cùm:
có thê xét nghiệm và theo dõi tình trạng bệnh ung thư và cũng có thè đónu uóp

cho việc phân biệt các loại bệnh ung thư khác nhau cũng như các bệnh tnivèn
nhiễm khác.
1.6. Các phưong pháp miễn dịch trong chấn đoán và tlìeo dõi UIIÍỊ thu.
Ị .
6
.
1
. Hhiứmạ/>//<//> /ìiỊỈnên cứu insitu:
Nuưừi ta sử dụng các phương pháp miễn dịch trong chấn đoán và theo dõi
ung thu' vì khá nàng phát hiện rất đặc hiệu và đo chính xác các dâu hiệu chI diêm
ung thư (Tumormarker) của chúng. Các phân lử dấu hiệu chỉ điểm mia thư cũng
Ihường được cọi là các kháng nguyên ung thư vì chúng được nhận biêt ctãc hiệu
bời kháng thế chống ung Ihư nhu' đã trình bày ở trên. Tuy nhiên các kluíim
13
níiuyòn này nói chung không có khả nâng tạo ra đáp ứng miễn dịch ở bệnli nhãn.
Vì vạy không nên nham lần với các kháng nguyên ung thư đã mô tả trong phân
1.4. Người la có thế tạo ra kháng thể đơn dòng (hoặc đa dòng) chông lai cát-
phan lử liên kết với khối II này đê có thê nhận biết sự xuất hiện cua khỏi II có
nguồn gốc biểu mô hay có nguồn trung mò. Các dấu hiệu biệt hóa liên kẽi với
các khôi II có thc được pliáí hiện ở một số nhỏ các tế hào ỏ' một giai đoạn chính
xác cua MI hiệt hóa. Vi dụ kháng nguyên CD10 là một kháng nguyên chmm cho
ung thu' bạch cáu dạng nguyên bào lympho (CALLA: Common Acnk’
lymphoblastic Lcukemia An(igen) tliirờng bộc iộ tiên các tế bào ức (Thymoọ lc)
\à tiên các tố bào B của tuv xương nhưng không biểu hiện ở các tế hào lympho
máu ngoại vi. Các phương pháp nghiên cứu mô học và hóa miễn dịch mô. được
gọi là pluionu pháp nghiên cứu insitu, đã chứng minh rằng đa sô các khôi II cua
người chứa một đám thăm nhiễm (iníiltrte) của các tê bào viêm cùng vói các lô
bào lympho. các đại thực bào, đôi khi có cả các tế bào viền xẻ thùy, tế hào đa
nhân và các tê bào mast.
1.6 .2 . Phát hiện \'à (lịnh lưựiií> các chi (hèm ung thư(Tnm or um rkcrs).:

Các thành phán của một sô khối u được giái phóng trong tuần hoàn mau
(huyết thanh và huyết tương) có thê được phái hiện và được định lượng bằng mọt
sò phương pháp xét nghiệm miễn dịch rất đặc hiệu và có độ nhạy cao. Nhừnu
chất chi điếm ung thư này có llìể là: các hooe môn nhu' HCG. ỊMKXi.
Calxilonin. ACTH, prolactin, có thế là các thành phán của các kháng thò don
dòng (mánh protein Bence Joiie), p2-microglobulin (một khôi chát cua II
myeloma), ư-ĩeto protein (AFP) có xuất hiện trong ung thư biểu mô tế bào gan.
ung thư phôi tinh hoàn. Các kháng nguyên ung thư phôi CEA (Carcinoma
Embryon Anligen), các kháng nguyên CA 19.9, CA50, CA 125 đều là sán phám
cua các kiểu khối u khác nhau ở đường tiêu hóa như dạ dày, tụy, ống mật. Kháim
nguyên prostatic (PSA) là một chất chi điểm tốt nhất của ung thư tuyên tiền liệt,
nêu được phát hiện sớm ở nồng độ tăng cao sẽ chẩn đoán sớm khá nâng xtiai
hiện khối II tuyến tiền liệt và theo dõi sự chữa trị bằng hocmon.
Đa số các dấu hiệu chi điểm ung thư có bản chất là các giycopiotcin.
chẳng hạn AFP. CEA Vì vậy, người ta có thể sử dụng lectin. một hoạt ch;ì! pho
biên ờ thế ai ới đông vAt, thưc vAt và vi sinh vât có khá năng liên kêt đăc hiên với
các glycoprotein dể phát hiện các dấu hiệu chỉ điểm ting thư, bàng các phưoìm
pháp miễn dịch liên kết đặc hiệu.
