Nghiên cứu ứng dụng sản xuất kháng nguyên Streptolysin O, sử dụng trong chẩn đoán thấp tim và viêm cầu thận cấp ở trẻ em doc

TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004
Nghiên cứu ứng dụng sản xuất kháng nguyên
streptolysin O, sử dụng trong chẩn đoán
thấp tim và viêm cầu thận cấp ở trẻ em
Nguyễn Thị Tuyến
1
, Nguyễn Văn Dịp
2
1
Bộ môn Vi sinh Y học, trờng Đại học Y Hà Nội
2
Vụ Khoa học và Đào tạo, Bộ Y tế

Nghiên cứu đã đa ra đợc các bớc cụ thể hoá về mặt kỹ thuật và tìm ra các điều kiện tối u trong quy
trình sản xuất kháng nguyên streptolysin O theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới. Đồng thời áp dụng sản
xuất thành công kháng nguyên streptolysin O dới dạng lỏng với hiệu giá ổn định là 1: 16. Ngoài ra nghiên cứu
cũng đã đa ra đợc điều kiện giữ chủng liên cầu nhóm A kinh tế nhất là môi trờng BHI huyết thanh ngựa
50% và nhiệt độ bảo quản là - 70C.

I. Đặt vấn đề
Hiện nay ở Việt Nam cũng nh trên thế giới,
phản ứng ASLO đợc sử dụng trong chẩn đoán ở
hầu hết các phòng xét nghiệm ở các bệnh viện
tuyến trung ơng và một số bệnh viện tuyến tỉnh.
Ngoài ra còn sử dụng trong chơng trình phòng
chống bệnh thấp tim. Vì vậy, nhu cầu sử dụng
kháng nguyên streptolysin O là rất lớn. Song cho
tới nay ở Việt Nam vẫn cha có cơ quan nào
nghiên cứu thành công sản xuất kháng nguyên
streptolysin O. Do đó các phòng xét nghiệm vẫn
phải mua kháng nguyên của nớc ngoài với giá

thành cao. Xuất phát từ tình hình thực tế trên,
nghiên cứu của chúng tôi tiến hành nhằm mục tiêu
sau:
+ Nghiên cứu các điều kiện giữ chủng chuẩn
liên cầu nhóm A: C203S.
+ Nghiên cứu cụ thể hoá về mặt kỹ thuật của
từng bớc trong quy trình sản xuất kháng nguyên
streptolysin O theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế
Thế giới (TCYTTG) năm 1983 và 1996.
II. Đối tợng, Vật liệu và phơng
pháp nghiên cứu:
1. Đối tợng nghiên cứu:
- Quy trình giữ chủng liên cầu nhóm A.
- Quy trình sản xuất kháng nguyên streptolysin O
2. Vật liệu
Môi trờng nuôi cấy vi khuẩn:
- Môi trờng thạch máu, BHI (Brain Heart
infusion) của hãng Sanofi diagnostics Pasteur.
- Môi trờng Kalbak broth tự sản xuất theo
công thức và quy trình của TCYTTG 1983, 1996.
Các sinh phẩm và hoá chất chính
- Kháng thể kháng streptolysin O của Mỹ.
- Hoá chất pha đệm PBS.
- Methiolate, hồng cầu thỏ, huyết thanh ngựa
Chủng chuẩn quốc tế để sản xuất kháng
nguyên streptolysin O C203S do Trung tâm Kiểm
định liên cầu Quốc gia Thái Lan cung cấp.
3. Phơng pháp nghiên cứu:
3.1. Phơng pháp giữ chủng mẫu liên cầu
nhóm A C203S:

