Tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
VIỆN SINH HỌC NÔNG NGHIỆP




BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH VIRUS
BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN










9251

HÀ NỘI, THÁNG 03 NĂM 2012


1

MỞ ĐẦU

Khoai tây là cây trồng lý tưởng cho vụ Đông ở Đồng bằng Sông Hồng, tuy
nhiên diện tích khoai tây của Việt Nam không vượt quá 50.000 ha. Có nhiều
nguyên nhân hạn chế sự phát triển khoai tây của Việt Nam nhưng nguyên nhân

chính là do công tác giống khoai tây. Công tác giống khoai tây có vai trò quyết
định sự phát triển ngành sản xuất khoai tây của Việt Nam. Có 2 vấn đề bức xúc
của công tác giống khoai tây là:
(1) Chưa xây dựng được hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh tại chỗ
nh
ằm cung cấp chủ động củ giống sạch bệnh cho sản xuất với giá thành được
sản xuất chấp nhận. Các giống khoai tây sử dụng trong sản xuất chủ yếu vẫn
phải nhập nội.
(2) Còn có rất nhiều khó khăn và hạn chế trong công tác chọn tạo giống
khoai tây phù hợp với điều kiện sinh thái Việt Nam có năng suất cao, phẩm chất
tốt (ăn tươi ho
ặc chế biến) và đặc biệt có đặc tính kháng bệnh nhất là bệnh virus
gây thoái hóa giống khoai tây và bệnh mốc sương vào cuối vụ đông gây thiệt hại
về năng suất nghiêm trọng.
Công tác xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh đã được
nhiều cơ quan quan tâm nghiên cứu và đã đạt được những kết quả đáng khích lệ.
Hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu nay
ở Việt Nam chủ yếu vẫn là
công tác nhập nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù hợp cho
sản xuất. Các nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây chủ yếu vẫn sử dụng các
phương pháp chọn tạo giống truyền thống. Ở Việt Nam, việc tạo giống thông
qua lai tạo gặp rất nhiều khó khăn và hầu như chưa được tiế
n hành; chưa sử
dụng các phương pháp CNSH hiện đại; chưa có bộ vật liệu phong phú mang các
tính trạng quý. Cùng với những tiến bộ và thành tựu đạt được của thế giới trong
nghiên cứu cải tạo giống cây trồng bằng dung hợp tế bào trần, Việt Nam đang

2
dần kế thừa và bắt đầu nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo giống khoai
tây kháng virus và bệnh cũng như một số dịch hại nguy hiểm khác.

Xuất phát từ tình hình trên, chương trình CNSH trọng điểm của Bộ
NN&PTNT đã cho phép chúng tôi tiến hành đề tài: ”Tạo giống khoai tây kháng
bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần” .
Mục tiêu của đề tài:
1. Tạo được dòng khoai tây kháng bệnh virus hại khoai tây. Ít nh
ất tạo được 2
dòng khoai tây kháng virus X (PVX) và virus Y (PVY)
2. Đưa ra được quy trình công nghệ tạo giống khoai tây kháng bệnh virus thông
qua kỹ thuật dung hợp tế bào trần (protoplast): Quy trình tách, dung hợp, nuôi
cấy, chọn lọc tái sinh tế bào trần trong chọn tạo giống khoai tây
Ý nghĩa khoa học của đề tài
+ Sản phẩm khoa học công nghệ của đề tài là quy trình công nghệ tạo
giống khoai tây kháng bệnh virus là sản phẩm có tính độc đáo và đạt trình độ
KHCN quốc tế, có giá trị chuy
ển giao trong và ngoài nước.
+ Chất lượng khoa học của các sản phẩm nghiên cứu đều đạt yêu cầu cao,
có tính mới. Các dòng khoai tây mới tạo ra đều có tính độc đáo và có triển vọng
phát triển thành giống phục vụ sản xuất đại trà.
Ý nghĩa thực tiến của đề tài
+ Kết quả quan trọng của đề tài là tạo ra các dòng khoai tây lai soma có
khả năng kháng bệnh virus X và Y là các virus nguy hại nhất ở khoai tây. Kết
quả này cũng m
ở ra một triển vọng sáng sủa cho việc ứng dụng kỹ thuật dung
hợp tế bào trần trong công tác chọn tạo giống cây trồng khác ở Việt Nam.
+ Đề tài cũng góp phần xây dựng một đội ngũ, một trường phái nghiên
cứu mới về công nghệ tế bào thực vật của Việt Nam: trường phái ứng và phát
triển kỹ thuật tế bào trần trong tạo giống cây trồng

3
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây khoai tây
Khoai tây là một cây trồng lấy củ, nó có giá trị kinh tế rất cao trong nền kinh
tế quốc dân của nhiều nước trên thế giới từ những nước phát triển đến nước đang
phát triển như Việt Nam. Đặc biệt khoai tây còn có giá trị dinh dưỡng lớn đã góp
phần quan trọng trong việc giải quyết an toàn an ninh lương thực của nhiều nước.
Cây khoai tây thu
ộc họ cà, thân thảo, lớp hai lá mầm.
Các yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây:
* Nhiệt độ:
Nhiệt độ trong vụ trồng khoai tây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự
phát triển của cây và năng suất củ. Nhiệt độ trong vụ trồng bình quân là 16
o
C –
18
o
C là thích hợp và cho năng suất cao nhất. Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau
sẽ yêu cầu điều kiện nhiệt độ khác nhau.
* Ánh sáng:
Độ dài ngày ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của cây
khoai tây. Khoai tây là cây ưa ánh sáng ngày dài. Cường độ ánh sáng thích hợp
từ 40000 - 60000 Lux sẽ cho năng suất cao.
* Độ ẩm:
Khoai tây là cây có bộ rễ ăn nông, tiềm năng năng suất cao nên để cây
khoai tây sinh trưởng, phát triển tốt cần phả
i cung cấp nước thường xuyên. Thời
kỳ trồng đến xuất hiện tia củ đảm bảo độ ẩm tối thiểu 60-80%. Thời kỳ phát
triển củ cần thường xuyên giữ ẩm độ ẩm đất là 80%.