14
2. ( ac ỉccíiìi dặc hiệu ỉiẽtì két vói các khátĩg thê và kháng nqnyén IIỈIÍ* lim:
Lectm theo Golstein ( l()80) (lịnh nghĩa là những protein hoăc glycopioiem
C(ó kha năng ngưng kêt các lè bào hổng cáu cùa động vệt và tương tác đặc hiệu
voi các loại đường cung như các hợp chất cộng hợp với đường (glycocoiiju<\ìles).
Leclin dà dược Stiilmaik phát hiện lừ năm 1888, nhưng chỉ được nghiên
cum mạnh mẽ từ những năm 50 cùa thê kỷ XX và ngày nay khá năng ung clung
simh liọc.y học. miễn dịch học của lectin ngày càng phát triển.
Các lectin đã đuợc phát lìiện ả liÀu nỊnr tâ( cả các cơ thê động vật. thực vât
vài VI sinh vật, thẠm chí có mặt ở các bào quan quan trọng của người nhu' màiiíT tê
bàto, m à n g n h â n và n h iề u c ơ q u a n n ộ i lạ n g q u n n trọn<í k h á c n h ư t im , ó c . p h ô i,
gam Tuy vây. chức năng sinh học cùa các leetiiì cho đến nay, mặc du dà hièl lò

kh;í nhiều, nhung cfing còn nhiều vân để đang tranh ỉuận. Mặc dù vậy. Cik' ứng
cỉụing cua ỉectin vẫn phái trièn và đang đua đến nhiều lợi ích (rong nghiên cứu
SÌ! ìh học y học, liong đó có nghiôn cứu ung thư học.
Các lectin được ứng dụng nhiều trong y học và sinh học tnrớc liên là lcclin
từ nguồn gốc các cây họ dậu {Fabacea<>\ liếp theo đó là các cây họ dâu lam
{i\íỉ<>i Ii('(’(fc’), họ tháu dâu hay ho ba mảnh vỏ {Eupììorhiaceae, Tricon eae). bới
VI khá năng luoìig tác đạc hiệu với các tô bào hổng cẩu thuộc các nhóm máu A.
B. o cùn người, kha năng phản ứng chc hiệu vói các kháng lliể và kháng nguyên
cổ bân cliất glycoprotein, khả năng kích thích phàn bào đặc hiệu và kìm hãm iiã\
dộc (lạc hiệu đối với bào quan riboxoni (RỈP)
2.1. nặc tính sinh học vâ rũvt dịch của Ịecíiỉt họ dậu:
Trong so các lectin từ họt cùa các cAy họ clẠu, Coĩicanavalin A la lcclm
(lược tóch và linh chế lừ cổy rtộu Cnnavalia ensiíonnis, thường gọi tắt là Con A
ciri choe nghiên cứu cấu tnìc hón học sAu sắc nhất và khá năng ứng dụng y học
cn.1 nó cho đốn pay vãn dang được khai thác mạnh mẽ nhai. Vì thế, các chè
phàm lcctin này dã dược tinh c ỉ^ở m ứ c độ sạch rất cao và dược thương mại hói)
hên thế giới, với piá trị cao. r:hnpg hnn lg chế phẩm Con A cùa hãng SKiMA.
có độ sạch dồng nhấí trong 'liọ-ì di ::r.'S-PAGE, dạng dông khô đã được bán voi
giá I90USD.