- Phơng pháp chúng tôi thử nghiệm trên môi
trờng BHI huyết thanh ngựa so sánh với các
phơng pháp hiện đang lu giữ nh:
+ Giữ trên môi trờng thạch máu, giữ trên môi
trờng BHI glycerol 20%, giữ dới dạng đông khô.
3.2. Phơng pháp tách chiết kháng nguyên
streptolysin O:
94
TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004
Theo thờng quy của TCYTTG 1983, 1996,
nhng đã đợc đề tài nghiên cứu cụ thể hoá từng
bớc trong quy trình và áp dụng sản xuất.
3.3. Phơng pháp chuẩn độ kháng nguyên
streptolysin O:
Theo thờng quy của TCYTTG 1996.
iii. Kết quả
1. Kết quả nghiên cứu các điều kiện giữ
chủng liên cầu nhóm A C203S.
Bảng 1. Kết quả nghiên cứu giữ chủng liên cầu nhóm A C203S ở các môi trờng
và các điều kiện bảo quản khác nhau
Môi trờng bảo quản Nhiệt độ bảo quản Thời gian vi khuẩn sống
Thạch máu
4C
48 giờ
BHI và glycerol
- 20C
1 - 2 tuần
BHI và glycerol
- 70C
2 tuần - 1 tháng

BHI và huyết thanh ngựa
- 20C
1 - 2 năm
BHI và huyết thanh ngựa
- 70C > 4 năm vẫn đang sống
Đông khô
4C > 4 năm vẫn đang sống

* Nhận xét:
- Trong số các môi trờng giữ chủng liên cầu
nhóm A C203S, môi trờng BHI và huyết thanh
ngựa là môi trờng tốt nhất.
- Điều kiện bảo quản các môi trờng này tốt
nhất là ở - 70C.
- Đã giữ đợc chủng liên cầu nhóm A C203S
trong môi trờng BHI và huyết thanh ngựa ở -
70C từ tháng 4 năm 2000 đến tháng 6 năm 2004
vi khuẩn vẫn còn sống và không có sự thay đổi về
đặc điểm sinh vật học.
- Vi khuẩn giữ theo phơng pháp đông khô trên
4 năm vi khuẩn vẫn sống và không có sự thay đổi
về đặc điểm sinh vật học.
2. Kết quả sản xuất kháng nguyên
streptolysin O.
* Bớc 1: Theo quy trình khuyến cáo của
TCYTTG: cấy chuyển chủng mẫu sang môi trờng
thạch máu:
Bảng 2. Mối liên quan giữa số lần cấy chuyển chủng trên môi trờng thạch máu
với hiệu giá kháng nguyên SO
Lần cấy chuyển Môi trờng Nhiệt độ Thời gian CO2 Hiệu giá KN

(chuẩn độ sơ bộ)
Lần 1 TM
37C
18 - 24 giờ không 1: 4
Lần 2 TM
37C
18 - 24 giờ không 1: 16
Lân1 TM
37C
18 - 24 giờ 5% 1: 4 - 1: 8
Lần 2 TM
37C
18 - 24 giờ 5% 1: 16 - 1: 32

* Bớc 2: Theo khuyến cáo của TCYTTG: cấy chuyển chủng từ môi trờng thạch máu sang môi
trờng tách chiết kháng nguyên streptolysin O.
Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi thu đợc mối liên quan giữa hiệu giá kháng nguyên streptolysin O
với các hình thức cấy chuyển nh sau:
95
TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004
Bảng 3. Mối liên quan giữa hiệu giá kháng nguyên SO với các hình thức cấy chuyển khác nhau:
Hình thức cấy chuyển Hiệu giá kháng nguyên SO
TM MT ặ trung gian MT ặ cần tách chiết KN SO
1: 16 - 1: 32
TM MT ặ cần tách chiết KN SO
1: 8