* Đất trồng và pH đất:
Đất trồng khoai tây thích hợp nhất là đất phù sa nhẹ, đất cát pha, đất nhẹ
tơi xốp có lượng mùn cao, lớp đất canh tác dày, giữ ẩm tốt, tưới tiêu t
ốt.
Khoai tây có thể phát triển trên đất có pH từ 4,8 - 7,1, pH lý tưởng đối với
cây khoai tây là 5,2 - 6,4. Nếu pH trên 7 thì cây khoai tây dễ bị nhiễm bệnh ghẻ

4
củ. Đất có hàm lượng Chloride cao sẽ làm giảm hàm lượng chất khô của củ
(Trương Văn Hộ, 1990)[8]
* Sâu bệnh:
+ Các loại bệnh virus hại khoai tây:
Có nhiều bệnh virus hại khoai tây, đến nay các nhà khoa học đã xác định
được các loài chủ yếu như sau:
Virus Y (Potato Virus Y) gây xoăn lá, khảm lá, giảm năng suất từ 50% - 90%.
Virus X (Potato Virus X) gây khảm lá nhưng không biến dạng, giảm năng
suất 10-25%.
Virus A (Potato Virus A) gây khảm lá làm giảm năng suất tới 50%.
Virus M (Potato Virus M) gây cuố
n lá nhẹ ở ngọn, khảm gân lá, giảm
năng suất 60-70%.
Virus S (Potato Virus S) triệu chứng ẩn, có thể làm giảm diện tích, gây đổ
cây, giảm năng suất 10-15%.
+ Bệnh mốc sương hại khoai tây:
Bệnh do nấm Phytophthora infestans DB gây ra và rất phổ biến ở các
vùng trồng khoai tây. Ban đầu bệnh xuất hiện trên lá, trên cành khoai tây các vết
nhỏ màu nâu. Khi vết bệnh loang ra trên nhiều lá, lá cây héo, rũ xuống, có màu
đen, khô dòn. Khi thời tiết ẩm, có sương buổi sáng, ở
dưới chung quanh vết
bệnh xuất hiện các đám nấm màu trắng.

- Bệnh đốm vàng:
Bệnh do nấm Macrosporium Solani Ell-et Mart gây nên. Bệnh rất phổ
biến ở các vùng trồng khoai tây. Bệnh tạo thành các vết bệnh lớn hình tròn hoặc
có cạnh, màu nâu đậm. Trên bề mặt vết bệnh có các vòng đồng tâm rất rõ và các
đám bào tử nấm màu đen nhạt.
* Sâu xám, sâu xanh:
Sâu ăn lá, phá hoại chủ yếu ở giai đoạn cây con.
1.2. Tình hình sả
n xuất, sản lượng khoai tây trong và ngoài nước

5
1.3.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai tây trong nước
Vấn đề khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó là
giống. Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ đáp ứng từ 20-25% nhu cầu,
số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan…
Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết do nông dân tự duy
trì từ vụ này sang vụ khác hoặc giống do người dân tự mua không rõ nguồ
n gốc,
do vậy mà giống không những bị thoái hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm virus cao từ
54–65% cộng với hao hụt trong bảo quản từ 45–60%. Khoai tây trồng chủ yếu
bằng con đường nhân giống vô tính nên tỷ lệ tái nhiễm virus cao. Hơn nữa trong
điều kiện sản xuất ở Việt Nam, củ giống bảo quản trong thời gian dài khoảng 9
tháng (từ tháng 2– tháng 10), điều kiện nóng ẩm của mùa hè củ giống bị già sinh
lý nhanh chóng, khi trồng khả năng sinh trưởng kém, hậu quả là năng suất và chất
lượng củ thấp.
Mặt khác việc sản xuất và cung ứng giống khoai tây ở Việt Nam còn nhỏ lẻ,
chưa mang tính hệ thống. Trước tình hình đó cần xây dưng các chương trình nhân
tạo giống khoai tây sạch bệnh, có chất lượng và phẩm chất tốt phục vụ bà con
nông dân.
Từ năm 2003 đến 2004 diện tích trồng khoai tây ở n

ước ta là 47340 ha
với năng suất đạt 148 tạ/ ha. Vùng Trung du miền núi phía Bắc có 9266 ha đạt
năng suất 109 tạ/ ha. Vùng Duyên hải Bắc Trung Bộ có 1686 ha với năng suất
đạt 200 tạ/ ha. Vùng Đồng bằng sông Hồng có 38267 ha đạt năng suất 164 tạ/
ha. Vùng Tây Nguyên có 1126 ha với năng suất đạt 178 tạ/ ha.
Trong giai đoạn hiện nay, cây khoai tây rất được chú trọng trong công tác
nhập nội, chọn lọc và lai tạo dòng đặc biệt là việc sử dụ
ng kỹ thuật nuôi cấy mô
tế bào và dung hợp tế bào trần. Vì vậy, trong những năm gần đây diện tích trồng
khoai tây được mở rộng nhanh chóng và khoai tây trở thành cây trồng chính
trong vụ đông, là cây quan trọng ở nước ta.
1.3.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai tây trên thế giới

6
Bảng 1.1: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế
giới năm 2007 (FAOSTAT)
Chỉ tiêu
Quốc gia
Diện tích thu
hoạch (ha)
Năng suất
(tấn)
Sản lượng
(tấn/ha)
Châu Phi 1 541 498 16 706 573 10,8
Châu Á /Châu Đại Dương 8 732 961 137 343 664 15,7
Châu Âu 7 473 628 130 223 960 17,4
Mỹ Latinh 963 A16 15 682 943 16,3
Bắc Mỹ 615 878 25 345 305 41,2
Thế Giới 19 327731 325 302 445 16,8

Do đó, khoai tây chính là cây trồng giàu tiềm năng phát triển trong tương lai,
với diện tích trồng ngày càng được mở rộng và năng suất, chất lượng khoai tây
ngày càng tăng, nhất là ở các nước đang phát triển cộng với những nước nghèo.

Bảng 1.2. Sản lượng khoai tây trên thế giới giai đoạn 1991 – 2007
(triệu tấn) (FAOSTAT)
Năm

Quốc gia
1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007
Phát triển 183.13 199.31 177.47 174.63 165.93 166.93 160.97 159.97 159.89
Đang phát
triển
84.86 101.95 108.50 128.72 135.15 145.92 152.11 160.01 165.41
Thế giới 267.99 301.26 285.97 303.35 301.08 312.85 313.08 319.98 325.30
Ở các nước đang phát triển có diện tích trồng lớn nhưng năng suất kém
một phần là do nguồn giống không đảm bảo chất lượng, củ giống không rõ
nguồn gốc, dễ bị nhiễm bệnh nhất là bệnh virus sau vài năm trồng, dẫn đến sự
thoái hóa củ giống nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng củ. Do
vậy, các nhà nghiên cứu đang xây dựng chiế
n lược sản xuất củ giống sạch bệnh
và có phẩm chất tốt phục vụ sản xuất khoai tây thương mại.