■ c.v.ìh đó, các Ịccíin ‘-Ỉ các cAy «b«.!Ộc chi Phaseolus, đặc biệt là lừ (lậu
ÍHận cỉò (rhtscohi.s vuì^ns) lỉ lườngÔIIỢC gọi là PHA (Phyto ỉỉacniaoo/unnnil iniỉiin 1,1
chai gây ngimg kết hổng cáu có nguồn gốc thực vật, đã được tinh chê lừ v;'n dìtir
năm nay và dược thương mại hóa (lẽn thè giới, dùng làm chât kích thích phnn
hào [miioocn) điên hình. Itiy vậy. chính trong hạt của cAy dậu Iiìiy. IÌI\ iheo
15
nmiổn gốc giông trổng (Cullivar), nghĩa là sự phản loại ở mức dưới loài, leclin
cùa chúng có Ihê thê’ hiện ứ 5 loại I/.olectin khác nhau, với tý lệ khác nhau giống nhu
kicti càu tnìc cua lzozym ỉaclatđehyđrogena/a (Rudiger el al, 1985). Một trong 5 loai
l/olecíiiì dó là PHA-E4 có khá năng liên kết chọn lọc, đặc hiệu với khánu
nguyên AFP của khối II trong bệnh ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Dua \ <1(1

lính chát liên kê! đặc hiệu cao này, Taketa và Cộng sự [32] dã nhiều năm imhièn
cứu vổ ái lực liên kêt miền đích đặc hiệu giữa nhiều dạng AFP cùa một sổ díiiiu
un SI thu' ờ người, như ung thư biểu mồ tế bào gan, ung thư noãn hoàng và AFP
vòn sán có cùa bào thai của sán phụ bình thường. Cùng với các tác già trên,
nlnéii nhà khoa học cũng đã chứng minh được tính khác biệt tinh vi trong cấu
trúc đường cùa nhiều loại phân tử AFP có nguồn gốc khác nhau có ánh hườn SI
đèn ái lực liên kết của chúng đôi với các loại lectin khác nhau [31] [32]. Nho
những phát minh ỏ' trên, Taketa và Cộng sự [32] đã đưa ra một khái niệm vé dâu
hiệu chi điểm ung thư AFP-lectin nghĩa là dấu hiệu AFP ái lực với lectin phán
biệt với AFP không có ái lực với lectin.
2.2. Đặc điểm cáu trúc của AFP và ái lực liên kết AFP-lectiìi.
Đến đây, chúng ta cán tìm hiếu đặc tính của AFP. AFP (Alphafoetoprolein) là mọt
glycoprotein, có khối lượng phân tủ'70kDa, chứa 4% cacbohydrat liên kèt với phán
protein qua một gốc Asparagin (Asn). Đáy là kiểu liên kết N-glycozil cun phân
tử AFP. Lán đắu tiên vào năm 1944, Pedersen K đã tìm thấy trong huyết Ihanh
bào thai bé' một loại glycoprotein đirợc gọi là protein thai Foetuin. Sau này vào
năm 1956, Bergstranđ C.G và Cộng sự [20] đã phát hiện ra một glycoprotein m<í'i
tương tự Foefnin nhung là Alpha l-globulin ở huyết thanh bào thai người, nhiriiu
không có trong huyết thanh người trưởng thành, ở các loài động vật có vú khác,
người ta cũng tìm thấy các phân tử Alpha Feto-protein trong huyết Ihanh hào ihni
tương tự nhu' người. Nhu' vậy AFP có thể coi là dạng protein huyết thanh hào lh;ii
phổ biến ở động vật có vú, không có mặt ỏ' huyết thanh cá thể trưởng thành. Tuy
nhiên, một phát hiện quan trọng của Abelev và Cộng sự I 16] là AFP có mội o'
huyết thanh chuột trưởng thành bị ung thu' gan trong thực nghiệm. Tiếp llico
Tatarinov YS và Cộng sự [33] đã tìm thấy AFP ở ung thu' biếu mô lê bào gan
(HCC). Từ dó nhiều nhà khoa học dã đi sâu nghiên cứu bán chất hóa học và sư
biểu hiện cùa dâu hiệu chi điểm ung thư AFP này ở bệnh ung thư biếu mỏ tè hào
gan (HCC) và ỏ' các bệnh lý khác của người.
Các kết quả nghiên cứu về AFP cho biết: AFP di chuyên nhanh ở vùng ơ
khi điện di trên giấy và tiên tâm thạch agar-agar, ngay bên canh phân tủ' Albumin

huyết thanh. Điếm dâng diện của AFP là 4,5 4- 5,2. Hệ sô tắt đặc tnrng cùa dung dịch
16
/\[;p 1% với chiêu dày lem ớ bước sóng 278mm là <'"'=5,3, thời gian hán huy lừ 3
ttèn 5 ngày (AlịXírl E. 1985 116]).
AFP trong huyèí thanh của phụ nữ có (hai tăng lên nhanh chóng vào Ihiinii
thứ 2 và thứ 3 (từ tuần thứ 12 - 14) và đạt cực đai trong các tháng tiếp theo. Đãc
biệt là ờ dây rốn cùa trẻ sơ sinh, hàm lượng AFP có thể đạt lới I0.(XX) -
l(.X).(XX)mg/lít và sẽ giám ngay lập (ức dưới I Oị.un/1 san khi sinh 10 tháng.