* Nhận xét:
- Để tách chiết đợc một lợng lớn kháng
nguyên SO, chúng ta cần cấy chuyển vi khuẩn từ

môi trờng thạch máu qua một lợng nhỏ môi
trờng (1/10 tổng môi trờng tách chiết kháng
nguyên) để tăng sinh vi khuẩn, sau 6 - 8 giờ mới
cấy chuyển vào môi trờng cần tách chiết kháng
nguyên, sẽ thu đợc lợng kháng nguyên SO cao.
* Bớc 3: Ly tâm lạnh để tách kháng nguyên
streptolysin O:
- Bớc này ly tâm nhằm mục đích để vi khuẩn
lắng xuống đáy ống, còn kháng nguyên
streptolysin O nằm trong phần nớc nổi phía trên.
Vì vậy vấn đề đặt ra là: ly tâm với số vòng là bao
nhiêu? và trong thời gian bao nhiêu? để kháng
nguyên streptolysin O không bị lắng xuống đáy
ống cùng vi khuẩn? trong quy trình khuyến cáo
của TCYTTG không nêu cụ thể, vì vậy chúng tôi
đã phải thử nghiệm để tìm ra các điều kiện tối u
sau:
- Nếu ly tâm cỡ lớn (mỗi ống ly tâm có thể
chứa đợc số lợng 100 - 200ml môi trờng), nh
vậy một lần ly tâm chúng ta có thể ly tâm đợc
khoảng 1 1ít môi trờng, thì số vòng là 2000
vòng/1 phút, trong thời gian là 30 phút.
- Nhng nếu ly tâm loại nhỏ (mỗi ống ly tâm
chỉ chứa đợc 15 - 20 ml môi trờng, thì số vòng
2000 vòng/ 1 phút, trong vòng 10 - 15 phút.
* Bớc 4: Theo đúng nh quy trình khuyến cáo
của TCYTTG:
- Phần nớc nổi chắt đợc (kháng nguyên
streptolysin O) sau ly tâm đợc bổ sung thêm
methiolate với tỷ lệ 1% (methiolate1/10000) hoặc

sodium azid với nồng độ 0,02%.
* Bớc 5: Theo quy trình khuyến cáo của
TCYTTG là lọc vô trùng bằng lọc seitz.
+ Trớc tiên lọc qua giấy lọc có kích thớc
0,45àm, lọc đợc một l
ợng dịch khoảng 100ml
thì phải thay giấy lọc 1 lần (để dịch lọc chảy nhanh
không kéo dài quá trình lọc).
+ Dịch lọc đợc lọc lại lần 2 qua giấy lọc có
kích thớc 0,22 àm.
* Bớc 6: Đóng gói và bảo quản loại bỏ kháng
nguyên streptolysin S (theo quy trình của TCYTTG
bảo quản dịch lọc ở 4C trong vòng 1 tháng để loại
bỏ kháng nguyên streptolysin S).
Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới:
kháng nguyên sau khi sản xuất có thể bảo quản ở
4C sử dụng đợc trong vòng nhiều năm. Qua
nghiên cứu thử nghiệm ở một số điều kiện nhiệt độ
bảo quản khác nh: 4C, - 20C, ngăn đá tủ lạnh,
kết quả theo dõi trong vòng 2 năm nh sau:
Bảng 5. Mối liên quan giữa hiệu giá kháng nguyên SO với nhiệt độ bảo quản khác nhau
Nhiệt độ
bảo quản
Hiệu giá
KNSO
sau sản xuất
Hiệu giá
KNSO sau
6 tháng
Hiệu giá

KNSO sau
12 tháng
Hiệu giá
KNSO sau
18 tháng
Hiệu giá
KNSO sau
24 tháng
4C
1: 32 1: 32 1: 32 1: 16 1: 16
Ngăn đá 1: 32 1: 32 1: 32 1: 16 1: 16
- 20C
1: 32 1: 32 1: 32 1: 32 1: 32