7
1.3. Tình hình nhiễm bệnh virus PVY (potato Y-potyvirus) ở khoai tây
Các loại virus hại khoai tây bao gồm: PLRV, PVY, PVA, PVV, PVX, PVM
và PVS trong đó PVY là loại gây hại lớn nhất (Beemster và De Bokx, 1987,
Burton, 1989; Brunt và cộng sự, 1996). PVY lần đầu tiên được phát hiện ở Anh
(Smith, 1931), bao gồm các chủng khác nhau tùy theo vùng và qua trình lây
nhiễm vào cây kí chủ (Jones, 1990; Kerlan và cộng sự, 1999): PVY

O
, PVY
C
,
PVY
N
, PVY
NTN
, PVY
N
W, PVY
Z
, PVY
ZE
. Trong đó có 3 chủng PVY chủ yếu là
PVY
O
(ordinary strain), PVY
N
(tobacco veinal necrosis strain) và PVY
C
(stipple
streak strain). PVY
C
ít quan trọng hơn so với PVY
O
và PVY
N
. Gần đây đã phát
hiện thêm một số chủng PVY khác như PVY

NTN
, PVY
N
W, PVY
Z
, PVY
ZE
.
Chủng PVY
NTN
gây đốm vòng ở củ, hiện nay có mặt ở hầu hết các vùng trồng
khoai tây.
Virus PVY là một trong những loại bệnh virus phá hoại nghiêm trọng
nhất đối với khoai tây trồng. Virus lây truyền vào cây khoai tây từ thế hệ này
sang thế hệ khác qua củ. Chiến lược sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật để
phòng trừ loại bệnh này đã không thành công (Jones và cộng sự, 1982; De Bokx
và Van der Want, 1987; Valkolen và cộng sự, 1996). Việc trồng các củ
giống vị
nhiễm virus PVY (potato Y potyvirus hoặc PLRV (potato leafroll luteovirus) đã
làm giảm năng suất tới 80% (Banttari và cộng sự, 1993). Theo Hull (1984),
nước Anh đã phải tốn 30-50 triệu bảng Anh mỗi năm để dùng cho phòng trừ
bệnh virus hại khoai tây. Năng suất khoai tây trên toàn thế giới đã giảm 20 triệu
tấn mỗi năm do virus PLRV (Kojima và Lapierre 1988).
Việc cải tiến tính kháng virus PVY (một loại virus hại chủ yếu ở khoai tây)
là một chi
ến lược lớn nhằm giảm thiểu việc sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật.
Tính kháng cực kỳ cao (extremely resistance) đối với loại virus này thể hiện ở
khả năng kìm hãm sự nhân lên của virus tại các tế bào xâm nhiễm (Solomon-
Blackburn và Barker, 2001). Tính kháng này được chuyển từ loài khoai tây dại
S. stoloniferum vào các giống khoai tây trồng S. tuberosum của Châu Âu qua 3 -

8
7 thế hệ lai backcross với cây mẹ mang gen RT
sto
(Song và Schwarzfischer
2008). Tính kháng với virus cũng được chuyển vào khoai tây trồng bằng các
thao tác gen song mức độ kháng là không hoàn toàn hoặc chỉ có thể kháng với 1
chủng của virus PVY trên trồng ruộng (Schubert và cộng sự, 2002). Hơn nữa
việc chuyển gen có hạn chế với chương trình chọn tạo giống khoai tây. Do đó
việc sử dụng các loài khoai tây dại như một nguồn gen kháng virus là mối quan
tâm của các nhà chọn tạo giống cây trồng bằng phương pháp lai soma. Các nhà
chọn tạ
o giống khoai tây đã sử dụng các gen có liên quan đến tính kháng virus
PVY từ các loài khoai tây dại (Solanum demissum Lindly, S. hougasii Correll, S.
stoloniferum Achlechtendal & Bouche, S. tuberosum L. ssp. andigena
(Juzepczuk và Bukasov) và S. chacoense Bitter. để đưa vào nguồn gen khoai
tây trồng bằng phương pháp dung hợp tế bào trần. Tuy nhiên các loài khoai tây
dại này rất khó để lai với khoai tây trồng và lai hữu tính với khoai tây trồng thì
chưa được biết đến. Để khắc phục những khó khăn trong lai hữu tính, lai soma
được sử dụng để dung hợp protoplast giữa loài dại này v
ới giống khoai tây trồng
Delikat (một giống rất nhạy cảm với virus). Các con lai soma không có biểu
hiện bị nhiễm virus sau khi lây nhiễm nhân tạo với 6 chủng PVY quan trọng
nhất ở điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng (Thieme và cộng sự, 2008). Điều
này chứng tỏ rằng tính kháng virus PVY đã được chuyển từ loài dại vào khoai tây
trồng bằng dung hợp protoplast. Sau đó, lai backcross giữa các con lai soma với
giống khoai tây trồng Delikat nhạy cảm vớ
i virus, tất cả các dòng lai BC1 đều
không có biểu hiện nhiễm virus PVY khi lây nhiễm với tất cả các chủng của virus
này. Trong các dòng lai BC2, các kiểu gen kháng và nhạy cảm đã được chọn lọc.

1.4.Tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần
Đối với hướng tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần
giữa hai hay nhiểu dòng mang đặc tính kháng tỏ ra có nhiều ưu điểm: Tổ hợp
được bộ genome của c
ả hai bố mẹ tạo thành một cấu trúc genome dị hợp tử
mới, không có sự biệt lập trong quá trình giảm phân, rút ngắn thời gian chọn tạo,

9
khắc phục những rào cản về mặt di truyền trong lai hữu tính… Cho nên trở
thành công cụ đầy hứa hẹn phục vụ chương trình chọn tạo giống cây khoai tây
kháng virus
Trong tự nhiên tồn tại khá nhiều nguồn gen kháng virus, theo một số
nghiên cứu đã xác định có khoảng 206 loài khoai tây dại mang củ, 7 loài nguyên
thủy và một loài khoai tây trồng Solanum spp, cũng như một số loài dại không
mang củ có đặc tính kháng virus tốt (Spooner và Hijmans , 2001). Trong số đó
dòng
S. etuberosum có đặc tính kháng cao với bệnh virus PVY, PVA…(Valkonen
et al, 1992b; Thieme et al, 2000 ), S. tarnii rất kháng với dòng virus PVY (Thieme
et al, 2003), loài khoai tây S. cardiophyllum Lindl và S. etuberosum Lindl thuộc
chi Pinnatisecta và Etuberosa (Hawkes, 1990) thể hiện tính kháng cao với nấm
Phytophthora infestans (Hanneman và Bamberg 1986). Chúng được thu thập và
thăm dò về tính kháng virus và tác nhân gây bệnh khác kể cả sâu hại. Một số
nghiên cứu về khoai tây ở Châu Âu khẳng định 90% loài khoai tây dại trong quỹ
gen thu thập là nguồn gen kháng mới có ý nghĩa. Đây là nguồn gen kháng quan
trọng phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung h
ợp
tế bào trần. Nếu lai tạo giống theo phương pháp truyền thống giữa những dòng
dại có tính kháng virus và dòng trồng thường gặp rào cản về mặt di truyền, thời
gian chọn tạo lâu
Rất khó khăn để có thể tập hợp nguồn gen dại vào dòng khoai tây trồng

Châu Âu bằng lai hữu tính, do đó dung hợp tế bào trần là phương pháp hữu hiệu
để đưa nguồn gen đó vào quỹ gen của loài S. Tuberosum, vượt qua
được tính
không tương hợp trong lai hữu tính và sự phân tách gen trong chương trình chọn
tạo giống (Millam et al, 1995). Sự dung hợp giữa tế bào trần của loài khoai tây
dại không có củ S. Brevidens với loài khoai tây trồng S. Tuberosum tạo con lai
soma biểu hiện tính kháng cao với một số nhóm virus và kháng vector truyền
bệnh (Austin et al, 1985b; Fish et al, 1987; Gibson et al, 1988; Pehu et al, 1990;
Vankonen et al, 1994b).