AFP cluợc tổng hợp ở nhu mô của gan HCC và ở gan bào thai khá tiiống
nhau về câu trúc hóa học. cũng như đặc tính phản ứng miễn dịch ([Alpcrl H.
19851[ 16]).
Nống độ AFP có thể thay đổi trong các trường hợp bệnh lí khác cùa gan.
như các bệnh viêm gan mạn tính, cấp tính do siêu vi trùng HBV, HCV Hàm
lượng AFP lớn hơn 20j.tm/l (nghĩa là 20ng/Kt/có thê được coi là dương tính đối
với các bệnh nhân viêm gan cấp tính, viêm gan mãn tính, xơ gan và chiếm ly lệ
tương ứng là 31%, 15% và I 1%. Hàm lượng AFP huyết thanh của bệnh viêm gan
mãn tính (Chronic hepatiíies) rất hiếm khi vượt quá 500ng/ml. Tuy nhiên, (rong
V vãn đã có 1 úc liêu trường hợp cá biệt đạt lới 1000-^3000ng/ml, thậm chí có khi
là 7.l90ng/ml (Taketa và Cộng sự [32J), nhưng vẫn không thấy xuất hiện ung thư
gan ờ bệnh nhân này. AFP huyết thanh của bệnh nhân viêm gan thường liinu lừ
từ hoặc có thế tăng nhanh đổng thời với một số enzym transnminnza, chẳnu han.
Cilutamal oxaloacetat Transaminaza và Glutamal pymval limisaminazn cún hiiNòi
(hanh (ký hiệu tương ứng là SGOT, SGPT). Sự xuất hiện AFP íăng dột ngộ! irdiiii
bệnh viêm gan cấp thường liên quan đến sự tổn thương các tế bào gan ciần đèn
húy hoại tè bào gan, được phán ánh rất rõ bằng sự tăng lên mạnh mẽ hoạt dộng
của các transaminaza. Nồng độ AFP huyết thanh cũng tăng mạnh trong các bênh
ung thư gan thứ phát và ung thư ngoài gan. Đối với ung thư dạ dày, ung thu' tuy
và ung thư gan thứ phát, tý lệ AFP dương tính tương ứng với các bệnh đã nêu là
18%, 23% và 8,6%. 0 bệnh ung thư túi noãn hoàng của người (human yolk sac
Tutnor). người ta cũng tìm thấy sư tăng lên nồng độ AFP huyết thanh. Tất c;i

những phân tích ỏ' trên đều cho thấy, không thê dựa vào sự tăng lên về nóim ctộ
AFP đê phân biệt các bệnh lí khác nhau ở người, đặc biệt là không thê phíìn biẹi
giữa bệnh ung thư biêu mô tế bào gan với các bệnh viêm gan và các bọnh mm
thu khác. Vì lẽ đó, căn cứ vào ái lực liên kết hóa học giữa các dạng AFP bệnh li
với các lectin khác nhau để phAn biệt các loại AFP bệnh lí khác nhau. Bán chai
của cơ chế liên kết ái lực AFP-lectin được quy định bằng sự khác nhau cua cáu
trúc đường tiên các kiểu phân từ AFP.
/• 1
17
V l Ị l W 3 ĩ
Từ nam 1980, yoshđn và Cộng sự đã đưa ra cấu trúc (lường cua AFT
cỉi;i
bệnh nhân n c c . Cấu trúc đường cùa AFP bệnh HCC đã đirực so sánli với câu
Irúc cĩirò'ii«i của AFP trong bênh 1111« thu' lúi noãn hoàng do YamashitaK và Cónu
sự lìm ra năm 1983 [31,32] có sự khác nhau?èhí m gôc đường Glc NAe/.Tmnũ
khi đó câu trúc đường của AFP của bệnh nhan viêm gan mãn tính do Takcla YÌt
Cộng sự lìm ra [32] hoàn toàn không chứa gốc Fucoza và Glc NAc, nhưng lại có
thêm 2 gốc Neu Ac.