96
TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004
* Nhận xét:
- Mặc dù theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế
giới: kháng nguyên SO sau khi sản xuất có thể bảo
quản ở 4C trong nhiều năm, nhng theo kết quả
chúng tôi thử nghiệm, thì nhiệt độ tối u nhất để
bảo quản kháng nguyên SO là - 20C (trong vòng
2 năm hiệu giá không thay đổi).
- Kết quả bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh và ở 4C
(ngăn lạnh của tủ lạnh), trong vòng 1 năm hiệu giá
kháng nguyên ổn định không thay đổi, nhng sau
1 năm bị giảm hiệu giá.
Nh vậy qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi đã
cụ thể hoá và tìm ra đợc các điều kiện tối u
trong từng bớc của quy trình sản xuất kháng

nguyên mà TCYTTG đã khuyến cáo năm 1983 và
năm1996.
3. Nghiên cứu hiệu quả sản xuất kháng
nguyên streptolysin O trên các môi trờng khác
nhau.

Bảng 6. Hiệu quả sản xuất kháng nguyên streptolysin O trên các môi trờng khác nhau:
Môi trờng Hiệu giá KNSO Giá 1 1ít môi trờng (đồng)
Todd - Hewith 1: 16 - 1: 32 315.000
BHI 1: 16 - 1: 32 45.000
Kalbak (tự điều chế) 1: 16 - 1: 32 25.000

* Nhận xét:
- Kết quả tách chiết kháng nguyên streptolysin
O trên 3 loại môi trờng tơng tự nhau.
- Giá thành của môi trờng kalbak là rẻ nhất vì
điều chế từ nguyên liệu thô sẵn có trong nớc (tim
bò), nhng mất thời gian điều chế hơn.
iv. Bàn luận
1. Bàn luận về các điều kiện giữ chủng liên
cầu nhóm A
Mục đích đầu tiên của giữ các chủng vi khuẩn
là làm sao cho chúng sống đợc lâu dài, không bị
nhiễm bẩn và không thay đổi các đặc tính di
truyền.
* Cấy chuyển và phơng pháp giữ chủng liên
cầu nhóm A C203S trong môi trờng BHI glyxerol
20%:
- Cả 2 phơng pháp này không phù hợp trong
việc lu giữ chủng liên cầu nhóm A C203S để

phục vụ quá trình sản xuất kháng nguyên
streptolysin O vì:
- Phơng pháp cấy chuyển có khả năng bội
nhiễm cao.
- Dễ xuất hiện chọn lọc các biến thể.
* Phơng pháp giữ chủng liên cầu nhóm A
C203S trong môi trờng BHI huyết thanh ngựa
50%:
Trong phơng pháp này chúng tôi đã thay thế
glyxerol bằng huyết thanh ngựa là chất chống tinh
thể hoá và kết quả thu đợc đã loại trừ đợc những
nhợc điểm của các phơng pháp trên và kinh tế
hơn (Kết quả bảng 3.1).
* Phơng pháp giữ chủng bằng đông khô:
Là phơng pháp bảo quản dài hạn và cũng là
một trong những phơng pháp bảo quản vi khuẩn
hiệu quả hiện nay. Tuy nhiên kỹ thuật đông khô
khá phức tạp. Ngoài ra không phải cơ sở nào cũng
có máy đông khô để phục vụ quá trình giữ chủng
phục vụ sản xuất kháng nguyên.
* Bàn luận về nhiệt độ bảo quản chủng:
Nhiệt độ bảo quản chủng từ - 12 đến - 20C
trong các ngăn đá tủ lạnh hiệu quả thờng thay đổi
vì quá trình xả đá tự động làm nhiệt độ của các
khoang này không ổn định và điều đó làm tổn hại
tới tế bào vi khuẩn. Vì vậy giữ vi khuẩn ở lạnh sâu
- 70 C trong quầy lạnh chuyên dụng sẽ tốt hơn
ngăn đá tủ lạnh rất nhiều. Quá trình lạnh sâu liên
quan đến việc đông băng hỗn dịch vi khuẩn có
chứa các chất chống tinh thể hoá nh: glyxerol,