10
Tùy thuộc vào thành phần gen của con lai soma mà biểu hiện một số các
biến đổi về tính trạng hình thái và phản ứng lại sự xâm nhiễm virus PVX bởi
vector (Thieme et al, 2000). Một số con lai soma được lai lại thành công với
dòng khoai tây trồng mà vẫn biểu hiện tính kháng (Willliams et al, 1992; Helges
et al, 1993; Thieme et al, 2002). Hàng loạt con lai soma của S. etuberosum và S.
tuberosum và dòng BC1 thể hiện kháng tốt với PVY (Novy và Helgeson, 1994b)
và tính rất kháng với PVX. (Gavlirenco et al, 2003). Nghiên cứu của Polgar et al
(2002) đã tạo được 150 dòng lai soma giữa thứ khoai tây Hungari và S.
brevidens cùng một vài thế h
ệ BC. Kết quả cho thấy rằng tất cả con lai và hầu
hết dòng BC biểu hiện mức kháng cao với virus PVY và PLRV.
Một nghiên cứu mới mẻ của Thieme et al (2008) cho biết loài khoai tây
dại S. tarnii là nguồn gen kháng quan trọng với cả sâu hại và bệnh hại, biểu hiện
tính rất kháng với virus PVY, tính kháng cao với nấm Phytopthera infestans.
Khi đó tiến hành lai soma với một số dòng khoai tây trồng thuộc loài S.
tuberosum để tạo thể lai mới kế
thừa tính kháng từ dòng khoai tây dại S. tarnii.
Trong số các phương pháp tạo giống khoai tây kháng virus thì phương
pháp lai soma có nhiều ưu điểm và hiệu quả hơn cả. Về phương pháp lai hữu

tính gặp nhiều khó khăn về mặt di truyền, tốn thời gian chọn tạo. Đối với phương
pháp chuyển gen cũng gặp không ít rắc rối bởi khi chuyển gen kháng virus vào
cây chúng có thể không biểu hiện tính kháng (Cockerham, 1970; Ross, 1986;
Jones 1990; Mendoza et al, 1990) mà còn xuất hiện các sản ph
ẩm phụ (protein) từ
gen chuyển gây rối loạn hoạt động của cây chủ. Nhược điểm của phương pháp
chuyển gen là mang tính kháng đặc hiệu dòng virus, dễ bị phá vỡ tính kháng khi
lây nhiễm virus với nồng độ cao, chỉ có ý nghĩa với nhóm virus lây nhiễm cơ giới
mà không có hiệu quả với nhóm virus truyền qua tuyến nước bọt của côn trùng
(Anderson et al, 1989; Stark và Beachy, 1989)
Để có thể giải quyết vấn đề bệnh virus của cây khoai tây, cầ
n áp dụng
nhiều biện pháp khác nhau, trong đó ưu tiên giải pháp tạo giống kháng vector

11
truyền bệnh virus và kháng trực tiếp dòng virus.
1.5. Cơ sở khoa học của phương pháp lai soma (dung hợp tế bào trần)
1.5.1. Khái niệm tế bào trần (protoplast) và con lai soma (somatic hybrid)
Tế bào trần là tế bào đã bị tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học
hay enzym, phần còn lại sau phân giải thành là màng nguyên sinh chất bao bọc
nhân và các bào quan bên trong. Màng nguyên sinh chất là phần ranh giới phân
biệt giữa môi trường bên trong tế bào và bên ngoài tế bào trần.
Mỗi tế bào thực vật đề
u có tính toàn năng (tipotential) nghĩa là có tiềm
năng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Do đó việc dung hợp hai hay
nhiều tế bào trần nhằm tạo con lai soma hoàn toàn có thể phát triển thành cây lai
hoàn chỉnh.
Con lai soma là sản phẩm của sự dung hợp giữa các nguồn tế bào trần
khác nhau. Nhân và các bào quan là sự lai giữa hai bố mẹ dung hợp, với
mục đích kết hợp các tính trạng tốt của bố mẹ vào con lai để cải t

ạo nguồn gen
của cây trồng. Con lai soma được tạo ra khi phương pháp lai hữu tính gặp khó
khăn về mặt di truyền hoặc các thao tác lai…
1.5.2. Quá trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast
Sự ra đời của kỹ thuật dung hợp tế bào trần ở thực vật cho phép tạo ra
những cơ thể lai mới, mang các đặc tính tốt mà phương pháp lai truyền thống
rất khó hoặc không thể tạo ra được con lai. Hơn nữa, cây khoai tây là một loại
cây rấ
t dễ nuôi cấy mô, do vậy các nhà nghiên cứu dễ dàng áp dụng kỹ thuật
dung hợp tế bào trần tạo thể lai soma để cải tiến một số tính trạng mong muốn,
đặc biệt là tính kháng. Đặc tính kháng bệnh trong con lai soma có được là do
một trong hai đối tượng tế bào dung hợp có mang tính chất đó. Đồng thời tế bào
lai soma là sự dung hợp của gen nhân và các bào quan (ty thể lai, lạp thể lai),
nên cũng góp phần tăng cường các đặc tính nông sinh học khác ở con lai soma.

12
Vào những năm 60 của thế kỷ XX, E. C. Cooking đã sử dụng một
enzyme để phân giải thành tế bào và kết quả là tạo ra các protoplast tế bào chóp
rễ của cây cà chua.
Sau đó I.Takebe và cộng sự (Viện nghiên cứu virus thực vật, Aobacho,
Chiba/Japan) đã cải tiến kỹ thuật trên và đã tạo được một lượng lớn tế bào trần
của các tế bào thịt lá cây thuốc lá. Quy trình này cũng được áp dụng thành công
trên nhiều
đối tượng thực vật khác, rất dễ sử dụng và đạt hiệu quả cao. Quy trình
này được tiến hành qua hai bước: đầu tiên là phân giải lớp màng mỏng bằng
enzym pectinase; sau đó, phân giải thành tế bào bị phân giải bằng enzym
cellulase.
Đây là những người đặt nền móng đầu tiên cho các nghiên cứu về tế bào
trần. Những kết quả nghiên cứu trên góp phần vào sự thành công tạo nguồn tế
bào trần phục vụ dung hợp.