Sau đáy là câu trúc đường của 3 loại AFP khác nhau:
( ìal(í I > 4(ilcN Ac(31 ->2Mana I ^ Fuca 1
Man|3 1 -> 4GlcNAcp 1 > 4Cỉlc NAc [ỉ 1 > Asn
Ciaipi ->4CilcNAcpl >2Manal -
Cấu trúc đường AFP bệnh HCC
Gaipi —> 4GlcNAc(Ị 1 ->2Manal
GlcNAcpl

ManỊ31->4GlcNAcỊ31->4Glc NAc (31 -> Asm
Ciaipi —> 4GlcNAc(3 1
Cấu trúc đường AFP bệnh ung Ihư noãn hoàng
NotiAca2—»6Cìaip 1 —>4GIcNAcP I —>2Mím ơ.l

->4CìlcNAỊÌl ->4GlcBAc(il \ mi
NcuAca2—>6Cìiil(ĩ 1 —>4GlcNAcị31 —>2Man ơ.l
Câu trúc đường của AM* bệnh gan măn tính
Dựa trên những nghiên cứu về cấu trúc phân tử AFP người ở những bệnh
lý khác nhau và dựa trên kết quả nghiên cứu ái lực của AFP với những leclin
khác nhau, các tác già (30,32) đà cho biết:
- Phân tử AFP ỏ' UTBMTBG (hình 1) ngoài cấu trúc chung, còn có mặt
cùa nhóm Pucose (Fucai —> 6) và nhóm này đóng vai trò quyết định ái lực của
AFP với lcctin, mà nó được thể hiện bằng dải AFP-L3.
18
Phân íử AFP ờ UTNH, llìi Cấu trúc phàn tử giống như phân lử AFI’ o'
UTBMTBG, nhưng có thêin N-Acetylglucosamina (CilcNAc) và nhóm nà\ có ái
lực (rung gian với AFP, mà I1Ó thè hiện bằng dái AFP-L2.
- Phím tứ AFI’ ở bệnh gan mạn tính thì không có mặt của nhóm Pucose và
nhóm N-Acetylglucosamine nhưng lại có thêm hai pliủn tử Nen Ac. Do váv. no
klìóng có ;íi lực với lectin và được thê hiện bằng dái AFP-LI.
Su' có mặt và sự thay đối các thành phân caibohydrate, mà cụ thó là su
(ha\ dổi các nhóm Fncose và N- Acetylglucosamine có trong chuỗi đườnu cu;i
API’ sẽ quyèí định lới ái lực của nó với leclin. 0 những tình trạng bệnh gan khác
nhau. sự chuyến biến từ bệnh gan lành tính (ví dụ: như viêm gan mạn) sang bệnh
gan ác tính (UTBMTBG) có liên quan chặt chẽ tới biến đổi cấu trúc phán tử AFP
và có ánh hưởng tới ái lực của AFP với lectin. Do vậy, đây là cơ sở đế chắn đoán
phân biệt giữa UTBMTBG với các bệnh gan mạn tính, thông qua cấu trúc phân
lư của AFP bằng các kỹ thuật điện di ái lực lectin và chuyển tham miễn dịch
kháng thể [32].
2.J. Danh pháp của AI' I* liên kết vói lecliii,
Do có nhiều lectin được ứng dụng trong điện di, vì vậy hệ llìónu đanh
pháp (cách trọi lên) của AFP liên kết với những lectin được viết dưới nhiêu tlạng
khác nhau, lùy thuộc vào cách đặt lên và cách gọi tên của từng tác giá [32,331.
Tuy nhiên. Taketa K. và Cộng sự [32] đã đưa ra hệ thống danh pháp hợp lý

và dấy dù nhất. Hệ thống danh pháp này có thể sử dụng cho tát cà các loại leclin.
và không phụ thuộc vào sô lượng của các dải AFP (heo lectin. Có thể tóm lãl như
sau: Các dài chính của ÀFP được đánh số liên tục theo số nguyên dương và số
dấu tiên của dài bao giò'cũng là sô I. Hậu tố tiếp nối với AFP là lectin được viết
bãns chữ sô in hoa và lấy chữ đầu tiên. Ví dụ: khi điện di AFP với concavalin A
(Con A), kết quả cuối cùng sẽ phân tách được 2 dải: AFP-CI và AFP-C2. tron”
đó: c là chữ đau cùa concavalin A.
Tuy nhiên, trong một sô trường hợp có một sô dái trung gian.Ví du: (J;ii
(rung gian giữa AFP-L2 và AFP-L3 thì được diễn tá bằng: AFP-L2-3. Sau dâ\ 1.1
các dài (band) của AFP ái lực với các loại lectin đã được phân loại theo hệ ihõnu
danh pháp Taketa K và Cộng sự [32].