97
TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004
huyết thanh ngựa để ngăn ngừa tổn hại tế bảo trong
quá trình đông lạnh.
2. Bàn luận về kỹ thuật tách chiết kháng
nguyên streptolysin O:
Quá trình tách chiết kháng nguyên streptolysin
O phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhng có hai yếu tố
quyết định đó là: sự phát triển tốt của chủng vi
khuẩn liên cầu nhóm A mẫu và chống đợc quá
trình oxy hoá kháng nguyên streptolysin O trong
quá trình tách chiết.
2.1. Cấy chuyển chủng mẫu liên cầu nhóm A
C203S để tách chiết kháng nguyên streptolysin O.
Khi chủng liên cầu nhóm A C203S đợc lu giữ
ở lạnh sâu, vi chất lỏng trong và ngoài tế bào vi
khuẩn bắt đầu đông và hình thành dần các tinh thể,
các enzym trong tế bào ngừng hoạt động và tế bào
chuyển sang dạng tiềm sinh. Quá trình bảo quản
chủng dới dạng đông khô cũng tơng tự nh vậy
nhng sau quá trình đông băng là làm mất nớc
trong huyền dịch vi khuẩn bằng cách cho chúng
bay hơi dới áp lực âm. Vì vậy, khi chủng đợc
chuyển từ điều kiện bảo quản sang môi trờng
dinh dỡng, chúng ta nên cấy chuyển 2 lần để vi
khuẩn thích nghi trở lại trạng thái phát triển bình
thờng rồi mới chuyển vào môi trờng tối u để
tách chiết kháng nguyên
Để tách chiết đợc lợng kháng nguyên
streptolysin O cao, cần phải có một lợng lớn vi

khuẩn ở cùng một thời gian và đang ở giai đoạn
phát triển mạnh, nếu không lợng kháng nguyên
streptolysin O đợc sản xuất ra từ một lợng nhỏ
vi khuẩn sẽ bị oxy hoá ngay mà không còn để
chúng ta tách chiết nữa.
2.2. Tách chiết kháng nguyên streptolysin O:
Đặc điểm của kháng nguyên streptolysin O là
rất dễ bị các thành phần lipid, cholesterol, pH acid
vv làm biến đổi tính kháng nguyên. Vì vậy quá
trình tách chiết kháng nguyên streptolysin O bắt
buộc phải loại vi khuẩn liên cầu nhóm A C203S ra
khỏi dung dịch tách chiết. Để thực hiện đợc mục
đích này trong quá trình tách chiết kháng nguyên
streptolysin O chúng tôi đã sử dụng cùng một lúc 3
phơng pháp để loại vi khuẩn ra khỏi dung dịch
tách chiết:
- Phơng pháp ly tâm: mục đích của ly tâm là
để vi khuẩn lắng xuống đáy ống còn phân tử kháng
nguyên streptolysin O nằm trong phần n
ớc nổi
phía trên. Vì vậy số vòng ly tâm chỉ cần đủ để vi
khuẩn lắng xuống đáy ống là đạt yêu cầu (thông
thờng chỉ cần 2000 vòng/1 phút), thời gian ly tâm
tuỳ thuộc vào ống ly tâm lớn hay bé.
- Phơng pháp sử dụng methiolate: Mục đích để
diệt các vi khuẩn còn sót lại sau khi ly tâm: phần
nớc nổi đợc chắt sau khi ly tâm đợc bổ sung
thêm 1% methiolate của (1/10000) và lọc vô trùng.
- Phơng pháp lọc vô trùng: là phơng pháp
cuối cùng sử dụng để loại vi khuẩn ra khỏi hỗn