* Tách protoplast
Để tách được protoplast người ta có thể sử dụng hai phương pháp tách cơ
học và tách bằng enzyme. Tách cơ học là làm cho protoplast ở trạng thái co
nguyên sinh sau đó tác động cơ học để giải phóng tế bào trần. Tuy nhiên phương
pháp này có nhiều mặt hạn chế: chỉ áp dụng trên một vài đối tượng thực vật; mật
độ protoplast thu được không cao; khả năng tái sinh yếu. Phương pháp tách
protoplast bằng enzyme đã khắc phục được những nhượ
c điểm trên. Hiện nay,
phương pháp enzyme được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao.
* Dung hợp
Hai đối tượng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một
cách tự phát hoặc được cảm ứng bởi tác nhân như hóa chất (dung hợp hóa chất
polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện-
electrofusion). Đối với cây khoai tây người ta đã sử dụng cả hai phương pháp
trên. Tuy nhiên so với ph
ương pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung
điện được áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản,

13
tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độc đối
với tế bào (Banner, 1990). Phương pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thường
gây độc cho tế bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hưởng đến
khả năng tái sinh sau này.
* Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần sau dung hợp
Sản phẩm sau khi dung hợp sẽ được nuôi cấy trong môi trường lỏng cho
tới khi microcallus xuất hiện. Trong giai đ
oạn ban đầu protoplast “rất yếu ớt” do
chưa có thành tế bào, do vậy môi trường nuôi cấy cần phải đảm bảo áp suất
thẩm thấu để không làm vỡ tế bào, ngoài các yếu tố dinh dưỡng cần thiết còn
cần cung cấp đủ ion Ca

2+
cho quá trình phân chia hình thành thành vách tế bào
mới. Tiếp đó, các microcalli này sẽ được chuyển sang môi trường rắn để tạo
thành macrocallus, tùy thuộc vào từng loại cây trồng mà sử dụng loại môi
trường khác nhau. Cho tới khi kích thước calli đạt tiêu chuẩn thì cấy chuyển
sang môi trường tái sinh để tạo chồi và cuối cùng tạo cây hoàn chỉnh.
1.5.3. Xác định con lai soma
Sản phẩm sau dung hợp là hỗn hợp gồm: Các dạng bố hoặc mẹ dùng để
lai partners), các thể lai đồ
ng hợp (do các tế bào của cùng 1 loài kết hợp lại với
nhau - homozygous) và thể lai dị nhân (các tế bào khác loài kết hợp lại với nhau
-hetezygous) do quá trình dung hợp xảy ra ngẫu nhiên và không kiểm soát được.
Chính vì vậy việc chọn lọc chính xác con lai soma trong hỗn hợp sản phẩm sau
dung hợp là rất cần thiết. Có rất nhiều phương pháp để chọn lọc con lai soma
khác nhau, có thể xếp vào hai nhóm là chọn lọc ở mức tế bào (hay calli) và chọn
lọc ở m
ức cây hoàn chỉnh (planlet). Tùy từng loại cây trồng mà có thể áp dụng
các phương pháp khác nhau, tuy nhiên thường thì chọn lọc con lai ở giai đoạn
cây hoàn chỉnh cho hiệu quả cao hơn.
Chọn lọc ở mức tế bào
* Phương pháp tách trực tiếp:

14
Sau khi dung hợp, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi để chọn lọc trực
tiếp sản phẩm dung hợp, bằng cách sử dụng micropipet hút trực tiếp tại
vị trí dung hợp. Tuy nhiên phương pháp này rất khó khăn để tách được tế bào lai
do mât độ tế bào khá dày, hơn nữa dễ gây tổn thương tế bào, ảnh hưởng đến sự
tái sinh sau này. Phương pháp này ít được áp dụng trong chọn lọc con lai (Hein
và Schieder 1984)
* Phương pháp nhuộm huỳnh quang:

Puite và Pijnacker (1986)
đã đề xuất phương pháp chọn lọc sản phẩm
dung hợp bằng cách nhuộm huỳnh quang. Tiến hành nhuộm flouresencein
diacetate (FDA) cho nguồn protoplast thu được từ mẫu lá xử lý trong dung dịch
thuốc trừ cỏ, các protoplast này không hoặc có rất ít lục lạp, sau đó tiến hành
dung hợp với nguồn protoplast bình thường có chứa lục lạp. Sau khi xử lý dung
hợp, kết quả cho thấy các protoplast xuất hiện màu đỏ và màu xanh của FDA
được xác nhận là con lai soma (heterokaryon). Tuy nhiên yêu cầu c
ủa phương
pháp này là mật độ nuôi cấy protoplast phải thấp.
Theo Harkins và Galbrain, 1984, các ông tiến hành nhuộm flouresent
khác nhau cho cả hai nguồn protoplast dung hợp. Sau dung hợp, hỗn hợp
protoplast được chiếu tia laser khi đó các tế bào hấp thu năng lượng ánh sáng,
cuối cùng tiến hành chọn lọc con lai dựa trên định lượng hàm lượng flouresent.
* Dựa trên các biểu hiện di truyền, sử dụng các gen chỉ thị và gen đánh dấu:
Chẳng hạn như các gen đột biến gây bạch tạ
ng, các đột biến hóa sinh
làm ức chế gen nào đó dẫn tới sự thiếu hụt enzyme hoạt động, các gen đánh dấu
có được bằng phương pháp chuyển gen, các gen kháng sinh hoặc kháng thuốc
trừ cỏ. Có thể nêu một số ví dụ sau:
Gây đột biến tính lặn mẫn cảm với ánh sáng SSvv và ssVV của cây
thuốc lá (Nicotiana tabacum), khi đó dạng lai giữa hai kiểu đột biến trên có kiểu
gen SSssVVvv không mẫn cảm với ánh sáng. Các dòng tế bào tồn t
ại hình thành

15
diệp lục ở cường độ ánh sáng cao do không mẫn cảm với ánh sáng, đó chính là
con lai soma (Athuja 1982).
Dạng lai giữa Solanum nigrum và Petunia hybrida có thể phát triển trên
môi trường có chứa diethylpyrocarbamate (hợp chất gây mẫn cảm với Solanum

nigrum) và iodine acetate (gây mẫn cảm với Petunia hybrida). Protoplast bố mẹ
dung hợp không phát triển trên môi trường có đồng thời hai chất trên do đó dễ
dàng chọn lọc được con lai soma (Davey và Kumar 1983).
Hai nguồn protoplast Nicotiana glauca và B.langsdorfii cần có auxin
trong môi trường mới có th
ể phát triển được, ngược lại dạng lai giữa chúng có
thể tự tổng hợp được auxin do vậy phát triển được trong môi trường thiếu auxin.
Qua đó con lai soma dễ dàng xác định được trong điều kiện môi trường nuôi
cấy (Pelletier và Chupeau 1984).
Dòng tế bào A của Shaerocarpos donelli chỉ phát triển được khi trong
môi trường có acid nicotinic và dòng tế bào B (dạng bạch tạng) thì cần đường.
Dạng lai giữa A và B phát triển bình thường trên môi trường không có cả acid
nicotinic và đường. Dòng tế bào A và B
được gọi là dòng tế bào đột biến dinh
dưỡng thụ động (auxotrophic) theo Gonzales và Widholm 1985.
Chọn lọc ở mức cây hoàn chỉnh.
Bằng các phương pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) hoặc
Isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả bố
và mẹ dung hợp.
Theo N.Q.Thach và U. Frei và G. Wenzel (1993) đã tạo thành công con
lai soma giữa các nhóm khoai tây thuộc Solanum tuberosum L., việc xác định
con lai dựa trên phân tích isozyme esterase, peroxidase (Deimling et al. 1988) và
kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI) đã xác định được các con lai đều có sự
biểu hi
ện của 2 allele trội đơn gen Rx và Ry từ bố mẹ dung hợp (partners).
Theo Ramona Thieme và Elena Rakosy – Tican (2007), Con lai giữa
Solanum tuberosum cv. Delikat và S. tarnii được xác nhận bằng chỉ thị phân tử