19
CÁC DAI AM’ ẢI L ự c VỚI CÁC LOẠI LECTIN
Các (lái (banđ) của AM* với lectin Lectin (iìing tronỊí điện (li
APP-LI, AFP-L2, APP-L3
LCA
APP-CI. APP-C2
Con A
APP-PI, AFP-P2, AFP-P3, AFÍ5-P4, AFP-P5
E-PHA
AFÍ’-AI. AFP-A2, APP-A3
AI lo
AFP-KL AFP-R2, APP-R3
RCA-I
AFP-DI, AFP-D2, AFP-D3, AFP-D4, AFP-D5
DSA
AFP-AAL AFP-AA2, AFP-AA3, AFP-AA4
AAL
AFP-E1, AFP-E2, AFP-E3
ECL

2.4. Một sỏ dặc diêm leclin các loài mít được dùng cho y học - miễn dich
Trong hai thập kỷ 80 và 90 của thê ky này nhiều công trình khoa học
nghiên cứu vổ lectin các loài mít thuộc chi mít (Artocarpus) được thực hiện theo
l-iai hnóng cơ bàn: nghiên cứu cấu trúc phân tử và nghiên cứu đặc tính miền dịch
cùa lectin.
Từ năm 1988 sau khi phát hiện những giá trị lo lớn của iectin các loài mít
[rong việc ngăn chặn bệnh AIDS và nghiên cứu kháng thê trong huyết lh.mil
người, nhiều công trình nghiên cứu về lectin mít được công bỗ: Hagiw;n;i
(1988), Pineau và Cộng sự (1989), Aucouturie và Cộng sự (1990), Brugier và
Cộng sự (1990), Nicolas và Cộng sự (1993), Corbeau và Cộng sự (1994), Đỗ
Ngọc Liên, Johan Hoebeke, Briliard và Cộng sự (1993, 1995, 1996). Các công
tlình khoa học này đều tập trung nghiên cứu sáu cấu trúc bộc nhất và câu 1 rúc
không gian của phân tử lectin mít có nguồn gốc từ châu Phi và Nam Mỹ
(Bra/.in), và Việt Nam.
Theo thứ tự thời gian, những vân đề về cấu trúc phàn tử lectin các loài mít
chi Aitocarpus dã dần dần được sáng tỏ và được đông đáo các nhà khoa học llnìa
nhận.
Những nghiên cứu về đặc tính cấu trúc phân tử và miễn dịch học của lcclin
mít cùa Viộl Nam, có nguồn gốc Đông Nam châu Á (Jarette, 1959) chI mới bál
dắn từ những năm 1991-1992. Khi đó, Đỗ Ngọc Liên và các đồng tác già IILIIIÓI
Pháp [22,23,24,25] đã tiến hành tách tinh chế và so sánh câu trúc phân tử (lình lu'
sãp xốp đau N của các lectin từ 3 loài mít của Việt Nam là mít mật, mít to mì
Á t' (t I ụ ị' luỷilll í }
ị/\.ch(/in/>('<I('n) và (A.toììkinrsis) trồng lại iniền Bắc Việt Nam. Kết quá nghiên
cứu cho thấy giông như các tác già của Canada Young N.M và Cộng sự (l()()l )
phàn lích trôn lcctin của mít Bra/.in, lectin mít ciia Việt Nam cũng bao gốm 2
chuồi polypeptit là chuồi (X gồm 133 axit am in và chuỗi Ịì gồm 20-21 axil ;nnin.
Tuy nhiên (rình lự sãp xếp các axit amin trong chuỗi polypeptit của chuỗi u co
một sô sai khác từ 5 đến 7 gốc axit amin và ở chuỗi p có 3 đến 4 gốc axit am in
sai khác nhau. Trong năm 1994. Đỗ Ngọc Liên và Cộng sự [24,25] cũng đã tièp

tục phân tích trình tự đầu N của 2 chuỗi polypeptit a và p ở 2 loài mít dại cua
Việt Nam là A.masticatn, A.asperulus. Tiếp theo đó, chúng tôi tiếp tục nghiên
cứu một sô đặc tính hóa sinh miễn dịch, đặc biệt là khả năng tương tác dặc hiệu
cua các lectin này đối với các dòng kháng thê đơn dòng và đa dòng IgA. lgD.