dịch kháng nguyên streptolysin O. Trong nghiên
cứu chúng tôi sử dụng 2 loại giấy lọc: kích thớc
0,45àm và 0,22 àm là phù hợp cho việc tách chiết
kháng nguyên streptolysin O. Vì nếu chúng ta sử
dụng giấy lọc có kích thớc lớn hơn 0,22àm thì sẽ
không loại bỏ hết đợc vi khuẩn liên cầu nhóm A
C203S, nhng nếu sử dụng giấy lọc có kích thớc
nhỏ hơn 0,22àm thì phân tử kháng nguyên
streptolysin O cũng bị giữ lại trên lỗ lọc và nh
vậy quá trình tách chiết kháng nguyên không thực
hiện đợc.
3. Bàn luận về hiệu giá kháng nguyên
streptolysin O tự sản xuất:
Theo quy trình và khuyến cáo của Tổ chức Y tế
thế giới: hiệu giá kháng nguyên chuẩn độ sơ bộ ngay
sau khi sản xuất (cha bất hoạt treptolysin S) ít nhất
đạt 1: 8 là đạt yêu cầu [4]. Trong sản xuất thử nghiệm
của chúng tôi các lô sản xuất đều đạt hiệu giá cao
hơn trong khoảng: 1: 16 - 1: 32. Sau khi đã bất hoạt
streptolysin S, hiệu giá kháng nguyên streptolysin O
hầu hết ở các lô sản xuất đều đạt hiệu giá từ 1: 16 trở
lên. Kết quả này đã đợc Trung tâm Kiểm định
Vacxin và Chế phẩm sinh học Quốc gia kiểm tra 3 lô
liên tiếp và ghi nhận kết quả.
V. Kết luận
1. Điều kiện giữ chủng liên cầu nhóm A tốt
nhất và kinh tế là trong môi trờng BHI huyết
thanh ngựa 50% và nhiệt độ bảo quản là - 70C.
2. Đã nghiên cứu cụ thể hoá từng bớc chi tiết
và tìm ra các điều kiện tối u trong quy trình sản

xuất kháng nguyên streptolysin O theo khuyến cáo
98
TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004
của Tổ chức Y tế Thế giới nh: số lần cấy chuyển
chủng chuẩn trên môi trờng thạch máu, hình thức
cấy chuyển chủng vào môi trờng tách chiét, số
vòng ly tâm, kích thớc giấy lọc phù hợp nhất là
trên môi trờng Kalbak, nhiệt độ bảo quản kháng
nguyên tối u là - 20C, để giúp các cơ sở sản
xuất có thể áp dụng quy trình để sản xuất hàng
loạt.
3. áp dụng quy trình sau khi đã đợc cụ thể
hoá với các điều kiện tối u sản xuất thành công
kháng nguyên streptolysin O dới dạng lỏng với
hiệu giá ổn định là 1: 16.
Tài liệu tham khảo
1. Kaplan EL. (1992). The anti streptolysin O
test in clinical medicin. Background and guidelines
for the clinical laboratory. Printed by SANOFI
Diagnostics Pasteur, Inc chaska, Minesota. Vas,
Janury. 1992, p1 - 4.
2. Vandepite J, Engback, et al (1991). Upper
respiratory track infection. Basis laboratory
procedures in clinical bacteriology. WHO Geneva
1991, p44 - 51.
3. WHO (1983). Menual of microbiological
diagnostic methods for streptococcal infection and
their sequelae. 1983, p1 - 69.
4. WHO (1996). Laboratory diagnosis of group
A streptococcal infection. 1996, p1 - 106.

5. WHO, UNESO, ISFC (1992). Streptococcal
sore throat rheumatic fever. Rheumatic heart
diseases. 1992, p1 - 16.

Summary
Apply procedure for producting antigen streptolyssin O using
in diagnosis of rheumatic fever and acute glomerulonephritic
in children
The authours specified steps of procedures of producsion antigen streptolysin O and optimized technical
conditions during the prossesss of applying methods proposed by WHO. The antigen streptolysin O was
produced in sold fomation stably with the titer 1: 16. The results also pointed out the conditions for storing
group A streptococci with low - cost by using media BHI composed 50% hose serum at - 70

C.
99