16
SSR (Simple Sequence Repeat ) và AFLP (Amplified Fragment length

polymorphism), đồng thời cũng dựa vào đặc điểm hình thái và phân tích Flow
cytometry. Kết quả cho thấy SSR không cho kết quả với tổ hợp lai trên và các
con lai BC1 còn AFLP cho kết quả tốt để khẳng định đúng con lai soma.
Ngoài ra, để xác định con lai soma một số tác giả đã nghiên cứu thành
phần, hàm lượng alkaloid trong các cây lai. Theo nghiên cứu của Pehu và cộng
sự (1990) về dung hợp protoplast giữa S. tuberosum và S. brevidens đã tạo con
lai soma thành công. Để xác định con lai soma ông tiến hành phân tích thành phần
SGAA (Steroidal Glycoalkaloid Aglycone) của cây lai. Kết quả cho thấy các thành
phần alkaloid của bố mẹ bao gồm solanidine và slanthrene của S. tuberosum,
tomatidine của S. brevidens (Laurila et al 1996) đều có mặt trong cây lai. So sánh với
bố mẹ, cho biết thành phần SGAA trong cây lai cao hơn so với S. tuberosum nhưng
hàm lượng thấp vào khoảng 20 mg/ 100g trọng lượng tươi.
Hơn nữa người ta có thể xác định con lai dựa vào đặc điểm hình thái khi
bố mẹ có đặc điểm khác nhau rõ rệt. Tuy nhiên ph
ương pháp này chỉ được áp
dụng đông thời với phương pháp xác định ở mức phân tử thì mới cho kết
quả chính xác nhất.
1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống nhờ kỹ thuật lai tạo, lai hồi
giao (back cross), đột biến và chọn lọc (Kuckuck et al, 1985) vấp phải những
khó khăn về mặt đặc tính di truyền của kỹ thuật trồng tr
ọt (Solanum
tubersosum). Đó là bộ genom của khoai tây trồng trọt ở thể tứ bội tetraploid
(2n=4x = 48 nhiễm sắc thể), gây ra sự phân ly sau lai tạo với một quần thể rất
lớn, rất phức tạp, đòi hỏi quá trình chọn lọc rất nhiều công sức. Quá trình này
đòi hỏi tối thiểu 10 năm để có được một giống lai ra đời (Fitsden, 1984). Ngoài
ra, nhiều đặc tính chống chịu do nhiều gen quy định sẽ có thể
mất dần trong quá
trình chọn lọc ở các thế hệ tiếp sau.

17
Phương pháp chuyển gen được coi là chiến lược mới để cải tiến các giống
cây trồng. Tuy nhiên, nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng không thể
chuyển vào cây trồng bằng công nghệ gen do chúng được kiểm soát bởi đa gen;
hoặc các gen kiểm soát các tính trạng mong muốn vẫn chưa được biết đến; hoặc
các gen của chúng chưa thể tách ra được và nhân dòng thành công. Do đó,
phương pháp lai tạo giữa các loài có quan hệ gần gũi bằng dung hợp tế
bào trần
là một phương pháp thú vị để khắc phục những nhược điểm trên. Phương pháp
dung hợp tế bào trần đã giải thích cơ sở di truyền của tính kháng với các stress
vô sinh và hữu sinh ở cây trồng (Chen và cộng sự, 1998; Naess và cộng sự,
2000; McGrath và cộng sự, 2002).
Sơ đồ tạo giống khoai tây nổi tiếng của Wenzel (1979) bằng dung hợp
tế bào trần bao gồm các khâu: chọn lọc các đặc tính mong muốn
ở bố mẹ
(haploid, 1x) sau đó tạo cây dihaploid (2x), lai tạo các cây dihaploid (có các đặc
tính khác nhau) để tạo con lai 2x tổ hợp được các đặc tính mong muốn của bố
mẹ. Sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào để tổ hợp các đặc tính mong muốn ở các
dạng 2x. Kết quả thu được con lai soma 4x (tetraploid). Các dòng lai soma này
được chọn lọc để phát triển thành giống có đặc tính mong muốn.

18
Các dòng tứ bội khởi đầu (4x )

Hình 1.1. Sơ đồ tạo giống khoai tây sử dụng tổng hợp kỹ thuật: Lai
tạo, nuôi cấy bao phấn (nuôi cấy hạt phấn), nhị bội hóa và dung hợp tế bào
trần. (Wenzzel và cộng sự 1976)

Theo định hướng này đã có hàng loạt công trình của các tác giả nhằm giải
quyết từng khâu của sơ đồ tạo giống trên: các công trình về nghiên cứu kỹ thuật
giảm độ bội của khoai tây tứ bội xuống nhị bội khi lai khoai tứ bội với dòng dại
Solanum phureja (Nitzche và Wenzel, 1977); các công trình nghiên cứu về hoàn
thiện kỹ thuật tách protoplast và dung hợp protoplast khoai tây theo các phương
pháp hoá học, điện học (Shepard, Tohen 1977, Thomas 1981, Bokelmann, Roest
1983, Millers 1990, 1994, Si and Dai, 1997 ).
Eduard Chani và cộng sự (2000)
đã áp dụng công nghệ dung hợp
protoplast và nuôi cấy bao phấn để tạo các cây đơn bội. Các con lai soma được
tạo ra từ tổ hợp lai giữa Solanum phureja Juz.&Buk. và S. chacoense Bitt. Nuôi
a
*
1
a
2
a
3

a
4

a
1
a
*
2
a
3
a
4


a
1
a
2
a
*
3
a
4


a
1
a
2
a

3
a
*
4


Tạo dòng nhị bội nhờ kỹ thuật parthenogen etic
a
*
1
a a
*
2
a a
*
3
a a
*
4
a Chọn lọc (2x)
Tạo dòng đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn – nhị bội hóa tạo 2x
a
*
1
a
*
1
a
*
2

a
*
2
a
*
3
a
*
3
a
*
4
a
*
4
Chọn lọc (2x) x x
a
*
1
a
*
2
(+) a
*
3
a
*
4

a

*
1
*
2
a
*
3
a
*
4


19
cấy hạt phấn của các con lai này để tạo 1 họ cây đơn bội. Có nhiều yếu tố ảnh
hưởng đến nuôi cấy bao phấn như điều kiện trồng cây cho bao phấn; phương
pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy; điều kiện nuôi cấy; kiểu gen; thời gian lấy
bao phấn Đa số các cây tái sinh đều là cây nhị bội, điều này chứng tỏ rằng có
một số alen
đã bị đào thải trong thể dị hợp ở cây cho hạt phấn. Trong các cây tái
sinh, các thể đồng hợp cũng được xác định thành công bằng chỉ thị phân tử SSR
với 8 cặp mồi.
Trong giai đoạn những năm 80 đến 90, các nghiên cứu nhằm phát triển
các phương pháp tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các thể lai soma được tiến
hành rất mạnh mẽ (Shepard và totten,1977; haberlach và cs,1985; Austin và cs,
1985a; Fish và cs, 1988; Perl và cs , 1988; Schilde, Rentschler và cs, 1988;
Deimling và cs,1998; Masson và cs, 1988; Hunt và Helgeson, 1989; Chaput và
cs, 1990; Wenzel, 1992; Thach et al., 1993; Menke và cs,1996,1997). Các công
trình nghiên cứu tạo các con lai soma t
ổ hợp được các đặc tính kháng bệnh virus
từ bố mẹ đã chọn lọc (2x) cũng được rất nhiều tác giả nghiên cứu thành công.