Kôl quà cho thây các lectin của một sô loài mít của Việt Nam có kha nang liên
kết đặc hiệu chủ yếu với ỉgAI, một sô loại lectin liên kết với IgAI và IgD Iiliuim
không liên kết với IgA2, IgE, IgM. Rõ ràng là nhờ những nghiên cứu co ban sáu
săc, các ứng dụng y học và miễn dịch của lectin mít đã đạt được nhũng kêl qu;t
có ý nghTa khoa học và thực tiễn cao.
21
II. NíỉUYÊN LIÊU VẢ PHƯƠNG PHÁP N(ỈHIÍ;N c ứ u
l. N(;UYÊN LIỆU
1.1. llo dâu tăm (Moraeeae)
Chi mít (Arlocarpus) thuộc họ dâu tằm (Moraceae), có tlèn 50 loài. Theo
larrctt (1959) chi mít có nguồn gốc lừ An Độ và Đông Nam Á' sau c'() nh.inli
chóim có mật ỏ' Cháu Phi. Mít được nhập vào Brazin, Bổ Đào Nha vào giữa thô
k\ 17. Các loài mít đều có đặc điểm chung là loại cảy lâu năm, thân gồ, hoa mọc
thành cụm tlên cành quả phức nhiều múi, mỗi múi ứng với một hoa. Mít Ihuộc
lớp hai lá mám, hạt chứa nhiều chất dự trữ. Chúng tôi đã chọn các loài míl ỉhi
nghiệm gốm: mít mật (Artocarpns heterophyllns),thay (Artocarpus t(>nkui(’\i.\).
míl dại (.Artocarpus masticata) và mít tô nữ {Artocưrpus champeden). Các loai
mít này được thu hái tại Hà Nội và các tỉnh Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Tây Nguyên.
Mầu được định loại theo Lecompt mô lả (1910), Jaret.t (1959) và được Phạm
1 ỉoànu Hộ tổng kết [4j.
1.2. Họ đậu (Kabaceac)
Họ dậu (Fabaccae) là cây trồng thực phẩm rất quan trọng cua nước la.
Theo các tài liệu đã công bố họ đậu ở các tỉnh phía Bắc nước ta gồm có 58 chi
với 209 loài nhưng được trồng phổ biên có 49 chi với 105 loài, trong đó hao uôm
các loại đậu đỗ (Nguyễn Đãng Khỏi, 1989). Đặc biệt trong thử nghiệm, chúng
tôi đã lựa chọn hai loài đậu dại mọc trên rừng Yên Bái, Lao Cai, Ba Vì-Sơn T;ìv.

Đó ià đậu kiêm hoặc đâu gươm (Canavalia gladiata) và đậu rựa (Canavalia
ensiĩormis). Các mẫu đậu này đã được chuyên gia về cây đậu đồ cua Việi Nam
dịnh loại là tiên sT Nguyễn Đăng Khôi.
1.3. Huyết thanh ngưòỉ.
Huyết thanh người bình thường do Viện Huyết học và Truyền máu lniim
ương cung cáp, được đảm bảo qua khám tuyển.
Các bệnh nhân viêm gan siêu vi (rùng và bệnh nhân ung thư gan dược
khoa Sinh hóa và khoa Nội tiêu hóa bệnh viện quân y 108 khám và kết luận là
mắc bệnh cấp tính. Một số bệnh nhân mắc bệnh là đôi tượng thí nghiệm cũng (lo
khoa Ngoại tiêu hóa bệnh viện Việt Đức khám và kết luận là mắc bệnh. Htivci
thanh của các bệnh nhân viêm gan siêu vi trùng và bệnh nhân ung thư g;m tlo
bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và bệnh viên K cung cấp.
Độ tuổi những bệnh nhân là dôi tượng nghiên cứu trong độ tuổi lao dộng
tù' 15-60 đôi với nam, từ 15-55 đối với nữ.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.
2.1. Phương pliáp tách và tinh chê lectin từ các mẫu thí nghiệm.
* Phỉiong pháp tách lecíiti.
Lectin (ừcác mẫu thí nghiệm được chiết lút bẳng đệm PBS, pH7,4 vói (í lệ
1/10 (trọng lượng/thể tích) bằng khuấy từ từ trong 30 phút. Sau đó li tâm 15 phui.