Các tác giả này thừa nhận có thể tổ hợp được các đặc tính kháng bệnh (virus
PVY, PVX, mốc sương, rệp) của bố mẹ vào con lai soma và các đặc tính này có
thể quan sát rõ trên đồng ruộng. Tuy nhiên những dòng con lai soma có nhiều
biến dị trên đồng ruộng cần phải chọn lọc.
Thach và cộng s
ự (1993) đã chọn lọc thành công 14 dòng khoai tây nhị
bội S. tuberosum mang gen kháng Rx hoặc Ry hoặc cả hai, biểu hiện tính kháng
rất cao với virus PVX, PVY, điều này rất ý nghĩa để tiến hành nghiên cứu dung
hợp tế bào trần giữa chúng nhằm tạo thể lai soma mang đặc tính kháng bệnh
virus. Các tổ hợp chọn cho dung hợp hầu hết tạo thể lai tứ bội (tetraploid), một
số kết quả khác gần 50% là thể lục bộ
i (hexaploid) và thể bội không hoàn chỉnh
(aneuploid). Đặc biệt một tổ hợp lai thu được có tới 94% dòng lai soma, trong
khi đó những tổ hợp khác chỉ có 2% là dòng lai soma. Đa số các con lai soma
thu được có biểu hiện tính kháng virus của cả hai đối tượng khoai tây dung hợp,

20
con lai được xác định bằng kỹ thuật RFLP và phân tích isozyme với 2 loại
enzym esterase và peroxidase.
Lu Wenhe và cộng sự (2004) cho rằng dung hợp tế bào trần không chỉ
vượt qua rào cản lai tạo thông thường mà còn thu được các thể lai soma, do vậy
con lai soma sẽ thể hiện ưu thế lai rất rõ. Kỹ thuật dung hợp tế bào đã được
nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc phát triển các giống cây trồng
mới. Có thể kể tên một số giống đã th
ương mại hoá thành công như : cam
"Oretachi" (cam + cam ba lá), "Shuvel" (quít Satsuma + cam), "Gravel" (cam lai
bưởi chùm), "Murrel" (murcott +cam) và "Yuvel" (Yuzu + cam), Giống thuốc lá
bất dục đực Ms-F 224. Ngoài ra nhiều dòng bất dục đực dùng để sản xuất hạt
F1 ở lúa, cà rốt, cải bắp và cà cũng được phát triển bằng kỹ thuật dung hợp tế
bào (Nakajima, 1991).

Với sự phát triển không ngừng của các công nghệ hiện đại kết hợp với các
kỹ thuật truyền thống, các gen kháng hai loại virus PVY và PVX
đã được xác
định thông qua các nghiên cứu di truyền và chỉ thị phân tử (Blackburn & Barker,
2001). Các trình tự liên quan đến khả năng kháng virus ở khoai tây đã được xác
định. Bên cạnh đó, hơn 5881 SSRs ở khoai tây đã được tìm thấy. Đây chính là
những cơ sở dữ liệu quan trọng để ứng dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh
học hiện đại (tin sinh học, chỉ thị phân tử) nhằm nhanh chóng tạo các giống
khoai tây theo định hướ
ng mong muốn. D.Milbourne và cộng sự (1998) đã
thành công trong việc phân lập, đánh giá và lập bản đồ SSR cho khoai tây. Các
nhà nghiên cứu đã thiết kế và tổng hợp thành công 120 cặp mồi với vị trí chính
xác trên ADN của khoai tây được thiết kế và tổng hợp. Đây là những giữ liệu rất
quan trọng cho nghiên cứu di truyền ở khoai tây trong tương lai. Kế thừa những
kết quả này, Ye –So Song và cộng sự (2005) đã xây dựng thành công bản đồ gen
Ry
sto
(gen kháng cực kỳ cao với virus PVY), gen này nằm trên nhiễm sắc thể số
XII của khoai tây. 12 marker của gen Ry
sto
đã được sử dụng để phân tích đa hình
của 106 giống khoai tây của Đức, Ba lan, Thụy sỹ. Locus của gen Ry
sto
đã được

21
xác định nằm trên nhiễm sắc thể số XII bằng mồi STM0003. Sử dụng các dòng
khoai tây nhị bội tạo ra từ nuôi cấy hạt phấn sơ cấp để phát triển các chỉ thị phân
tử đã được chứng minh. Đây là nguồn marker tiềm năng cho chương trình chọn
tạo giống khoai tây có các đặc tính mong muốn.

Gần đây, có nhiều hướng nghiên cứu mới là sử dụng nguồn gen khoai
tây dại có
đặc tính kháng bệnh và dịch hại (virus, Phytophtora infestan, rệp
truyền bệnh ) rất điển hình làm nguyên liệu dung hợp trực tiếp với các dòng
khoai tây trồng để tạo các con lai soma mang đặc tính chống chịu virus mốc
sương và rệp truyền bệnh Các dòng lai này sẽ được sử dụng làm vật liệu lai lại
(BC) với chính bố mẹ của chúng. Kết quả tạo ra các dòng khoai tây trồng trọt
mang đặc tính kháng bệnh virus rõ rệt cùng với các đặc tính nông sinh h
ọc tốt
của bố mẹ. Đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây
dại để chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai
hữu tính: S. Chacoense (Butenko và cs, 1982); S.niggrum (Binding và cs, 1982;
1988); S.brevidens (Austin và cs, 1985; helgeson, 1993); S.circaeifolium
(Mattheij và cs, 1992); S.berthaultii (Serraf và cs,1991); S.commersonii (Cardi
và cs, 1993); S. Khasianum, S.aculeatissimum (Stattmann và cs, 1994);
S.torvum (Jadari và cs, 1992); S.phureja (Puite và cs, 1986); S.pinnatisectum
(Sidorov và cs, 1987, 1994; Schilde-Rentschler và cs, 1993; Thieme và cs,
1995); S.bulbocastanum (Austin và cs, 1993; Brown và cs, 1995; Schilde-
Rentschler và cs, 1993; Thieme và cs, 1995, 2004, 2008, 2010; . Ioana Dinuet
al., 2000; Tajana Gavrilenko et al., 2003)
1.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước:
Mặc dù thế giới đang tiến rất nhanh và đạ
t được khá nhiều thành tựu
trong chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh và sâu hại bằng công nghệ dung hợp
tế bào trần, song ở Việt Nam, cho đến nay công nghệ này vẫn còn hết sức mới
mẻ. Chúng ta chưa thành công trong việc tạo giống thông qua lai tạo truyền
thống; chưa sử dụng các phương pháp CNSH hiện đại; chưa có bộ vật liệu

22
phong phú mang các tính trạng quý như mang gen kháng virus, mốc sương,

chống chịu với các stress phi sinh học (abiotic stress). Sản xuất khoai tây ở Việt
Nam đang gặp 2 vấn đề nan giải: (1) Chưa xây dựng được hệ thống sản xuất
giống khoai tây sạch bệnh tại chỗ nhằm cung cấp chủ động củ giống sạch bệnh
cho sản xuất với giá thành được sản xuất chấp nhận. Các giống khoai tây sử
dụ
ng trong sản xuất chủ yếu vẫn phải nhập nội; (2) Còn có rất nhiều khó khăn
và hạn chế trong công tác chọn tạo giống khoai tây phù hợp với điều kiện sinh
thái Việt Nam có năng suất cao, phẩm chất tốt (ăn tươi hoặc chế biến) và đặc
biệt có đặc tính kháng bệnh nhất là bệnh virus gây thoái hóa giống khoai tây và
bệnh mốc sương vào cuối vụ đông gây thiệt hại về n
ăng suất nghiêm trọng.
Công tác xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh đã được
nhiều cơ quan quan tâm nghiên cứu và đã đạt được những kết quả đáng khích lệ.
Gần đây, quy trình sản xuất giống khoai tây sạch bệnh bằng nguồn nuôi cấy mô
đã được nhận giải nhì VIFOTEC năm 2008 và được công nhận là TBKT năm
2009 (Viện SHNN – Trường ĐHNN HN).
Hướng nghiên cứu ch
ọn tạo giống khoai tây lâu nay ở Việt Nam chủ yếu
vẫn là công tác nhập nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù
hợp cho sản xuất. Bộ giống khoai tây nhập nội của Việt Nam còn rất nghèo nàn
bao gồm: giống Thường Tín (Ackersegen nhập nội từ đầu thế kỷ 20); giống
Mariella (nhập nội từ Đức năm 1974 và công nhận giống mới năm 1980); giống
Lipsi (nh
ập nội từ Đức năm 1985, công nhận 1990); giống Sanetta (nhập nội
1987, công nhận 1990); giống Rasant, Karsta (nhập nội từ Đức 1995, công nhận
tạm thời năm1998); giống VT2 (nhập nội từ Trung Quốc và công nhận năm
1998); giống PO3 (nhập nội từ Philipin, công nhận tạm thời 2004); giống Solara
(nhập nội từ Đức 2001, công nhận năm 2007); giống Diamant và giống Nicola
(nhập nội từ Hà Lan); giống Marabel và Esprit (nhập nội t
ừ Đức và công nhận

2009). Một số giống khoai tây do Việt Nam chọn tạo từ nguồn vật liệu của CIP
bao gồm: giống KT2 (công nhận 1995), giống P3 (công nhận 2001), giống

23
VC386 (công nhận tạm thời năm 2004), giống khoai tây hạt lai Hồng Hà 2 và
Hông Hà 7 chọn từ các tổ hợp lai của CIP (theo 575 giống cây trồng nông
nghiệp mới, Bộ NN&PTNT, nxb Nông nghiệp năm 2005). Các cơ quan chọn tạo
và khảo nghiệm giống khoai tây chủ yếu là: Trung tâm Nghiên cứu cây có củ -
Viện KHNN VN, Bộ môn cây có củ - Viện cây lương thực và thực phẩm, Trung
tâm khảo kiểm nghiệm giống cây trồng Trung ương.
Giai đoạn 1980-2000 quan hệ h
ợp tác nghiên cứu giữa CIP với Việt nam
chương trình chọn giống đã giới thiệu, đánh giá và chọn lọc được một số dòng
giống khoai tây kháng bệnh mốc sương như các giống Atzimba, CFK- 69.1, B-
71.2902 và P3 đã được trồng rộng rãi tại Cao nguyên Đà lạt, thay thế những giống
cũ nhập từ Châu âu, sau đó phát triển thêm giống Hồng 07 rất được sự ưa chuộng
của người sản xu
ất và người tiêu thụ. Tại Đồng bằng Sông hồng 2 giống được đánh
giá cao kháng bệnh mốc sương đó là P3 và KT3, các giống trên mang nguồn Gen
S.demissum (P3) và S. andijena (Atzimba, CFK-69.1,B-71-240-2, 07 và KT3.
Như vậy, các nghiên cứu trên chủ yếu vẫn sử dụng các phương pháp chọn
tạo giống truyền thống. Cùng với những tiến bộ và thành tựu đạt được của thế giới
trong nghiên cứu cải tạo giống cây trồng bằng dung hợp tế
bào trần, Việt Nam đang
dần kế thừa và bắt đầu nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo giống khoai
tây kháng virus và bệnh cũng như một số dịch hại nguy hiểm khác
Xuất phát từ tình hình thực tế trên, Viện SHNN được Bộ NN&PTNT cho
phép tiến hành nghiên cứu đề tài “ Tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng
dung hợp tế bào trần” giai đoạn 2007-2010. Đề tài tập trung nghiên cứu xây
d

ựng quy trình trình công nghệ tạo giống khoai tây kháng bệnh virus thông qua
kỹ thuật dung hợp tế bào trần (protoplast), đồng thời tạo được các dòng lai soma
là vật liệu quan trọng cho chương trình chọn tạo giống khoai tây của Việt Nam.

24
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
+ Vật liệu nghiên cứu gồm 8 dòng khoai tây nhị bội có nguồn gốc từ trung
tâm nghiên cứu khoai tây của Viện nghiên cứu Tài nguyên cây trồng- Bavaria -
Cộng hòa liên bang Đức cung cấp: A15, A16, A41, A56, B186, B208,
H1959/195 và H1929/34.
+ Các giống khoai tây tứ bội: Atlantic, Solara, Fasan, Caruso, Margit,
Omega, Pallina (các giống này ở cấp xác nhận)
2.1.2. Các chủng virus sử dụng để lây nhiễm nhân tạo
Các ch
ủng virus PVY được dùng cho thí nghiệm tồn tại trên giống thuốc
lá Nicotiana tabacum cv.Samsun. Chúng được làm tinh khiết bằng phản ứng IC-
RT-PCR (Schubert và cộng sự 2007). Các chủng virus PVY bao gồm:
- Amigo-N150/1 (PVY
N
, K.Lindner, JKI, Braunschweig, Germany)
- Q3 (PVY
C
, I. Browning, SASA, Edinburgh, Scotland)
- Linda (PVY
NTN
, JKI, Germany)
- Wilga O (PVY

N
W, M. Chrzanowska, IHAR, Mlochow, Poland)
- CH605 (PVY
N
, P.Gugerli, RAC, Nyon, Switzerland)
- 205 (PVY
O
, JKI, Germany)